JPH05112524A - ヒドロキシプロリン誘導体の精製法 - Google Patents
ヒドロキシプロリン誘導体の精製法Info
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- JPH05112524A JPH05112524A JP27299291A JP27299291A JPH05112524A JP H05112524 A JPH05112524 A JP H05112524A JP 27299291 A JP27299291 A JP 27299291A JP 27299291 A JP27299291 A JP 27299291A JP H05112524 A JPH05112524 A JP H05112524A
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- hydroxyproline
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- diethyl ether
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Abstract
(57)【要約】
【目的】４−ヒドロキシプロリン含有ペプチドの化学的
合成を可能とする、アミノ基及びヒドロキシ基が保護さ
れた４−ヒドロキシプロリンの活性エステル誘導体の精
製法を提供する。 【構成】シリカゲルをジエチルエーテルを用いてカラム
（内径３０×長さ３００ｍｍ）に充填する。次いで、粗
精製の非結晶状のFmoc-Hyp(t-Bu)-ODhbtをエーテルに溶
かし、この溶解液を上記のカラムに負荷し、窒素ガス加
圧下にジエチルエーテルを約３０分かけて流す。流出液
を分取し、各分画液中の成分が単一であることをシリカ
ゲル薄層クロマトグラフィーで確認する。目的物を含む
分画を集め、減圧下にエーテルを留去し、デシケータ
中、減圧下に乾燥して、非結晶固体状の精製物（収率：
７４．９％）を得る。
合成を可能とする、アミノ基及びヒドロキシ基が保護さ
れた４−ヒドロキシプロリンの活性エステル誘導体の精
製法を提供する。 【構成】シリカゲルをジエチルエーテルを用いてカラム
（内径３０×長さ３００ｍｍ）に充填する。次いで、粗
精製の非結晶状のFmoc-Hyp(t-Bu)-ODhbtをエーテルに溶
かし、この溶解液を上記のカラムに負荷し、窒素ガス加
圧下にジエチルエーテルを約３０分かけて流す。流出液
を分取し、各分画液中の成分が単一であることをシリカ
ゲル薄層クロマトグラフィーで確認する。目的物を含む
分画を集め、減圧下にエーテルを留去し、デシケータ
中、減圧下に乾燥して、非結晶固体状の精製物（収率：
７４．９％）を得る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、４−ヒドロキシプロリ
ン（Ｈｙｐとも略す）含有ペプチドの化学的合成を可能
とする、アミノ基及びヒドロキシ基が保護された４−ヒ
ドロキシプロリンの活性エステル誘導体の精製法に関す
る。
ン（Ｈｙｐとも略す）含有ペプチドの化学的合成を可能
とする、アミノ基及びヒドロキシ基が保護された４−ヒ
ドロキシプロリンの活性エステル誘導体の精製法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】イ貝、フジツボ等の貝類の分泌する接着
性タンパク質はポリテトラフロオロエチレン等の低エネ
ルギー表面に対して強い接着力をもっている。この接着
性タンパク質に豊富に含まれている構成アミノ酸の一つ
は４−ヒドロキシプロリンで、４−ヒドロキシプロリン
は接着機構に深く関与していると推定されている。ま
た、４−ヒドロキシプロリンは高等動物の神経に生理活
性を示すペプチド、例えば海ヘビの神経毒のペプチド等
にも多量含まれている。そのため、４−ヒドロキシプロ
リンを含有するペプチドは医薬品への応用も期待され
る。このように、４−ヒドロキシプロリンを含むペプチ
ドを通常のアミノ酸を含むペプチドと同様に化学的に合
成する技術は新しい接着剤や医薬品を開発する上で強く
望まれていた。
性タンパク質はポリテトラフロオロエチレン等の低エネ
