JPH05123167A - 無血清培養用培地 - Google Patents
無血清培養用培地Info
- Publication number
- JPH05123167A JPH05123167A JP3066079A JP6607991A JPH05123167A JP H05123167 A JPH05123167 A JP H05123167A JP 3066079 A JP3066079 A JP 3066079A JP 6607991 A JP6607991 A JP 6607991A JP H05123167 A JPH05123167 A JP H05123167A
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- JP
- Japan
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- serum
- medium
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 動物細胞の無血清培養に有用な培地を、簡便
な方法により、安価かつ多量に提供する。 【構成】 ラット上皮系細胞株を無血清培地で培養して
得られる培養上清を含有する無血清培養用培地。
な方法により、安価かつ多量に提供する。 【構成】 ラット上皮系細胞株を無血清培地で培養して
得られる培養上清を含有する無血清培養用培地。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、無血清培養用培地、
特に、ヒトを含む動物の細胞、就中、上皮系初代培養細
胞の無血清培養に好適な培地に関する。
特に、ヒトを含む動物の細胞、就中、上皮系初代培養細
胞の無血清培養に好適な培地に関する。
【０００２】
【従来の技術】生物を利用した有用物質の生産は古来よ
りおこなわれ、特に微生物による食品生産は現在でも重
要な技術分野の一つである。さらに、この発酵生産技術
を基礎として抗生物質などの医薬品の製造技術が蓄積さ
れてきた。一方、近年生物学あるいは医学の発展に伴い
ヒトを含む動物の細胞の培養が可能となり、その結果細
胞を用いた有用物質の製造が可能となってきた。例え
ば、マウスのＢ細胞とミエローマを融合させて得られる
ハイブリドーマを用いる抗体の製造は既に実用段階に入
っている。
りおこなわれ、特に微生物による食品生産は現在でも重
要な技術分野の一つである。さらに、この発酵生産技術
を基礎として抗生物質などの医薬品の製造技術が蓄積さ
れてきた。一方、近年生物学あるいは医学の発展に伴い
ヒトを含む動物の細胞の培養が可能となり、その結果細
胞を用いた有用物質の製造が可能となってきた。例え
ば、マウスのＢ細胞とミエローマを融合させて得られる
ハイブリドーマを用いる抗体の製造は既に実用段階に入
っている。
【０００３】しかしながら、動物細胞の培養法は、研究
の歴史が長く培養の制御技術の蓄積がある微生物の培養
に比べ、十分には確立されていないのが現状である。例
えば、動物細胞の培養用の培地には牛などの動物血清が
添加されることが多く、このため細胞が生産する微量の
有用物質を培地から分離精製するのに極めて複雑な操作
を必要とする。また、培地に添加される動物血清は複雑
な組成を有するため、有用物質を高度の技術で分離精製
したとしても動物血清由来の成分が不純物として混入し
てくる可能性がある。このような問題点を解決する方法
として、動物血清を含まない無血清培地で細胞を培養し
ようという試みがなされている。例えば、ハヤシ、サト
ウはラット下垂体由来の腫瘍細胞を血清を含まない培地
で培養することに成功している[ネイチャ(Ｎature)、第
２５９巻、第１３２頁〜第１３４頁(１９７６年)参
照]。彼らは、培地に動物血清を添加する代わりに、数
種の既知のホルモン、トランスフェリンおよび細胞成長
因子として発見されたソマトメジンＡを用いた。現在、
新しい細胞成長因子が次々に発見され、それらを用いて
細胞の無血清培養の試みがなされている[例えば、日本
組織培養学会編「細胞成長因子」(朝倉書店、１９８４年
発行)参照]。
の歴史が長く培養の制御技術の蓄積がある微生物の培養
に比べ、十分には確立されていないのが現状である。例
