JPH04505020A - ヒトの悪性腫瘍を処置するための1,2―ベンゾピロン誘導体の使用 - Google Patents
ヒトの悪性腫瘍を処置するための1,2―ベンゾピロン誘導体の使用Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
ヒトの1、 を るための
I2−ベンゾピロン の
本発明は、ヒトの悪性腫瘍の予防的および治療的処置のための薬剤を生産するた
めの1,2−ベンゾピロン誘導体の使用ニ関する。
腫瘍学的治療の現在可能な概念には、迅速に細胞を死滅させ、そして原発性Il
廣および/または転移性腫瘍の容積を結果的に減少させることを達成するために
、物質または放射線を用いる治療が包含される。放射線感受性膿瘍については、
この原理は局部的に有利に実施され得る。しかし、局所的な適用が技術的に不可
能な場合、細胞増殖抑制性/!lII胞毒性の物質を眉いた治療は、通常、生体
全体に系統的に作用する。
系統的な細胞増殖抑制性/細胞毒性の概念は、一般に知られる副作用の範囲によ
り、その生物学的効果において制限される。このように、毒性の副作用を許容し
得るレベルにまで軽減させるために、例えばシス−プラチナからカルボ−プラチ
ナへのような修飾した細胞毒性の分子による試みがなされている。さらに修飾の
原理としては、副作用を軽減させる目的で、ヒアルロニダーゼ、ベラブラミルな
どのような生物学的効果およびその他の効果を増大させる物質を追加することが
あり、そのことによって、細胞増殖抑制剤の使用量を少なく、することが可能に
なる。この概念は、それぞれのプロトコールにおいてうまく適用されている。
直接の細胞増殖抑制以外のメカニズムを介して作用する、あるいは細胞増殖抑制
に加えて用い得る他のメカニズムを有する物質を使用する試みが、さらになされ
ている。このように、低濃度で741Jンパ球の生物学的活性を阻害するシクロ
ホこ スフアミドが知4れて%、Xる。このように、細胞増殖抑制により免疫調
節が達成され得る。
m瘍学における新しい治療の概念は、特に植物の抽出物によるか、または化学合
成により純粋な物質として生産し得る天然物質に集約されている。それ故に、ク
マリンが細胞培養および動物実験において悪性細胞の増殖を阻害することが示さ
れており、哺乳類において経験的に確認されている副作用、は生物学的活性と比
較して軽視されることが示されている(例えば、K、S、 Zaenkerら二
″メラノーマ患者におけるクマリンの実験的および臨床的研究”、Drugs
Exptl、 Cl1n、 Res。
X (+1> 767−774 (19114) ; M、E、 Marsha
llら、”クマリン(1,2−ベンゾピロン)およびシメチジンを用いた転移性
腎細胞癌の処置、試験的研究”、Journal of C1fnical O
ncology。
i、 862−866 (19g?); D、 Thornesら、′クマリン
による高危険率の悪性メラノーマの早期再発の予防”、European Jo
urnalof Surgtcal Oncology lj、 431−43
5 (1989)を参照のこと)。
ヒトの悪性腫瘍を予防的および治療的に処置するために天然物質に基づく入手可
能な物質を作ることが、本発明に潜在する問題である。ここで述べられている物
質は、それらの生物学的活性に関しては、すでに試験されている物質よりも優れ
ており、それと同時に毒物学的に受容可能である。
この問題を解決するために、次の一般式で示される1、2−ベンゾピロン誘導体
の使用が提案される:ここでs R+は水素、ハロゲンもしくはヒドロキシ、ス
ルフォニル、アルキル、ヒドロキシアルキル、アシルオキシ、アルコキシまたは
ベンジル基、あるいはグリコシド基である。
必要に応じて存在するアルキル、ヒドロキシアルキル、アシルオキシまたはアル
コ牛シ基中のアルキル基は、メチル、エチルまたはプロピル基である。
グリコシドについては、例えば、αおよびβのD−グルコシド、特にβ−D−グ
ルコピラノシドが考えられる。