ルギー表面に対して強い接着力をもっている。この接着
性タンパク質に豊富に含まれている構成アミノ酸の一つ
は４−ヒドロキシプロリンで、４−ヒドロキシプロリン
は接着機構に深く関与していると推定されている。ま
た、４−ヒドロキシプロリンは高等動物の神経に生理活
性を示すペプチド、例えば海ヘビの神経毒のペプチド等
にも多量含まれている。そのため、４−ヒドロキシプロ
リンを含有するペプチドは医薬品への応用も期待され
る。このように、４−ヒドロキシプロリンを含むペプチ
ドを通常のアミノ酸を含むペプチドと同様に化学的に合
成する技術は新しい接着剤や医薬品を開発する上で強く
望まれていた。
【０００３】アミノ酸を原料として化学合成法でペプチ
ドを合成する場合、脱水縮合反応に関与しないアミノ酸
の主鎖のアミノ基及びカルボキシル基、側鎖のアミノ
基、カルボキシル基、ヒドロキシ基等の官能基を種々の
保護基を用いて保護し、必要に応じて中間生成物から保
護基を外して（脱保護）、その後の反応に関与させるこ
とが必要である。脱水縮合反応に関与しないアミノ基、
カルボキシル基又はヒドロキシ基等の官能基を保護した
アミノ酸と、脱水縮合反応に関与しないアミノ基、カル
ボキシル基又はヒドロキシ基等の官能基を保護した他の
アミノ酸を脱水縮合反応（ペプチド結合）させる場合
は、通常、活性エステル法と呼ばれる方法が用いられ
る。
ドを合成する場合、脱水縮合反応に関与しないアミノ酸
の主鎖のアミノ基及びカルボキシル基、側鎖のアミノ
基、カルボキシル基、ヒドロキシ基等の官能基を種々の
保護基を用いて保護し、必要に応じて中間生成物から保
護基を外して（脱保護）、その後の反応に関与させるこ
とが必要である。脱水縮合反応に関与しないアミノ基、
カルボキシル基又はヒドロキシ基等の官能基を保護した
アミノ酸と、脱水縮合反応に関与しないアミノ基、カル
ボキシル基又はヒドロキシ基等の官能基を保護した他の
アミノ酸を脱水縮合反応（ペプチド結合）させる場合
は、通常、活性エステル法と呼ばれる方法が用いられ
る。
【０００４】活性エステル法としてはジシクロヘキシル
カルボジイミド等のカップリング試薬の存在下にペンタ
フルオロフェノール又は式（II）
カルボジイミド等のカップリング試薬の存在下にペンタ
フルオロフェノール又は式（II）
【化２】 で表される３−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オ
キソベンゾトリアジン（Ｄｈｂｔ−ＯＨと略す）等の電
子吸引性化合物を反応させる方法が知られている。
キソベンゾトリアジン（Ｄｈｂｔ−ＯＨと略す）等の電
子吸引性化合物を反応させる方法が知られている。
【０００５】電子吸引性化合物としてペンタフルオロフ
ェノールを用いる方法は、キスファルディー（L. Kisfa
ludy）らによって固相ペプチド合成に適用された（Synt
hesis,1983,325;同、1986,303）。これによると、主鎖
のアミノ基をｔ−ブトキシカルボニル基又はFmoc基で保
護したのち、ジオキサン又は酢酸エチル等の溶媒中、等
モルのペンタフルオロフェノール及びジシクロヘキシル
カルボジイミドと反応させ、アミノ酸のペンタフルオロ
フェニル誘導体を得ている。
ェノールを用いる方法は、キスファルディー（L. Kisfa
ludy）らによって固相ペプチド合成に適用された（Synt
hesis,1983,325;同、1986,303）。これによると、主鎖
のアミノ基をｔ−ブトキシカルボニル基又はFmoc基で保
護したのち、ジオキサン又は酢酸エチル等の溶媒中、等
モルのペンタフルオロフェノール及びジシクロヘキシル
カルボジイミドと反応させ、アミノ酸のペンタフルオロ
フェニル誘導体を得ている。
【０００６】また、電子吸引性化合物としてＤｈｂｔを
用いる方法は、ケーニッヒ（W.Koenig）らによって開発
され（Chem. Ber., 1970, 103, 2034-2040）、アセルト
ン（E. Atherton）ら、カメロン（L. Cameron）ら、ゴ
ッダード（P. Goddard）らによって、固相ペプチド合成
に適用された（J. Chem. Soc. Chem. Commun.,1986, p.