えば、動物細胞の培養用の培地には牛などの動物血清が
添加されることが多く、このため細胞が生産する微量の
有用物質を培地から分離精製するのに極めて複雑な操作
を必要とする。また、培地に添加される動物血清は複雑
な組成を有するため、有用物質を高度の技術で分離精製
したとしても動物血清由来の成分が不純物として混入し
てくる可能性がある。このような問題点を解決する方法
として、動物血清を含まない無血清培地で細胞を培養し
ようという試みがなされている。例えば、ハヤシ、サト
ウはラット下垂体由来の腫瘍細胞を血清を含まない培地
で培養することに成功している[ネイチャ(Ｎature)、第
２５９巻、第１３２頁〜第１３４頁(１９７６年)参
照]。彼らは、培地に動物血清を添加する代わりに、数
種の既知のホルモン、トランスフェリンおよび細胞成長
因子として発見されたソマトメジンＡを用いた。現在、
新しい細胞成長因子が次々に発見され、それらを用いて
細胞の無血清培養の試みがなされている[例えば、日本
組織培養学会編「細胞成長因子」(朝倉書店、１９８４年
発行)参照]。
【０００４】上記のように無血清培養の試みがなされて
いるが、いままで知られている動物細胞の無血清培養法
にはいくつかの問題点がある。まず第一に、無血清培地
に添加されるホルモンあるいは細胞成長因子の種類が細
胞の種類によって異なることである。さらに、使用され
るホルモンあるいは細胞成長因子は、動物の組織や血液
から分離されたりあるいは遺伝子操作の技術で製造され
るため、極めて高価である。このため、現在細胞培養に
よる工業的な有用物質の生産には限界がある。
いるが、いままで知られている動物細胞の無血清培養法
にはいくつかの問題点がある。まず第一に、無血清培地
に添加されるホルモンあるいは細胞成長因子の種類が細
胞の種類によって異なることである。さらに、使用され
るホルモンあるいは細胞成長因子は、動物の組織や血液
から分離されたりあるいは遺伝子操作の技術で製造され
るため、極めて高価である。このため、現在細胞培養に
よる工業的な有用物質の生産には限界がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】この発明は、動物細胞
の無血清培養に有用な培地を、簡便な方法により、安価
かつ多量に提供するためになされたものである。
の無血清培養に有用な培地を、簡便な方法により、安価
かつ多量に提供するためになされたものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】即ちこの発明は、ラット
上皮系細胞株を無血清培地で培養して得られる培養上清
を含有する無血清培養用培地に関する。
上皮系細胞株を無血清培地で培養して得られる培養上清
を含有する無血清培養用培地に関する。
【０００７】ラット上皮系細胞株としては、無血清培地
で増殖するものであればいずれでも使用可能であり、例
えば、１８．５４ＳＦ細胞[エンドクリノロジー(Ｅndoc
rinology)、第１０４巻、第１７６５頁〜第１７７３頁
参照]、ＲＬＣ−１６(理研ジーンバンク番号ＲＣＢ０６
９)、ＧＨ1細胞(ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８２)等が挙げら
れる。
で増殖するものであればいずれでも使用可能であり、例
えば、１８．５４ＳＦ細胞[エンドクリノロジー(Ｅndoc
rinology)、第１０４巻、第１７６５頁〜第１７７３頁
参照]、ＲＬＣ−１６(理研ジーンバンク番号ＲＣＢ０６
９)、ＧＨ1細胞(ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８２)等が挙げら
れる。
【０００８】本発明による無血清培養用培地の必須成分
である培養上清は、上記のラット上皮系細胞株を無血清
培地で培養することによって調製される。このように目
的に用いられる培地としては、栄養源(例えば、各種ア
ミノ酸、グルコース等)および微量要素(例えば、微量金
属、ホルモン等)を含む培地、例えば、ＲＰＭＩ １６４
０、ＭＥＭ、ＭＣＤＢ １５３、ＣＦ１２等が挙げられ
る。これらの基本培地は、培養するラット上皮系細胞株
の種類および該培養によって得られる培養上清を含有す
る無血清培地を用いて培養する細胞の種類等に応じて適
