JPH0471498A - Ｌ―塩基性アミノ酸オリゴペプチドの酵素的合成法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［技術の分野］ 本発明は、Ｌ−塩基性アミノ酸であるＩ４−リジン、Ｌ
−オルニチン、Ｌ−アルギニンまたはこれらのアミノ酸
誘導体を原料としたＬ−アミノ酸オリゴペプチドの酵素
を触媒として用いた合成法に関するものである。

「従来の技術１ 近年、ペプチドに種々の生理活性が存在することが明ら
かになり、治療、詮所等の囚薬品として、あるいは呈味
物質としての重要性がますます増大し−）つある。ペプ
チドを構成するアミノ酸のうぢ■、−塩基性アミノ酸に
は、栄養学的に重要で種々の生理活性を有するものがあ
る。

例えば、リジンは栄養強化を目的として家畜用飼料に添
加され、アルギニン、オルニチンは、高アンモニア血症
、肝臓機能障害に効果があることが報告されている。そ
こでこれらのアミノ酸を食品に添加することが行われる
が、従来アミノ酸はモノマーの形で食品に添加されてき
た。

しかし、アミノ酸モノマーは、腸からの能動輸送方式に
より運ばれるので、異なるアミノ酸が共存する場合、ア
ミノ酸同士の輸送が競合し、経腸吸収はこの競合により
制限される。したがって、食品の栄養強化を目的として
上記塩基性アミノ酸をモノマーの形として食品に添加し
ても栄養強化を望むのは難しい。

一方、最近ペプチド結合により結合した２〜３個のアミ
ノ酸（ジペプチドまたはトリペプチド）よりなるペプチ
ド分子が上記のアミノ酸モノマーの輸送メカニズムとは
異なったメカニズムによりそのまま腸から吸収されるこ
とが明らかにされた。［Ｄ、Ｂ、Ａ、　５ｉｌｋ、　Ｇ
ｕｔ　１５．１９Ｎ１９７４１：　Ｄ、Ｍ。

Ｍａｔｔｅｖａ、　Ｐｈｙｓ、　Ｒｅｖ、、　　５５．
　５３７（１９７５１：　Ｓ、Ａ。

Ａｄｉｂｉ　ａｎｄ　Ｙ、Ｓ、　Ｋｉｍ、　ｉｎ　Ｐｈ
ｙｓｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｇａｓｔｒｏ−ｉｎｔｅｓｔ
ｉｎａｌ　ｔｒａｃｔ、　ｅｄ、　ｂｙ　Ｌ、Ｒ，Ｊｏ
ｈｎｓｏｎ、　ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒ
ｋ（１９７３１］このためリジン、オルニチン、アルギ
ニンなどの塩基付アミノ酸よりなるジペプチドやトリペ
プチドはそれらを構成するアミノ酸モノマーよりも栄養
学的意義が大きく食品添加物として有用である。

また、これら塩基性■、−アミノ酸のジペプチドおよび
ｉ・ジペプチドには上記のごときモノマーとしての栄養
学的価値のみならず種々の生理学的活性も期待できる。

例えば、リジンの二量体であるノジルリジンの誘導体に
は抗菌活性が存在することが報告されている。

［従来の技術の問題点］ 現在までに知られているオリゴペプチドの合成法の主な
ものとしては、例えば、ファルマシア、レビュー、３号
、２７　＋１９８０１に記されているように主として、
化学合成法と酵素法に大別される。

化学合成法としてはカルボキシル活性化法に基づくアン
ド法、混合酸無水物法、カルボジイミド法、活性エステ
ル法、カルボジイミド法でアミノ酸を逐次的に縮合する
方法などをあげることができる。

しかしながら、−ＡＱにこれらの化学的合成法は操作が
複雑で、かつ反応条件が過激であるため副反応やラセミ
化が起こりやすく、また生成物の重合度の制御が困難で
あるため目的とするオリゴペプチドの収率が低い。

特に塩基性アミノ酸であるリジンやアルギニンなどでは
α−位以外のアミノ基が反応に関与するのを防ぐためα
−位以・外のアミン基を適当な保護基で保護すると共に
ペプチド結合生成後にこれらの保Ｊτ基を除去する必要
があり、これらの処理がオリゴペプチドの化学合成の操
作を更に煩雑にしている。

一方、酵素を用いたペプチド合成法では一煎にその反応
条件が温和であること、及び生体触媒である酵素は基質
としてのアミノ酸及びその誘導体の種類、立体化学に対
する特異性が高いことから官能基の保護を必要とせずラ
セミ化の心配もないとされている。