さらに、本発明によれば、R1が次の一般式で示されるアシルオキシ基である1
、2−ベンゾピロンの誘導体が特に適している:
ここで、R2は水素、ヒドロキシ基またはアミノ基であり、モしてR3は水素あ
るいはメチル、エチルまたはプロピル基である。
本発明によれば、特に好ましい物質は、R+が水素、ヒドロキシ基、メトキシ基
またはβ−D−グルコピラノシル基である物質である。これらのうち最初に命名
された、すなわち7−ヒドロキシ−1,2−ベンゾピロン(7−OH−1,2−
BP)が最も好適である。
本発明に従って使用される1、2−ベンゾピロンの誘導体は、公知の方法を泪い
て生産され得るo Ba1lstein、 E III/IV ljl、 29
4 ffを参照のこと。
本発明によれば、特に好ましい化合物、すなわち7−ヒドロキシ−1,2−ベン
ゾピロン、6.7−ヒドロキシ−1,2−ベンゾピロン、6−(β−D−グルコ
ピラノシロキシ)−7−ヒドロキシ−1,2−ベンゾピロンおよび6−メト牛シ
ーフーヒドロキシー1.2−ベンゾピロンは、さらに天然物質として市販されて
いるので入手可能である。
さらに、例えば、H,Wagnerら、Chet Bar、 102.3006
(1969)に従って、グリコシドの合成による生産が可能である。
結局、本発明に使用する物質は、専門家にはよく知られた方法を用いてファーメ
ンタ−内で酵素学的に生産し得る。
本発明の1.2−ベンゾピロン誘導体は、腫瘍細胞の増殖阻害、腫瘍の退縮また
は転移の阻害に関して思いがけなく高いイン、ビボ活性を現わすことが、驚くこ
とに見い出された。表1から3に示すように、インビボにおける種々の起源の多
数の腫瘍細胞において本発明による誘導体の増殖阻害活性を論証することが可能
であった。
(以下余白)
1よ
細胞株 増殖培地中の 対照と比較したくヒト) ?−0ト1.2−BP X8
後の増殖阻害%の濃度
前立腺癌 LNCap 250 68 x 寓10退生の
星状膠細胞履 g−CCM 200 44 〃退生の
鳳状膠細胞腫 g−OVW 200 40゜乳癌 MCF7 200 g4−
膀胱癌 EJ 200 26 #
へ゛−キットリンへ°腫 Daudi 1.2 94.8 X ■ 9(白血病
)
り゛リア芽細胞騰 リ 178 MG 25 74 X −12神経芽細胞腫
TP 410 N 25 62 X −12り゛すT芽細胞履 TP 242
MG 25 79−り゛リア芽細胞m TP336MG 10 60 〃類表皮
癌 A431 1G 76−
1本発明に従って用いられる1、2−ベンゾピロン誘導体、すなわち7−ヒドロ
キシー1.2−ベンゾピロンおよび6.7−ヒドロキシ−1,2−ベンゾピロン
、およびその6−エーテルおよび一エステルは、脳腫瘍細胞(ダリア芽細胞腫)
に強い増殖阻害効果を有することは(表1から3を参照のこと)、特に重要であ
る。なぜならば、以前は、化学療法、放射線療法あるいはいわゆるBRM (生
体応答調整物質)による治療はいずれも治療的に成功していないからである。イ
ンターフェロンは別として、脳腫瘍細胞に対するインビボでの増殖阻害は、本発
明に記載の物質を用いて初めて示された。
ダリア芽細胞腫細胞の悪性形質転換および増大した増殖速度と関連して、EGF
およびPDGF系の二つの オートクリニックループ(autocrinic
1oop)が論じられている。7−0H−1,2−BPを通して、これらのシス
テムの一つの遺伝子発現レベルでコードする遺伝子の転写は阻害されるが、PD
GFレセプターおよびEGFシステムの発現は影響されないことは論証されてい
る( Sel igerら、未公開の結果) 。7−0H−L、2−BPにより
誘発されるPDGF=mRNAの阻害は、観察される増殖阻害、阻止されるオー
トクリニックループの原因であることは考慮すべきである。
本発明に記載の1.2−ベンゾピロン誘導体は、さらに、腎臓、膀胱、前立腺、
皮膚または肺の癌および白血病の処置に特に適している。本発明に記載の物質は
、単独で、ならびに悪性、II瘍の処置のための伝統的な治療および他の方法と
