JPH0468920B2 - - Google Patents

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JPH0468920B2
JPH0468920B2 JP58236505A JP23650583A JPH0468920B2 JP H0468920 B2 JPH0468920 B2 JP H0468920B2 JP 58236505 A JP58236505 A JP 58236505A JP 23650583 A JP23650583 A JP 23650583A JP H0468920 B2 JPH0468920 B2 JP H0468920B2
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JP
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bacteria
reduction
leukocytes
sample
cells
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JP58236505A
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Furanshisu Garudeino Robaato
Torokoniizu Berii Robaato
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Eastman Kodak Co
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Eastman Kodak Co
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Publication date
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Publication of JPH0468920B2 publication Critical patent/JPH0468920B2/ja
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5094—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for blood cell populations
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2304/00—Chemical means of detecting microorganisms
    • C12Q2304/20—Redox indicators
    • C12Q2304/24—Tetrazolium; Formazan
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q2326/90—Developer
    • C12Q2326/92—Nitro blue tetrazolium chloride, i.e. NBT
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10S435/805—Test papers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
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    • Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
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Description

【発明の詳細な説明】
発明の分野 本発明は、還元性基質を指示薬として用いて細
菌の存在を検出する水性試料の臨床分析に関す
る。 従来技術 特異的で有効な抗体の利用可能性の増大に相応
して、より迅速な感染の臨床的診断方法が要求さ
れている。感染の標準的診断方法は、感染してい
る細菌を含むと考えられる試料を培養するもので
あるが、この方法は熟練者でなければできない時
間のかかる方法である。このため、体液中の細菌
を検出及び定量するための化学的方法が探究され
ている。 １つの公知方法は指示薬として還元性色原体を
使用するものである。この方法はウロスクリーン
ＴＭ（UroscreenTM；トリフエニルテトラゾリウ
ム）として知られる試薬を使用するものであつ
て、「推定的細菌尿症の簡易な半定量的鑑別方法
（Ａ Simple Semiquantitative Diagnostic
Screening Method for Presumptive
Bacteriuria）」、フアイザー（Pfizer）、ダイアグ
ノステイルクス・デイビジヨン（Diagnostics
Division）、ニユーヨーク（小冊子）、1974年に記
載されている。ウロスクリーンTMは多数の細菌の
存在下で４時間のインキユベーシヨン後に還元さ
れてピンク〜赤の不溶性折出物になる緩衝化され
た乾燥試薬である。製造業者は、色の濃いまたは
血液を含んだ尿では結果が不鮮明になると注釈し
ている。 このタイプの方法には重大な問題がある。臨床
感染には著しい数の白血球を伴うことが多く、そ
れが分析のための試料中にも存在するであろう。
さらに感染がない場合でさえ、尿のような試料中
に著しい数の白血球が存在することもある。都合
の悪いことに、白血球もまた、ウロスクリーンTM
のような公知の色原体を還元し得るため、白血球
