JPH0482840A - 細菌性ショック治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、カブトガニ類（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ　ｔｒ
ｉｄｃｎ−ｔａｔｕｓ、　Ｔ、　ｇｉｇａｓ、　Ｌｉｍ
ｕｌｕｓ　ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）から抽出、単離され
たペプチドの用途に関する。具体的には、ダラム陰性細
菌性エンドトキシンに結合し、その生物学的効果を中和
するダラム陰性菌血症及び細菌性ショックの治療剤とし
て有効なペプチドに関する。

〔従来の技術〕

ダラム陰性菌による細菌性ショックは、患者に発熱、白
血球減少症、血管内凝集などの重篤な症状を引き起こす
死亡率の高い感染症である。

細菌性ショックの治療法として、まず第一に上げられる
のが、抗生物質及び合成抗菌剤による化学療法である。

ペニシリン、ストレプトマイシン、カナマイシンなど多
くの抗生物質が開発され、これらの多くはブドウ球菌な
どのダラム陽性菌及び大腸菌等のダラム陰性菌に著しい
臨床効果を示してきた。しかしながら、今日これら抗菌
物質に対する耐性菌の出現により、必ずしも有効な効果
を上げられない場合が多くなっている。

また細菌性ショックの治療法として、免疫グロブリン製
剤の投与、いわゆる抗体療法がある。この免疫グロブリ
ン製剤は、健常人または、細菌感染既応患者から血液を
採取し、既知の方法により免疫グロブリンを分画、精製
したものが用いられるが、これにはいくつかの欠点があ
る。第一に、細菌に対する抗体価が低く、十分な治療効
果が期待できない。第二に、原料を、採血された血液に
依存しているため、免疫グロブリンを大量に安定して供
給することが困難である。第三に、ヒトの血液より製造
されるので、肝炎ウィルス、エイズウィルス、Ａｄｕｌ
ｔ　Ｔ　ｃｅｌｌ　Ｌｃｕｋａｃｍｉ　ｖｉｒｕｓなど
が混入する恐れがある。最近これら問題を解決するため
に、ハイブリドーマセルラインによる、エンドトキシン
に結合するモノクローナル抗体の作製が行われているが
これにも問題はある。第一に、ヒトではないマウスまた
はラットなどのセルラインを用いた場合は、抗体がヒト
のものとは異なるため、抗体自身の抗原性が問題となる
。すなわち、−度この製剤を投与した患者が細菌性ショ
ックを再発した場合、アレルギー反応の恐れがあり再度
投与することが困難となる。第二に、ヒト由来ハイブリ
ドーマセルラインを用いた場合は、製剤中に混入するＤ
ＮＡか問題となる。すなわち、ハイブリドーマセル由来
の癌遺伝子などが製剤中に混入する危険性である。

〔発明が解決しようとしている課題〕

ダラム陰性菌による細菌性ショックの原因は、菌体の細
胞壁に存在するリポ多糖であることが判明している。リ
ポ多糖はリピドＡに糖鎖が結合した高分子化合物であり
、その生物活性の本体はリピドＡであることが証明され
ている。多種のダラム陰性菌は、多種のリポ多糖を生産
するが、これらリポ多糖は共通してリピドＡをもってい
る。そのためリピドＡと特異的に結合し、その活性を中
和するような物質の開発が望まれている。

〔課題を解決するための手段〕

このような見地から、本発明者らは、カブトガニ血球中
より抽出、精製されたペプチド類が、リピドＡと結合し
、細菌性ショック治療剤として有用であることを見出し
、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は式（Ｉ） Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−■■−Ｇｌ
ｙ−１１ｅ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ
−Ａｒｇ−Ｎｌ２（式中、■と■、■と■は、それぞれ
直接に結合している。Ａｒｇ−Ｎｌ２は、アルギニンの
カルボキシル基がアミドであることを示す。） で表されるペプチド（Ｉ）及びその薬理的に許容される
塩を有効成分として含有する細菌性ショック治療剤にあ
る。

また、本発明は式（ＩＩ） Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−■（本頁以
下余白） ■−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ
−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｎｌ２（式中、■と■、■と■は、
それぞれ直接に結合している。Ａｒｇ−Ｎｌ２は、アル
ギニンのカルボキシル基がアミドであることを示す。） で表されるペプチド（Ｉ［）及びその薬理的に許容され
る塩を有効成分として含有する細菌性ショック治療剤に
ある。

