JPH0465981B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、遠心分離で分離された血液試料の、
顆粒細胞及び赤血球を含むより重い層を、血小
板、白血球及び単球を含むより軽い層から分離す
る方法及び装置に関するものである。 一般に血液の分析には詳細な分析のための白血
球の単離および分離を必要とする。一般に、白血
球の分離のためには、二つの異なる方法が使用さ
れている。これらのうちの一つは、特にニユート
ン性の液体中での細胞の浮遊密度遠心分離法であ
る。最も一般に使用される液体は、フイコール−
パツク（Ficoll Paque）の名で知られる、スウ
エーデン、ウプサラのフアルマシア・フアイン・
ケミカルスABから市販されている、比重1.077
ｇ／c.c.の水溶性液状物である。第二の方法は、非
ニユートン性、水不溶性、チキソトロピー性のゲ
ル様物質であつて、リンホサイト（白血球）を含
む軽い相と赤血球および顆粒球を含む重い相との
間に、容器内に沿つて連続的半固体ゲル様シール
を形成する物質を使用することである。 上記「フイコール−パツク」法は次の一般的方
法による： (1) 所定量のフイコール−パツクを、試験管のよ
うな遠心分離に適する容器の底部へ注加し、 (2) 全血又は希釈血のサンプルを注意深くフイコ
ール−パツク上にピペツトでのせ、 (3) 次に、フイコール−パツク／血液を約400ｇ
で約30分間遠心分離して、血液成分を層分離さ
せ、白血球を含む単核細胞層よりなる上部の軽
い相とフイコール−パツク中に移動もしくはそ
れを通過して移動する赤血球および顆粒球を含
む底部の重い相とを形成させ、 (4) 上部血漿層をピペツトで取り除き、後にフイ
コール−パツク表面上の白血球層を残し、 (5) 清浄なパスツールピペツトを用いて白血球層
を清浄な遠心分離管へ移す。 しかし、フイコール−パツク法はいくつかの欠
点を有する。第一に、作業者の非常に細かい技術
が要求される。もし、最初の血液サンプルの導入
において、注意が欠けると、白血球がフイコール
−パツク基質の表面より下側に拡散し、フイコー
ル−パツクの局部的比重を減少させ、白血球およ
び単核球の分離を不十分とする。 第二に、フイコール−パツクの表面から白血球
層を洗浄のために清浄な遠心管に移す際にも注意
深い技術を要する。この移し変えの際にはフイコ
ール−パツクの移動を最少限に抑えながら全ての
界面部を移動させることが重要なためである。 第三に、遠心分離中に血液中の軽い相がフイコ
ール−パツク基質中に入り込むと、その後この基
質中を上昇することはできない。これは、約400
ｇという低い遠心力を使用するため生じる遠心力
が低いことによる。 第四に、約400ｇより大きな遠心力を使用する
ことは出来ない。この理由は、フイコール−パツ
クは水溶性であり、遠心力を強めると血液サンプ
ル中への溶解性が大きくなり、フイコール−パツ
クの比重が変化して分離効率の実質的変化が生じ
るためである。 第五に、この方法は終了まで１ないし２時間を
必要とする。より迅速な方法が切望されている。 より迅速な方法は、白血球を含む軽い相と赤血
球及び顆粒球を有する重い相との間にバリヤーを
形成させる、非ニユートン性、水不混和性、チキ
ソトロピー性のゲル様物質（以下、単にゲル様物
質と略称する）の使用により達成される。この方
法はルデレール（Luderer）の米国特許第
4190535号、ザイネ（Zine）の米国特許第3852194
号、ベネツト（Bennett）の米国特許第4147628
号、ケスラー（Kessler）の米国特許第4350593号
およびケスラーの米国特許第4153739号に記載さ
れている。ゲル様物質を軽い相と重い相との間に
バリヤー層を設けるために使用することは、フイ
コール−パツク法に比べて軽い相および重い相を
分離するためのより迅速且つ容易な方法を一般に
提供する。しかしながら、血液分離手段における
ゲル様物質の使用にも短所がある。最も重大な短
所は、遠心分離後にゲル様物質の直上に存在する
白血球層が、ゲル様物質の直下に存在する顆粒球
の混入を受け易いことである。したがつて、血液