による色原体の還元は誤つた陽性の結果を生ず
る。このため、公知の細菌アツセイは信頼性がな
く、定量化はできない。 発明の目的 本発明の目的は細菌アツセイにおける白血球妨
害の問題を解決することにある。 発明の構成 本発明の目的は、検出可能な最終生成物を形成
する還元性指示薬と試料を接触せしめながらまた
は接触せしめる前に、細菌を溶解せずに白血球を
選択的に溶解するのに充分な量のノニオン界面活
性剤並びにサポニン及びジギトニンから選ばれた
アニオン界面活性剤の中から選ばれた界面活性剤
と試料を接触せしめ、インキユベートし、そして
存在する細菌の量を最終生成物の量の関数として
検出することによつて達成される。 作用 本発明は、細菌もしくは白血球または両者を含
む可能性のある水性試料を分析する方法に関す
る。このような試料は一般に、尿、血液及び脳脊
髄液のような体液を含む。疾病及び感染の診断に
おける手段として試料の細胞成分を検定するため
に分析を行なう。本発明によれば、水性臨床標本
中の種々の細胞成分を区別することができる。 任意の手段によつて白血球を溶解すると白血球
細胞の還元能は祖倍されることが判明した。「細
胞溶解」とは細胞単位の破壊または分解を意味す
る。還元阻害は細胞膜を完全または不完全に溶解
すると起こる。 本発明は選択的溶解方法、すなわち、細菌を溶
解せずに白血球を溶解する方法を用いるものであ
る。選択的溶解が可能なのは、２種の細胞の間に
構造上の相違があるためである。細菌は硬い細胞
壁で包まれているのに対し、白血球にはこの硬い
構造がない。白血球の硬い構造を破壊するいくつ
かの化学的及び機械的操作は細胞壁の状態に影響
を与えず、細胞壁は完全な状態に保たれる。 白血球を選択的に溶解する手段は、超音波振動
による試料の処理、すなわち、超音波処理と称さ
れる手法を含む。選択的溶解のためのこの処理は
当業界では公知である。一定条件の出力及び暴露
時間を用いて超音波処理することによつて白血球
を選択的に溶解し得る。超音波処理に適当な装置
としては、音響変換器−ホーン集成装置及びマイ
クロチツプ〔ヒート・システムズ−ウルトラソー
ニツクス社（Heat Systems−Ultrasonics，
Inc.），ニユーヨーク州プレーンビユーから入手
可能〕を装着した超音波発振器〔たとえば、ブラ
ンソンＪ−17A型（Branson model Ｊ−17A），
ブランソン・イオニツク・パワー社（Branson
Ionic Power Co.），コネテイカツト州ダンベリ
ー〕が挙げられる。白血球の選択的溶解のための
超音波処理法は、試料を氷浴中に保持しながら
100ワツトの出力を用いて20秒間の超音波処理に
２回暴露することを含んでなる。 選択的白血球溶解の好ましい方法は、細胞を界
面活性剤と充分に接触させることである。これら
の界面活性剤は、細菌細胞は溶解しないが白血球
細胞を溶解するのに充分な濃度及び量で用いる。
界面活性剤溶液は濃度は一般に概ね0.01〜1.0％
である。 選択的に白血球を溶解する有用な界面活性剤は
中性、すなわち、ノニオン界面活性剤である。こ
れらの例としてはたとえば、次のものが挙げられ
る：オクチルフエノキシポリエトキシエタノール
〔トリトン（Triton）Ｘ−100〕、ｎ−ノニルフエ
ノキシポリグリセロール〔オリーン（Olin）
10G〕、第二アルコールのポリエチレングリコー
ルエーテル〔タージトール（Tergitol）15−Ｓ−
12〕、ポリオキシエチレン（23）ラウリルエーテ
ル〔ブリツジ（Brij）35〕、及びポリオキシエチ
レン（８）ステアレート〔ミルジ（Myrj）45〕。 いくつかのアニオン界面活性剤も選択的白血球
溶解剤として有用である。これらの例はサポニン
及びジギトニンである。 白血球を選択的に溶解する手段及び白血球を選
択的に溶解するのに充分な界面活性剤の濃度を決
定する手段は以下の試験に従わなければならな
い。溶解手段は、その手段の白血球の還元活性に
対する効果を細菌の還元活性に対する効果と比較
することによつて試験する。潜在的白血球還元阻
害剤の選択性を評価するこの方法は次の通りであ
る。 処理が白血球細胞の溶解に有用か否かを決定す
るために、燐酸塩で緩衝化された生理食塩液
（PBS）（0.85％塩化ナトリウム中0.05M燐酸カリ
ウム緩衝液）中の白血球浮遊液（細胞約0.5×106
個／mlを含む）１mlを２個のアツセイ試験管の
各々にピペツトで分注する。特定の超音波処理法
を試験しようとする場合には、試験管の一方を超
音波で処理し、他方は対照として未処理のままに
しておく。PH7.0のPBS1mlの各試験管に加える。
特定の界面活性剤の溶解効果を試験するために
は、白血球浮遊液１mlを２個のアツセイ試験管の
各々にピペツトで分注する。一方の試験管には界
面活性剤を試験濃度（たとえば0.01グラムパーセ
ント〜1.0グラムパーセント）で含むPBS1mlを入
れ、他方にはPBS1mlを入れ、対照とする。全試
験管に10％グルコース50マイクロリツトル及び
PMS（フエナジンメトスルフエート）（１mg／ml
メタノール）50マイクロリツトルを加える。試験
管をボルテツクス（Vortex；VWR，ニユーヨー
ク州ロチエスター）のような攪拌機上で攪拌す
る。各試験管にMTT〔３−（４，５−ジメチル−
２−チアゾリル）−２，５−ジフエニル−2H−テ
トラゾリウムブロミド〕（10mg／mlメタノール）
15マイクロリツトルを加え、溶液を混合し、次い
で37℃で30分間インキユベートする。インキユベ
ート後、試験管をMTT還元について調べる。
MTT還元は赤紫色（パープル）の存在によつて
示される。超音波処理されたまたは界面活性剤で
処理された浮遊液がほとんどまたは全く還元を示
さないが対照がかなりの還元を示す場合には、溶