また、本発明は式（Ｉ［） Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−■■−Ｇｌ
ｙ−１１ｅ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ
−Ａｒｇ−Ｎｌ２（式中、■と■、■と■は、それぞれ
直接に結合している。Ａｒｇ−ＮＨ□は、アルギニンの
カルボキシル基がアミドであることを示す。） て表されるペプチド（Ｉ［）及びその薬理的に許容され
る塩を有効成分とする細菌性ショック治療剤ある。

また、本発明は式（ＩＶ） Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＣＹｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−■
■−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ
−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｎｌ２（式中、■と■、■と■は、
それぞれ直接に結合している。Ａｒｇ−Ｎｌ２は、アル
ギニンのカルボキシル基がアミドであることを示す。） で表されるペプチド（ＩＶ）及びその薬理的に許容され
る塩を有効成分として含有する細菌性ショック治療剤に
ある。

また、本発明は式（Ｖ） Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ＝■
■−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ
−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｎｌ２（式中、■と■、■と■は、
それぞれ直接に結合している。Ａｒｇ−Ｎｌ２は、アル
ギニンのカルボキシル基がアミドであることを示す。） で表されるペプチド（ＩＶ）及びその薬理的に許容され
る塩を有効成分として含有する細菌性ショック治療剤に
ある。

本発明にかかわるポリペプチドはいずれもカブトガニ類
（Ｌｉｍｕｌｕｓ　ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ、　Ｔａｃｈ
ｐｌｅｕｓ　ｔｒｉｄｅｎｔａｔｕｓ、　Ｔ４ｉｇａｓ
）の血球中より抽出、単離されるものである。このポリ
ペプチドのうち式（ＩＶ）のポリペプチドまたはその塩
は特願昭６３−２０３７２４号（特開平２−５３７９９
号）に、式（Ｖ）のポリペプチドまたはその塩は特願昭
６３−２４４５２２号に、式（Ｉ）のポリペプチドまた
はその塩は特願平１−８９８３０号にそれぞれその製法
が記載されている。

上記ポリペプチドのうち、式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表さ
れるポリペプチドまたはその塩は以下の方法により製造
される。

すなわち、マレーシア産カブトガニ（Ｔａｃｈｙｐｌｅ
ｕｓｇｉｇａｓ）又は日本産カブトガニ（Ｔ、　ｔｒｉ
ｄｅｎｔｕｔｕｓ）の血球に、塩化ナトリウム及びベン
ズアミジン塩酸塩を含むトリス塩酸緩衝液を加え粉砕し
、これを遠心して沈澱物を得る。これに塩酸溶液を加え
粉砕し、遠心して上澄を得る。これを５ｅｐｈａｄｅｘ
■Ｇ５０に添加して、塩酸溶液で溶出する。２８０ｎｍ
における吸光度を測定して集めた溶出区分を、コスモシ
ール０５Ｃ１８に添加しアセトニトリルの濃度を変化さ
せたトリフルオロ酢酸溶液で溶出することにより、目的
のポリペプチド（Ｉ）画分を得る。

また、本発明のポリペプチド（Ｉ）は、固相法による合
成も可能である。この方法を本発明に適用する場合、α
−アミノ基はいずれのアミノ酸に・ついてもｔｅｒｔ−
ブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）で保護し、チロ
シンの水酸基は、２，６−ジクロロベンジル基（ＣＩ２
−ＢＺＩ基）で、アルギニンのグアニジノ基はトシル基
（Ｔｏｓ基）で、それぞれ保護するのが好適である。ま
ず、Ｃ末端アミノ酸の保護誘導体をクロロメチル樹脂に
導入し、以後順次アミノ酸鎖を延長し、保護ペプチド樹
脂を合成し、これをフッ化水素で処理することにより保
護ペプチドを樹脂から切断し、同時に脱保護し、これを
還元し、以下、常法に従って合成ペプチドを得る。