サンプルを白血球及び単核球を含む軽い相と、赤
血球および顆粒球を含む重い相から分離するため
の、迅速で且つ後続の分析のために混在物のない
白血球成分のみを提供しうる方法および装置の出
現が望まれていた。 本発明は、フイコール−パツク法より迅速で、
チキソトロピー性ゲル様物質を単独で使用する方
法よりも分離性の優れた、血液サンプル中の白血
球および単核球を赤血球および顆粒球から分離す
る方法である。 最も広い範囲において、本発明の方法は、次の
一般的工程よりなる： (1) フイコール−パツクのような水溶性密度勾配
物質を遠心分離に適する開口容器に添加する。 (2) 前記のような非ニユートン性、水不溶性、チ
キソトロピー性のゲル様物質のような水不溶性
ゲル様物質を、上記容器の水溶性密度勾配物質
の上に添加する。 (3) 血液サンプルをこの容器に加え、これをフイ
コール−パツク法におけるより若干高い遠心力
で遠心分離し、この間にゲル様物質と水溶性密
度勾配物質によるバリヤーを重い血球細胞と軽
い血球細胞の間に形成させ、そして (4) 血液の血漿分画をバリヤー層の上部から取り
除き、白血球、単核球および血小板を含有する
層を後に残し、これを次の分析に用いるため容
易に回収する。分離操作の間、赤血球および顆
粒球を含む重い血液分画はバリヤー層を通過し
て、容器の底に集められる。 本発明の重要点は、血液の重い細胞が、水溶性
密度勾配物質を通過する際、血液中の血漿の少量
を伴つて移動することである。このため、水溶性
密度勾配物質の一部が希釈され、この希釈物は遠
心分離中にゲル様物質を通過上昇して、ゲル様物
質の上部で単核細胞の下部に水溶性密度勾配物質
中間層を形成する。この水溶性密度勾配物質中間
層は、ゲル様物質の層の下方に横たわる水溶性密
度勾配物質の大部分と協力して、単核細胞層の夾
雑から効果的に顆粒球細胞を隔離するために役立
つ。これにより、顆粒球による混在なしに単核球
細胞が一層きれい且つ一層効果的に分離できる。
ゲル様物質の組成または混合は厳密でなくてよ
い。本発明の方法においては水不混和性、チキソ
トロピー性、ゲル様物質について記載された任意
の先行技術組成物を使用できる。例えば、米国特
許第4190535号はシリコン流状物と非常に微細な
疎水性シリカ粉末の混合物の使用によるゲル様物
質の提供につき記載している。この特許明細書に
は、アモコ ケミカル コーポレーシヨン
（Amoco Chemical Corporation）シカゴ イリ
ノイから市販され、同社の技術情報（bulletin）
12−11に主として高分子量モノ−オレフイン（85
−98％）よりなり、残部はイソパラフインである
ブチレン ポリマーとして記載されているポリブ
タン11−100を炭化水素系ゲル様物質として使用
することも記載している。このポリブチレンをヒ
ユームドシリカ粉末と混合して、水不混和性、チ
キソトロピー性のゲル様物質の製造している。他
に有用なものは重合度が約50のヒドロキシ末端ブ
タジエンホモポリマーである。これをヒユームド
シリカ粉末と混合して適する水不混和性−チキソ
トロピー性のゲル様物質を得る。ゲル様物質とし
て使用するに好ましい物質は、ケスラー
（Kessler）の米国特許第4350593号に記載されて
いるような、ポリエステルである。特に好ましい
ものは、エメリー インダストリー社から市販さ
れているポリエステルである単一成分ポリエステ
ル＃NB2042−108である。このポリエステル組
成は適当な比重を得るためにシリカ粉末と混合す
る必要がないため本発明のゲル様物質としての使
用に特に好ましい。シリカ粉末の使用は、フロー
サイトメトリー装置のようなある種の装置で、回
収した白血球を分析するためには、有害であるこ
とが判明している。従つて、適する比重を有する
ポリエステルの使用が好ましい。 一般に、ゲル様物質は次の要件に合致する必要
がある。 (a) ゲル様物質は、単核細胞の比重と顆粒球およ
び赤血球の比重の中間の比重を有する必要があ
る。一般に、ゲル様物質の比重は約1.07乃至約
1.85ｇ／c.c.、好ましくは約1.075乃至約1.08ｇ／
c.c.、最も好ましくは1.077ｇ／c.c.である； (b) ゲル様物質は、血液中に存在する成分に対し
