JPH0479418B2 - - Google Patents

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JPH0479418B2
JPH0479418B2 JP58239549A JP23954983A JPH0479418B2 JP H0479418 B2 JPH0479418 B2 JP H0479418B2 JP 58239549 A JP58239549 A JP 58239549A JP 23954983 A JP23954983 A JP 23954983A JP H0479418 B2 JPH0479418 B2 JP H0479418B2
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JP
Japan
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bsa
antibody
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capillary
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JPS60133368A (ja
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Mitsugi Hibino
Taira Kaneda
Mitsuyoshi Hirata
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Daiichi Kagaku Yakuhin Co Ltd
Original Assignee
Daiichi Kagaku Yakuhin Co Ltd
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Publication date
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Publication of JPH0479418B2 publication Critical patent/JPH0479418B2/ja
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody

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  • Molecular Biology (AREA)
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  • Medicinal Chemistry (AREA)
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  • Analytical Chemistry (AREA)
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  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は免疫反応により被検体中の成分を検出
又は定量する方法、更に詳細には、標識物質の捕
捉を毛細管中で行う免疫測定法に関する。 従来、免疫測定法としては、被検体中の抗原又
は抗体を、放射性同位元素、酵素又は螢光物質等
で標識した抗原又は抗体と免疫反応させ、斯くし
て得られる標識物質を測定する放射免疫測定法、
酵素免疫測定法あるいは螢光免疫測定法が採用さ
れている。 而して、これらの免疫測定法は、従来、その免
疫反応を試験管等の中で行つていたゝめ、その結
果得られる反応した標識物質と未反応の標識物質
を分離することが必要である。しかし、この分離
には煩雑な操作、専門的熟練及び長時間を要する
という欠点があつた。 そこで、本発明者らは、斯かる従来の欠点を解
決すべく鋭意研究を行つた結果、毛細管中で免疫
反応を行い、毛細管現象等と固定化標識物質捕捉
物質を利用して反応した標識物質と未反応の標識
物質を反応位置から移動させ、それぞれ異なる位
置で捕捉して不動化することにより、簡単かつ短
時間に被検体中の成分を検出又は定量することが
できることを見出し、本発明を完成した。 すなわち、本発明は、免疫反応により被検体中
の測定対象物質を検出又は定量する方法におい
て、毛細管にその基端部から、少なくとも、 標識免疫反応試薬を保持させた40〜300メツ
シユの球状又は多角形粒子の不溶性担体、及び 標識免疫反応試薬と免疫反応する物質及び／
又は標識免疫反応試薬−測定対象物質−結合物
と免疫反応する物質（以下、これらを標識物質
捕捉物質と称する）を固定化した40〜300メツ
シユの球状又は多角形粒子の不溶性担体、 を順次充填し、該毛細管基端部より被検体を吸入
して、該毛細管中で免疫反応を行わせ、標識免疫
反応試薬と測定対象物質との結合物及び／又は標
識免疫反応試薬を標識物質捕捉物質と結合させて
不動化し、不動化された標識物質を測定すること
を特徴とする免疫測定方法である。 本発明で測定せんとする被検体中の成分として
は、例えば免疫グロブリン、ベンス・ジヨーンズ
蛋白、α1−アンチキモトリプシン、α1−アンチト
リプシン、α1−マイクログロブリン、α2−マイク
ログロブリン、β2−マイクログロブリン、ハプト
グロビン、フエリチン、トランスフエリン、セル
ロプラスミン、アンチトロンビン、ミオグロビ
ン、ミオシン軽鎖、クリオグロブリン、カルモデ
ユリン、プレアルブミン、アルブミン、トランス
コーチン、チロキシン結合蛋白、レチノール結合
蛋白、ヘモペキシン、フイブロネクチン、妊娠特
異糖蛋白（SPI）等の生体成分中蛋白質。GOT、
GPT、ALP、ACP、LDH、γ−GTP、クレア
チンキナーゼ、LAP、アミラーゼ、マクロアミ
ラーゼ、コリンエステラーゼ、アルドラーゼ、
MAO、5′−ヌクレオチダーゼ、アシドホスフア
ターゼ、OCT、膵リパーゼ、プラスミノーゲン
アクチベータ、カタラーゼ、Ｌ−CAT、リポ蛋
白リパーゼ、ホスホリパーゼＡ、DNase、
RNase、ターミナルトランスフエラーゼ、ペプ
シン、トリプシノーゲン、キモトリプシン、エン
テロキナーゼ、アミノペプチダーゼ、ペルオキシ
ダーゼ、カタラーゼ、エノラーゼ、チロシン水酸
化酵素、ドーパー脱炭酸酵素、ドーパミンβ水酸
化酵素等の酵素。酸性ムコ多糖類、イヌリン、ノ
イラミン酸、ガングリオシド、ムコ多糖等の糖
質。コレステロール、リポプロテイン、アポリポ
プロテイン類、トリグリセライド、遊離脂肪酸、
リン脂質、胆汁酸、過酸化脂質等の脂質。ビタミ
ンＡ、Ｄ、Ｅ及びＫ、ユビキノン、チアミン、リ
ボフラビン、ビタミンB6、ニコチン酸、葉酸、
ビタミンB12、アスコルビン酸、イノシトール等
のビタミン。フイブリノゲン、FDP、プラスミ
ノーゲン、因子、因子、XI因子、XII因子、プ
ロトロンボプラスチン因子、因子、因子、
因子、プロトロンビン、β−トロンボグロブリ
ン、C1インヒビター、β2マクログロブリン、α2プ
ラスミンインヒビター、血小板第４因子、血小板
膜蛋白、プロテインＣ等の凝固因子。成長ホルモ
ン、ソマトメジン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激
ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、LPH、
MSH、β−エンドルフイン、エンケフアリン、
甲状腺刺激ホルモン、プロラクチン、バソプレシ
ン、ニユーロフイジン、オキシトシン等の下垂体
分泌物質。T4、総サイロキシン、遊離サイロキ
シンインデツクス、遊離サイロキシン、トリヨー
ドサイロニン、リバースT3、持続性甲状腺刺激
物質、カルシトニン、サイドグロブリン等の甲状
腺分泌物質。カテコールアミン、メタネフリン、
ノルメタネフリン、バニリルマンデル酸、ホモバ
ニリン酸、３，４−ジハイドロキシフエニルアラ
ニン、３，４−ジハイドロキシフエニル酢酸、３
−メトキシ−４−ヒドロキシフエニルエチレング
リコール、ドーパミン−β−ハイドロキシレース
等の副腎髄質・交感神経分泌物質。アルドステロ
ン、11−デオキシコルチコステロン、コルチコス
テロン、18−ハイドロキシコルチコステロン、コ
ルチゾール、11−デオキシコルチゾール、11−ハ
イドロキシコルチコステロイド、17−ハイドロオ
キシコルチコイド、17−ケトジエニツクステロイ
ド、デヒドロエピアンドロステロン、デヒドロエ
ピアンドロステロンサルフエート、アンドロステ
ンジオン、17−ケトステロイド等の副腎皮質分泌
物質。テストステロン、5α−ジヒドロテストス
テロン、アンドロスタンデイオール、エストロ
ン、エストラジオール、エストリオール、エステ
トロール、カテコールエストロジエン、プロジエ
ステロン、プレグナンジオール、17α−ハイドロ
キシプロジエステロン、プレグナントリオール、
絨毛性ゴナドトロピン、胎盤ラクトーゲン等の性
腺・胎盤分泌物質。インスリン、プロインスリ
ン、Ｃ−ペプタイド、膵グルカゴン、ガストリ
ン、セクレチン、CCK−PZ、モチリン、エンテ
ログルカゴン、パンクレアテイツクポリペプチ
ド、ソマトスタチン、サブスタンスＰ、ニユーロ
テンシン等の膵、消化分泌物質。梅毒検査、病源