得られた粗合成ペプチドは、ゲル濾過、逆相ＨＰＬＣ等
ペプチドの精製に常用される手段により精製し高純度の
ポリペプチド（Ｉ）を得る。なお、ペプチド合成に常用
される固相法については、例えば、日本生化学合綴、「
生化学実験講座（Ｉ）」蛋白質の化学、４巻、２０８〜
４９５頁、■東京化学同人発行（１９７７）、及び、泉
屋信夫ほか著、「ペプチド合成」丸善■発行（１９７５
）に記載されているメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅ
ｌｄ）等の方法に準じて行うことができる。

ポリペプチド（ＩＩ）は、Ｔｏｓｈｉｙｕｋｉ　Ｍｉｙ
ａｔａら、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｖｏｌ、１０６．
　ｐ、６６３〜６６８．　（１９８９）に記載されてい
る方法により得られる。

本発明のポリペプチド（Ｉ）〜（■）は、薬理的に許容
される塩と塩を形成することができ、例えば、その塩と
してはアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩アンモニウ
ム塩、有機アミン塩等の無機塩基、有機塩基との塩、及
び、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸、塩酸、硫酸
、硝酸、燐酸等の有機酸又は無機酸の付加塩が含まれる
。

本発明のポリペプチドの毒性は、極めて低いか又は非毒
性である。このポリペプチドを医療用抗菌剤として投与
する場合は経口投与法又は非経口的投与方法、すなわち
静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与等が好ましい。そし
て、１投与単位当りのポリペプチド使用量は０．１〜１
０００■程度である。

〔発明の効果〕

本発明のポリペプチドは、後記参考例に示すように、ダ
ラム陰性菌に対して強い抗菌作用を示し、リピドＡの生
物活性を中和することができるので細菌性ショック治療
剤としてきわめて優れたものである。この効果は、マウ
スを用いたｉｎ　ｖｉｖｏの系でも確認できた。

〔参考例〕

（１）ポリペプチド（Ｉ）の製造 マレーシア産カブトガニ（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ　ｇｉ
ｇａｓ）、又は日本産カブトガ−（Ｔ、　ｔｒｉｄｅｎ
ｔｕｔｕｓ）の血球１５ｇに５０ｍＭ塩化すトリウム及
び５ｍＭベンズアミジン塩酸塩を含む２０ｍＭ　）リス
塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）１００ｍＡ’を加え粉砕し、
４°Ｃで遠心（７５００ｒｐｍ、　４０分）して沈澱を
得た。さらにこの操作を２回くりかえし沈澱を得た。得
られた沈澱に２０ｍＭ塩酸溶液１００ｍ１を加え粉砕す
る。４°Ｃで遠心（７５００ｒｐｍ、　４０分）して上
澄を得た。沈澱には２０ｍＭ塩酸溶液１００ｍｊを加え
再度粉砕し、４℃で遠心（７５００ｒｐｍ、　４０分）
して上澄を得た。得られた上澄は集め凍結乾燥した。

上記の凍結乾燥物を２０ｍＭ塩酸溶液に溶解し、４°Ｃ
で遠心（１２，０００ｒｐｍ、　１５分）して上澄を得
た。これを５ｅｐｈａｄｅｘ＠Ｇ−５０（ファルマシア
社製）カラム（３Ｘ８５ｃｍ）に添加し、２０ｍＭ塩酸
溶液で溶出した。

これを１０ｍ１ずつ分画しながら同時に２８０ｎｍにお
ける吸光度を測り、分画番号６９−８６の画分を集め、
これを凍結乾燥した。この凍結乾燥物を２０ｍＭ塩酸溶
液１０ｙｄに溶解しコスモシール０５Ｃ１８（牛丼化学
薬品社製）カラム（１０ｘ　２５０ｎｍ）に添加し、ア
セトニトリルの濃度２２〜３０％に変化させて０．１％
トリフルオロ酢酸溶液で溶出した。この溶出曲線を第１
図に示す。２９％アセトニトリルで溶出される区分を集
め凍結乾燥することにより本発明のポリペプチド（Ｉ）
を得た。収量は５■であった。

（２）構造決定 本物質の構造は以下の如くして決定された。即ち、還元
Ｓ−ビニルピリジンでピリジルエチル化したサンプルを
６Ｎ塩酸を用いて加水分解しアミノ酸組成を決定した。