て化学的に不活性で有ることを必要とする； (c) ゲル様物質はチキソトロピー性である。即ち
この物質は、分離操作で使用される遠心分離力
下で流動性であつて遠心分離後にバリヤーを形
成しなければならない。 水溶性密度勾配物質は、好ましくはフイコール
−パツクタイプの物質である。フイコール−パツ
クは、フイコール−400とナトリウム・ジアトリ
ゾエート（diatrizoate sodium）の水溶液であ
る。フイコール−400は、庶糖とエピクロロヒド
リンとの合成高分子（平均分子量4000）ポリマー
であり、水に容易に溶ける。フイコール−400の
分子は高度に枝分かれしており、ほぼ粒状であ
り、同一分子量の線状ポリサツカライドに比べて
低い固有粘度を有する。ナトリウム・ジアトリゾ
エートは、低粘度および高い密度の溶液を形成す
るからフイコール−400とともに使用するために
都合よい化合物である。ナトリウム・ジアトリゾ
エート（分子量635.92）は３，５−ジアセタミド
−２，４，６−トリヨード安息香酸のナトリウム
塩である。フイコール−パツクの比重は、フイコ
ール−400の中に含まれるナトリウム・ジアトリ
ゾエートの量を変化させて調節することができ
る。フイコール−パツクは各100ml中に5.7ｇのフ
イコール−400と９ｇのナトリウム・ジアトリゾ
エートを含有する。本発明に使用するには、フイ
コール−パツクの比重は約1.08乃至約1.100ｇ／
c.c.の範囲に調節することが好ましく、更に好まし
いのは約1.085乃至約1.095、最も好ましいのは
1.090ｇ／c.c.である。 本発明で使用するために、約5.7ｇ乃至6.0ｇの
フイコール−400および約11.0ｇ乃至約12.0ｇの
ナトリウム・ジアトリゾエートを含有する水性溶
液が水溶性密度勾配物質の使用に適する。 本発明の方法は、通常の開口採血チユーブおよ
び血液サンプルの挿入のための針で刺通可能な隔
壁で口部が閉じられた採血チユーブのどちらにも
有用である。開口チユーブ系においては、ゲル様
物質および水溶性密度勾配物質を、任意の順序で
チユーブ中に適当な量で添加する。例えば、７ml
試験管におけるゲル様物質の適当量は約1.2ｇで
あり、水溶性密度勾配物質の適当量は約1.0ｇで
ある。これにより、約５ml迄の血液サンプルを分
離可能である。フイコール−パツク法で要求され
た血液サンプルの注意深い重層の問題を避けるた
め、ゲル様物質および水溶性密度勾配物質を含有
する採血試験管は、血液サンプル添加前に予備−
遠心分離しておく必要がある。予備−遠心分離は
水溶性密度勾配物質を試験管の底に移動させ、ゲ
ル様物質が水溶性密度勾配物質の上面にバリヤー
を形成させている。次いで、血液サンプルを特別
注意すべき技術を要せずに採血試験管に挿入出来
る。 サンプルを採血試験管の水溶性密度勾配物質の
上面に添加した後、採血試験管を適当な加重で適
当な時間遠心分離する。通常、約600ｇから約
2000ｇの遠心加重を使用して、約20ないし約５分
間行う。 第１図に示す通り、予備−遠心分離の後、採血
試験管１５中の水溶性密度勾配物質１３の上面に
ゲル様物質１１がバリヤーを形成する。血液サン
プル１７を第２図に示す通り、ゲル様物質１１の
バリヤーの上面に重層する。遠心分離の後、血液
サンプルは第３図に示す通り、数層に分離する。
赤血球１９は最も底に層となる。顆粒球の層２１
は赤血球１９の上に存在する。水溶性密度勾配物
質の大部分は顆粒球２１の上部に存在する。前記
のとおり、赤血球は水溶性密度勾配物質の層を通
過して移動するとき少量の血漿を一緒に運ぶ。こ
のため、水溶性密度勾配物質の一部分の比重が若
干減少し、これが遠心分離中にゲル様物質のバリ
ヤー層を通過して移動し、第３図に示す通り、水
溶性密度勾配物質の少量部分の層２３を形成す
る。白血球、単核球および血小板の層２５は比重
の減少した水溶性密度勾配物質１３の層２３の上
に存在する。血漿２７が最上部の層である。 次いで、血小板、白血球および単核球の層２５
を水溶性密度勾配物質の層２３の表面上に乱れの
ないよう残すようにして、血液の血漿部分を取り
除く。通常の方法としては、パスツールピペツト