解手段はこの試験の最初の部分を満足させる。 阻害剤が選択的か否かまたは白血球と同様に細
菌にも影響を与えるか否かを決定するために、
PBS中の細菌細胞浮遊液（細胞約109個／ml）2.5
mlを２個のアツセイ試験管の各々にピペツトで分
注する。浮遊液中の適当な微生物としては次のも
のが挙げられる：大腸菌（Escherichia coli）、
プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）、
シユウドモナス・アエルギノーザ
（Pseudomonas aeruginosa）、スタフイロコツカ
ス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、及
びストレプトコツカス・フエカーリス
（Streptococcus faecalis）。一方の試験管には前
述の白血球浮遊液と同様な試験処理を行なう。す
なわち、超音波処理を行なうかまたはPBS2.5ml
中界面活性剤で処理する。他方は対照として未処
理のままとし、PBS2.5mlのみを加える。各試験
管に10％グルコース、PMS（１mg／mlメタノー
ル）及びMTT（10mg／mlメタノール）を各々100
マイクロリツトル加える。溶液を混合し、37℃で
15分間インキユベートした後、MTT還元を目視
検査する。前述の通り、還元活性は赤紫色の形成
によつて証明される。本発明に包含される、選択
的白血球溶解の手段である超音波処理法及び界面
活性剤は、前述の試験によれば、白血球還元を阻
害する（すなわち、対照では着色するのに対し、
試験浮遊液ではほとんどまたは全く着色が見られ
ない）が細菌還元活性を阻害しない（試験浮遊液
及び対照浮遊液の両方で着色が見られる）もので
ある。 前述の溶解法は、細胞の還元特性に基づくアツ
セイと組み合わせて使用される。活発に代謝を行
なつている細胞は、酸化−還元反応の複合系に携
わつている。細胞を含む培地に薬品を添加する
と、細胞はその代謝プロセスの間に薬品を作用す
る可能性がある。還元アツセイまたは還元型アツ
セイは、試験される細胞によつて化学的に還元さ
れて検出可能な最終生成物を生成する還元性指示
薬を試料に加えることを含んでなる。この型の試
験の例は、フオークマン（Forkman）及びダー
ルキスト（Dahlquist）の米国特許第3415718号に
記載されている。 細胞によつて還元されて比色分析、電位差滴定
または螢光分析のような任意の手段で検出され得
る最終生成物を生成する任意の化合物が還元分析
に有用であり、本明細書中ではこれを「還元性指
示薬」と称するものとする。色原体は好ましい還
元性指示薬である。本明細書中で用いる「色原
体」なる用語は、還元によつて有色の最終生成物
を生成する還元性指示薬を意味する。本発明の還
元分析に適当な指示薬は、細菌及び白血球によつ
て還元されることができ且つ検出され得る最終生
成物を生成する任意の化合物である。 本発明の実施に使用する、検出可能な物質に還
元され得る化合物は、還元阻害剤の不存在下にお
いてその酸化型が微生物によつて還元されて検出
可能な生成物を生成できる任意の化合物であるこ
とができる。このような検出はたとえば、電位差
滴定手段によつて実施できる。好ましくは、検出
可能な物質は輻射線測定手段によつて直接的に検
出され得る物質である。本明細書中において用い
る「輻射線測定手段」なる用語は、輻射線を用い
て分析結果を得る種々の分析的検出手段を含むも
のと定義する。 輻射線測定手段によつて直接的に検出され得る
種々の検出可能な物質を一部次に挙げる：(a)常用
の比色分析検出装置を用いてその存在または濃度
を測定するのに使用できる吸光係数または吸収ス
ペクトルを有する、比色分析によつて検出可能な
物質、たとえば、着色剤（すなわち、染料または
顔料）；ならびに(b)その物質から放射される輻射
線を検出し得る装置によつて検出され得る輻射線
放射物質、たとえば、螢光物質（螢光プローブ）。 染料または染料前駆体は有用な、検出可能な物
質である。染料の使用にはいくつかの可能性があ
る：(1)酸化還元反応によつて染料の色が別の色に
変化する、(2)有色の染料が無色になる、または(3)
無色の物質、すなわち、染料前駆体が有色の染料
になる。発色の色は消失よりも一般に容易に検出
され得るので、本発明の実施には前記(3)が好まし
い。 本発明の実施に使用できる染料の例は、メチレ
ンブルー、ジクロロインドフエノール、レゾアズ
リン、ならびに還元によつて有色のホルマザン染
料になる種々のテトラゾリウム化合物、たとえ
ば、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−
２，５−ジフエニル−2H−テトラゾリウムブロ
ミド、２，３，５−トリフエニル−2H−テトラ
ゾリウムクロリド、テトラニトロブルー、テトラ
ゾリウムクロリド及びニトロテトラゾリウムバイ
オレツトである。 本発明において有用なテトラゾリウム塩は一般
式（）で表わされるものであり、次のように一
般式（）のホルマザン染料に還元され得る。 前記式（）及び（）において、Yはアニ
オンを表わし；R1，R2及びR3は各々、アリール
または複素還式置換基（好ましくは５〜６個の原
子を含み、好ましいヘテロ原子はＮ，Ｓ，Ｏ及び
Seである）、たとえば、フエニル、置換されたフ
エニル、ナフチル、置換されたナフチル、置換さ
れたもしくは未置換のチアゾリル、ベンゾチアゾ
リル、オキサゾール、ベンゾキサゾール、セレナ
ゾールもしくはベンゾセレナゾール基を表わし；
R2はさらに、アルキル基（たとえば、メチル、
ブチル、ヘキシル、ドデシル等）もしくは置換基
（酸置換基を含む）、たとえば、−Ｈ、−OH、−
COOH、−SO3Ｈ、−SH、−NO2等、またはChem.
