JPH0475595A - フェニル配糖体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、リンドウ科植物たとえばスェルチア属植物お
よびゲンチアナ属植物には含有されていなかったフェニ
ル配糖体を、該植物の形質転換細胞である毛状根を培養
することによって、効率的に製造する方法に関するもの
である。

〔従来の技術〕

リンドウ科たとえばスェルチア属植物及びゲンチアナ属
植物は全草に苦味成分であるスェルチアマリン、ゲンチ
オピクロサイド、スエ口すイドアマロゲンチン等のセコ
イリドイド配糖体を含有し、健胃薬、養毛剖等に広（利
用されている。

スェルチア属植物の細胞を培養することによって、スェ
ルチアマリン等の苦味配糖体を生産する試みがなされた
が、この培養細胞中には苦味配糖体は存在しなかった（
三浦他　生薬学雑１３２　（２）９０−９５．１９７８
）。

これに対し、リンドウ科植物をＲｉプラスミドによって
形質転換し、生じた高増殖性毛状根を培養することによ
り、生産効率の高い苦味配糖体の製造方法を見出してい
る（特願昭６３ １７６００２）。

従来、リンドウ科植物から見出された成分は、前述のセ
コイリドイド配糖体以外に、スエルチアニン、スエルチ
アノリン、イソスエルチアノリン等のキサントン誘導体
やスエルチシン、イソビテキン等のフラボノイドやスェ
ルチアサイド　センブリサイドＩ等のイリドイド配糖体
やビフェノサイドＡ、ビフエノサイドＢ等のビフェニル
配糖体が挙げられる。

しかしながら、リンドウ科植物によるフェニル配糖体の
生産に関する報告は全く知られていない。

本発明に言うフェニル配糖体のうち、１−０５ｉｎａｐ
ｏｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅはアブラ
ナ科アブラナ属植物に存在することが報告されている（
Ｈａｒｂｏｒｎｅ、　Ｊ、Ｂ、ら、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ
、Ｊ、、　８１．２４２−２５０（１９６１）。

Ｈｅｒｒｍａｍ、に、Ｐｒｏｇ、Ｃｈｅｍ、Ｏｒｇ、Ｎ
ａｔ、Ｐｒｏｄ、＋　　　３５＋７３−１３２（１９７
８））が、その製造方法や回収率についての記載はない
。

また、２．６−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｈｙｄｒｏｘ
ｙｐｈｅｎｏｌ　１−０β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎ
ｏＳｅはトウダイグサ科アカメガシワ属植物の樹皮から
抽出した２、　６−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−４ｈｙｄｒｏ
ｘｙｐｈｅｎｏｌ　　’１−０−　β−Ｄ−（６’　−
０−ｇａｌｌｏｙｌ）ｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅをタンナ
ーゼで加水分解することによって得られる（Ｓａｉｊｏ
ら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２Ｂ（９）２４４
３−２４４６．１９８９）が、その回収率は樹皮の新鮮
重量当り０．　ＯＯＯ２％以下である。

〔発明が解決しようとする課題］ 本発明は、リンドウ科植物をＲｉプラスミドによって形
質転換し、生じた高増殖性毛状根を培養することにより
、従来リンドウ科植物で生産されなかったフェニル配糖
体を生産可能とし、生産効率の高いフェニル配糖体の製
造方法を橙供することを目的としている。

〔課題を解決するための手段〕

医薬品１食品、化粧品分野等に、さらに有用な物質を提
供するという目的のもとに、リンドウ科植物にアグロバ
クテリウム菌を感染させ、Ｒｉプラスミドによって形質
転換し、生じた毛状根を培養し、その生産物について鋭
意研究した結果、従来リンドウ科植物が生産しなかった
フェニル配糖体の生産が可能であることを見出し、該毛
状根が生産するフェニル配糖体を取り出すことを特徴と
するフェニル配糖体の製造方法を完成した。

本発明はリンドウ科植物細胞をアグロバクテリウム属細
菌が保持するＲｉプラスミドにより形質転換し、生じた
毛状根を培養して、該毛状根が産生ずるフェニル配糖体
を取り出すことを特徴とするフェニル配糖体の製造方法
である。