宜選定すればよい。例えば、ラット上皮系細胞株がＲＬ
Ｃ−１６であり、培養上清含有培地で培養する細胞がラ
ット表皮角化細胞の場合には、ＣＦ１２培地が好適であ
る。
である培養上清は、上記のラット上皮系細胞株を無血清
培地で培養することによって調製される。このように目
的に用いられる培地としては、栄養源(例えば、各種ア
ミノ酸、グルコース等)および微量要素(例えば、微量金
属、ホルモン等)を含む培地、例えば、ＲＰＭＩ １６４
０、ＭＥＭ、ＭＣＤＢ １５３、ＣＦ１２等が挙げられ
る。これらの基本培地は、培養するラット上皮系細胞株
の種類および該培養によって得られる培養上清を含有す
る無血清培地を用いて培養する細胞の種類等に応じて適
宜選定すればよい。例えば、ラット上皮系細胞株がＲＬ
Ｃ−１６であり、培養上清含有培地で培養する細胞がラ
ット表皮角化細胞の場合には、ＣＦ１２培地が好適であ
る。
【０００９】上記の培養上清を調製する培養操作は、当
初から血清を含有しない上記の基本培地を用いておこな
ってもよいが、当初は、血清、例えば、牛胎児血清を約
３％以上添加した培地を使用し、血清濃度を経時的(通
常、１日以上の間隔)に順次低減させてゆき、最終的に
約０．５％以下になった時点で、血清を全く含有しない
当該基本培地で置換した後、培養を続行するのが好まし
い。この場合、血清濃度の低減率は通常、約１／２〜１
／３である。また、培養は、通常炭酸ガスを約５％含有
する空気中において、約３７℃でおこない、培養上清は
連続的または不連続的に採取され、低温または凍結状態
で保存される。
初から血清を含有しない上記の基本培地を用いておこな
ってもよいが、当初は、血清、例えば、牛胎児血清を約
３％以上添加した培地を使用し、血清濃度を経時的(通
常、１日以上の間隔)に順次低減させてゆき、最終的に
約０．５％以下になった時点で、血清を全く含有しない
当該基本培地で置換した後、培養を続行するのが好まし
い。この場合、血清濃度の低減率は通常、約１／２〜１
／３である。また、培養は、通常炭酸ガスを約５％含有
する空気中において、約３７℃でおこない、培養上清は
連続的または不連続的に採取され、低温または凍結状態
で保存される。
【００１０】本発明による無血清培養用培地は、上記の
ようにして得られる培養上清を、無血清培養用の基本培
地、例えば、上述のＲＰＭＩ １６４培地やＭＣＤＢ １
５３培地等に適宜添加することによって調製される。培
養上清の添加量は特に限定的ではないが、通常は３〜３
０容量％、好ましくは５〜２０容量％であり、３容量よ
りも少ない場合には、十分な増殖効果は得難い。
ようにして得られる培養上清を、無血清培養用の基本培
地、例えば、上述のＲＰＭＩ １６４培地やＭＣＤＢ １
５３培地等に適宜添加することによって調製される。培
養上清の添加量は特に限定的ではないが、通常は３〜３
０容量％、好ましくは５〜２０容量％であり、３容量よ
りも少ない場合には、十分な増殖効果は得難い。
【００１１】本発明による無血清培養用培地には、上記
の培養上清や栄養源等のほかに、所望により、細胞生育
補助成分を適宜配合してもよい。この種の配合成分とし
ては、上皮成長因子(ＥＧＦ)、インスリン、ハイドロコ
ルチゾン、ステロイドホルモン、トランスフェリン、ア
ルブミンおよび下垂体抽出物等が例示され、これらは２
種以上併用してもよい。
の培養上清や栄養源等のほかに、所望により、細胞生育
補助成分を適宜配合してもよい。この種の配合成分とし
ては、上皮成長因子(ＥＧＦ)、インスリン、ハイドロコ
ルチゾン、ステロイドホルモン、トランスフェリン、ア
ルブミンおよび下垂体抽出物等が例示され、これらは２
種以上併用してもよい。
【００１２】
【実施例】以下、本発明を実施例によって説明する。実施例１ ラット上皮系細胞株ＲＬＣ−１６細胞を、牛胎児血清１
０％含有ＣＦ１２培地で培養し、これを多糖ゲル粒子
(サイトデックス３; ファルマシアファインケミカル社
市販品)に接着させた後、３lのガラス培養器で浮遊培養
した。毎日培養液の半分を捨て、代りに牛胎児血清を含
まない培地を添加することにより、培地の牛胎児血清濃
度を順次減らし、１週間後に牛胎児血清を含まないＣＦ
１２培地に置き換えた。この状態で培養を継続し、その
培養上清を連続的に回収し−２０℃で保存した。