従来報告されている酵素によるペプチド合成法では、酵
素どしてプロテアーゼを用いるが、酵素が本来ペプチド
分解活性を有しているため生じたペプチドが合成と並行
して分解され、しばしば目的とするペプチドが得られな
いという重大な欠点を有していた。

そのため目的とするペプチドを反応系外に沈澱として析
出させることにより生成したペプチドの二次加水分解を
防いだり、酵素活性の調節や反応系への有ｍ溶媒の添加
・により収率の向上を計ることが必要であった。このた
めこれらの方法は必ずしも簡便でなく、有機溶媒による
酵素の失活や生成ペプチドからの有機溶媒の除去などの
欠点を持っている。

［発明が解決しようとしている問題点］上記のごとく化
学合成によるペプチドの合成はその操作が煩雑でかつ反
応条件が過激であるため目的とするペプチドの収率が低
く、また光学純度の高いものを得ることが困難である。

また、酵素法による各種ペプチド合成法についても生成
するペプチドが水溶性であるような場合酵素によるペプ
チドの二次加水分解のため収率よくペプチドを得ること
は難しく、収率向上のために酵素の活性の調節や反応系
からの生成ペプチドの速やかな採取、反応系への有機溶
媒の添加、反応時間の制御など煩雑な作業が必要であり
、酵素を用いた簡便なる方法で水溶性ペプチドを合成す
る方法に関する報告例はない。

本発明者らはＬ　　ｌｐ基性アミノ酸とそのジペプチド
、トリペプチドの有用性に鑑み、Ｌ−塩基性アミノ酸ジ
ペプチドおよびトリペプチドの有効な製造法について鋭
意研究を重ねた結果、蛋白質加水分解酵素の一つである
トリプシンを触媒として用いることにより、簡便にＬ−
塩基性アミノ酸のジペプチドおよびトリペプチドもしく
は反応条件を制御することによりジペプチドのみを高収
率で製造できることを見いだし、この知見に基づいて本
発明を完成した。

本発明の目的は、Ｌ−塩基性アミノ酸エステルを含む溶
液中に蛋白質加水分解酵素であるトリプシンを存在させ
、一定時間以上反応を行わせることにより該溶液より該
Ｌ−アミノ酸のジペプチドおよびトリペプチドのみより
なる重合度の揃ったＬ−塩基性ペプチドを採取すること
によりＬ−アミノ酸のジおよびトリペプチドをＷＡ造す
る方法を提供することである。

［問題点を解決するための手段］ 本発明は、下記ｉ１）・ないしく５）の構成を有する。

（１）Ｌ−塩基性アミノ酸エステルを含む緩衝液溶液中
に蛋白質加水分解酵素を存在させ、該酵素の触媒作用に
より該溶液から該Ｌ−アミノ酸オリゴペプチドを得るこ
とを特徴とするＬ−塩基性アミノ酸オリゴペプチドの酵
素的合成法。

（２）前記第＋１）項に示した製造法において蛋白質加
水分解酵素としてトリプシンを用いるＬ−アミノ酸オリ
ゴペプチドの酵素的合成法。

（３１前記第＋１）項に示した製造法においてＬ−塩基
性アミノ酸エステルとしてリジン、オルニチンまたはア
ルギニンを用いるＬ−アミノ酸オリゴペプチドの酵素製
造法。

（４）前記第ｆｌ）項に示した製造法において反応温度
４〜５０℃で１〜４８時間反応させることによりオリゴ
ペプチドのうち該アミノ酸ジペプチドおよびトリペプチ
ドのみを高収率で得ることを特徴とするＬ−アミノ酸オ
リゴペブヂドの製造法。

（５）前記第（４）項に示した製造法において反応条件
の操作として反応時間を２４時間以上とすることにより
該■、−アミノ酸ジペブヂドのみを高収率で得ることを
特徴とするアミノ酸ジペプチドの製造法。

本発明の構成と効果につき以下に詳述する。

本発明において用いる酵素としてはトリプシンを例示し
たがＬ−塩基性アミノ酸エステルに作用してその基質特
異性及び活性あるいは反応条件により最終産物として該
アミノ酸のジおよびトリペプチドを反応溶液中に蓄積で
きるものであれば動物、植物、微生物由来の蛋白質加水
分解酵素のいずれも用いることができる。