1763；同、1987, p.270；同、1988, p.1025）。これら
によると、主鎖のアミノ基をｔ−ブトキシカルボニル基
又はFmoc基で保護したのち、テトラヒドロフラン中で等
モルのＤｈｂｔ−ＯＨ及びジシクロヘキシルカルボジイ
ミドを反応させてアミノ酸のＤｈｂｔ誘導体を得てい
る。
用いる方法は、ケーニッヒ（W.Koenig）らによって開発
され（Chem. Ber., 1970, 103, 2034-2040）、アセルト
ン（E. Atherton）ら、カメロン（L. Cameron）ら、ゴ
ッダード（P. Goddard）らによって、固相ペプチド合成
に適用された（J. Chem. Soc. Chem. Commun.,1986, p.
1763；同、1987, p.270；同、1988, p.1025）。これら
によると、主鎖のアミノ基をｔ−ブトキシカルボニル基
又はFmoc基で保護したのち、テトラヒドロフラン中で等
モルのＤｈｂｔ−ＯＨ及びジシクロヘキシルカルボジイ
ミドを反応させてアミノ酸のＤｈｂｔ誘導体を得てい
る。
【０００７】いっぽう、４−ヒドロキシプロリンの主鎖
のアミノ基へのFmoc基の導入は、ラパトサニス（L. Lap
atsanis）らによって初めてなされた（Synthesis, 198
3, 671-673）。また、４−ヒドロキシプロリン、セリン
及びスレオニン等の側鎖のヒドロキシ基はベンジル基、
置換ベンジル基及びｔｅｒｔ−ブチル基等の保護基で保
護されることが知られている（E. Wunsch et al:Chem.
Ber.,1968,101,3659）。
のアミノ基へのFmoc基の導入は、ラパトサニス（L. Lap
atsanis）らによって初めてなされた（Synthesis, 198
3, 671-673）。また、４−ヒドロキシプロリン、セリン
及びスレオニン等の側鎖のヒドロキシ基はベンジル基、
置換ベンジル基及びｔｅｒｔ−ブチル基等の保護基で保
護されることが知られている（E. Wunsch et al:Chem.
Ber.,1968,101,3659）。
【０００８】いっぽう、合成物を精製する方法として
は、吸着剤を充填したカラムクロマトグラフィーによる
方法や再結晶による方法が一般的にはよく使用される。
は、吸着剤を充填したカラムクロマトグラフィーによる
方法や再結晶による方法が一般的にはよく使用される。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】しかし、アミノ基及び
ヒドロキシ基が保護された４−ヒドロキシプロリンのＤ
ｈｂｔやペンタフルオロフェノール等の活性エステルは
反応性が高く、また結晶化しにくい物質である。そのた
め、再結晶による方法はとれず、また、操作に長時間を
要する通常のカラムクロマトグラフィーの方法では操作
中に目的物が分解し、収量が著しく低下する。本発明
は、化学的に合成した、アミノ基及びヒドロキシ基が保
護された４−ヒドロキシプロリンの活性エステル誘導体
を、分解・損失させることなく、短時間に精製・分離す
る方法を提供するものである。
ヒドロキシ基が保護された４−ヒドロキシプロリンのＤ
ｈｂｔやペンタフルオロフェノール等の活性エステルは
反応性が高く、また結晶化しにくい物質である。そのた
め、再結晶による方法はとれず、また、操作に長時間を
要する通常のカラムクロマトグラフィーの方法では操作
中に目的物が分解し、収量が著しく低下する。本発明
は、化学的に合成した、アミノ基及びヒドロキシ基が保
護された４−ヒドロキシプロリンの活性エステル誘導体
を、分解・損失させることなく、短時間に精製・分離す