微生物の免疫血清学的検査。マイコプラズマ抗
体、リケツチヤ、抗ストレプトリジンＯ、抗スト
レプトキナーゼ、抗デオキシリボヌクレオキナー
ゼＢ、単純疱疹ウイルス、水痘・帯状疱疹ウイル
ス、サイトメガロウイルス、EBウイルス抗体、
アデノウイルス、Ａ・Ｂ型インフルエンザウイル
ス、Ｃ型インフルエンザウイルス、パラインフル
エンザウイルス、RSウイルス、ムンプスウイル
ス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、日本脳炎ウイ
ルス、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型
肝炎ウイルス、肝炎ウイルスのS.E.C.及びノン
Ａ、ノンＢ型、ライノウイルス、コロナウイル
ス、外来性伝染病、狂犬病、流行性耳下腺炎、コ
クサツキ−ウイルス、クラミジア、ロタウイルス
等のウイルス。抗核抗体、抗DNA抗体、抗ENA
抗体、リウマトイド因子、抗グロブリン、LE細
胞、抗ミトコンドリア抗体、抗平滑筋抗体、抗胃
壁抗体、抗内因子抗体、抗横紋筋抗体、抗心筋抗
体、抗副腎皮質抗体、抗サイログロブリン抗体、
抗甲状腺マイクロゾーム抗体、抗インスリン抗
体、抗インスリン受容体抗体、抗アセチルコリン
受容体抗体等の自己抗体。βIEグロブリン、C1q、
C1r、C1s、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、
βIEグロブリン等の補体系成分、Ｔ細胞、Ｂ細
胞、マクロフアージ等の細胞物質。癌胎児性抗
原、α−フエトプロテイン、塩基性フエトプロテ
イン、フエリチン、イソフエリチン、ポリアミ
ン、CRP、イムノアセテイツクプロテイン
（IAP）、膵胎児性抗原（POA）、デイスフアクタ
ー等のチユーモアマーカー（Tumor marker）。
フエノバルミタール、プリミドン、フエニトイ
ン、カルバマゼピン、バルプロ酸、塩酸リドカイ
ン、ジゴキシン、ジギトキシン、テオフイリン、
デイソピラマイド、メキシレチン、塩酸プロプラ
ノロール、利尿薬、合成ステロイド剤、クロラム
フエニコール系薬剤、アミノ配糖体系薬剤、抗結
核剤、メトトレキサート、オピエート、メサド
ン、バルビタール、アンフエタミン、コカイン代
謝物、ベンゾジアゼピン代謝物、プロトキシフエ
ン、フエンシクリジン、カンナビノイド等の薬
物。レニン、アンジオテンシンノゲン、アンジオ
テンシン、、、アンジオテンシンコンバー
テイングエンザイム、キニン、キニノ−ゲン、プ
ラズマカリクレイン、腺性カリクレイン等のレニ
ンアンジオテンシン系。HLA、血液型、血液交
叉適合試験等。これらの抗原およびこれらの抗原
に対する抗体が挙げられる。 また抗体の種類にはイムノグロブリンの他、こ
れを加工したＦ（ab′）2、Fab′、Fabなどがあり、
これらは自体公知の方法で調製される〔免疫学−
１−、中山書店（1981）〕。そして同様なことがモ
ノクロナール抗体に対しても挙げられる。 不溶性担体としては、例えば巨大分子の蛋白
質、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレン、シリ
カ、フエノール樹脂、アクリル樹脂、セルロー
ズ、ウレタン樹脂、ポリビニルアルコール、塩化
ビニル樹脂、ポリ塩化ビニリデン、ポリプロピレ
ン、ポリテレフタレート、ポリカーボネート、ナ
イロン、フツ素系プラスチツク、ポリエステル等
の球体又は多角形粒子が挙げられる。これらの粒
子は40〜300メツシユであり、好ましくは80〜150
メツシユである。 標識免疫反応試薬としては、測定せんとする被
検体中の抗原又は抗体に対する抗体又は抗原を標
識したもの、あるいは競合反応に用いる抗原又は
抗体を標識したものを挙げることができる。標識
剤としては、例えばヨウ素アイソトープ（例えば
125I）、14C、トリチウム等の放射性アイソトープ；
ペルオキシダーゼ、アルカリフオスフアターゼ、
ジアホラーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グル
コースオキシダーゼ、ペニシリナーゼ等の酵素；
またはフルオレツセインイソシアネート、フルオ
レツセインインチオシアネート、ローダミン等の
螢光物質が挙げられる。これらの標識剤で上記抗
原又は抗体を標識するには自体公知の方法が採用
される〔続ラジオイムノアツセイ−講談社サイエ
ンテイフイツク（1979）；J.Histo.Chem.
Cytochem.22、1084（1974）；Immunochemistry、
６、43（1969）；同８、871（1971）；J.Biochem.
78、235（1975）；Fluorescent Antibody
methods−Academic press〕。 標識物質捕捉物質は、後述の免疫反応の結果生
ずる測定せんとする標識物質（標識剤結合−反応
生成物又は未反応の標識免疫反応試薬）と結合す
るものであればよく、例えば抗体、抗原あるいは
これらに対して親和性をもつ物質等が挙げられ
る。標識物質捕捉物質と不溶性担体に固定化する
には、不溶性担体のもつ吸着性を利用して、自体
公知の方法によつて標識物質捕捉物質を担体の表
面に結合させる。例えば、担体がガラスビーズの
場合は、その表面に塩基性アミノ酸類を吸着さ
せ、これに架橋剤を結合させ、更にこの架橋剤に
標識物質捕捉物質を結合させることにより固定化
する。架橋剤としては、グルタルアルデヒド、マ
レイミド類が使用される。また、担体がセルロー
ズ系のものの場合には、その表面を過クロール
鉄、過ヨウ素酸カリ等の酸化剤で処理し、これに
標識物質捕捉物質を結合させて固定する方法等が
一般に知られている。 また、本発明では、不溶性担体に標識免疫反応
試薬、基質、発色剤、阻止剤等を保持させたもの
を用意する。基質及び発色剤としては、標識剤の
酵素に対応して次のもの（基質：発色剤）が使用
される。ペルオキシダーゼ（過酸化水素：ｏ−ジ
アニシジン、ｏ−トリジン、４−クロル−１−ナ
フトル、２，2′−アジノ−３−エチルベンゾチア
ゾリンスルホネート〔ABTS〕、３−アミノ−９
−エチルカルバゾール、２，７−フルオレンジア
ミン、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンハイ
ドロゾン〔MBTH〕、チラミン）、アルカリフオ
スフアターゼ（ｐ−ニトロフエノールリン酸：４
−アミノアンチピリン）又は（４−メチルウンベ
リフエリルリン酸：）、β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ（ｏ−ニトロフエノール−β−Ｄ−カラクトシ
ド：）又は（４−メチルウンベリフエリール−β
−Ｄ−カラクトシド）。これらの標識免疫反応試
薬、基質、発色剤、阻止剤等の不溶性担体に保持
させるには、担体に上記標識免疫反応試薬等の水
又はアルコール溶液を混合し、次いで乾燥して、
担体表面に該試薬等を付着させることによつてな
し得る。 本発明では、上述のようにして調製した標識物
質捕捉物質を固定した不溶性担体及び標識免疫反
応試薬を保持させた不溶性担体、更に必要に応じ
て基質、発色剤、阻止剤等を保持させた不溶性担
体を毛細管に充填する。 毛細管はガラス又は透明もしくは半透明の合成
樹脂、例えば塩化ビニル、ポリエチレン、ポリカ
ーボネート、ポリプロピレン、ポリスチレン、ア
クリルフタル酸樹脂等の材質のものを使用するこ
とができ、毛細管の直径は0.5〜２mm特に1.0〜1.1
mm、長さは３〜20cm、特に５〜15cmが好ましい。
この毛細管の内壁は蛋白質が吸着しないことが必
要であり、例えば、蛋白質類（例えばアルブミ
ン）の中性緩衝液等で処理しておくのが好まし
い。 毛細管に標識物質捕捉物質を固定した不溶性担
体及び試薬保持不溶性担体を充填するには、毛細
管の基端に綿、ポリエステル等の栓を結め、この
基端よりアスピレーター等の吸入器具を用いて毛
細管内を減圧にして、上記不溶性担体を吸入充填
する。この毛細管中には、少なくとも標識物質捕
捉物質を固定した不溶性担体及び標識免疫反応試
薬保持不溶性担体を充填することが必要であり、
更に必要に応じて基質、発色剤、阻止剤等を付着
させた不溶性担体を充填することができる。標識
物質捕捉物質を固定した不溶性担体は被検体が標
識免疫反応試薬を保持させた不溶性担体を通過し
た後に到達するように充填することが必要であ
り、これは標識剤結合−反応生成物又は未反応標
識免疫反応試薬の何れか一方と結合するものを一
つだけ充填してその一方の標識物質を不動化する
ようにしても、また両者を充填して両方の標識物
質を不動化することもできる。また、標識物質捕
捉物質を固定した不溶性担体及び標識免疫反応試
薬、基質、発色剤、阻止剤等を保持させた不溶性
担体はそれぞれ隔離して充填することが必要な場
合があり、その隔離には不溶性担体が使用され
る。 本発明において、被検体中の測定せんとする成
分を抗原として場合の標識物質捕捉物質を固定し
た不溶性担体及び標識免疫反応試薬を保持させた
担体の基本的な充填順序は次のとおりである。 ○イ 標識抗体−固定化抗原 ○ロ 標識抗原−固定化抗体 ○ハ 標識抗体−固定化抗体 ○ニ 標識抗体−固定化抗体（前）−標識抗原−固
定化抗体（後） ○ホ 標識抗体−固定化抗体−固定化抗原 ○ヘ 標識抗体−固定化抗体−固定化抗標識物抗体 ○ト 標識抗体−（固定化抗体＋補助標識物）−（固