組み合わせても使用し得る。
このように、本発明に記載の1.2−ベンゾピロン誘導体、ならびにシス−プラ
チナおよび5−フルオロウラシル(5−FU)のような化学治療剤の組合せは、
予期しない相乗効果を示した(実施例6を参照のこと)。
本発明に記載の物質は、その効果を高めるため、および治療体系における毒性の
軽減のために、サイトカインおよびモノカインを用いた伝統的治療に加えて、な
らびに放射線療法と共に、さらに使用され得る。7−0H−1,2−BPおよび
腫瘍壊死因子(、TNF)の組合せ使用は、細胞増殖をさらに強く阻害すること
が、前立腺癌由来の異なった細胞株で示された(実施例7を参照のこと)。
例えば、LNCaPNCa上うなホルモン依存性腫瘍細胞の場合、?−0H−1
.2−BPにより引き起こされる増殖阻害は、例えばテストステロンを用いた伝
統的な観念におけるホルモン追加療法により、増大し得ることがさらに見い出さ
れた(実施例8を参照のこと)。
本発明に記載の物質の使用は、悪性腫瘍の予防、ならびにる。
本発明に記載の物質を用いた予防処置の場合、化学的予防に対する、および特に
オンコ遺伝子の発現の阻害に対するそれらの能力は、重要な役割を果たす。オン
コ遺伝子の牛ヤリアは、癌の高い危険性にさらされている。なぜならば、これら
の遺伝子は種々の方法で活性化され、その発現産物は腫瘍の形成を誘導し得るか
らである。′化学的予防”という用語は、オンコ遺伝子の発現により誘導される
膿瘍形成を防ぐか、または遅らせるのに適した物質の能力を示す。遺伝子導入マ
ウスは、テスト物質の化学的予防効果を試験するのに特に適している。(オンコ
遺伝子−MTV/ras−は遺伝子操作によりある品種のマウスの授精卵母細胞
に移入され、モして該卵母細胞は再移植され、分娩される。充分に成長した動物
およびその子孫は体細胞にオンコ遺伝子を有する。)遺伝子導入マウスは頻繁に
腫瘍を生じる。本発明によれば、これらの動物を用いて、7−0EI−1,,2
−BPでの処置によって膿瘍の発生率が、対照の動物と比べて有意に減少したこ
とが示された(実施例11を参照のこと)。
この点について、腫瘍がc1yc”およびH−ras″のようなある橿のオンコ
遺伝子を不均衡に発現する患者の生存期間は、腫瘍がオンコ遺伝子の発現の増加
を示さない膿瘍患者の生存期間よりも短いことも知られている。本発明によれば
、本発明に記載の物質、および特に7−01(−1,2−BPは、オンコ遺伝子
の過剰発現によって腫瘍細胞の細胞増殖を阻害することがここで示された(実施
例12を参照のこと)。
本発明に従って、1.2−ベンゾピロン誘導体の少量の投与が、免疫調節効果を
有することがさらに見い出された〈実施例10および第5図から箪7図を参照の
こと)。特に、7−0H−BPお、よびバクテリア由来のリポ多糖類のようなエ
ンドトキシンを有する組合せによる細胞の刺激は、種々のサイトカインが結びつ
いた相互作用によることがヒトの単核細胞(MMC)で示された。第7図に示す
ように、+1−ルベルにおけル10倍増ハ、TNF−(腫瘍−壊死一因子)レベ
ルにおいては7倍増をもたらす。■1−6レベルにおける10倍増は、TNF−
レベルにおいては4倍増が伴い、類似の結、果が、It−6について得られた。
悪性腫瘍の予防的処置のために本発明に記載の物質が上述の方法で使用される場
合、患者あたり、例えば毎日50から3゜O+agの投与量が使用に適している
。
悪性腫瘍の治療処置の場合、重要な点は、例えば、毎E300から600hgの
高投与用量において効果をもたらすことが、本発明に記載の物質の増殖阻害の特
性である。これは、腫瘍の再発および転移形成を防ぐために、最初の治療の後の
処置に応じて適用される。
特に重要なのは、特に悪性腫瘍の従来の通常の治療に関して、本発明に記載の物
質がヒトに使用される場合、非常に高い投与11 (7000mg/日、実施例
9を参照のこと)の長期投与においてさえ、いかなる種類の毒性の副作用も観察
されないという事実である。
本発明に従って使用される物質は、従って、本発明の巨的に対して、効果が高い