る方法を提供するものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、化学合成
により得られた反応液中の式（Ｉ）で表される、アミノ
基及びヒドロキシ基が保護された４−ヒドロキシプロリ
ンの活性エステル誘導体を、担体を充填したカラムで精
製する方法を種々検討したところ、加圧下で、短時間に
目的物を展開、溶出すれば、ほとんど分解・損失するこ
とはなく、純度の高い、アミノ基及びヒドロキシ基が保
護された４−ヒドロキシプロリンの活性エステル誘導体
が得られることを見出し、本発明を完成した。すなわ
ち、本発明は、担体を充填したカラムに被精製物を負荷
したのち、加圧下に展開することを特徴とする、下記の
一般式（Ｉ）
により得られた反応液中の式（Ｉ）で表される、アミノ
基及びヒドロキシ基が保護された４−ヒドロキシプロリ
ンの活性エステル誘導体を、担体を充填したカラムで精
製する方法を種々検討したところ、加圧下で、短時間に
目的物を展開、溶出すれば、ほとんど分解・損失するこ
とはなく、純度の高い、アミノ基及びヒドロキシ基が保
護された４−ヒドロキシプロリンの活性エステル誘導体
が得られることを見出し、本発明を完成した。すなわ
ち、本発明は、担体を充填したカラムに被精製物を負荷
したのち、加圧下に展開することを特徴とする、下記の
一般式（Ｉ）
【化３】 〔式（Ｉ）中、Ｑは酸素原子又は硫黄原子を示し、Ｒは
直鎖状もしくは分枝状の低級アルキル基、アリール基、
ｐ−ニトロフェニル基、１，３，５−トリクロロフェニ
ル基、ペンタクロロフェニル基、ペンタフルオロフェニ
ル基、２，４−ジニトロフェニル基、スクシンイミディ
ル基、フタルイミディル基、ピペリジニル基、５−ノル
ボルネン−２，３−ジカルボキシイミディル基、８−キ
ノリル基、２−ピリジル基、ｏ−ヒドロキシフェニル
基、ｏ−（フェナンシルオキシ）−フェニル基、１−ベ
ンゾトリアジル基又は３，４−ジヒドロ−４−オキソ−
１，２，３−ベンゾトリアゾール−３−イル基を示す〕
で表されるアミノ基及びヒドロキシ基が保護された４−
ヒドロキシプロリンの活性エステル誘導体の精製法に関
する。
直鎖状もしくは分枝状の低級アルキル基、アリール基、
ｐ−ニトロフェニル基、１，３，５−トリクロロフェニ
ル基、ペンタクロロフェニル基、ペンタフルオロフェニ
ル基、２，４−ジニトロフェニル基、スクシンイミディ
ル基、フタルイミディル基、ピペリジニル基、５−ノル
ボルネン−２，３−ジカルボキシイミディル基、８−キ
ノリル基、２−ピリジル基、ｏ−ヒドロキシフェニル
基、ｏ−（フェナンシルオキシ）−フェニル基、１−ベ
ンゾトリアジル基又は３，４−ジヒドロ−４−オキソ−
１，２，３−ベンゾトリアゾール−３−イル基を示す〕
で表されるアミノ基及びヒドロキシ基が保護された４−
ヒドロキシプロリンの活性エステル誘導体の精製法に関
する。
【００１１】本発明で用いられる担体としては、有機物
の精製によく用いられるシリカゲル、アルミナ等の無機
質吸着剤があるが、これらの中でシリカゲル（弱酸性）
が最も好ましい。担体は、通常のカラムをつくる方法で
先ず常圧でカラムに充填する。次に、そのカラムに目的
物を含む反応液を負荷し、そののち窒素、ヘリウム等の
不活性ガスで圧力をかけながら、展開溶媒を流す。
の精製によく用いられるシリカゲル、アルミナ等の無機
質吸着剤があるが、これらの中でシリカゲル（弱酸性）
が最も好ましい。担体は、通常のカラムをつくる方法で
先ず常圧でカラムに充填する。次に、そのカラムに目的
物を含む反応液を負荷し、そののち窒素、ヘリウム等の
不活性ガスで圧力をかけながら、展開溶媒を流す。