を使用して、血漿層２７を除去し、白血球、単核
球および血小板の層２５を乱れのない状態で後に
残す。 次いで、白血球、単核球および血小板の層２５
を、次の二つの方法のいづれかで取り出すことが
できる。一つの方法では、パスツールピペツトを
使用して、層２５を清浄な遠心分離チユーブに洗
浄のために移す。べつの方法では、単核球細胞お
よび血小板の層２５の上に直接緩衝化塩類液を注
加することができる。ゲル様物質の層１１が、緩
衝化塩類液と顆粒球および赤血球との相互作用を
防止する。次いで単核細胞をバリヤー層１１の頂
部から取り出すために、単に緩衝化塩類液および
単核細胞の混合物を採血試験管１５から流し出す
ことができる。 以下の実施例及び比較例により、本発明をさら
に説明するが、この実施例は限定的なものと解す
べきではない。 比較例 １ 血液サンプルの一定量を密度1.077ｇ／mlを持
つポリエステル系チキソトロピーゲルの上面に重
層した。900×Ｇで10分間遠心分離を行つた。血
漿をサイフオンで除いて緩衝化塩類液を加え、泡
だておよびピペツト操作で細胞に穏やかな乱れを
与え、細胞を収穫した。単核細胞の収量は84％そ
してこの単核細胞のなかの顆粒球の混在量は
10.28％であつた。 比較例 ２ 等量の緩衝化等張塩類液で希釈した血液サンプ
ル（血液サンプル２ml＋緩衝化塩類液２ml）の一
定量を使用して比較例１の方法をくりかえした。
単核球細胞の収量は理論量の64％であり、顆粒球
の混在率は3.25％であつた。 実施例 １ 血液サンプル中の単核細胞を単離するために本
発明の方法を使用した。７ml試験管中に1.077
ｇ／c.c.のチキソトロピー性ポリエステルのゲルを
1.2ｇ加えた。この試験管中にシユークロースポ
リマー5.8ｇおよび水に溶解したナトリウム・ジ
アトリゾエート10ｇを含んだ密度勾配物質1.0ｇ
を添加した。試験管を予備遠心分離して密度勾配
物質の上部にゲル物質のバリヤー層を形成させ
た。このゲルバリヤー層の上面に血液サンプルの
一定量を乗せた。900×Ｇで10分間遠心分離を行
つた。血漿をサイフオンで除去して、緩衝化塩類
液を加え、泡立ておよびピペツト操作によつて細
胞に穏やかな乱れを与え、細胞を収穫した。単核
球細胞の収量は80％であり、顆粒球の混在量は
1.65％であつた。 実施例 ２ 一定量の血液サンプルを緩衝化等張塩類液の等
量で希釈した以外は実施例１と同様の試験を繰り
返した。単核細胞の収量は60％であり、顆粒球の
混在率は1.94％であつた。 実施例 ３ ５人の別々の患者からの血液サンプルについ
て、実施例１の方法をフイコール−パツク密度勾
配法と比較した。第１表に平均収量と分析の実施
に要した時間を示す。

【表】

【表】 【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の水不溶性密度勾配物質およ
び水溶性密度勾配物質の入つた血液採取試験管を
示す図であり、第２図は、遠心分離前に血液サン
プルを添加した後の第１図の血液採取試験管を示
す図であり、第３図は、サンプルを遠心分離した
後の第２図の血液採取試験管を示す図である。 １１……ゲル様物質、１３……水溶性密度勾配
物質、１５……試験管、２１……顆粒球、２３…
…水溶性密度勾配物質の少量部分の層、２５……
白血球、単核球および血小板の層、２７……血
漿。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ (a) 閉じた末端及び開口した末端を有する容
   器を用意し、 (b) 前記容器中にゲル様物質及び該物質より大き
   い比重を有する水溶性の密度勾配物質を入れ、 (c) 前記容器中に血液試料を入れ、 (d) 前記容器を遠心力下に置いて、前記血液試料
   を、顆粒細胞及び赤血球を含む重い相と、血小
   板、白血球及び単球を含む軽い相とに分離し、そ
   して該重い相と軽い相との間に前記ゲル様物質と
   前記水溶性密度勾配物質の別々の層よりなるバリ
   ヤー層を確立することを含む、遠心分離により分
   離した血液試料の顆粒細胞及び赤血球を血小板、
   白血球及び単球から分離する方法。