Rev.，55，355〜483（1955）においてホルマザン
もしくはテトラゾリウム塩のこの位置に存在する
ものとして記載されている他の任意の置換基を表
わすこともでき；置換基R1及びR2は金属キレー
トまたは錯体を形成し得る電子共有基を含むこと
ができる。このようなキレート基または錯体の例
は、第一、第二及び第三アミノ、イミノ、置換さ
れたイミノ、オキシム、チオエーテル、ケト、チ
オケト、ヒドロキシル、メルカプト、カルボキシ
ル、スルホ及びホスホ、アルコキシ基または錯体
である。 本発明に有用なテトラゾリウム塩としてはさら
に一般式（）のビス化合物を挙げることができ
る。これは微生物によつて還元されて一般式
（）のホルマザンを形成できる。 前記式（）及び（）において、Yはア
ニオンを表わし、Ｘはアルキレンまたはアリーレ
ン基を表わし、R1，R2及びR3は式（）及び
（）に関して前述した置換基を表わす。 本発明の実施に有用なテトラゾリウム塩の特定
の例は次の通りである： ａ トリフエニルテトラゾリウムクロリド ｂ ２，2′−（ｐ−ジフエニレン）−ビス（３，５
−ジフエニル）テトラゾリウムクロリド（ネオ
テトラゾリウムクロリドまたはNTとしても知
られる）； ｃ NTのメトキシ誘導体（BTブルーテトラゾ
リウムとしても知られる）； ｄ ２−（ｐ−ヨードフエニル）−３−（ｐ−ニト
ロフエニル）−５−フエニルテトラゾリウムク
ロリド（INT）； ｅ ２，2′−ジ−ｐ−ニトロフエニル−５，5′−
ジフエニル−３，3′−（３，3′−ジメトキシ−
４，4′−ビフエニレン）ジテトラゾリウムクロ
リド（ニトロ−BTとしもて知られる）； ｆ ２，2′，５，5′−テトラ−ｐ−ニトロフエニ
ル−３，3′−（３，3′−ジメトキシ−４，4′−ビ
フエニレン）−ジテトラゾリウムクロリド（テ
トラ−ニトロBTまたはTNBTとしても知られ
る）； ｇ ３−（４，５−ジメチル−チアゾリル−２）−
２，５−ジフエニルテトラゾリウムブロミド ｈ ２，2′−ジ−（３−ニトロフエニル）−５，
5′−ジメチル−３，3′−（４，4′−ビフエニレ
ン）ジテトラゾリウムクロリド（イエロ−テト
ラゾリウムまたはYTとしても知られる）； ｉ ２，３，５−トリ（ｐ−ニトロフエニル）−
テトラゾリウムブロミド（TNTTC）； ｊ ２−フエニル−３−（３−メトキシ−４−フ
エニル）−５−（ｐ−ニトロフエニル）−テトラ
ゾリウムクロリド（半ニトロBTとしても知ら
れる）；及び ｋ ２，５−ジ（ｐ−ニトロフエニル）−３−（３
−メトキシ−４−フエニル）−テトラゾリウム
クロリド（半TNBTとしても知られる）。 これらの化合物に関するより詳細な情報は、ヒ
ストケミストリー、セオレテイカル・アンド・ア
ブライド（Histochemistry，Theoretical and
Applied），A.G.E.パース（Pearse）著、第２巻、
第３版、880〜883ページ、チヤーチル・リビング
ストン（Churchill Livingstone）、エジンバラ及
びロンドン、1972年から得られる。 水性試料中の細菌の溶液式アツセイは、選択的
溶解による白血球阻害及びそれに続く還元分析と
いう前述の手法を用いるものである。尿のような
体液の試料を試験用に入手する。試料は新鮮で均
質であることが好ましい。好ましい白血球阻害手
段は、前述の中性またはアニオン界面活性剤の１
つを利用するものであり、これは細菌を溶解せず
に白血球を選択的に溶解するのに有効な濃度で加
える。検出可能な最終生成物を生成する還元性基
質、好ましくは、色原体を指示薬として加える。
ここで好ましい色原体指示薬はMTTで、その好
ましい使用濃度は５×10-5Ｍ〜５×10-4Ｍであ
る。細胞から基質に電子を移動させることによつ
て還元反応を速めることのできる電子移動剤を加
えるのが好ましい。染料の還元電位と細胞の還元
電位との中間の還元電位を有する、適当に置換さ
れたフエナジン類、ベンゾキノン類及びナフトキ
ノン類が有用である。有用な電子移動剤の例はフ
エナジンメトスルフエート（PMS）であり７×
10-5Ｍ〜４×10-4Ｍで使用するのが好ましい。他
の有用な電子移動剤としては、フエナジンエチル
スルフエート、メルドラブルー、メナジオン、ト
リメチルベンゾキノン等が挙げられる。 アツセイへの他の有用な添加剤としては、細胞
反応にエネルギー源を提供するグルコースまたは