【００１２】展開溶媒としては、酢酸エチル、ジエチル
エーテル、ｎ−ヘキサン、あるいはこれらの２種以上の
混合液を用いることができる。
エーテル、ｎ−ヘキサン、あるいはこれらの２種以上の
混合液を用いることができる。
【００１３】このとき、窒素、ヘリウム等の不活性ガス
によって加える圧力は、目的物が１０分〜２時間、好ま
しくは２０分〜１時間の時間内に目的物が溶出されるよ
うに、数気圧以内、通常は０．５〜２気圧とするのがよ
い。目的物が溶出されるまでに要する時間が１０分未満
では目的物と不純物の分離が不十分であり、２時間を越
えると目的物の分解を無視できない。
によって加える圧力は、目的物が１０分〜２時間、好ま
しくは２０分〜１時間の時間内に目的物が溶出されるよ
うに、数気圧以内、通常は０．５〜２気圧とするのがよ
い。目的物が溶出されるまでに要する時間が１０分未満
では目的物と不純物の分離が不十分であり、２時間を越
えると目的物の分解を無視できない。
【００１４】目的物である式（Ｉ）のアミノ基及びヒド
ロキシ基が保護された４−ヒドロキシプロリンの活性エ
ステル誘導体を含む液は、Ｎ−（９−フルオレニルメト
キシカルボニル）−４−ヒドロキシプロリン（Fmoc−ヒ
ドロキシプロリン）を溶媒中、カップリング試薬の存在
下に電子吸引性化合物を加え、−３０℃〜０℃で１〜２
４時間撹拌し、反応させて調製した式（III）
ロキシ基が保護された４−ヒドロキシプロリンの活性エ
ステル誘導体を含む液は、Ｎ−（９−フルオレニルメト
キシカルボニル）−４−ヒドロキシプロリン（Fmoc−ヒ
ドロキシプロリン）を溶媒中、カップリング試薬の存在
下に電子吸引性化合物を加え、−３０℃〜０℃で１〜２
４時間撹拌し、反応させて調製した式（III）
【化４】 で表されるＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニ
ル）−４−ヒドロキシプロリン誘導体にイソブチレンを
触媒量の硫酸の存在下で反応させて得られる。
ル）−４−ヒドロキシプロリン誘導体にイソブチレンを
触媒量の硫酸の存在下で反応させて得られる。
【００１５】この際に用いるFmoc−ヒドロキシプロリン
は、ラパトサニス（L. Lapatsanis）らの方法（Synthes
is, 1983, 671-673）によっても得られるが、アンモニ
ア又はアミン類でｐＨを８〜１２に保ちつつ、４−ヒド
ロキシプロリン溶液にFmoc化剤のＮ−（９−フルオレニ
ルメチル）−Ｎ−スクシンイミディルカーボネートを反
応させ、反応液から有機溶媒抽出、ｐＨ調整、再結晶等
によって得てもよい。
は、ラパトサニス（L. Lapatsanis）らの方法（Synthes
is, 1983, 671-673）によっても得られるが、アンモニ
ア又はアミン類でｐＨを８〜１２に保ちつつ、４−ヒド
ロキシプロリン溶液にFmoc化剤のＮ−（９−フルオレニ
ルメチル）−Ｎ−スクシンイミディルカーボネートを反
応させ、反応液から有機溶媒抽出、ｐＨ調整、再結晶等
によって得てもよい。
【００１６】
実施例１ Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−４−ｔ
ｅｒｔ−ブトキシプロリン−３，４−ジヒドロ−４−オ
キソ−１，２，３−ベンゾトリアジン−３−イル エス
テル〔Fmoc-Hyp(t-Bu)-ODhbt〕の合成及び精製 Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−４
−ヒドロキシプロリン３，４−ジヒドロ−４−オキソ−
１，２，３−ベンゾトリアジン−３−イル エステル８.