と同時に非毒性である。
上記示したように、本発明に従って使用される1、2−ベンゾピロン誘導体は、
単独で、あるいは好ましくは、確定した組、合せとして公知の細胞増殖抑制剤お
よび/またはサイトカインと組合わせて投与し得る。それらが単独で投与される
場合、毎日の投与量は、症状および治療目標に従って、免疫調節効果が顕著な場
合には50から300+ggの間に、そして重点が、細胞増殖抑制的な局面にあ
る場合は、300から6000mgの間に変えられる。
これらの投与量が、例えば溶液、糖衣丸、カプセル、錠剤、注射薬液または輪注
液のような通常の薬剤調製物の形で経口的に、そして筋肉内、動脈内、静脈内の
ように非経口的に、モして経皮硬膏剤の形でのような局所的にも投与され得る。
本発明に従って提案される活性因子を含有する無菌の水溶液は、投与に適してい
る。これらの溶液は、必要に応じて適当な方法で緩衝化され得る。さらに、液体
で希釈した薬剤は充分な塩溶液またはグルコースを用いて等張にされ得る。
本発明に従って使用される1、2−ベンゾピロン誘導体を生薬とした薬剤を製造
するためには、通常の担体および添加物が使用され得る。通常の担体とは、例え
ば、水、生理食塩水、アルコール、ポリエチレングリコール、グリセリンエステ
ル、ゼラチン、ラクトースおよびスターチのような炭水化物、炭酸カルシウム、
ステアリン酸マグネシウム、タルクである。
通常の添加物とは、例えば、防腐剤、潤滑剤、過湿剤および乳化剤、着色剤、香
味剤および芳香物質である。担体および添加物の選択は、本発明に記載の調製物
が経腸的にか、非経口的か、または局所的に投与されるかどうかに依存している
。
本発明を以下の実施例について説明する。
【実施例1】
ツーヒドロキシ−12−ベンゾビaンの、々の における −クマリンとの
以下の細胞株が検討されたニ
ゲリア芽細胞II IJ 178 MG神経芽細胞腫 TI’ 410 N
グリア芽細胞腫 TP 242 MG
グリア芽細胞1lTP 336 MG
類表皮癌 A431
神経芽細胞履の細胞株および3つのダリア芽細胞腫の細胞株は、10%ウシ胎児
血清(FCS) 、通常量のペニシリン、ストレプトマイシン(Pan/5tr
ap)およびグルタミンを加えたHa■のFIO培地で培養した。類表皮癌の細
胞株は、同様に10%(FCS)および通常量のグルタミンおよびPen/5t
repを加えた改変イーグル培地(MEM)で培養した。
実験に先だって、各細胞株の細胞5 X 1G’個を最初96つ品ルプレートに
プレートし、異なった濃度、すなわちmlあたり各々lsOgmol、 75μ
i+ol、 37.Sgmol、 18gw+olおよび9μmolの7−しド
ロキシ−1,2−ベンゾピロン培地と共に48時間インキ二ベートした。未処理
の細胞を対照に供した。その後、細胞を3H−チミジンと共に8時間イン亭エベ
ートした。細胞に吸収された放射能を通常の方法で測定した。丁P 336およ
びA431の細胞株はU178、TP 242およびTP 41ONよりも(7
−OH−1゜−2−BP)に感受性であることが示された。しかしながら、活性
物質の濃度37.5HM/■1のものは、いずれの細胞に対しても細胞増殖抑制
性を示したが細胞毒性は示さなかった。
これらの結果に基づいて、12日間にわたっての前記細胞株についての増殖曲線
が得られた。TP 336 MG株およびA431株は上述の条件下テLOtt
M/m1(D7−OR−1,2−BPと共ニ47 + aヘートサレタカ、TP
242 MG株、TP 410 M株オヨびU 1711 MG株については
25μM/mlの活性物質が使用された。各々の場合において、5 X 10’
個の細胞が72Sボトルに取り出され、未処理の細胞は対照として同様の条件下
でインキュベートされた。
細胞数は、3.5.7.1(lおよび12日後に顕微鏡により計数して決定した
。
以下の表2に示す結果が得られた。
(以下余白)
細胞株 ?−0ト1.2−BP 細胞数(xlo’) 対照と比較の濃度 した
12日後の