他の代謝され得る化合物が挙げられる。 色原体還元の量は、精度の必要性に応じていく
つかの方法で検出できる。発色の目視検査によつ
て充分な情報が得られる場合には、試料を混合
し、次いで好ましくは30分間またはそれ以下、20
〜45℃においてインキユベートし、然る後に目視
検査する。パーキン−エルマー（Pekin−Elmer）
572のような分光光度計で吸光度を測定すること
によつて、結果のより正確で定量的な読みが得ら
れる。色原体還元の量は37℃における540nmの吸
光度の10分間の変化として定義する。吸光度法に
おいては標準曲線が有用である。この曲線は、既
知量の細菌を含む浮遊液に前述の還元アツセイ法
を行なうことによつて得られた吸光度値をプロツ
トすることによつて作製する。次いで、臨床試料
からの吸光度値を標準曲線と比較して存在する細
菌数を読み取る。 細菌の存在を検出することは臨床診断において
有効な手段であるが、含まれる微生物の同定もま
た必要であろう。微生物の主要な特性の１つは、
よく知られたグラム染色法に対する反応である。
細菌は、グラム陽性及びグラム陰性として知られ
る２群に類別される。これらの２つの型の識別
は、抗菌療法及び細菌のより詳細な同定法の選択
に影響を与える有用な決定である。 前述の白血球還元阻害法とグラム陽性菌の選択
的阻害とを組み合わせることによる、グラム型を
区別する細菌アツセイは有用である。溶液中で実
施する分析は、３，９−ジエチルトリデカノール
硫酸ナトリウム〔タージトール（Tergitol）７〕
のような第２の界面活性剤を添加して、既に前述
した方法を用いて行なう。タージトール７は約
0.1〜10％（ｖ／ｖ）の濃度で用いる場合にはグ
ラム陽性細菌の還元活性阻害剤である。最適PH範
囲は７〜8.5である。還元性基質、好ましくは色
原体を前述のようにして加える。好ましい添加剤
は電子移動剤、フエナジンメトスルフエート、グ
ルコース、トリトン（Triton）Ｘ−100及びター
ジトール７である。色原体還元は試料中にグラム
陰性細菌が存在することを示す：この方法は、高
濃度の塩のようなグラム陰性菌の阻害剤と組み合
わせるとグラム陽性菌の検出にも有用である。 アツセイ組成物は、10-4Ｍ〜10-6Ｍの濃度の還
元性指示薬、好ましくは色原体、選択的溶解を惹
起するのに適当な量の、細菌を溶解せずに白血球
を選択的に溶解する界面活性剤、ならびに白血球
及び／または細菌を含むと考えられる水性試料を
含んでなる。このような組成物の好ましいPH範囲
は7.5〜8.2で、このPHは無機燐酸塩のような緩衝
剤によつて保持される。さらに、前に有用である
と述べた他の添加剤、たとえば、電子移動剤
（10-4Ｍ〜10-6Ｍ）及びグルコース（0.1〜1.0ｇ
％）を含むことが好ましい。 前述のアツセイは、プルツイビロヴイツジ
（Przybylowicz）及びミリカン（Millikan）の米
国特許第3922158号及びパース（Pierce）及びフ
ランク（Frank）の米国特許第4258001号に記載
されたような試験要素を用いて乾式でも実施でき
る。このような要素は、支持体、好ましくは塗布
層及び試薬層から成る。試薬層は試薬／塗布混合
層であつてもよいし、別個の塗布層を試薬層上に
塗つてもよい。支持体は、前述の特許に記載され
た任意の適当な材料、たとえば、ポリ（エチレン
テレフタレート）から成る。 支持体と試薬層の間に下塗り層を設けることも
できる。下塗り層として有用な材料の例は、ポリ
（アクリルアミド−co−Ｎ−ビニル−２−ピロリ
ドン）またはポリ（アクリルアミド）のようなポ
リマー及びゾニル（Zonyl）FSNのような界面活
性剤である。 試薬層はMTTのような還元性色原体（約0.1
ｇ／m2〜0.2ｇ／m2）及びPMSのような電子移動
剤（約0.01〜0.1ｇ／m2）を含む。特定のアツセ
イに使用される要素には、試薬層中に阻害剤とし
て種々の界面活性剤を混合しなければならないこ
ともある。全ての細菌をアツセイできるように設
計された要素は白血球の還元活性の選択的阻害剤
としてアニオンまたは中性界面活性剤を含む（約
１ｇ／m2〜10ｇ／m2）。グラム識別アツセイに使
用される要素は２種の界面活性剤、すなわち、白
血球を選択的に阻害する界面活性剤（約１ｇ／m2
〜10ｇ／m2）及び一方のグラム型の細菌を選択的
に阻害する界面活性剤（約１ｇ／m2〜10ｇ／m2）
を含む。塗布／試薬混合層は米国特許第4258001