定化抗標識物抗体＋補助標識物） その他これら○イ〜○トを適当に組合せ使用するこ
とも可能である。 上述のようにして調製した測定用毛細管を用い
て、被検体中の成分を検出又は定量するには、測
定用毛細管の基端を被検液中に浸漬し、該毛細管
中に吸入させる。このとき、被検体中の成分が抗
原の場合、上記測定用毛細管中で次のような反応
が生起し、標識物質が不動化される。 ○イの毛細管 検体中の抗原が先ず標識抗体と反応して抗原−
標識抗体となり、抗原−標識抗体と未反応の標識
抗体は移動し、固定化抗原と接触すると、未反応
の標識抗体が反応して標識抗体−固定化抗原とな
つて不動化される。 ○ロの毛細管 検体中の抗原が標識抗原と共に固定化抗体と接
触し、両者が競合しながら反応し、標識抗原−固
定化抗体となつて不動化される。 ○ハの毛細管 検体中の抗原が標識抗体と反応して抗原−標識
抗体となり、抗原−標識抗体と未反応の標識抗体
は移動し、固定化抗体と接触し、抗原−標識抗体
が反応して固定化抗体−抗原−標識抗体となつて
不動化される。 ○ニの毛細管 検体中の抗原が標識抗体と反応して抗原−標識
抗体となり、次いでこれが固定化抗体（前）と接
触して固定化抗体−抗原−標識抗体となつて不動
化される。また、被検体中の抗原が標識抗体より
過剰に存在すると、その過剰の抗原が標識抗原と
競合して固定化抗体（後）と反応し、標識抗原−
固定化抗体となつて不動化される。 ○ホの毛細管 被検体中の抗原が標識抗体と反応して抗原−標
識抗体となり、次いでこれが固定化抗体と反応し
て固定化抗体−抗原−標識抗体となつて不動化さ
れる。また未反応の標識抗体は更に移動して固定
化抗原と反応して固定化抗原−標識抗体となつて
不動化される。 ○ヘの毛細管 被検体中の抗原が標識抗体と反応して抗原−標
識抗体となり、次いで固定化抗体と接触して固定
化抗体−抗原−標識抗体となつて不動化される。
また未反応の標識抗体及び不動化されなかつた一
部の抗原−標識抗体は更に移動して固定化抗標識
物抗体と反応して固定化抗標識物抗体−標識抗体
及び固定化抗標識物抗体−標識抗体−抗原となつ
て不動化される。 ○トの毛細管 被検体中の抗原が標識抗体と反応して抗原−標
識抗体となり、次いで（固定化抗体＋補助標識
物）と接触して（固定化抗体＋補助標識物）−抗
原−標識抗体となつて不動化される。また未反応
の標識抗体は更に移動して（固定化抗標識物抗体
＋補助標識物）と反応して（固定化抗標識物抗体
＋補助標識物）−標識抗体となつて不動化される。
本方法は標識結合単独では標識とならないが、補
助物質と合せる事により標識物となる。なお、補
助標識物とは例えばパーオキシダーゼの基質をグ
ルコースから酵素反応によつて出すグルコースオ
キシダーゼ、ジアホラーゼに対する補酵素
NADH、発光物質が発光するのに必要なもの等
である。 このようにして不動化された標識物質は、その
標識剤が放射性同位元素の場合には、その部位を
切り取つてガンマー線測定機等で測定し標識物質
の量を測定する。また標識剤が酵素又は螢光物質
の場合には、当該毛細管に充填された基質、発色
剤または励起波長によつて発色するので、その着
色によつて標識物質を測定することができる。ま
た、基質及び発色剤は被検液を吸入させた後に吸
入させることもできる。 なお、被検液としては、血液、血清、血漿及び
だ液、尿等の体液及び排水等が使用できる。また
被検体中に本反応を阻害する成分が存在する場合
は、あらかじめ阻害物を不活化または除外するか
あるいは測定に影響をおよぼさない濃度まで希釈
することにより測定が可能になる。 叙上の如く、本発明方法は免疫反応と標識物質
の捕捉を毛細管中で行うことができるので、次の
ような種々の利点を有する。 試薬が全て毛細管中に充填されているので、
従来法のように測定に当つて、各試薬を調製す
るとか、余分な試薬を廃棄しなければならない
という欠点がない。 被検液に毛細管の基端を浸漬するだけで、被
検体中の成分を検出又は定量できるので、操作
が極めて簡単であり、専門的熟練を要すること
なく何人でも測定できると共に、他の装置及び
器具を必要としないし、また極めて短時間で測
定を行うことができる。 従つて病院のベツトサイドでの測定が可能で
ある。 被検体は極めて少量でよく、例えば耳たぶを
切開し、これに毛細管の基端をあてて血液を吸
入するのみで、血液中の成分を測定することが
できる。 測定後の毛細管はそのまま保存することもで
きるし、また廃棄も容易である。 次に実施例を挙げて説明する。 実施例 １ (1) 試薬及び器具 アルブミン吸着ガラス毛細管 ガラス毛細管（直径１mm、長さ100mm）に、
ボヴインアルブミン20mg／mlの0.01Mリン酸
緩衝生理食塩水（PBS）（PH7.2）を通し、吸
引して余分な液を除き、乾燥する。 ガラスビーズ（GB.）直径0.17mm アルブミン吸着GB（GB.BSA） ガラスビーズ（直径0.17mm）（GB）を、ボ
ヴインアルブミン20mg／mlのPBSに浸し、
ガラスビーズを精製水で２〜３回洗浄後、乾
燥する。 ポリエステル繊維 市販品を利用 ジアニシジン混合GB.BSA ｏ−ジアニシジン塩酸塩6.25mgのエタノー
ル溶液２mlにGB.BSA1ｇを混合した後乾燥
する。 抗兎IgG抗体結合ペルオキシダーゼ（αRb
−IgG−HRP） ペルオキシダーゼ４mgを水に溶かし、
0.1M過ヨーソ酸ナトリウム0.2mlを加えた
後、室温で20分反応させる。反応物を1mM
酢酸緩衝液PH4.0に対し１夜透析する。透析
終了後、0.2M炭酸緩衝液PH9.5を加え、透析
液をPH9.5とした。直ちに、山羊抗兎IgG抗体
（10mg／ml）、0.01炭酸緩衝液PH9.5を加え、
室温で２時間反応させた。反応終了後、ホー
化水素４mg／mlを0.1ml加え、４℃、２時間
反応させた。終了後、セフアクリルｓ−200
（フアルマシア社製）（カラム直径；2.5cm、
長さ；30cm）に添加し、反応液を0.01MPBS
でゲルろ過する。先に流出する高分子部分を
取り、凍結乾燥し、保存した。 αRb−IgG−HRP混合GB.BSA で調製したαRb−IgG−HRP1ml相当の
凍乾品にGB.BSA8ｇを加えて乳鉢で均一に
混合する。 ウサギIgG結合GB（Ｒ−IgG−〇） ガラスビーズ（GB）５ｇに濃硫酸５mlを
加え、室温に５分間放置する。これを洗浄液
が中性になるまで精製水で洗浄し、これにポ
リ−Ｌ−リジン30mg／mlを加え、室温で１時
間混合する。精製水で洗浄後、2.5％グルタ
ールアルデヒドを加え室温で１時間反応させ
る。精製水で洗浄後、ウサギIgG（５mg／ml）
２mlを加え、室温で3.5時間反応させ、乾燥
する。 (2) 測定用毛細管の調製 アルブミン吸着ガラス毛細管の基端より最初
５mm、次から3.5mm間隔にて５本の印をつける。
最初の５mmのところにポリエステル繊維（ａ−
１）を詰める。この基端を真空ポンプに連結し
て毛細管内を陰圧とし、次の3.5mmのところに
ジアニシジン混合GB.BSA（ａ−２）を吸引充
填する。同様にしてGB.BSA（ａ−３）、αRb−
IgG−HRP混合GB.BSA（ａ−４）、GB.BSA
（ａ−５）、Rb−IgG−〇（ａ−６）を順次充
填する。残り上端５mm下までGB（ａ−７）を
充填し、最後に再度ポリエステル繊維を残り５
mmに詰める。（第１図） (3‐1) ヒト血清とウサギ血清の判定 ２本の測定用毛細管を用意し、その１本の
基端をヒト血清、他の１本をウサギ血清につ
け、第１図の（ａ−６）まで同血清を吸入さ
せる。そのときの血清量か約8μであり、
吸入に要した時間は１分であつた。次いで、
この毛細管の基端を0.003％過酸化水素PBS
に浸漬し、これを毛細管の上端付近（基端よ
り８〜９cm）まで吸入させる。これに要した
時間は15分であつた。その結果、ヒト血清の
場合にはRb−IgG−〇〔第１図の（ａ−
６）〕の部分が茶色に着色したが、ウサギ血
清では着色はみられなかつた。 (3‐2) 抗凝固剤（EDTA）を含むヒト血液とウサ
ギ血液を判定 基質液として0.03％過酸化水素PBSを使用
する以外は（３−１）と同様に操作した。そ
の結果、ヒト血液ではウサギIgG結合GBの
部分が茶色に着色し、ウサギ血液では着色は
みられなかつた。 実施例 ２ (1) 試薬及び器具 アルブミン吸着ガラス毛細管 直径1.5mm、長さ125mmのガラス毛細管を使
用した以外は、実施例１の(1)のと同様に操
作して作成した。 ガラスビーズ（GB）（直径0.17mm） アルブミン吸着GB.（GB.BSA） 実施例１の(1)のと同じものを使用。 ポリエステル繊維 ジアニシジン混合GB.BSA 実施例１の(1)のと同じものと使用。 兎IgG結合ペルオキシダーゼ（Rb−IgG−
HRP） 山羊抗兎IgG抗体を兎IgGに代えた以外は
実施例１の(1)のと同様に操作し作成。 Rb−IgG−HRP混合GB.BSA で調製したRb−IgG−HRP1ml相当の凍
乾品にGB.BSA16ｇを加えて乳鉢で均一に混
合する。 抗兎IgG抗体結合GB（αRb−IgG−〇） 兎IgGの代わりに山羊抗兎IgG抗体を用い
た以外は、実施例１の(1)のと同様に操作し
作成。 穴あきスポイド 毛細管に太さが合つたゴムスポイドの上部
に穴をあけたもの。 ヘパリン、EDTA混合GB.BSA ベパリン10mg、EDTA2K1.15ｇ、GB.