１ｇ（１６．２ミリモル）を容器にとり、塩化メチレン
４０ｍｌに溶かし、ドライアイス−メタノールで冷却し
ながらイソブチレン１８．２ｇ（２０倍当量）及び濃硫
酸０．２ｍｌを加えた。容器を密封し、温度を室温とし
て、２日間撹拌した。減圧下にイソブチレン及び塩化メ
チレンを除いたのち、これに食塩水７０ｍｌ及びエチル
エーテル１００ｍｌを加えて振り混ぜ、エーテル層を回
収した。このエーテル抽出を更に２回（７０ｍｌ、５０
ｍｌ）繰り返した。エーテル抽出液を合わせて、無水硫
酸ナトリウム上で乾燥し、減圧下にエーテルを留去した
のち、デシケータ中、減圧下に乾燥して、非結晶固体状
の生成物８.３ｇを得た。これをシリカゲル（メルク社
製のキーゼルグール６０Ｆ254）の薄層クロマトグラフ
ィー（展開溶媒：ジエチルエーテル）で分析したところ
Ｒｆ＝０．７９の目的生成物のほかに、未反応物のスポ
ットも検出された。
ｅｒｔ−ブトキシプロリン−３，４−ジヒドロ−４−オ
キソ−１，２，３−ベンゾトリアジン−３−イル エス
テル〔Fmoc-Hyp(t-Bu)-ODhbt〕の合成及び精製 Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−４
−ヒドロキシプロリン３，４−ジヒドロ−４−オキソ−
１，２，３−ベンゾトリアジン−３−イル エステル８.
１ｇ（１６．２ミリモル）を容器にとり、塩化メチレン
４０ｍｌに溶かし、ドライアイス−メタノールで冷却し
ながらイソブチレン１８．２ｇ（２０倍当量）及び濃硫
酸０．２ｍｌを加えた。容器を密封し、温度を室温とし
て、２日間撹拌した。減圧下にイソブチレン及び塩化メ
チレンを除いたのち、これに食塩水７０ｍｌ及びエチル
エーテル１００ｍｌを加えて振り混ぜ、エーテル層を回
収した。このエーテル抽出を更に２回（７０ｍｌ、５０
ｍｌ）繰り返した。エーテル抽出液を合わせて、無水硫
酸ナトリウム上で乾燥し、減圧下にエーテルを留去した
のち、デシケータ中、減圧下に乾燥して、非結晶固体状
の生成物８.３ｇを得た。これをシリカゲル（メルク社
製のキーゼルグール６０Ｆ254）の薄層クロマトグラフ
ィー（展開溶媒：ジエチルエーテル）で分析したところ
Ｒｆ＝０．７９の目的生成物のほかに、未反応物のスポ
ットも検出された。
【００１７】そこで、シリカゲル６０（メルク社製）１
８０ｇをジエチルエーテルを用いて、カラム（内径３０
×長さ３００ｍｍ）に充填した。次いで、上記の非結晶
状生成物をジエチルエーテルに溶解し、この溶解液を上
記のカラムに負荷し、窒素ガス加圧（約１気圧）下にジ
エチルエーテルを流した。流出液を分取し、各分画液中
の成分が単一であることをシリカゲル薄層クロマトグラ
フィーで確認した。目的物を含む分画を集め、減圧下に
エーテルを留去し、デシケータ中、減圧下に乾燥して、
非結晶固体状の精製物６.７２ｇ（収率：７４．９％）
を得た。
８０ｇをジエチルエーテルを用いて、カラム（内径３０
×長さ３００ｍｍ）に充填した。次いで、上記の非結晶
状生成物をジエチルエーテルに溶解し、この溶解液を上
記のカラムに負荷し、窒素ガス加圧（約１気圧）下にジ
エチルエーテルを流した。流出液を分取し、各分画液中
の成分が単一であることをシリカゲル薄層クロマトグラ
フィーで確認した。目的物を含む分画を集め、減圧下に
エーテルを留去し、デシケータ中、減圧下に乾燥して、
非結晶固体状の精製物６.７２ｇ（収率：７４．９％）
を得た。
【００１８】得られた精製物の分析結果は次の通り。 高速液体クロマトグラフィー：図１ 赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ錠剤法）：図２1 Ｈ核磁気共鳴スペクトル(２５０ＭＨｚ，ｄ6−ＤＭＳ
Ｏ ，ｐｐｍ)：δ８．４〜δ８．３（ｍ，２Ｈ），δ
８．２〜δ８．１（ｍ，１Ｈ），δ８．２〜δ８．１
（ｍ，１Ｈ），δ８．０〜δ７．９（ｍ，２Ｈ），δ
７．７〜δ７．６（ｍ，２Ｈ），δ７．５〜δ７．３
（ｍ，４Ｈ），δ５．１〜δ４．８（ｍ，１Ｈ），δ
４．５〜δ４．２（ｍ，４Ｈ），δ３．７〜δ３．２
（ｍ，２Ｈ），δ２．５〜δ２．４（ｍ，２Ｈ），δ