くμM/11) 3 5 7 10 12日後場殖阻害%U 178 MG 2
5 15 Is 26 2737 74%対照 23578491 141
TP41ON 25 82036 4250 62%対照 25457197
132
TP242MG 25 4 8 810 12 79%対照 10 Is 23
49 57
TP33610 10 71LzZLB 18 60%対照 13253934
45
A431 10 410 312 21 76%対照 6244556 87
、この表は、検討した全ての細胞株について明らかな阻害が生じていることを示
している。25μM/elを使用したTP 242 MGの場合、対照と比較し
てほぼ80%の増殖阻害が観察された。特に重要なのは、脳腫瘍細胞0178
MG、 TO410N、 TP 242 MGおよびTP 336 MGに対す
る増殖阻害であり、このことは、インターフェロンを除いては、これまでいかな
る入手可能な物質を用いても達成され得なかった。
?−OF!−1.2−BPの代わりに、相当する濃度のクマリンを眉いて、増殖
曲線の作成を繰り返した。
予備実験だけでなく、生長曲線の作成のための処方においても、クマリンで処理
した細胞試料と対照との開に有意な差は観察され得なかった。
7位が置換されていない化合物ではない、7−ヒドロキシ−1,2−ベンゾピロ
ンのみが、試験した細胞株で増殖阻害活性を示した。
【実施例2】
7−0H−12−BPの における
乳癌由来のMCF ?細胞株を、lO%FCSを加えたDMEM−S 10で1
0日間、通常の方法で培養した。次いで、細胞を第1図に示された濃度の7−
OH−1,2−BPと共にイン士コベートし、次いで公知の方法でエチジウム−
プロミド/アクリジンオレンジ法により生存率および細胞数の計数を光度計で決
定した。その結果を第1図に示す。
、結果は、乳癌における?−0H−1.2−BPの細胞増殖抑制効果を明らかに
示している。
【実施例3】
7−0H−12−BPのヒトの° における11勿且
ヒトの退生星状膠細胞腫由来のa−uvw系の細胞を使用し、L−グルタミンお
よびlO%FCSを、DMEM: HAMのF12培地(1:1)に加えたこと
を除いては、実施例2による方法を繰り返した。
その結果を第2図に示す。
結果は、7− OH−1,2−BPが、ヒトの退生星状膠細胞腫細胞において細
胞増殖抑制効果をも有することを示している。
【実施例4】
7−0H−12−BPおよびその の、々の にお仇m口Ll肱里
7−ヒドロキシー1.2−ベンゾピロン(7−OH−クマリン)、6.7−ヒド
ロキシ−1,2−ベンゾピロン(ニスフレチン)、6−β−D−グルコピラノシ
ロ亭シー7−ヒドロ亭シー1,2−ベンゾピロン(エスクリン)および6−メト
キン−7−ヒドロ亭シー1.2−ベンゾピロン(スコポレチン)の効果を、以下
の細胞株について検討した。
ダリア芽細胞腫 Tp242MG
Tp483MG
神経芽細胞腫 Tp41ON
、白血病 に562
Daudi
副腎Ill CAN r−t
CAN I−2
膀胱癌 HCV
乳癌 MCF−7
Z−R−75−1
前立腺癌 G’l 1
メラノーマ A−375
細胞株は実施例1で示したように培養した。
各々の場合の腫瘍細胞株における本発明に記載の1.2−ベンゾピロン誘導体の
抗増殖効果は、 3H−チミジン導入の助けを 。
得て、生長曲線との関係によって示した。
」ユニヱヱ立丘
24ウエルのプレートに、各々の場合、調べる株の細胞をウェル当たり10’@
播種した。約48時間後、細胞は生栗密状態になった。次いで培地を交換し、問
題の活性物質を含有する培地で置き換えたく表3を寥照のこと)。さらに48時
間後、 0.25μCI 3H−チミジン(アメルシャム社製)を各ウェルに添
加し、さらに24時間インキュベートした。次いで、培養物を水冷したPBSで
2回洗浄し、高分子量のロー放射活性物を5%トリクoo酢酸を用いて4℃で1
時間沈澱させた。PBSで細胞、を洗浄した後、3H−放射活性物を0.3Mの
NaOHで可溶化し計数器にて測定した。増殖阻害は、活性物質で処理した細胞