号に記載された高分子構造、たとえば、ポリ（ビ
ニルトルエン−co−ｐ−ｔ−ブチル−スチレン
−co−メタクリル酸）を含むことができる。試
薬層は要素内のどの位置にあつてもよく、試薬は
塗布層に混合することができる。 これらの乾燥試験要素の使用法は試料を好まし
くは10マイクロリツトル試薬層表面にスポツトす
ることを含んでなる。スポツトする直前に試料に
グルコース0.2ｇ％を加えるのが好ましい。色原
体還元の検出は、反射濃度計で約540nmで反射濃
度（DR）を測定することによつて行なう。次い
で、ブランク対照要素に、PBS及びグルコース
を含むが細胞を含まない液をスポツトする。イン
キユベーシヨン及び検出の方法は少なくとも２つ
ある。第一の方法では、550nmにおけるDRを37
℃において10分間測定する。10分間の反射濃度の
変化（ΔDR10分）を、10分後におけるDRから０
分におけるDRを差し引いてから対照のΔDR10分
を差し引くことによつて算出する。第二の方法で
は、乾燥要素にスポツトした後、水分平衡室中で
適当な時間、20〜45℃においてインキユベートす
る。インキユベートした後、DRを測定する。試
験試料の15分後のおけるDRから細胞を含まない
対照の15分後におけるDRを差し引くことによつ
て、15分後におけるΔDRを算出する。 反射濃度を、存在する細胞の量と関連づける標
準曲線を作製できる。既知量の白血球及び細菌を
含む浮遊液を調製し、前記方法に従つて測定す
る。このように、乾式アツセイは迅速で定量的で
ある。 実施例 以下の実施例は本発明をさらに詳細に説明する
ものである。 以下の材料を実施例中で用いた： 白血球浮遊液はヒトの血液から調製した。 細菌浮遊液はメリーランド州ロツクビルのアメ
リカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨン
（American Type Culture Collection）から入
手した微生物から調製した。 フエナジンメトスルフエート（PMS）、サポニ
ン、ジギトニン、ポリオキシエチレン（20）ソル
ビタンモノオレエート〔トウイーン（Tween）
80〕、ナトリウム3.9ジエチルトリデカノールサル
フエート〔タージトール（Tergitol）７〕、第二
アルコートのポリエチレングリコールエーテル
（タージトール15−Ｓ−12）、及びオクチルフエノ
キシポリエトキシエタノール〔トリトン
（Triton）Ｘ−100〕はミズーリ州セントルイス
のシグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Co.）
から購入した。 ポリオキシエチレン（23）ラウリルエーテル
〔ブリジ（Brij）35〕及びポリオキシエチレン
（８）ステアレート〔ミルジ（Myrj）45〕はデラ
ウエア州ウイルミントンのICIアメリカ社
（ICIAmericas，Inc.）から入手した。 フルオロケミカル界面活性剤ゾニル（Zonyl）
FSNはデラウエア州ウイルミントンのE.I.デユポ
ン・ド・ネモアース社（E.I.Dupont de
Nemours and Co.）から入手した。 Ｎ−ノニルフエノキシポリグリセロール〔オリ
ーン（Olin）10G〕はコネクテイカツト州スタン
フオードのオリン社（Olin Corp.）から入手し
た。 他の全ての薬品は試薬用であつて、ニユーヨー
ク州ロチエスターのイーストマン・コダツク社
（Eastman Kodak Company）から入手した。 溶液式アツセイは、５−セルプログラマー及び
温度調節器を装着したパーキン−エルマー
（Perkin−Elmer）572分光光度計を用いて実施し
た。 乾燥要素アツセイには、常用の反射濃度計を変
形したものを用いた。 多層乾燥試験要素は次の構成で調製した： 塗布／試薬層 ポリマービーズ及び結合剤、 界面活性剤 ３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−
２，５−ジフエニル−2H−テトラゾ リウム
ブロミド（MTT）（0.11ｇ／m2）ならびに電子移
動剤。 下塗り層 支持体層 ポリ（エチレンテレフタレート） 実施例 １〜７ 細胞溶解による白血球の還元活性の選択的阻害 ヒトの血液から調製した、PH7.0のPBS中に白
血球を含む溶液をアニオンもしくは中性界面活性
剤または超音波によつて処理した。顕微鏡検査に