また、このサンプルを気相シークエンザーを用いて１６
回のエドマン分解に附し、Ｎ末端のリジンから１６番目
のシスティンに至るアミノ酸の種類と結合の順序を決定
した。また、アミノエチル化したサンプルをリシルエン
ドペプチダーゼ処理してＣ末端残基を遊離させて得られ
た生成物のフェニルチオカルバミル誘導体の逆相高速液
体クロマトグラフィー上での溶出時間は、別に合成した
フェニルチオカルバミルアルギニンアミドのそれと一致
した。さらに質量分析結果もＣ末端をアルギニンアミド
とした質量数示したものでＣ末端はアルギニンアミドで
あると決定した。

〔試験例〕

本発明ペプチドの抗菌活性について検討した結果を以下
に示す。

（１）ダラム陰性菌に対する抗菌性試験■実験材料 供試菌：　Ｅｓｅｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＡＴＣ
Ｃ１１７７５Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｕｒｉ
ｕｍＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｍｉｎｎｅｓｏｔａＰｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｃｒｇｉｎｏｓａＳｃｒｒａｔｉ
ａ　ｍａｒｃｃｓｃｃｎａ　Ｓｌ培　地：牛心臓浸出液
　　　　　２５０ｇカザミノ酸　　　　　　　１５ｇ Ｌ−トリプトファン　　　０．０５ｇ 精製水　　　　　　　　１０００ｄ ■実験方法 各画をＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ｂｒｏｔｈ■（Ｄｉｆｉｃｏ
社製）培地で２０時時間上う培養後、菌の濃度を６６０
ｎｍの吸光度が約０．３になるように調整し、その０．
１　ｍｌを上記培地に加えたものを供試菌液とした。ポ
リペプチド（ｒ）、　（ＩＩ）、　（ＩＩＩ）、　（Ｉ
Ｖ）及び（ｖ）の各３００μｇを精製水１２艷に溶解し
２５μｇ／ｒｎｌの溶液を得る。

これを原液として２倍階段希釈を行い１２．５．６．２
５゜３、１３．１．５６μｇ／ｍｌの試料液を得た。

滅菌した試験管に各濃度の試料液１ｍｌずつを分注し、
これに各菌液１−ずつを加え混合し３７°Ｃで２０時間
培養し、６６０ｎｍの吸光度を測定した。対照は試料液
の代わりに精製水を用い、各物質の各画に対する最小生
育阻害濃度を決定した。その結果を第１．２表に示す。

第　１　表　ポリペプチドの最小生育阻害濃度（μｇ／
ｍｅ’） 第２表　ポリペプチドの最小生育阻害濃度３７°Ｃで１
０分間保温した。そこにＣ因子３μｇを加え、１０分間
保温し、活性型Ｃ因子の基質となる、Ｂｏｃ−■ａｌ−
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＭＣＡを加え、さらに１０分間３７°
Ｃで保温した。０．８Ｎ酢酸０．５　ｍＡ’を加え脳を
停止させた後、遊離したＡＭＣをＥＸ３８０ｎｍ、　Ｅ
Ｍ４６０ｎｍで測定した。ポリペプチド（Ｉ）〜（Ｖ）
を加えていない対照のＡＭＣの蛍光強度を１００とした
。

（２）本発明物質にょろりピドＡ中和実験すピドＡによ
り活性化されることが証明されている、カブトガニＣ因
子を用いて、本発明物質によるリピドＡの中和実験を行
った。

■実験材料 カブトガニＣ因子（Ｌ、　ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ由来）
合成リピドＡ ポリペプチド（Ｉ）〜（Ｖ） ■実験方法 合成リピドＡ１μｇを含む０．２ｙｎｌのトリス緩衝液
に、ポリペプチド（Ｉ）〜（Ｖ）を５μｇ加えて第３表 ポリペプチド（Ｉ） ポリペプチド（ＩＩ） ポリペプチド（ＩＩＩ） ポリペプチド（ＩＶ） ポリペプチド（Ｖ） 対　　　　照 第３表に示すごとく、ポリペプチド（Ｉ）〜（Ｖ）はリ
ビドＡの活性を中和した。