のチミジンの導入と未処理の細胞とを比較することにより決定した。その結果を
以下の表3に示す。
(以下余白)
表」−
活性物質 対照に対する3H−fミツ” 7導入の割合(%)の濃度
(μM/+1) ?−0H−1.2−BP ニスフレチン エスクリン スコ本
°レチンA)ダリア芽細胞腫細胞Tp242MG/Tp483MG16 73/
69 75/フ3 フ3/74 84/711So 43/39 60/62
65154 74/67(以壬輩b2
表旦10−
活性物質 対照に対する3H−fミy吟導入の割合(%)の濃度
(μM/ml) 7−0H−1,2−BP ニスフレチン エスクリン スコ本
°レチンB)神経芽細胞腫TP 410 N
4 Bo 75 85 95
50 48 42 54 フ1
too 42 40 43 65
(ふメ下ネ白)
表1mと
活性物質 対照に対する3H−fミツ”ン導入の割合(%)の濃度
(μM/ml) 7−0H−1,2−BP ニスフレチン エスクリン スコ本
°レチンC)白血病細胞Daudi/に−5628 76/76 フ5/77
+17/88 79/8516 63/67 H/62 80/8k 71/8
250 49/47 61150 69/To 58/66250 35/39
54/44 4g151 49/47500 2B/37 39/31 44
/40 41/44表m
活性物質 対照に対する”H−fミv’y導入の割合(%)の濃度
(μM/冒1) ?−0H−1.2−BP ニスフレチン エスクリン スコ本
°しfンD)CAKE細胞CAKI−1/CAKI−21100/95 96/
98 Zoo/99 100/992 9B/92 93/94 94/96
9B/964 90/8g 118/90 92/90 87/848 81/
フ7 110/87 83/84 511/8G16 76/71 62/11
2 18/13 8G/7625 62/65 5B/69 74/72 フ3
/フ110G 49/46 45154 60150 67/61表ユ」コLL
と
活性物質 対照に対する3H−fミシ” y導入の割合(%)の濃度
(μM/ml) ?−0H−1.2−BP ニスフレチン エスクリン スコ本
°レチンE)HCV細胞
衣1」コEEと
活性物質 対照に対する3■−fミv” 7導入の割合(%)の濃度
(μM/1m1) ?−0H−1.2−BP ニスフレチン エスクリン スコ
本°レチンF)乳癌細胞MC7/Z−R−75−119B/96 100/98
99/100 10G/9825 69155 g9/70 69/72 7
6/72too 51/43 58153 51156 69157艮旦mと
活性物質 対照に対する3H−fミ9”ン導入の割合(%)の濃度
(μM/+1) 7−0H−1,2−BP ニスフレチン エスクリン スコ本
°レチンG)前立腺癌細胞GV−1/AL T 201 、 100/98 9
7/93 97/100 100/988 75/78 84/75 84/F
J3 88/+1425 63/60 75/67 76/69 78/H50
0 27/H50/44 43/44 51/43表」−立読LLI
活性物質 対照に対する3H−fミV−y導入の割合(%)の濃度
(μM/ml) 7−0H−1,2−BP ニスフレチン エスクリン ス]本
”レチンH)メラノーマ細胞A−375/G−3611too/94 9g/9
7 100/98 99/1008 81/77 84/88 8’l/86
8978816 72/74 75/72 82/81 〃25 64/68
7076g 78774 87785So 53158 65/60 71/7
0 78/85・131」しλ1或
各々の場合の細胞株の増殖曲線は、以下に示す活性物質の存在下で決定し、活性
物質なしで培養されている対照と比較した。
各々の場合の活性物質の濃度は、3H−チミジン導入が50%阻害されるように
選択した。各々の場合の活性物質および細胞株に対して、この見地のもとに用い
られる活性物質の濃度を、以下の表4にμM/mlで示す。
(以下余白)
紅