よつて細胞が完全に溶解したことが示された。次
いで、溶液を還元活性についてアツセイした。 白血球浮遊液１mlをアツセイ試験管中にピペツ
トで分注した。PH7.0のPBS1mlまたは界面活性剤
を含むPBS1mlをこのアツセイ試験管に加えた。
全試験管に10ｇ％グルコース50μ及びPMS（１
mg／mlメタノール）50μを加えた。試験管の内
容物を攪拌した。各試験管にMTT（10mg／mlメ
タノール）50μを加え、試験管の内容物を再び
攪拌し、そして37℃で30分間インキユベートし
た。 インキユベートした後、溶液をMTT還元につ
いて目視検査した。MTT還元は赤紫色（パープ
ル）の存在によつて示される。還元の度合を、経
験を積んだ観測者の主観的評価によつて０（無色、
還元なし）から４＋（濃赤紫色、極めて強い還元）
まで等級付けした。１，２及び３は発色の中間的
な濃さと中間的な還元量を表わす。 結果を第表に示す。病院の患者の血液から調
製した白血球の試料から無作為に抽出したものに
は、少量からなりの量まで対照溶液において常に
若干の検出され得る還元が見られた。この反応に
おける可変性は、存在する白血球数及び細胞の活
性レベルに患者間で差があるためである。この予
知できない可変性は細菌アツセイにおける白血球
妨害を相殺しようとする場合に問題の一部にな
る。しかしながら、試験された材料全てについ
て、妨害の大きさと無関係に、全ての場合に白血
球反応をゼロまで減少させた。 細菌によるMTT還元の溶液アツセイを、阻害
効果が選択的であるか否かを測定するために前述
の白血球の研究で用いられたのと同一の界面活性
剤を添加して実施した。PBS中の細菌細胞浮遊
液（細胞〜109個／ml）2.5mlに表に示された阻害
剤を含むPBS2.5mlを加えた。浮遊液に10％グル
コース、PMS（１mg／mlメタノール）及びMTT
（10mg／mlメタノール）を各々100μ加えた。試
験管の内容物を攪拌し、37℃で15分間インキユベ
ートした後、目視検査した。 第表に示した結果は、界面活性剤は白血球の
還元活性を阻害するが細菌の還元活性を阻害しな
いことを示している。このことは、界面活性剤の
存在下における白血球の反応がゼロであるのに対
し、界面活性剤の存在下における細菌の反応が４
または４＋である事実によつて示される。従つ
て、臨床試験が未知量の両方の型の試料を含む場
合、これらの溶解剤は還元に基づく細菌アツセイ
から白血球妨害を除く。
【表】 実施例 ８ 細菌及び白血球の両者による還元に対するTX−
100の濃度効果 MTTの細菌及び白血球の両者による還元に対
するTX−100の濃度効果を調べた。細菌細胞浮
遊液及び白血球細胞浮遊液を調製した。細胞の溶
液はトウイーン80及びグルコース各々0.3％、
MTT4.0×10-4Ｍ、PMS5.4×10-5Ｍならびに
種々の濃度のTX−100を含んでいた。TX−100
の各濃度について細胞を含まない対照溶液を調製
した。 37℃で10分間、分光光度計で540nmにおける吸
光度を測定した。第表に示した結果（ΔA）
は、10分後の540nmにおける吸光度から０分の
540nmにおける吸光度と適当な対照のΔA540nm
を差し引いたものを表わす。試験された細菌によ
るMTT還元は0.1，0.5または1.0％のTX−100の
存在下では阻害されなかつたが白血球による
MTTの還元は試験されたMTTの全濃度で阻害
された。0.1％のTX−100の存在下で白血球に関
して得られた大きな負の値は、細胞が徐々に溶解
する時に溶液の濁り度の減少が測定されるためで
あつた。これより高濃度のTX−100の場合には、
細胞溶解は速かであり、０分においてほとんど完
全であるため、濁り度の減少は瞬間的に起こり、
測定されなかつた。
【表】 実施例 ９ 細菌及び白血球による還元に対するオリーン10G
の濃度効果 溶液中における細菌及び白血球によるMTTの
還元に対するノニオン界面活性剤オリーン10Gの
効果を調べた。グルコース0.2％、MTT2.4×
10-4Ｍ、PMS2.0×10-4Ｍ及びオリーン10Gを含
む細菌溶液及び白血球溶液を調製した。試験する
オリーン10Gの各濃度について細胞を含まない対
照溶液を調製した。前記実施例８と同様にして10
分間の540nmにおけるΔAを測定した。 第表に示した結果は、白血球によるMTT還
元は0.1，0.5及び1.0％（ｖ／ｖ）のオリーン10G