酵素の使用量は、その種類、活性によって異なるが、反
応原料の所定量（例えば、５００ｍＭ）に対して通常１
−１，０００μＭで用いる。これらの酵素は、固定化に
より繰り返し使用が可能である。

基質であるＬ−塩基性アミノ酸のエステルとしては、種
々のものを用いることができる。例えば、エチル、ブチ
ル、・ヘキシル、ベンジルなどのアルコールのエステル
を例に挙げることができる。また、使用される基質の濃
度としては１０〜１．０００ｍＭの範囲であるが、反応
途中に適宜基質を添加することも可能である。

反応は、種々の緩衝液中で行われる。該緩衝液としては
、ジエタノルーアミン塩酸、りん酸、はう酸、グリシン
、炭酸緩衝液をはじめ種々のものを必要に応じて用いる
ことができる。反応のｐＨは、５−１）であるが好まし
くは７−１０である。反応温度は４−５０℃であるが好
ましくは２５−４０℃である０反応時間は、限定されな
いが、通常１〜４８時間、好ましくは２〜６時間で所定
の目的により更に長時間（例えば、２４時間以上）の反
応を行うことができる。

反応の進行に伴いはじめ重合度２−６のペプチドが反応
系内に蓄積される。しかしながら、本反応系において生
成されるペプチドは水溶性であるため更に反応を進める
とともに二次加水分解により重合度が２および３のジペ
プチドおよびトリペプチドへと変換される。更に長時間
の反応を行えば反応溶液中のペプチドの分布はジペプチ
ドに収束する。

反応収率は、反応液の一部を採取し、　ＩＮ　Ｎａ０Ｉ
ｌで６０℃、１５分処理してエステルを除去後、アミノ
酸自動分析計により残存している遊離のアミノ酸量を求
めることにより算出できる。

以下、本発明をＬ−塩基性アミノ酸としてリジンおよび
アルギニンをとりあげ、実施例を挙げてさらに詳細に説
明する。

実施例１ （リジンオリゴペプチドの合成とｐＨの影響）Ｌ−リジ
ンエチルエステル５００ｍＭを含む０．２Ｍリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ８，ｏｌ　１０ｍｆｆにたいしてト
リプシンを１０μＭとなるように添加し、反応温度２５
℃で２４時間反応させた。

ｐ１）８以外のｐｉｔ　（ｐＨ９、ｐＨ１０，ｐＨｌｌ
ｌでの反応には」二記すン酸ナトリウ・ム緩析液の代わ
りに０．２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液を用いて反応を行っ
た。経時的に反応液の一部を採取し、Ｉ　Ｎ　ＮａＯＨ
で６０℃、１５分処理してエステルを除去後、アミノ酸
自動分析計にて残存している遊離リジン量を求めた。こ
こで反応収率すなわち反応した基質の割合は、次式で与
えられる。

［反応収率１・［（初濃度−残存量）／初濃度］Ｘ１０
０生成物の重合度の分布は、ＳＰ−トヨパールイオン交
換樹脂（商品名）を充、填したカラム（４，６Ｘ　５０
ｍｍ１使用し、溶離液として２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
ｈ６．５１　とこれにＩＭ　ＮａＣｌ；２を加えた２種
の溶液を表１に示す比率で濃度勾配をかけて分析した。

表　　　　ま ただし、３０分以降はカラムの洗浄及び初発緩（１液の
平衡化のためのものである。

クロマトグラムは、流速０．５ｍε／ｍｉｎを用い、溶
出液の紫外領域ｆ２２０ｎｍ）の吸光度を測定すること
により分析した。また、各ピークの同定は、質量分析に
よった０水分析法により反応溶液中の２〜６の重合度の
オリゴペプチドを分離定量した。

ｐＨｌｏの緩衝液を用いた時の経時的な反応収率を第１
図に１重合度分布の分析結果を第２図に示した。これら
により、本反応系において反応収率は、反応時間３時間
で最高値６２％を示し、２４時間後においてもその値は
低下しなかった。

反応初期においては反応溶液中には重合度２〜６のリジ
ンオリゴペプチドの生成が見られるが、反応３時間では
、ジ及びトリペプチドの２　ｆｉＩＩ類のみが蓄積され
た。

さらに、２４時間後で・は反応溶液中のペプチドはジペ
プチドに収束した。（ジペプチド９５％以上、トリペプ
チド５％以内） 実施例２ （リジンオリゴペプチドの合成に対する基質濃度の効果
） 実施例１の反応条件のうち基礎濃度のみを５０〜１　、
０００ｍ１ｌの間で種々変化させ反応を行った。この時
の２時間および２４時間後の反応収率を表２に示す０分
析法、分析条件は、実施例１と同様に行った。表２より
基質濃度５００ｍＭにおいて最高収率（２時間で５３％
、２４時間で５４％）を示した。