BSA8.84ｇを乳鉢で均一に混合し、その0.2
ｇを取り、さらにGB.BSA9.8ｇを加え同様
に均一に混合する。 (2) 測定用毛細管の調製 実施例１の(2)と同じ操作を行ない、以下の毛
細管を作成した。 最初の５mmにポリエステル繊維（ｂ−１）、
次の3.5mmにヘパリン・EDTA混合GB.BSA（ｂ
−２）次の3.5mmにジアニシジン混合GB.BSA
（ｂ−３）、同様3.5mmずつでGB.BSA（ｂ−４）、
Rb−IgG−HRP混合GB.BSA（ｂ−５）、GB.
BSA（ｂ−６）、αRb−IgG−〇（ｂ−７）を入
れ、残り上端５mm下までGB（ｂ−８）を充填
し、残り５mmに再度ポリエステル繊維を詰めた
（第２図）。 (3) ヒト及び兎新鮮血での測定 測定用毛細管を２本用意し、その上端にそれ
ぞれ穴のあいたゴムスポイドを取りつける。そ
の１本の基端をヒト、他の１本の基端を兎の耳
の１部を切傷させた部分につけ、第２図の（ｂ
−７）までスポイドを利用してゆつくりと吸入
させる。そのときの血液量は約15μであり、
要した時間は20秒であつた。次いで各毛細管の
基端を0.003％過酸化水素PBSに浸漬し、これ
を毛細管上端近く（基端より９〜10cm）までス
ポイドを利用して吸込ませる。これに要した時
間は７分であつた。その結果ヒト血液では抗
Rb−IgG〔第２図の（ｂ−７）〕の部分が茶色
に着色したが、兎血液では前者に比べ薄く着色
した。 実施例 ３ (1) 試薬及び器具 アルブミン吸着硝子毛細管 実施例１の(1)ののアルブミン吸着ガラス
毛細管を使用。 硝子ビーズ（GB）（直径0.1mm） アルブミン吸着GB（GB.BSA） 直径0.17mmの代りに0.1mmの硝子ビーズを
使用した以外は実施例１の(1)のと同じ操作
で作成。 脱脂綿 抗Ｃ反応蛋白抗体結合ペルオキシダーゼ
（αCRP−HRP） 山羊抗兎IgG抗体を山羊抗CRP抗体に代え
た以外は実施例１の(1)のと同様に操作し作
成。 αCRP−HRP混合GB.BSA で調製したαCRP−HRP1ml相当の凍乾
品にのGB.BSA8ｇを加え乳鉢で均一に混
合する。 αCRP抗体結合GB（αCRP−〇） 本実施例(1)のの硝子ビーズ及びウサギ
IgGの代りに山羊αCRP抗体を使用した以外
は実施例１の(1)のと同様に操作し作成。 基質発色液 0.03％過酸化水素、0.25％ゼラチン及び
0.03％ｏ−トリジンを含むPBS。 (2) 測定用毛細管の調製 実施例１の(2)と同じ操作を行ない、以下の毛
細管を作成した。最初５mmに脱脂綿（ｃ−１）、
続いて3.5mmずつGB.BSA（ｃ−２）、αCRP−
HRP混合GB.BSA（ｃ−３）、GB.BSA（ｃ−
４）そしてαCRP−〇（ｃ−５）を充填する。
残り上端５mm下までGB（ｃ−６）を詰め、残
り５mmに再度脱脂綿を詰める（第３図）。 (3) CRP有無の判定 ４本の測定用毛細管を用意し、それぞれの基
端を（）兎血清、（）健常人血清、（）患
者血清、（）CRP5mg／dl含有血清にそれぞ
れつけ、第３図の（ｃ−３）まで検液を吸入さ
せる。そのときの被検液量は約5μであり吸
入に要した時間は30秒〜60秒であつた。 次いでこの毛細管の基端を基質発色液に浸漬
し、これを毛細管上端附近（基端より８〜９
cm）まで吸入させる。これに要した時間は20分
であつた。その結果（）と（）の場合には
αCRP−〇〔第３図の（ｃ−５）〕の部分に着
色はみられないが、（）と（）には同部分
に緑色の着色がみられた。 実施例 ４ (1) 試薬及び器具 アルブミン吸着ガラス毛細管 実施例１の(1)ののアルブミン吸着ガラス
毛細管を使用。 硝子ビーズ（GB）（直径0.1mm） アルブミン吸着GB（GB.BSA） 実施例３の(1)のアルブミン吸着GBを使
用。 ジアニシジン混合GB.BSA 直径0.17mmの代りに0.1mmの硝子ビーズを
使用した以外は実施例１の(1)のと同じ操作
で作成。 脱脂綿結合グルコースオキシダーゼ
（GOD−〇） 脱脂綿780mgと過ヨウ素酸ナトリウム214mg
を取り、これに精製水40mlを加え、室温で１
時間混合する。反応後精製水で良く洗い、グ
ルコースオキシダーゼ10mgを加え、室温で３
時間混合させた後精製水でよく洗浄後乾燥す
る。 脱脂綿混合グルコース（Glu−混合脱脂
綿） 脱脂綿1000mgを取り、100mgのグルコース
と混合する。次に精製水２mlを加えよく混合
溶解した後乾燥する。 抗フイブリン分解物抗体結合ペルオキシダ
ーゼ（αFDP−HRP） 山羊抗兎IgG抗体をマウス抗FDP抗体（モ
ノクロナール抗体−１）に代えた以外は実施
例１の(1)のと同じ操作で作成。 αFDP−HRP混合GB.BSA で調製したαFDP−HRP1ml相当の乾燥
品にのGB.BSA8ｇを加え乳鉢で均一に混
合する。 αFDP抗体結合GB（αFDP−〇） ウサギIgGをマウスαFDP抗体（モノクロ
ナール抗体−２）に代えた以外は実施例１の
(1)のと同じ操作で作成。 グルタチオン混合GB.BSA グルタチオン10mgとGB.BSA5ｇを乳鉢で
均一に混合する。 脱脂綿 (2) 測定用毛細管の調製 アルブミン吸着ガラス毛細管の基端より最初
５mm幅で２本、次から3.5mm間隔にて６本の印
をつける。基端より繊維性試薬を各々２点詰め
る。最初に基端より５mm奥から10mmまでGOD
−〇（ｄ−２）を詰め、次に基端より５mm奥ま
でGlu混合脱脂綿（ｄ−１）をそれぞれ針を利
用して詰める。続いて基端より吸引しながら
3.5mm長さに、ジアニシジン混合GB.BSA（ｄ−
３）、GB.BSA（ｄ−４）、グルタチオン混合
GB.BSA（ｄ−５）、αFDP−HRP（ｄ−６）、
GB.BSA（ｄ−７）そして、αFDP−〇（ｄ−
８）を充填する。残り上端５mm下までGB（ｄ
−９）を詰め、残り５mmに脱脂綿を詰めた（第
４図）。 (3) 尿中FDPの測定 ２本の測定用毛細管を用意し、その１本を
FDP（D2）50μｇ／尿mlにつけ、また他の１本
を健常人尿につけ、それぞれ毛細管の上端付近
（基端より８〜９cm）まで吸入させる。その時
の尿量は約25μであり、それに要した時間は
９分であつた。その結果、FDP添加尿には
αFDP−〇〔第４図の（ｄ−８）〕の部分が茶
色に着色したが、健常人尿では着色はみられな
かつた。 実施例 ５ (1) 試薬及び器具 アルブミン吸着硝子毛細管 実施例１の(1)ののアルブミン吸着硝子毛
細管を使用。 硝子ビーズ（GB）（直径0.17mm） アルブミン吸着GB（GB.BSA） 実施例３の(1)ののGB.BSAを使用。 ポリエステル繊維 ジアニシジン混合GB.BSA 実施例１の(1)ののジアニシジン混合GB.