で阻害されるが大腸菌によるMTTの還元は試験
した全濃度のオリーン10Gで阻害されなかつたこ
とを示している。
【表】 ＊ 無作為に抽出した４個の試料の平均
実施例 10 白血球及びグラム陽性細菌の還元阻害剤の組み合
わせ効果 無作為に抽出した３個の白血球の試料（平均濃
度：細胞4.9×106個／mlPBS）を、グルコース0.2
％、PMS0.2mM及びMTT0.24mMを含む溶液中
で37℃において10分間インキユベートした。溶液
はさらに、グラム陽性細菌の還元活性を阻害する
界面活性剤、タージトール７を0.1％及び／また
はTX−100を0.5％含んでいた。対照溶液は界面
活性剤以外の前記成分を全て含んでいた。540nm
における吸光度を０分及び10分において測定し
た。各溶液について10分間のΔAを前述と同様に
して算出した。 第表に示した結果は、白血球によるMTT還
元を阻害るTX−100の能力をタージトール７が
妨害しないことを示している。従つて、これら２
種の界面活性剤は組み合わせて使用することがで
き、グラム陰性細菌のアツセイを提供できる。こ
のアツセイは、白血球を阻害するためにグルコー
ス、PMS、MTT、TX−100をそしてグラム陽
性菌を阻害するためにタージトール７を、前述し
たような臨床標本に添加することを含んでなる。
インキユベートした後、赤紫色（パープル）によ
つて示される還元は、グラム陰性細菌の尺度であ
る。
【表】 実施例 11 乾燥要素形式における細菌及び白血球の還元に対
するTX−100の効果 前述の手法に従つて乾燥要素を調製した。試験
要素は試薬層中に5.38ｇ／m2のTX−100を含み、
対照要素は0.22ｇ／m2のゾニルFSNを含んでい
た。 グラム陰性細菌である大腸菌及びプロテウス・
ブルガリスならびにグラム陽性菌であるスタフイ
ロコツカス・アウレウス及びストレプトコツカ
ス・フエカーリスを各々含む４個の細菌浮遊液を
PH7.5の燐酸カリウム緩衝液中に細胞１×109個／
mlの濃度で調製した。無作為に抽出した４個の白
血球試料をPH7.5の0.05MPBS中に細胞7.3，9.4，
11.6及び13.8×106個／mlの濃度で浮遊せしめた。
各試料にグルコースを加えて最終濃度を0.2％と
した。 各要素に各試料10μをスポツトした。10分
間、540nmで反射濃度（DR）を監視した。緩衝
液ブランクについても測定し、前述のようにして
算出した全ΔDR値を適当な緩衝液ブランクのバツ
ググラウンド濃度で補正した。 第Ｖ表に示した結果は、乾燥要素形式において
TX−100は白血球による色原体還元を阻害する
がグラム陰性細菌またはグラム陽性細菌による色
原体還元は阻害しないことを示している。乾燥形
式の細菌アツセイは、白血球阻害剤を含む前述の
試験要素を使用することを含んでなる。要素に細
菌及び／または白血球を含む可能性のある試料液
をスポツトし、前述の手法に従つて処理する。
ΔDRは試料中に存在する細菌を表わす。
【表】 発明の効果 細菌に溶解せずに白血球を選択的に溶解するの
に充分な量の界面活性剤を還元性指示薬と共に試
料に接触せしめ、そして還元によつて形成された
最終生成物の量の関数として細菌を検出すること
によつて水性試料中の細菌を検出することを含ん
でなる本発明の方法は、細菌アツセイにおける白
血球による妨害を有利に減少させる。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 水性試料中の細菌を検出する方法であつて、 Ａ 該試料を、細菌を溶解せずに白血球を選択的
    に溶解するのに充分な量のノニオン界面活性剤
    並びにサポニン及びジギトニンから選ばれたア
    ニオン界面活性剤の中から選ばれた界面活性剤
    と接触せしめ； Ｂ 前記工程Ａの試料を、検出可能な最終生成物
    を形成する還元性指示薬と接触せしめ； Ｃ 前記工程Ｂの試料をインキユベートし；そし
    て Ｄ 存在する細菌の量を、前記工程Ｃにおいて還
    元によつて形成された最終生成物の量の関数と
    して検出する ことを含んでなる検出方法。
JP58236505A 1982-12-27 1983-12-16 水性試料中の細菌の検出方法 Granted JPS59120100A (ja)

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