以下に、本発明の詳細な説明する。

本発明で取り扱う微生物は、それ自体公知であるアグロ
バクテリウム属に属する細菌であり、特に限られるもの
ではなく、例えばアグロバクテリウム９リゾジエネス（
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｓ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）
ＡＴＣＣ１５８３４，Ａ４．８１９６．１８５５．＾Ｔ
ＣＣ１１３２５，Ｋｅｒｒ３８゜ＴＲｉ０５，ＴＲ７，
ＴＲｌ０Ｉ、アグロバクテリウム・ツメファシェンス（
＾、ｔｕｉ＊ｅｆａｃｉｅｎｓ）　Ｒｉ００Ｏ，７ＭＲ
３３Ｂ等が挙げられる。

本発明が適用されるリンドウ科植物としては、スェルチ
ア属に属する植物であるスェルチア・ジャポニカ（Ｓｗ
ｅｒｔｉａ　ｊａｐｏｎｉｃａ）　スェルチア・プソイ
ドキネンシス（Ｓ＠ｅｒｔｉａ　ｐｓｅｕｄｏｃｈｉｎ
ｅｎｓｉｓ）、ゲンチアナ属に属するゲンチアナ・ルテ
ア（Ｃｅｎｔｉａｎａ　１ｕｔｅｒ）＋　　ゲンチアナ
・トリフローラ（Ｇ、ｔｒｉｆ　１ｏｒａ）　＋　ハレ
ニア属に属するハレニア・コルニキュラータ（Ｈａｌｅ
ｎｉａ　ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔａ）等が挙げられる。

本発明において、リンドウ科植物遺伝子にアグロバクテ
リウム属に属する細菌に保持されるＲｉプラスミド断片
を導入するには、下記の、該菌を植物へ感染させる方法
等が考えられる。これらの方法はすでに公知である。

リンドウ科植物の無菌植物体を作製する方法は、該植物
体より頂芽または茎節部を切り取り、次亜塩素酸ナトリ
ウム等の溶液を用いて常法により無菌植物体を作製する
か、又は植物ホルモンを含む培地上で培養する方法が好
ましい。使用される培地は植物組織培養において通常使
用されるものであれば使用可能であり、特に限定される
ものではなく、例えばＭｕｒａｓｈｉｇｅ−５ｋｏｏｇ
等の植物組織培養に用いる通常の培地に３％程度の１！
類を添加し、植物ホルモンであるサイトカイニンとオー
キノンを適当に組み合わせて添加したものであるが、植
物ホルモンは添加しなくてもよい。

培養開始後、２週間程度で新たな茎葉の伸長が見られる
が、Ｕ織が水浸状になり感染の材料として不適当なもの
が多い。このなかで正常な状態に近いものを選抜・継代
することにより感染に好適な正常な無菌植物体が得られ
る。

次に、植物組織に細菌を接種するには前記細菌を有柄針
等に付着させ植物組織に突き刺す方法植物組織に傷を付
けそこに細菌を塗布もしくは細菌懸ｉｓを滴下もしくは
噴霧する方法、或いは、細菌含有液体中に植物組織を浸
漬する方法等がある。植物組織に細菌を接種した後、適
当な培地を用いてこの植物組織を２５°Ｃ〜３０°Ｃ好
ましくは暗所下で放置後、１〜６週間程度で毛状根が発
生する。

細菌を接種した後の植物組織の培養に使用される培地は
、植物組織培養において通常使用されるものであれば適
用可能であり、特に限定されるものではない。例えば、
Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ或いは、Ｗｈ　ｔ　ｔ
ｅの培地である。培地には１〜３％程度の糖類を添加す
るが、植物ホルモンは添加しなくても良い。

上記の方法により得られた毛状根は、生長点を含む先端
部を切り出し、２５°Ｃ〜３５°Ｃ１好ましくは暗所で
培養する操作を繰り返す方法や、抗生物質を含む培地に
、切り出した毛状根を置き２５℃〜３０°Ｃ好ましくは
暗所で培養する方法等により、無菌状態とすることがで
きる。