BSAを使用。 兎IgG結合ペルオキシダーゼ（Rb−IgG−
HRP） 実施例２の(1)ののRb−IgG−HRPを使
用。 Rb−IgG−HRP混合GB.BSA 実施例２の(1)ののRb−IgG−HRP混合
GB.BSAを使用。 兎IgG結合GB（Rb−IgG−〇） 実施例１の(1)ののRb−IgG−〇を使用。 (2) 測定用毛細管の調製 実施例１の(2)と同じ操作を行ない、以下の毛
細管を作成した。 最初５mmにポリエステル繊維（ｅ−１）、続
いて3.5mmずつ、ジアニシジン混合GB.BSA（ｅ
−２）、GB.BSA（ｅ−３）、Rb−IgG−HRP混
合GB.BSA（ｅ−４）GB.BSA（ｅ−５）、そし
てRb−IgG−〇（ｅ−６）を充填する。残り
上端５mm下までGB（ｅ−７）を詰め、残り５
mmにポリエステル繊維を詰める（第５図）。 (3) 抗Rb−IgG−抗体有無の判定 ２本の測定用毛細管を用意し、それぞれの基
端を（）Rb−IgG免疫中山羊血清、（）
αRb−IgG抗体がない山羊血清（オクタロニー
確認）につけ、第５図の（ｅ−３）まで検液を
吸入させる。そのときの検液量は約3μであ
り、要した時間は20秒であつた。 次いでこの毛細管の基端を0.03％過酸化水素
PBSに浸漬し、これを毛細管の上端付近（基
端より８〜９cm）まで吸入させる。これに要し
た時間は20分であつた。その結果、Rb−IgG
免疫中山羊血清（）にはRb−IgG−〇〔第
５図（ｅ−６）〕の部分が茶色に着色したが、
オクタロニーでαRb−IgG抗体を認めない山羊
血清（）では着色はみられなかつた。 実施例 ６ (1) 試薬及び器具 アルブミン吸着ガラス毛細管 実施例１の(1)ののアルブミン吸着ガラス
毛細管を使用。 アルブミン吸着ガラスビーズ（GB.BSA） 実施例３の(1)ののGB.BSAを使用。 脱脂綿 抗ヒトアルブミン抗体結合ペルオキシダー
ゼ（αHSA−HRP） 山羊抗兎IgG抗体を兎抗ヒトアルブミン抗
体に代えた以外は実施例１の(1)ののαRb−
IgG−HRPと同様に操作し作成。 αHSA−HRP混合GB.BSA αCRP−HRPの代わりに本実施例のを
用いた以外は実施例３の(1)のと同様に操作
し作成。 αHSA抗体結合GB（αHSA−〇） 山羊αCRP抗体を兎αHSA抗体に代えた以
外は実施例３の(1)のと同じ操作で作成。 基質発色液 0.03％過酸化水素、0.25％ゼラチン、及び
0.03％２，2′−アジノジ（３−エチルベンズ
チアゾリン）−６−スルホン酸を含む0.01燐
酸緩衝生理食塩水。 (2) 測定用毛細管の調製 実施例１の(2)と同じ操作を行ない、以下の毛
細管を作成した。 最初５mmに脱脂綿（ｆ−１）、続いて７mm長
さにGB.BSA（ｆ−２）、3.5mm長さでαHSA−
HRP混合GB.BSA（ｆ−３）、７mm長さでGB.
BSA（ｆ−４）、3.5mm長さでαHSA−〇（ｆ−
５）を充填する。残り上端５mm下までGB.BSA
（ｆ−６）を詰め、残り５mmに再度脱脂綿を詰
める。終了後基端より５cmの所に印をつける
（第６図）。 (3) 排液中のヒトアルブミン有無の判定 ３本の測定用試験管を用意し、それぞれの基
端を（）ヒト血清１ml／PBSl、（）排液
１、（）排液２にそれぞれつけ第６図のｆ−
５まで検液を吸入させる。そのときの検液量は
約9μであり、これに要した時間は１分であ
つた。次いでこの毛細管の基端を基質発色液に
浸漬し、これを毛細管基端より約５cmの所まで
吸入させる。これに要した時間は15分であつ
た。その結果は（）及び（）ではαHSA−
〇〔第６図の（ｆ−５）〕の部分に青着色をみ
たが、（）には着色をみなかつた。この結果
より排液（）はヒトアルブミンを含んでいる
と判定できた。 実施例 ７ (1) 試薬及び器具 アルブミン吸着硝子毛細管 実施例１の(1)ののアルブミン吸着硝子毛
細管を使用。 ガラスビーズ（GB）（直径0.1mm） アルブミン吸着GB（GB.BSA） 実施例３の(1)ののGB.BSAを使用。 ポリエステル繊維 ジアニシジン混合GB.BSA 実施例４の(1)ののジアニシジン混合GB.
BSAを使用。 抗αフエトプロテイン抗体（自製モノクロ
ナール抗体）結合ペルオキシダーゼ（αAFP
−HRP） 山羊抗兎IgG抗体をマウス抗αフエトプロ
テイン抗体（モノクロナール抗体−１）に代
えた以外は実施例１の(1)のと同様に操作し
作成。 αAFP−HRP混合GB.BSA αCRP−HRPを本実施例のαAFP−
HRPに代えた以外は実施例３の(1)のと同
様に操作し作成。 抗αフエトプロテイン抗体結合GB（αAFP
−〇） 山羊αCRPをマウス抗αフエトプロテイン
（モノクロナール抗体−２、自製）に代えた
以外は実施例３の(1)のと同様に操作し作
成。 αフエトプロテイン結合GB（AFP−〇） 山羊αCRP抗体をαフエトプロテイン（ミ
ドリ十字社製）に代えた以外は実施例３の(1)
のと同様に操作し作成。 (2) 測定用毛細管の調製 実施例１の(2)と同じ操作を行ない、以下の毛
細管を作成した。最初５mmにポリエステル繊維
（ｇ−１）、続いて3.5mmずつジアニシジン混合
GB.BSA（ｇ−２）、GB.BSA（ｇ−３）、αAFP
−HRP混合GB.BSA（ｇ−４）、GB.BSA（ｇ−
５）、αAFP−〇（ｇ−６）、GB.BSA（ｇ−
７）、そしてAFP−〇（ｇ−８）を充填する。
残り上端５mm下までGB（ｇ−９）を詰め、残
り５mmに再度ポリエステル繊維を詰める（第７
図）。 (3) 血清中αフエトプロテインの測定 ６本の測定用毛細管を用意し、それぞれの基
端を（）αフエトプロテイン０ｇ／ml血清、
（）αフエトプロテイン100mg／ml血清、（）
αフエトプロテイン1μｇ／ml血清、（）αフ
エトプロテイン10μｇ／ml血清、（）健常ヒ
ト血清、（）患者血清につけ、第７図の（ｇ
−８）まで検液を吸入させる。そのときの検液
量は約10μであり、これに要した時間は２分
であつた。次いでこの毛細管の基端を0.003％
過酸化水素PBSに浸漬し、これを毛細管の上
端付近（基端より８〜９cm）まで吸入させる。
これに要した時間は25分であつた。その結果
（）はαAFP−〇〔第７図（ｇ−６）〕に着色
せず、AFP−〇〔第７図（ｇ−８）〕に濃く着
色する。（）はαAFP−〇〔第７図（ｇ−
６）〕に淡く着色し、AFP−〇〔第７図（ｇ−
８）〕に濃く着色する。（）はαAFP−〇〔第
７図（ｇ−６）〕に着色し、またAFP−〇〔第
７図（ｇ−８）〕にも着色がみられた。（）
は、αAFP−〇〔第７図（ｇ−６）〕に濃く着
色し、AFP−〇〔第７図（ｇ−８）〕に淡く着
色がみられた。（）は（）と、また（）
は（）と同じ結果であつた。以上の結果よ
り、健常人にはαフエトプロテインを認めず、
患者血清には、約100nｇ／mlのαフエトプロ
テインが含まれていた。 実施例 ８ (1) 試薬及び器具 アルブミン吸着ガラス毛細管 実施例１の(1)ののアルブミン吸着硝子毛
細管を使用。 GB.（直径0.17mm） GB.BSA 実施例１の(1)ののGB.BSAを使用。 ポリエステル繊維 ジアニシジン混合GB.BSA 実施例１の(1)ののジアニシジン混合GB.