表 実施例３ （リジンオリゴペプチドの合成に対する酵素濃度の効果
） Ｌ−リジンエチルエステルを２０Ｏｎ＋Ｍまたは１．０
００ｍＭを含む　０．２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝析液ｐＨ
１０，０１）０ｍβに対してトリプシンを５〜２０ｆｌ
ＩＬＭとなるように添加し２５℃で２４時間まで反応を
行い、反応の収率を実施例１と同様にして分析した。

この時の２時間後および２４時間後での反応収率を表３
に示す。

実施例４ （リジンオリゴペプチドの合成に対する食塩の添加効果
） Ｌ−リジンエチルエステルを含む０．２ｖ炭酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨｌＯ，０１］Ｏｍ　（ｌに対してトリプ
シンを１）０１Ｉとなるように添加し、更に食塩を０．
１．０．５．１，０．１，５または２．０Ｍ添加し、２
５℃で２４時間まで反応を行い２時間および２４時間後
の反応収率を実施例１と同様にして分析した。

結果を表４に示す。この表より明らかなように塩濃度が
高い秤取率が向上した。

表　　　４ 実施例５ （リジンオリゴペプチドの合成に対するエステル基の効
果） Ｌ−リジンのエチル、ｎ−ブチル、ｎ−ヘキシル、ベン
ジルの各エステル２００ｍＭを含む０．２Ｍ炭酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ１０）　１０ｍ１！、にトリプシンを
ｌＯμｌとなるように添加し、２５℃、４０℃、５５℃
で２４時間まで反応を行い・２時間および２４時間後の
反応収率な実施例１と同様にして分析した。

結果を表５に示す。結果、エチルエステルよりもｎ−ブ
チルエステル、ｎ−ヘキシルエステルの方が高い収率を
示した。

表　　　５ 実施例６ （アルギニンのオリゴペプチドの合成）Ｌ−アルギニン
、エチルエステル５００ｍＭを含む０５１４炭酸緩衝液
（ｐＨ１０，０）　１０ｎｌに対してトリプシンを５０
ｇｋｌとなるように添加し、反応温度２５℃で２４時間
反応させた。反応収率の計算および生成物の分析は実施
例１と同様に行った。

表６に反応収率の時１間経過、第３図に生成物のクロマ
トグラムを示す０図および表より明らかなように６０分
の反応で反応収率は最高になり生成したトリペプチドの
分解も速（起こり、長時間反応を継続することによりア
ルギニルアルギニンのみを合成できる。

［発明の効果］ 本発明によれば、塩基性アミノ酸であるリジン、オルニ
チン、アルギニンのジペプチド、トリペプチドを酵素を
用いて簡便に製造することができる。

表　　　６

【図面の簡単な説明】

第 図 第１〜３図は、 本発明の詳細な説明するため の説明図である。 以 上 特 許 出 願 人 チッソ株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）Ｌ−塩基性アミノ酸エステルを含む緩衝液溶液中
   に蛋白質加水分解酵素を存在させ、該酵素の触媒作用に
   より該溶液から該Ｌ−アミノ酸オリゴペプチドを得るこ
   とを特徴とするＬ−塩基性アミノ酸オリゴペプチドの酵
   素的合成法。 （２）請求範囲（１）項に示した製造法において蛋白質
   加水分解酵素としてトリプシンを用いるＬ−アミノ酸オ
   リゴペプチドの酵素的合成法。 （３１請求範囲（１）項に示した製造法においてＬ−塩
   基性アミノ酸エステルとしてリジン、オルニチンまたは
   アルギニンを用いるＬ−アミノ酸オリゴペプチドの酵素
   製造法。 （４）請求範囲（１）項に示した製造法において反応温
   度４〜５０℃で１〜４８時間反応させることによりオリ
   ゴペプチドのうち該アミノ酸ジペプチドおよびトリペプ
   チドのみを高収率で得ることを特徴とするＬ−アミノ酸
   オリゴペプチドの製造法。 （５）請求範囲（４）項に示した製造法において反応条
   件の操作として反応時間を２４時間以上とすることによ
   り該Ｌ−アミノ酸ジペプチドのみを高収率で得ることを
   特徴とするアミノ酸ジペプチドの製造法。