（３）　　５ｃｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｃｓｃｃｎｓ　
Ｓｌ感染に対する治療効果 Ｓｃｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｃｓｃｃｎｓ　ＳＩＩＩＩ
ＸＩＯ’　　、　５　ＸＩＯ’細胞をＩＲＣ−ｓｌｃ　
マウス（４週令、雄、１群１０匹）の腹腔内に接種した
。１時間後に請求の範囲１）〜５）の物質１００μｇを
腹腔内に投与した。１週間後の生存率をもって治療効果
を判定した。

第４表 ポリペプチド（Ｉ）　　１００　　　　１００ポリペプ
チド（ＩＩ）　　１００　　　　　９０ポリペプチド（
Ｉ［）　　１００　　　　１００ポリペプチド（ＩＶ）
　　１００　　　　１００ポリペプチド（Ｖ）　　１０
０　　　　１’００対　　　　照　　　　　　　３０　
　　　　　１０第４表に示すごとく投与群では治療効果
が認められた。

〔実施例〕

本発明のポリペプチド（Ｉ）〜（Ｖ）を含む経口又は非
経口投与用の製剤例を以下に示す。なお、下記のポリペ
プチドはポリペプチド（Ｉ）〜（Ｖ）のいずれをも意味
する。

（１）　２００■錠剤 ポリペプチド　　　　　　　　　　　２００ｍｇコーン
スターチ　　　　　　　　　　　４０■ラクトース　　
　　　　　　　　　　　９８ｍｇステアリン酸マグネシ
ウム　　　　　　　８ｍｇタルク　　　　　　　　　　
　　　　　　４■（２）　１００■注射用アンプル（ｑ
、　ｓ、　ｐアンプル）ポリペプチド　　　　　　　　
　　　１００■注射用蒸留水　　　　　　　　　　　　
適量（３）　５００■カプセル ポリペプチド　　　　　　　　　　　　５００■ラクト
ース　　　　　　　　　　　　　５０■ステアリン酸マ
グネシウム　　　　　　５■（４）　５００■錠剤 ポリペプチド　　　　　　　　　　　　５００■コーン
スターチ　　　　　　　　　　　７０■ポリビニルピロ
リドン　　　　　　　　　３５■ラクトース　　　　　
　　　　　　　　７４ｍｇステアリン酸マグネシウム １４■ タルク ７■

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、［１］と［２］、［３］と［４］は、それぞれ
   直接に結合している。Ａｒｇ−ＮＨ＿２は、アルギニン
   のカルボキシル基がアミドであることを示す。） で表されるペプチド（ I ）及びその薬理的に許容され
   る塩を有効成分として含有する細菌性ショック治療剤。 ２）式（II） ▲数式、化学式、表等があります▼（II） （式中、［１］と［２］、［３］と［４］は、それぞれ
   直接に結合している。Ａｒｇ−ＮＨ＿２は、アルギニン
   のカルボキシル基がアミドであることを示す。） で表されるペプチド（II）及びその薬理的に許容される
   塩を有効成分として含有する細菌性ショック治療剤。 ３）式（III） ▲数式、化学式、表等があります▼（III） （式中、［１］と［２］、［３］と［４］は、それぞれ
   直接に結合している。Ａｒｇ−ＮＨ＿２は、アルギニン
   のカルボキシル基がアミドであることを示す。） で表されるペプチド（III）及びその薬理的に許容され
   る塩を有効成分とする細菌性ショック治療剤。 ４）式（IV） ▲数式、化学式、表等があります▼（IV） （式中、［１］と［２］、［３］と［４］は、それぞれ
   直接に結合している。Ａｒｇ−ＮＨ＿２は、アルギニン
   のカルボキシル基がアミドであることを示す。） で表されるペプチド（IV）及びその薬理的に許容される
   塩を有効成分として含有する細菌性ショック治療剤。 ５）式（Ｖ） ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｖ （式中、［１］と［２］、［３］と［４］は、それぞれ
   直接に結合している。Ａｒｇ−ＮＨ＿２は、アルギニン
   のカルボキシル基がアミドであることを示す。） で表されるペプチド（Ｖ）及びその薬理的に許容される
   塩を有効成分として含有する細菌性ショック治療剤。