BSAを使用。 過ホウ素酸ナトリウム混合GB.BSA 過ホウ素酸ナトリウム12mgとGB.BSA10ｇ
を乳鉢中で均一に混合する。 グルタチオン混合GB.BSA グルタチオン40mgとGB.BSA10ｇを乳鉢中
で均一に混合する。 抗フイブリン分解物抗体（モノクロナール
抗体−１）結合ペルオキシダーゼ（αFDP−
HRP） 山羊抗兎IgG抗体をマウス抗フイブリン分
解物抗体（自製モノクロナール抗体−１）に
代えた以外は、実施例１の(1)のと同様に操
作し作成。 αFDP−HRP混合GB.BSA αRb−IgG−HRPをαFDP−HRPに代え
た以外は、実施例１の(1)のと同様に操作し
作成。 α−FDP抗体結合GB（αFDP−〇） RbIgGをマウス抗フイブリン分解物抗体
（自製モノクロナール抗体−２）に代えた以
外は、実施例１の(1)のと同様に操作し作
成。 FDP結合GB（FDP−〇） RbIgGをヒトフイブリン分解物に代えた
以外は、実施例１の(1)のと同様に操作し作
成。 アルブミン混合GB.BSA ボヴインアルブミン20mgとGB.BSA1ｇを
乳鉢中で均一に混合する。 (2) 測定用毛細管の調製 実施例１の(2)と同じ操作を行ない、以下の毛
細管を作成した。最初５mmにポリエステル繊維
（ｈ−１）、続いて3.5mmずつアルブミン混合
GB.BSA（ｈ−２）、ジアニシジン混合GB.BSA
（ｈ−３）、過ホウ素酸ナトリウム混合GB.BSA
（ｈ−４）、グルタチオン混合GB.BSA（ｈ−
５）、GB.BSA（ｈ−６）、αFDP−HRP混合
GB.BSA（ｈ−７）、GB.BSA（ｈ−８）、αFDP
−〇（ｈ−９）、GB.BSA（ｈ−１０）、そして
FDP−〇（ｈ−１１）を充填し、最後にGB
（ｈ−１２）を毛細管上端５mm下まで充填し、
再度残り５mmにポリエステル繊維を詰める（第
８図）。 (3) 尿中FDPの測定 ４本の測定用毛細管を用意し、それぞれの基
端を（）正常尿、（）FDP50μｇ／ml添加
尿、（）FDP1mg／ml添加尿、（）患者尿に
浸漬し、検液を吸入させ、毛細管の上端附近
（基端より８〜９cm）まで吸入させる。その時
の尿量は約25μであり、要した時間は20分で
あつた。その結果（）は、αFDP−〇〔第８
図（ｈ−９）〕に着色せず、FDP−〇〔第８図
（ｈ−１１）〕に濃く茶色の着色が出た。（）
はαFDP−〇〔第８図（ｈ−９）〕に茶の着色
そしてFDP−〇〔第８図（ｈ−１１）〕にも茶
の着色が出た。（）では、αFDP−〇〔第８
図（ｈ−９）〕に濃い着色が、そしてFDP−〇
〔第８図（ｈ−１１）〕には淡い着色がみられ
た。（）は（）の結果を得た所より約50μ
ｇ／mlのFDPがある事を判定出来た。 実施例 ９ (1) 試薬及び器具 アルブミン吸着毛細管 実施例１の(1)ののアルブミン吸着毛細管
を使用。 硝子ビーズ（GB）（直径0.17mm） アルブミン吸着ガラスビーズ（GB.BSA） 実施例１の(1)ののアルブミン吸着GBを
使用。 ポリエステル繊維 ジアニシジン混合GB.BSA 実施例１の(1)ののジアニシジン混合GB.
BSAを使用。 抗αフエトプロテイン抗体結合ペルオキシ
ダーゼ（αAFP−HRP） 実施例７の(1)のの抗αフエトプロテイン
抗体結合ペルオキシダーゼを使用。 αAFP−HRP混合GB.BSAαRb−IgG−
HRPをαAFP−HRPに代えた以外は、実施
例１の(1)のと同様に操作し作成。 抗αフエトプロテイン抗体結合GB（αAFP
−〇） 兎IgGを抗αフエトプロテイン抗体に代え
た以外は実施例１の(1)のと同様に操作し作
成。 抗ペルオキシダーゼ抗体結合GB（αHRP−
〇） 兎IgGを山羊抗ペルオキキシダーゼ抗体に
代えた以外は実施例１の(1)のと同様に操作
し作成。 (2) 測定用毛細管の調製 実施例１の(2)と同じ操作を行ない、以下の毛
細管を作成した。最初５mmにポリエステル繊維
（ｉ−１）、続いて3.5mmずつ、ジアニシジン混
合GB.BSA（ｉ−２）、GB.BSA（ｉ−３）、
αAFP−HRP混合GB.BSA（ｉ−４）、GB.
BSA（ｉ−５）、αAFP−〇（ｉ−６）、GB.
BSA（ｉ−７）、そしてαHRP−〇（ｉ−８）
を充填する。残り上端５mm下までGB（ｉ−９）
を詰め、残り５mmに再度ポリエステル繊維を詰
める（第９図）。 (3) 血清中αフエトプロテインの測定 ３本の測定用毛細管を用意し、それぞれの基
端を（）αフエトプロテイン０ｇ／ml血清、
（）αフエトプロテイン500nｇ／ml血清、
（）αフエトプロテイン10μｇ／ml血清につ
け、第９図の（ｉ−８）まで検液を吸入させ
る。そのときの検液は約10μであり、要した
時間は１分であつた。次いでこの毛細管の基端
を0.003％過酸化水素PBSに浸漬し、これを毛
細管上端付近（基端より８〜９cm）まで吸入さ
せる。これに要した時間は20分であつた。その
結果（）はαAFP−〇〔第９図（ｉ−６）〕
に着色なく、αHRP−〇〔第９図（ｉ−８）〕
に濃い茶色の着色をみた。（）はαAFP−〇
〔第９図（ｉ−６）〕に着色し、αHRP−〇〔第
９図（ｉ−８）〕にも着色した。（）はαAFP
−〇〔第９図（ｉ−６）〕に濃く着色し、
αERP−〇〔第９図（ｉ−８）〕にも着色した。
以上より〔第９図（ｉ−６）〕と〔第９図（ｉ
−８）〕の色よりαフエトプロテイン濃度の区
別が出来た。 実施例 10 (1) 試薬及び器具 アルブミン吸着ガラス毛細管 実施例１の(1)ののアルブミン吸着ガラス
毛細管を使用。 ガラスビーズ（GB）（直径0.1mm） アルブミン吸着GB（GB.BSA） 実施例の(1)ののGB.BSAを使用。 ポリエステル繊維 ジアニシジン混合GB.BSA 実施例４の(1)ののジアニシジン混合GB.