無菌状態になった毛状根の中で、増殖速度の大きいもの
及び分枝数の多いものを選抜する。

このようにして選抜した高増殖性の毛状根がＲｉプラス
ミド断片の導入によりて形質転換したものであるかどう
かは、次の方法によって確認できる。

１００ｍｇ程度の毛状根を破砕し、遠心分離等の操作に
より上澄液をサンプルとして得る。サンプルはアゾロピ
ン。マンノビンとならべて％紙に滴下し、ギ酸：酢酸：
水を１：３：１６（ｖ：ｖ：ｖ）等を泳動用緩衝液とし
て用い、供紙１ｃｍあたり５〜ｌＯ■の電圧をかけて供
紙電気泳動する。を気泳動後の供紙をアルカリ性硝酸Ｗ
＆試薬を用いる反応により、サンプル中のアゾロピン。

マンノビンを検出する。アゾロピン。マンノビンは普通
の植物組織には存在しないが、Ｒｉプラスミド断片の導
入により形質転換した植物組織で特異的に産生されるア
ミノ酸である。これらの物質の存在の有無により、形質
転換した植物組織か否かを確認することができる。

このようにして選抜された毛状根を更に２５°Ｃ〜３０
°Ｃ好ましくは暗所で培養する事により、大量に増殖さ
せることが可能である。毛状根を大量に増殖させるため
の培地は、植物組織培養に通常使用されるものであれば
使用可能であり、特に限定されるものではなく、例えば
Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−５ｋｏｏｇ或いは−ｈｉｔｅの培
地である。培地には３％程度のｗａ類を添加するが、植
物ホルモンは添加しなくても良い。

培養終了後の毛状根をエタノール、メタノールアセトン
等の有機溶媒、もしくは水で抽出し、溶媒を留去後、残
渣を各種カラムクロマトグラフィーたとえば５ｅｐｈａ
ｄｅ＋＋　Ｌｌ（−２０，ＭＣＩ−ｇｅｌ　ＣＨＰ−２
０Ｐ。

Ｂｏｎｄａｐａｋ　Ｃａｍ　Ｐｏｒａｓｉｌ　Ｂ等のカ
ラムクロマトグラフィーをそれぞれ又は適宜組合せるこ
とによってフェニル配糖体を回収することができる。

以下実施例をあげて本発明を説明するが、本発明はこれ
に限定されるものではない。

また、培地はすべて１２０°Ｃで１５分間滅菌して使用
した。

実施例１ センブリ（Ｓｗｅｒｔｉａ　ｊａｐｏｎｉｃａ）の茎の
節部を１％次亜塩素酸ナトリウム溶液などの殺菌剤で滅
菌し、無菌水で洗浄した後０，２％ジェランガムで固形
化したＭｕｒａｓｈｉｇｅ−５ｋｏｏｇ培地（３％５ｕ
ｃｒｏｓｅ添加）に植え込んだ、得られた無菌植物体の
中から正常な個体を選抜し、この茎部に有柄針を用いて
Ｒｉプラスミドを保持するアグロバクテリウム・リゾジ
ェネス（ＡＴＣＣ１５８３４）　＠を接種した。

２〜４遍間後に接種部位から発生じた毛状根を切り取り
、０，２％のジェランガムで固型化したＲｏｏｔ　Ｃｕ
１ｔｕｒｅ　Ｍａｄｉｕｍ　　（以下ＲＣ培地と略記）
上に置き２５°Ｃで培養した。１週間毎に毛状根の先端
部を切り取り新しいＲＣ培地に移す操作を４〜８回繰り
返すことによって、除菌された毛状根を得た。

１００ｍｊ！の三角フラスコに液体ＲＣ培地を５０ｍｆ
入れ、この培地に上記毛状ｍ　１００　ｍ　ｇを入れ２
５°Ｃで４週間、回転振盪培養（８０回転／分）した、
培養終了後の毛状根は秤量したのち凍結乾燥した。

この結果、フラスコ１本あたり平均１グラムの毛状根乾
燥物が得られた（増殖率；１００倍／４週）。

毛状根乾燥物をふたたび秤量してから乳鉢ですりつぶし
粉末にした０次に、この粉末７３ｇに８００ｍｊ！のメ
タノールを加え、成分を抽出し、ロータリーエバポレー
ターでメタノール溶液を５０ｍｊ！に濃縮後２００ｍ１
！の水を加え、１００ｍ１のクロロホルムで３回溶媒分
画洗浄を行った。