０％含有ＣＦ１２培地で培養し、これを多糖ゲル粒子
(サイトデックス３; ファルマシアファインケミカル社
市販品)に接着させた後、３lのガラス培養器で浮遊培養
した。毎日培養液の半分を捨て、代りに牛胎児血清を含
まない培地を添加することにより、培地の牛胎児血清濃
度を順次減らし、１週間後に牛胎児血清を含まないＣＦ
１２培地に置き換えた。この状態で培養を継続し、その
培養上清を連続的に回収し−２０℃で保存した。
【００１３】実施例２ ラット上皮系細胞株ＧＨ1細胞をプラスチック製フラス
コ内で牛胎児血清を１０％含むダルベッコ改変イーグル
培地(ＤＭＥ培地)で培養し、実施例１に準じて、最終的
に牛胎児血清を含まないＤＭＥ培地に置き換えた。フラ
スコ中の培地の半分を毎日新しいものに置き換え、その
際得られる培養上清を凍結し保存した。
コ内で牛胎児血清を１０％含むダルベッコ改変イーグル
培地(ＤＭＥ培地)で培養し、実施例１に準じて、最終的
に牛胎児血清を含まないＤＭＥ培地に置き換えた。フラ
スコ中の培地の半分を毎日新しいものに置き換え、その
際得られる培養上清を凍結し保存した。
【００１４】実施例３ ラット胎児の表皮を分離し、ディスパーゼおよびトリプ
シンで処理して表皮角化細胞を分離した。この細胞をＴ
−２５フラスコ(細胞接着面２５cm2)中ＫＧＭ培地(倉敷
紡績株式会社製)で培養した。Ｔ−２５フラスコ２個各
々に得られた細胞９４万個を接種し、１つはＭＣＤＢ
１５３培地で、他方は実施例１で得られたＲＬＣ−１６
細胞の培養上清を２５％含むＭＣＤＢ １５３培地で培
養した。７日間培養した細胞数を測定したところ、ＲＬ
Ｃ−１６細胞の培養上清を含まない培地での培養では細
胞数は１１万個であり、細胞は増殖するよりむしろ死滅
していた。一方、ＲＬＣ−１６細胞の培養上清を含む培
地では、細胞数５０６万個となっており極めて良好な増
殖を示した。
シンで処理して表皮角化細胞を分離した。この細胞をＴ
−２５フラスコ(細胞接着面２５cm2)中ＫＧＭ培地(倉敷
紡績株式会社製)で培養した。Ｔ−２５フラスコ２個各
々に得られた細胞９４万個を接種し、１つはＭＣＤＢ
１５３培地で、他方は実施例１で得られたＲＬＣ−１６
細胞の培養上清を２５％含むＭＣＤＢ １５３培地で培
養した。７日間培養した細胞数を測定したところ、ＲＬ
Ｃ−１６細胞の培養上清を含まない培地での培養では細
胞数は１１万個であり、細胞は増殖するよりむしろ死滅
していた。一方、ＲＬＣ−１６細胞の培養上清を含む培
地では、細胞数５０６万個となっており極めて良好な増
殖を示した。
【００１５】実施例４ 実施例３と同様の方法でラット表皮角化細胞を培養し
た。ＭＣＤＢ １５３培地に１％、３％、１０％または
３０％のＲＬＣ−１６細胞の培養上清を１％、３％、１
０％または３０％添加して培養したところ、１％添加で
は細胞の増殖は無かったが、３％以上の添加では良好な
増殖が認められた。
た。ＭＣＤＢ １５３培地に１％、３％、１０％または
３０％のＲＬＣ−１６細胞の培養上清を１％、３％、１
０％または３０％添加して培養したところ、１％添加で
は細胞の増殖は無かったが、３％以上の添加では良好な
増殖が認められた。
【００１６】実施例５ ラット表皮角化細胞を、実施例１に準じて培養した。培
地としてＭＣＤＢ１５３培地とＫＤＭ培地(倉敷紡績株
式会社製)を等量混合し、これに実施例２で得られたＧ
Ｈ1細胞の培養上清を１０％添加したものを用いた。こ
の結果、７日間の培養で細胞数は６倍となった。
地としてＭＣＤＢ１５３培地とＫＤＭ培地(倉敷紡績株
式会社製)を等量混合し、これに実施例２で得られたＧ
Ｈ1細胞の培養上清を１０％添加したものを用いた。こ
の結果、７日間の培養で細胞数は６倍となった。
【００１７】実施例６ ウサギ角膜より分離したウサギ角膜上皮細胞１万個を径
３cmのプラスチックシャーレに接種した。この細胞をイ
ンスリン５μg／mlおよびハイドロコルチゾン０．５μg
／mlを含むＭＣＤＢ １５３培地で培養した。ＧＨ1細胞
の培養上清を３０％添加して培養したところ、６日目に
は細胞数は４万個となった。一方、培養上清を添加しな
い場合には、細胞は増殖しなかった。
３cmのプラスチックシャーレに接種した。この細胞をイ
ンスリン５μg／mlおよびハイドロコルチゾン０．５μg
／mlを含むＭＣＤＢ １５３培地で培養した。ＧＨ1細胞