１．２（ｄ，９Ｈ） 旋光度［α］（２５℃，ＤＭＦ，ｃ＝０.４４０ｇ／ｄ
ｌ，Ｌ＝１０.０ｃｍ）:−１０４．７２
Ｏ ，ｐｐｍ)：δ８．４〜δ８．３（ｍ，２Ｈ），δ
８．２〜δ８．１（ｍ，１Ｈ），δ８．２〜δ８．１
（ｍ，１Ｈ），δ８．０〜δ７．９（ｍ，２Ｈ），δ
７．７〜δ７．６（ｍ，２Ｈ），δ７．５〜δ７．３
（ｍ，４Ｈ），δ５．１〜δ４．８（ｍ，１Ｈ），δ
４．５〜δ４．２（ｍ，４Ｈ），δ３．７〜δ３．２
（ｍ，２Ｈ），δ２．５〜δ２．４（ｍ，２Ｈ），δ
１．２（ｄ，９Ｈ） 旋光度［α］（２５℃，ＤＭＦ，ｃ＝０.４４０ｇ／ｄ
ｌ，Ｌ＝１０.０ｃｍ）:−１０４．７２
【００１９】これらの結果から、得られた精製物は式
（IV）で表されるＮ−（９−フルオレニルメトキシカル
ボニル）−４−ｔｅｒｔ−ブトキシプロリン ３，４−
ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン
−３−イル エステルであることを確認した。
（IV）で表されるＮ−（９−フルオレニルメトキシカル
ボニル）−４−ｔｅｒｔ−ブトキシプロリン ３，４−
ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン
−３−イル エステルであることを確認した。
【化５】
【００２０】なお、高速液体クロマトグラフィーはカラ
ムとしてマイクロボンダスフェア５μＣ１８−１００Å
（３．９ｍｍ×１５０ｍｍ、ウォーターズ社製）を装着
したウォーターズ社製の６００シリーズを使用し、展開
液は水／アセトニトリル（５０：５０、容量比）から１
００％アセトニトリルへの連続濃度勾配液（カーブタイ
プ６）、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長は２５４
ｎｍで分析した。また、1Ｈ核磁気共鳴スペクトルは核
磁気共鳴装置（ブルカー社製、ＡＣ−２５０型）を用
い、赤外吸収スペクトルは赤外分析装置（日立製２７０
−５０型）により測定した。
ムとしてマイクロボンダスフェア５μＣ１８−１００Å
（３．９ｍｍ×１５０ｍｍ、ウォーターズ社製）を装着
したウォーターズ社製の６００シリーズを使用し、展開
液は水／アセトニトリル（５０：５０、容量比）から１
００％アセトニトリルへの連続濃度勾配液（カーブタイ
プ６）、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長は２５４
ｎｍで分析した。また、1Ｈ核磁気共鳴スペクトルは核
磁気共鳴装置（ブルカー社製、ＡＣ−２５０型）を用
い、赤外吸収スペクトルは赤外分析装置（日立製２７０
−５０型）により測定した。
【００２１】比較例 途中まで実施例１と同様に合成して得たFmoc-Hyp(t-Bu)
-ODhbt粗生成物２．３６ｇをシリカゲル６０（メルク社
製）を充填したカラム（内径４０ｍｍ、長さ２２５ｍ
ｍ）に負荷したのち、酢酸エチル／ｎ−ヘキサン（容量
比で２：１）を展開溶媒として、常圧で溶出した。この
とき、シリカゲル中の粗生成物はカラム内を展開するに
つれ、カラム内が黄色を帯びるように変色した。これは
Fmoc-Hyp(t-Bu)-ODhbtの分解を示すものである。展開溶
媒を６時間流し、流出液を分取し、各分画液を薄層クロ
マトグラフィーで分析したが、目的物のFmoc-Hyp(t-Bu)
-ODhbtを含む分画は単一スポットではなく、他の分解物
に起因するスポットが見られた。
-ODhbt粗生成物２．３６ｇをシリカゲル６０（メルク社
製）を充填したカラム（内径４０ｍｍ、長さ２２５ｍ
ｍ）に負荷したのち、酢酸エチル／ｎ−ヘキサン（容量
比で２：１）を展開溶媒として、常圧で溶出した。この
とき、シリカゲル中の粗生成物はカラム内を展開するに
つれ、カラム内が黄色を帯びるように変色した。これは
Fmoc-Hyp(t-Bu)-ODhbtの分解を示すものである。展開溶
媒を６時間流し、流出液を分取し、各分画液を薄層クロ
マトグラフィーで分析したが、目的物のFmoc-Hyp(t-Bu)
-ODhbtを含む分画は単一スポットではなく、他の分解物
に起因するスポットが見られた。
【００２２】