得られた水層を２０ｍｊ！に濃縮し、それを予め水で平
衡化しである５ｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ−２０（ｂｅｄ　
ｖｏｌｕｍｅ３、２　Ｘ　３０　ｃ　ｍ　、　Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ社製）に添加し、それぞれ２００ｍｊ！の水
、２０％メタノール水溶液５０％メタノール水溶液、メ
タノール、５０％アセトン水溶液を順次加え、溶出液を
１０ｍｊ！毎の画分に分けた０画分５１から画分９０を
まとめ、１０ｍｊ！に濃縮（画分Ａ）Ｌ、予め６０％メ
タノール水溶液で平衡化しである５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｌ
Ｈ−２０（ｂｅｄ　ｖｏｌｕｍｅ　２．３　Ｘ　３２　
ｃ　ｍ　）に画分Ａを添加し、６０％メタノール水溶液
で溶出した。溶出液を１０ｍＮ毎の画分に分け、両分ｌ
Ｏから百分２９をまとめ、１ｍｆにａ縮（画分Ａ−１）
した。

次に、両分Ａ−１を水で予め平衡化しであるＭＣＩ−ｇ
ｅｌ　ＣＨＰ−２０ＰＣｂｅｄ　ｖｏｌｕｍｅ２．３　
Ｘ　ｌ　５　ｃ　ｒｎ　、三菱化成工業■社製）に添加
し、水２００ｍ４２１０％メタノール水溶液２００ｍｆ
を順次加え、溶出液を１０ｍ１毎の画分に分けた。再分
１７から画分４３をまとめ、１ｍＮに濃縮した。次にこ
の濃縮液を、予め水で平衡化しであるＢｏｎｄａｐａｋ
Ｃ＋＊　Ｐｏｒａｓｉｌ　Ｂ　（ｂｅｄ　ｖｏｌｕｍｅ
　２．３　Ｘ　１５ｃ＋ｗ、Ｗａｔｅｒｓ社製）に添加
し、水２００ｍｊ２．１０％メタノール水溶液２００ｍ
ｆ、２０％メタノール水溶液３００ｍｆを順次加え、溶
出液を１０ｍｉ！毎の両分に分けた。

画分１５から画分２８をまとめ溶媒を留去し、白色、針
状結晶性の粉末を３５ｍｇ　（新鮮重量当りの回収率０
．０　Ｏ５％）採取した。

本物質は下記の分析項目により、フェニル配糖体１−０
−シナボイル−β−Ｄ−グルコース（弐〔ｆ〕）と確認
された。

（Ｉ） ■ＰＡＢＭＳ　：　ｍ／ｚ（ｔｅｌ、　ｉ　ｒ＋ｔ、）
　：　３８７［Ｍ＋旧”　　（８９）■　ＥＩＭＳ　　
　：　　ｍ／ｚ（ｒｓｌ、　　ｉ　　ｎｔ、）　　：　
　３８６℃Ｍ］　　　　　（２Ｂ）■　’　３ＣＮＭＲ ■　’［ＩＮＭＲ ■融点　１１７℃ ■旋光度（α）　Ｗ　＋　３４．８°　（ジメチルケト
ンＣ０，１２） ■ＴＣＬ　（クロロホルム：メタノール：水＝１０：４
：０．５） Ｒｒｉｌｉ　　Ｏ，６７ＩＩの呈色反応あり。

実施例２ 実施例１と同様にして、Ｒｉプラスミドにより形質転換
した毛状根乾燥物を得、これを乳鉢ですりつぶし粉末に
した。次に、この粉末７３ｔｌ二８００ｍｌのメタノー
ルを加え、成分を抽出し、ロータリーエバポレーターで
メタノール溶液を５０ｍ１に濃縮後２００ｍＥの水を加
え、１００ｍ１のクロロホルムで３回溶媒分画洗浄を行
った。