BSAを使用。 抗αフエトプロテイン抗体（モノクロナー
ル抗体−１、自製Fab′）結合ペルオキシダ
ーゼ（αAFP−HRP） ペルオキシダーゼ10mg／1.5ml、0.1M燐酸
緩衝液（PH7.0）とＮ−サクシニミジイル−
４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサ
ン−１−カルボネート（SMCC）16mg／0.2
mlジメチルスルホキシド溶液を撹拌させなが
ら滴下する。30℃で１時間混合して反応させ
る。遠心分離（3000rpm10分）し、沈澱する
過剰試薬を除く。マレイミドペルオキシダー
ゼをゲル濾過で分離（セフアデツクスＧ−25
0.1M燐酸緩衝液PH6.0）する。別に環元型Ｆ
（ab′）2を常法に従つて調製用意する。精製Ｆ
（ab′）2（自製モノクロナール抗体−１由来）
10mg／ml0.1Mリン酸緩衝液（PH6.0）にメル
カプトエチルアミン塩酸塩を終濃度0.01Mに
なるように添加し、37℃で90分反応させる。
還元型Fab′をセフアデツクスＧ−25、５ｍ
Ｍ EDTAを含む0.1M燐酸緩衝液PH6.0でゲ
ル濾過して分離する。酵素標識Fab′をウル
トロゲルACA−44（LKB製）0.1Mリン酸緩
衝液PH6.5でゲル濾過する。分離精製物を凍
結乾燥する。 αAFP−HRP混合GB.BSA αCRP−HRPをαAFP−HRPに代えた以
外は実施例３の(1)のと同様に操作し作成。 抗αフエトプロテイン抗体結合GB（αAFP
−〇） 実施例７の(1)ののものを使用する。 アルブミンビーズ結合グルコースオキシダ
ーゼ混合GB.BSA（GOD−〇） グルコースオキシダーゼ100mgとボヴイン
アルブミン400mgを取り、0.02M酢酸緩衝液
PH5.0 ５mlに溶かす。これに2.5％グルター
ルアルデヒド２mlを加えゆつくり混合し、１
時間放置する。放置後よく均一にしてから遠
心分離をかけ、沈澱物を採取する。採取した
沈澱物に0.1Mリジン20mlを加え１夜放置後、
水洗し、沈澱物を取る。乾燥後使用する。本
品７mgとGB.BSA1ｇとを均一に混合する。 グルタチオン混合GB.BSA 実施例４の(1)ののグルタチオン混合GB.
BSAを使用。 グルコース１mg／mlPBS (2) 測定用毛細管の調製 実施例１の(2)と同様に操作し、以下の毛細管
を作成した。最初５mmにポリエステル繊維（ｊ
−１）、続いて3.5mmずつジアニシジン混合GB.
BSA（ｊ−２）、GB.BSA（ｊ−３）、αAFP−
HRP混合GB.BSA（ｊ−４）、グルタチオン混
合GB.BSA（ｊ−５）、GOD−〇（ｊ−６）、そ
してαAFP−〇（ｊ−７）を充填する。残り上
端５mm下までGB（ｊ−８）を詰め、残り５mm
に再度ポリエステル繊維を詰める（第１０図）。 (3) 血清中αフエトプロテインの測定 ３本の測定用毛細管を用意し、それぞれの基
端を、（）αフエトプロテイン０ｇ／ml血清、
（）αフエトプロテイン500nｇ／ml血清、
（）αフエトプロテイン10μｇ／ml血清につ
け、第９図の（ｊ−７）まで検液を吸入させ
る。そのときの検液は約9μであり要した時
間は２分であつた。次いでこの毛細管の基端を
グルコース１mg／mlPBSに浸漬し、これを毛
細管上端付近（基端より８〜９cm）まで吸入さ
せる。これに要した時間は25分であつた。その
結果、（）はαAFP−〇〔第１０図（ｊ−
７）〕に着色なく、（）はαAFP−〇〔第１０
図（ｊ−７）〕に着色し、（）はαAFP−〇
〔第１０図（ｊ−７）〕に濃く着色した。以上よ
り〔第１０図（ｊ−７）〕の色からαフエトプ
ロテインの濃度の区別が出来た。 実施例 11 (1) 試薬及び器具 アルブミン吸着毛細管 実施例２の(1)ののアルブミン吸着ガラス
毛細管を使用。 ガラスビーズ（GB）（直径0.17mm） アルブミン吸着ガラスビーズ（GB.BSA） 実施例１の(1)ののGB.BSAを使用。 脱脂綿 抗兎IgG抗体結合フルオレツセンイソチオ
シアネート（αRb−IgG−FITC） 山羊抗兎IgG抗体５mg／ml生理食塩水に0.1
mlの0.5M炭酸緩衝生理食塩水（PH9.5）を加
え溶解する。別に調製したFITC2mg／ml
0.05M炭酸緩衝生理食塩水（PH9.5）を20ml
ビーカーに入れ、この液中に先のIgG液を透
析チユーブに入れた後、浸漬し、１夜４℃で
反応させる。反応後ゲル濾過（セフアクリル
Ｓ−200、溶液0.01M燐酸緩衝生理食塩水）
で、螢光標識化合物を分離する。精製分離し
たものを凍結乾燥する。 αRbIgG−FITC混合GB.BSA で調製したαRb−IgG−FITC1ml相当の
凍乾品にGB.BSA2ｇを加えて、乳鉢で均一
に混合する。 RbIgG結合GB（RbIgG−〇） 実施例１の(1)ののRb−IgG−〇を使用。 (2) 測定用毛細管の調製 実施例１の(2)と同じ操作を行ない、以下の毛
細管を作成した。最初の５mmに脱脂綿（ｋ−
１）、次の3.5mmにGB.BSA（ｋ−２）、同様に3.5
mmずつαRbIgG−FITC（ｋ−３）、GB.BSA（ｋ
−４）、そしてRbIgG−〇（ｋ−５）を充填
し、残り上端５mm下までGB.BSA（ｋ−６）を
充填し、残り５mmに再度脱脂綿を詰めた（第１
１図）。 (3) ヒト血清と兎血清の区別 ２本の測定用毛細管を用意し、その１本の基
端をヒト血清、他の１本をウサギ血清につけ、
第１１図の上端付近（基端より８〜９cm）まで
吸入させる。そのときの血清量は約60μであ
り、要した時間は30分であつた。吸込ませた毛
細管を励起ランプにかけた時、ヒト血清の場合
には〔第１１図（ｋ−５）〕螢光を認めるが、
兎血清の場合では螢光を認めなかつた。 実施例 12 (1) 試薬及び器具 〜まで実施例１の(1)と同様のものを使用。 穴あきスポイド 実施例２の(1)のと同様のものを使用。 ヘパリン・EDTA混合GB.BSA 実施例２の(1)のと同様のものを使用。 (2) 測定用毛細管の調製 アルブミン吸着ガラス毛細管の基端より最初
５mm、次から3.5mm間隔にて５本の印をつける。
最初の５mmのところにポリエステル繊維（ａ−
１）を詰める。この基端を真空ポンプに連結し
て毛細管内を陰圧とし、次の3.5mmにヘパリ
ン・EDTA混合GB.BSA（ａ−１′）次の3.5mm
のところにジアニシジン混合GB.BSA（ａ−２）
を吸引充填する。同様にしてGB.BSA（ａ−３）
αRb−IgG−HRP混合GB.BSA（ａ−４）GB.
BSA（ａ−５）Rb−IgG−〇（ａ−６）を順次
充填する。残り上端５mm下まで（ａ−７）を充
填、最後に再度ポリエステル繊維を残り５mmに
詰める。 (3) ヒト新鮮血とウサギ新鮮血の判定 ２本の測定用毛細管を用意し、その１本の基
端をヒト、他の１本をウサギの耳の１部を切傷
させた部分につけ、（ａ−６）まで同血液をス
ポイドを利用してゆつくり吸入させる。そのと
きの血液量は約9μであり、吸入に要した時
間は20秒であつた。次いで、この毛細管の基端
を0.003％過酸化水素PBSに浸漬し、これを毛
細管の上端付近（基端より８〜９cm）まで吸入
させる。これに要した時間は15分であつた。そ
の結果、ヒト血液の場合にはRb−IgG−〇の
（ａ−６）の部分が茶色に着色したが、ウサギ
血液では着色はみられなかつた。 実施例 13 (1) 試薬及び器具 アルブミン吸着毛細管 実施例１の(1)ののアルブミン吸着ガラス
毛細管使用。 直径0.1mmのGB GB.BSA 実施例１の(1)ののGB.BSAを使用。 ポリエステル繊維 ジアニシジン混合GB.BSA 実施例４の(1)ののジアニシジン混合GB.
BSAを使用。 過ホウ素酸ナトリウム混合GB.BSA 過ホウ素酸ナトリウム12mgとGB.BSA10ｇ
を乳鉢中で均一に混合する。 グリタチオン混合GB.BSAグルタチオン40
mgとGB.BSA10ｇを乳鉢中で均一に混合す
る。 抗αフエトプロテイン抗体結合ペルオキシ
ダーゼ（αAFP−HRP） 実施例７の(1)ののαAFP−HRPを使用。 αAFP−HRP混合GB.BSA 実施例７の(1)ののαAFP−HRP混合GB.