の培養上清を３０％添加して培養したところ、６日目に
は細胞数は４万個となった。一方、培養上清を添加しな
い場合には、細胞は増殖しなかった。
【００１８】
【発明の効果】本発明による無血清培養用培地は、簡便
な方法によって安価かつ多量に製造できる培地であっ
て、ヒトを含む動物の多くの培養細胞ならびに初代培養
細胞の無血清培養に使用し得るが、上皮系の初代培養細
胞には特に高い増殖効果を示し、例えば、このようにし
て培養された表皮細胞は創傷、火傷等の治療に使用し得
る。
な方法によって安価かつ多量に製造できる培地であっ
て、ヒトを含む動物の多くの培養細胞ならびに初代培養
細胞の無血清培養に使用し得るが、上皮系の初代培養細
胞には特に高い増殖効果を示し、例えば、このようにし
て培養された表皮細胞は創傷、火傷等の治療に使用し得
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山本 良平 大阪府寝屋川市下木田町14番５号 倉敷紡 績株式会社技術研究所内 (72)発明者 西野 豊和 大阪府寝屋川市下木田町14番５号 倉敷紡 績株式会社技術研究所内 (72)発明者 坂井 史明 大阪府寝屋川市下木田町14番５号 倉敷紡 績株式会社技術研究所内 (72)発明者 木村 茂樹 愛知県西春日井郡西春町大字九之坪西城屋 敷51 天野製薬株式会社中央研究所内
Claims (4)
- 【請求項１】 ラット上皮系細胞株を無血清培地で培養
して得られる培養上清を含有する無血清培養用培地。 - 【請求項２】 上皮成長因子、インスリン、ハイドロコ
ルチゾン、ステロイドホルモン、トランスフェリン、ア
ルブミンおよび下垂体抽出物から成る群から選択される
１種もしくは２種以上の成分を含有する請求項１記載の
培地。 - 【請求項３】 請求項１または２記載の培地を用いてお
こなう動物の上皮系初代培養細胞の無血清培養法。 - 【請求項４】 ラット上皮系細胞株を、血清含有培地を
用いて、該培地の血清濃度を経時的に順次低減させなが
ら培養し、血清濃度が０．５％以下になった時点で血清
不含培地で前記培地を置換した後、該無血清培地を用い
る該細胞株の培養を継続することを含む、培養上清の製
造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3066079A JPH05123167A (ja) | 1991-03-29 | 1991-03-29 | 無血清培養用培地 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3066079A JPH05123167A (ja) | 1991-03-29 | 1991-03-29 | 無血清培養用培地 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05123167A true JPH05123167A (ja) | 1993-05-21 |
Family
ID=13305489
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3066079A Pending JPH05123167A (ja) | 1991-03-29 | 1991-03-29 | 無血清培養用培地 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05123167A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010046058A (ja) * | 2008-07-24 | 2010-03-04 | Two Cells Co Ltd | 治療用培養細胞の製造方法 |
-
1991
- 1991-03-29 JP JP3066079A patent/JPH05123167A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010046058A (ja) * | 2008-07-24 | 2010-03-04 | Two Cells Co Ltd | 治療用培養細胞の製造方法 |
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