【発明の効果】本発明により、４−ヒドロキシプロリン
含有ペプチドの化学的合成を可能とする新規な、アミノ
基及びヒドロキシ基が保護された４−ヒドロキシプロリ
ンの活性エステル誘導体を提供することができた。
含有ペプチドの化学的合成を可能とする新規な、アミノ
基及びヒドロキシ基が保護された４−ヒドロキシプロリ
ンの活性エステル誘導体を提供することができた。
【図１】本発明の方法より得られたＮ−（９−フルオレ
ニルメトキシカルボニル）−４−ｔｅｒｔ−ブトキシプ
ロリン ３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−
ベンゾトリアジン−３−イル エステルの高速液体クロ
マトグラムである。
ニルメトキシカルボニル）−４−ｔｅｒｔ−ブトキシプ
ロリン ３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−
ベンゾトリアジン−３−イル エステルの高速液体クロ
マトグラムである。
【図２】本発明の方法より得られたＮ−（９−フルオレ
ニルメトキシカルボニル）−４−ｔｅｒｔ−ブトキシプ
ロリン ３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−
ベンゾトリアジン−３−イル エステルの赤外吸収スペ
クトクルである。
ニルメトキシカルボニル）−４−ｔｅｒｔ−ブトキシプ
ロリン ３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−
ベンゾトリアジン−３−イル エステルの赤外吸収スペ
クトクルである。
Claims (1)
- 【請求項１】担体を充填したカラムに被精製物を負荷し
たのち、加圧下に展開することを特徴とする、下記の一
般式（Ｉ） 【化１】 〔式（Ｉ）中、Ｑは酸素原子又は硫黄原子を示し、Ｒは
直鎖状もしくは分枝状の低級アルキル基、アリール基、
ｐ−ニトロフェニル基、１，３，５−トリクロロフェニ
ル基、ペンタクロロフェニル基、ペンタフルオロフェニ
ル基、２，４−ジニトロフェニル基、スクシンイミディ
ル基、フタルイミディル基、ピペリジニル基、５−ノル
ボルネン−２，３−ジカルボキシイミディル基、８−キ
ノリル基、２−ピリジル基、ｏ−ヒドロキシフェニル
基、ｏ−（フェナンシルオキシ）−フェニル基、１−ベ
ンゾトリアジル基又は３，４−ジヒドロ−４−オキソ−
１，２，３−ベンゾトリアゾール−３−イル基を示す〕
で表されるアミノ基及びヒドロキシ基が保護された４−
ヒドロキシプロリンの活性エステル誘導体の精製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27299291A JPH05112524A (ja) | 1991-10-22 | 1991-10-22 | ヒドロキシプロリン誘導体の精製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27299291A JPH05112524A (ja) | 1991-10-22 | 1991-10-22 | ヒドロキシプロリン誘導体の精製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05112524A true JPH05112524A (ja) | 1993-05-07 |
Family
ID=17521645
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27299291A Pending JPH05112524A (ja) | 1991-10-22 | 1991-10-22 | ヒドロキシプロリン誘導体の精製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05112524A (ja) |
-
1991
- 1991-10-22 JP JP27299291A patent/JPH05112524A/ja active Pending
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