BSAを使用。 抗αフエトプロテイン抗体結合GB（αAFP
−〇） 実施例７の(1)ののαAFP−〇を使用。 (2) 測定用毛細管の調製 実施例１の(2)と同じ操作を行ない、以下の毛
細管を作成した。最初５mmにポリエステル繊維
（ｌ−１）、続いて3.5mmずつジアニシジン混合
GB.BSA（ｌ−２）、過ホウ素酸ナトリウム混合
GB.BSA（ｌ−３）、グルタチオン混合GB.BSA
（ｌ−４）、GB.BSA（ｌ−５）、αAFP−HRP
混合GB.BSA（ｌ−６）、GB.BSA（ｌ−７）、そ
してαAFP−〇（ｌ−８）を充填する。残り上
端５mm下までGB（ｌ−９）を詰め、残り５mm
に再度ポリエステル繊維を詰める。 (3) 血清中αフエトプロテインの測定 αフエトプロテイン200μｇ／mlヒト血清を
PBSで10倍希釈し、終濃度αフエトプロテイ
ン20μｇ／ml（ヒト血清PBS混合液）としたも
の（サンプルＡ）αフエトプロテイン20μｇ／
mlヒト血清（サンプルＢ）そしてαフエトプロ
テイン20μｇ／ml血清0.5mlに中性水酸化銅を50
mg加え処理した上清液（サンプルＣ）の３つの
被検液を用意する。３本の測定用毛細管を用意
し、それぞれの基端をサンプルＡ、サンプルＢ
及びサンプルＣに浸漬し、被検液を毛細管上端
付近（基端より８〜９cm）まで吸入させる。そ
の結果サンプルＡはαAFP−〇〔第１２図（ｌ
−８）〕に茶の着色、サンプルＢはαAFP−〇
〔第１２図（ｌ−８）〕に着色なく、そして、サ
ンプルＣはαAFP−〇〔第１２図（ｌ−８）〕
に茶の着色がみられた。以上の結果より、被検
液中に本反応を阻害する物質が存在する場合
は、希釈又は添加物質の処理により測定可能と
なる。 実施例 14 (1) 試薬及び器具 アルブミン吸着ガラス毛細管 ガラス毛細管（直径１mm、長さ100mm）に
アルブミン20mg／mlのPBSを通し、吸引し
て余分な液を除き乾燥する。 ガラスビーズ（GB）直径0.17mm 市販品を利用。 GB.BSA GBをアルブミン20mg／mlのPBSに浸し、
GBを精製水で２〜３回洗浄後、乾燥する。 ポリエステル繊維 市販品を利用。 125Iαフエトプロテイン試薬混合GB.BSA
（以下、RI−AFP混合GB.BSAと略す） 市販AFP測定試薬（第一ラジオアイソト
ープ社製）の測定キツト内容試薬の放射性ヨ
ウ化AFP（125I）液（0.9μCi／バイアル）に
GB.BSAを1.0ｇ加え均一に混合し、五酸化
燐で乾燥する。 抗AFP−GB GB5ｇにポリ−Ｌ−リジン（１％）３ml
を加え室温放置させた後、精製水で洗浄す
る。表面加工GBにグルタールアルデヒドを
加え、放置させた後、同様に精製水で洗浄す
る。次いで、架橋GBに抗AFP抗体５mgを加
えて室温２時間反応させた後、乾燥し、抗
AFP−GBを作成した。 PBS (2) 測定用毛細管の作成 アルブミン吸着ガラス毛細管の基端より、
3.5mm間隔にて５本の印をつける。最初にポリ
エステル繊維（ｍ−１）を詰める。この基端を
真空ポンプに連結して毛細管内を陰圧とし、次
の3.5mmにGB.BSA（ｍ−２）を吸引充填する。
同様にして次の3.5mmにRI−afp混合GB.BSA
（ｍ−３）、続いてGB.BSA（ｍ−４）、抗AFP
−GB（ｍ−５）を順次充填する。残り上端５
mm下までGB.BSA（ｍ−６）を充填し、最後に
再度ポリエステル繊維（ｍ−７）を残り５mmに
詰める。（第１３図） (3) 血清中αフエトプロテインの測定 ５本の測定用毛細管を用意し、そのうち４本
の基端を既知濃度AFP：0.3.125、25、50μｇ／
ml、そして残り１本に被検血清を第１３図（ｍ
−３）まで、それぞれ均一に浸漬させて吸入す
る。この時の採取量は5μであつた。次にこ
の毛細管の基端をPBSに浸し測定用毛細管の
上端まで吸入する。この測定に要した時間は10
分であつた。 上記毛細管をそのまま基端を下にしてガンマ
ーカウンターにて測定した後、この毛細管の固
定化親和物（ｍ−５）が入つている部分を切り
取り、同様にガンマーカウンターで測定する。 (4) 結果 【表】 以上の結果AFP濃度上昇とともに不動化さ
れる放射能量は減少し、被検体中のAFP濃度
は55−60μｇ／mlと測定できた。 実施例 15 (1) 試薬及び器具 アルブミン吸着ガラス毛細管 ガラス毛細管（直径１mm、長さ100mm）に
アルブミン20mg／mlPBSを通し、吸引して
余分な液を除き乾燥する。 ガラスビーズ（GB）、直径0.17mm 市販品を利用。 GB.PBS GBをアルブミン20mg／mlのPBSに浸し、
GBを精製水で２〜３回洗浄後、乾燥する。 ポリエステル繊維 市販品を利用。 125I抗αフエトプロテイン抗体試薬混合
GB.BSA（以下、RI−抗AFP混合GB.BSAと
略す） 市販AFP測定試薬（第一ラジオアイソト
ープ社製）の測定キツト内容試薬放射性ヨウ
化α−フエトプロテイン抗体（125I）（凍結
乾燥品0.9μCi／バイアル）にGB.BSAを1.0
ｇ加え均一に混合する。 抗AFP−GB GB5ｇにポリ−Ｌ−リジン（１％）３ml
を加え室温放置させた後、精製水で洗浄する
表面加工GBにグルタールアルデヒドを加
え、放置させた後、同様に精製水で洗浄す
る。次いで、架橋GBに抗AFP抗体５mgを加
えて室温２時間反応させた後、乾燥し、抗
AFP−GBを作成した。 PBS (2) 測定用毛細管の作成 アルブミン吸着ガラス毛細管の基端より、
3.5mm間隔にて５本の印をつける。最初にポリ
エステル繊維（ｎ−１）を詰める。この基端を
真空ポンプに連結して毛細管内を陰圧とし、次
の3.5mmにGB.BSA（ｎ−２）を吸引充填する。
同様にして次の3.5mmにRI−抗afp混合GB.BSA
（ｎ−３）、続いてGB.BSA（ｎ−４）、抗AFP
−GB（ｎ−５）を順次充填する。残り上端５
mm下までGB.BSA（ｎ−６）を充填し、最後に
再度ポリエステル繊維（ｎ−７）を残り５mmに
詰める。（第１４図） (3) 血清中αフエトプロテインの測定 ７本の測定用毛細管を用意し、そのうち６本
の基端を既知濃度AFP：０、３、10、100、
1000、10000、ｎｇ／mlに、他の一本を被検血
清に浸漬させ（ｎ−４）迄吸入する。そのとき
の吸入量は約5μであつた。次にこの毛細管
の基端をPBSに浸し測定用毛細管の上端まで
吸入する。これに要した時間は10分であつた。 上記毛細管をそのまま基端を下にしてガンマ
ーカウンターにて測定した後、この毛細管の固
定化親和物（ｎ−５）が入つている部分を切り
取り、同様にガンマーカウンターで測定する。 (4) 結果 【表】 以上の結果AFP濃度上昇とともに不動化さ
れる放射能量も増加し、被検体中のAFP濃度
は50−100nｇ／mlと測定できた。
【図面の簡単な説明】
第１〜１４図は本発明で使用する測定用毛細管
である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 免疫反応により被検体中の測定対象物質を検
    出又は定量する方法において、毛細管にその基端
    部から、少なくとも、 標識免疫反応試薬を保持させた40〜300メツ
    シユの球状又は多角形粒子の不溶性担体、及び 標識免疫反応試薬と免疫反応する物質及び／
    又は標識免疫反応試薬−測定対象物質−結合物
    と免疫反応する物質（以下、これらを標識物質
    捕捉物質と称する）を固定化した40〜300メツ
    シユの球状又は多角形粒子の不溶性担体、 を順次充填し、該毛細管基端部より被検体を吸入
    して、該毛細管中で免疫反応を行わせ、標識免疫
    反応試薬と測定対象物質との結合物及び／又は標
    識免疫反応試薬を標識物質捕捉物質と結合させて
    不動化し、不動化された標識物質を測定すること
    を特徴とする免疫測定方法。
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DE8484115604T DE3484505D1 (de) 1983-12-19 1984-12-17 Immuntest.
EP84115604A EP0149168B1 (en) 1983-12-19 1984-12-17 Immunoassay
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