得られた水石を２０ｍｆｆ１に濃縮し、それを予め水で
平衡化しである５ｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ−２０（ｂｅｄ
　ｖｏｌｕｍｅ３、２　Ｘ　３０　ｃｍ、　Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ社製）に添加し、それぞれ２００ｒｒ＋７２の
水２０％メタノール水溶液５０％メタノール水溶液、メ
タノールを１１＠次加え、溶出液を１０ｍ１毎の両分番
こ分けた。

画分１１から画分５０をまとめ、Ｉ　ＯｍＩ！に濃！（
画分Ｂ）した０画分Ｂを予め水で平衡化しであるＭＣＩ
−ｇｅｌ　ＣＩＨ’−２０Ｐ（ｂｅｄ　ｖｏｌｕｍｅ２
．３　Ｘ　２０　ｃ　ｍ三菱化成工業■社製）に添加し
、水２００ｍ１１０％メタノール水？８液３００ｍ１を
順次加え、溶出液を１０ｍｆｆ毎の両分に分けた。画分
１６から画分１９をまとめ、２ｍｆに濃縮〔画分Ｂ−１
〕した。

この百分Ｂ−１を、予めエタノールで平衡化しである５
ｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ−２０（ｂｅｄ　ｖｏｌｕｌｌｅ
　２．３　Ｘ　１５　ｃｍＰｈａｒｍａｃｉａ社製）に
加え、エタノール４００ｍＩ！。

９０％エタノール水溶液４００ｍｊ２を順次加え、溶出
液を１０ｍｆ毎の両分に分けた。画分２９から画分４３
をまとめ１ｍｆに濃縮した。濃縮液１ｍｌを、予め６０
％メタノール水溶液で平衡化しである５ｅｐｈａｄｅｘ
　ＬＨ−２０（ｂｅｄ　ｖｏｌｕｍｅ　２．３　Ｘ　１
０　Ｃ１Ｐｈａｒ園ａｃｉａ社製）に添加し、６０％メ
タノール水溶液を加え、溶出液を１０ｍ２毎の画分に分
けた。

画分１１から画分１７をまとめ、溶媒を留去し灰白色、
非結晶性粉末を４．４ｍｇ（新鮮重量当りの回収率？　
０．０００６％）採取した。

本物質は下記の分析項目により、フェニル配糖体２．６
−シメトキシー４−ヒドロキシフェノール１−０−β−
Ｄ−グルコース（式〔■〕）と確■　ＰＡＢＭＳ　：　
ｓ／ｚ（ｔｅｌ、ｉ　ｎｔ、）：　３５５［Ｍ＋Ｎａｌ
　　”　　（１００）■　’”ＣＮＭＲ ■　’ＨＮＭＲ ■旋光度〔α］Ｆ４４．４°　（ジメチルケトン：メタ
ノール　１：１．ＣＯ，２３） ■ＴＣＬ（クロロホルム：メタノール；水＝１０：４：
０．５） Ｒｆ値　０．５５Ｉ！の呈色反応あり。

従来から知られているトウダイグサ科アカメガシワ属植
物から該物質を得る方法は、新鮮な樹皮に８０％アセト
ン水溶液を加え、２．５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ４−ｈｙ
ｄｒｏｘｙｐｈｅｎｏｌ　　１−０−β−Ｄ−（６’　
−０−ｇａｌｌｏｙｌ）ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅを
抽出しく新鮮重量当りの含有率；　０．０００２％）、
溶媒を留去後、残渣に水を加えた水溶液にタンナーゼを
加えて加水分解後（回収率は不明）カラムクロマトグラ
フィーを行い、該物質を採取するものである。

本発明による製造法は上記の従来方法のような加水分解
等の煩雑な操作を必要とせず、回収率も従来方法よりも
高いことが明らかである。

〔発明の効果〕

本発明によれば、リンドウ科植物の形質転換細胞培養に
よりフェニル配糖体を効率的に製造することができるの
で、本発明の方法はフェニル配糖体の工業的製造方法と
して極めて好適である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）リンドウ科植物細胞をアグロバクテリウム属細菌
   が保持するＲｉプラスミドにより形質転換し、生じた毛
   状根を培養して、該毛状根が産生するフェニル配糖体を
   取り出すことを特徴とするフェニル配糖体の製造方法。