細胞株?−0f(−Cニスフレチン エスクリン スコ本”レチンTp41ON
25 25 75 500HCV500500I500*500*参使用し得
るが、50%増殖阻害を引き起こさない最大の活性物増殖曲線を作成するために
、各々の場合、プレート当たり104個の細胞を播種し、問題の活性物質の存在
下に、あるいは対照としてインキュベートした。2.5.7および10日後に、
細胞の計数を顕微鏡で行った。その結果を第12図から第24図に示す。
そこで与えられる値は、各々の場合の、3回の同じ操作での平均細胞数を示す。
【実施例5】
?−OF[−12−BPによる および、 の3つの異なった膀胱癌由来の細胞
および赤白血痰細胞(x562)を、3回の同じ操作において、20時間、96
ウエルプレートにて、各々の場合において?−0H−1.2−BPの濃度を増加
させて(第3図を参照のこと)インキュベートし、洗浄し、培地と混合した。次
いで、A11ey M、C,ら、Cancer Re5earch 48、58
9−601 (198B)に従って細胞数を光度計により決定した。
この工程において、培地と混合されている細胞に着色剤を加えた。この着色剤は
細胞のミトコンドリアの活性により変色され、そのことによって光度計による細
胞数の決定が可能となる。
その結果を第3図に示す。
これらの結果は、調べた細胞株の場合、投与量に相関してミトコンドリア活性の
阻害が起こり、細胞増殖阻害の原因となり得ることを示している。
(実施例6]
5−フルオロウラシル 5−FU およびシス−プラチナとのせにおける7−0
H−12−BPの
結腸腺癌由来および気管肺胞癌由来の細胞を用いた。この細胞を培養し、各々の
場合において5−FUおよびシス−プラチナと組み合わせて?−0H−1.2−
BPの細胞増殖阻害の間における相乗効果を、5teel、 Int、 J、
Radiat、 0nco1. Blol、/Phys、互、 85−91 <
1979)に記載された方法に従って試験した。
この目的のために、まず最初に個々の投与量一応答曲線を、5−FU、シス−プ
ラチナおよび?−011−1.2−BPの各々の場合について細胞増殖阻害に関
してプロブトした。次いで、各々の組合せについて、同等の生物学的活性の点を
両方の曲線から得て、組合せ試験(5−FU+7−011−1.2−BPまたは
シス−プラチナ+7−0H−1,2−BP)に使用されるそれらの投与量に対す
る参照点として使用した。これらの濃度投与量応答曲線を再度プロットした。
その結果を箪4図4a)および4b)に示す。
結果は、調べた細胞株の細胞増殖の阻害の間、両方の組合せは相乗効果を発揮す
ることを示している。
【実施例7】
TNF との ムせにおける7−0R−12−BPの1然工
前立腺癌由来の種々の細胞株(Dt+−145、PC−3およびLNCaP)を
使用した。
細胞の増殖は実施例1と同様にウェルプレートにおいて決、定し、細胞は7−0
H−1,2−BPのみ、TNFのみ、?−OH−1,2−BPとTNFとの組合
せ、および活性物質の添加なしく対照)と共に培養された。
その結果を以下の表5に示す。
(以下余白)
細胞株 対照 ?−0H−1.2−BP TNF 7−0H−1,2−BP(5
00BM/ml) [1HM/all (500BM/1nM)D■−1455
1,86+3.06 38.30+2.92 55.39+0.68 29.9
7+3.69PC−31L5Jl+1.(1511,51+0.63 18.3
9+0.74 8.97+O,13LNCaP、61.40+3.70 11.
0+1.1G 15.60+2.50 1.60+0.99最初の細胞数:3X
IO’個細胞/ウェル:接触期間: DO−1451PC−3:4日間; LN
CaP: 6日間(以下余白)
、結果は、ツー0■−1,2−BPとTNFとの組合せは細胞増殖に対してさら
に強い阻害効果をもたらすことを示している。
【実施例8】
ツー0f(−12−BPとテストステロンとの 4世によるΔ1大
LNCaPNCa光の実施例で記述したようにしてウェルプレートにて培養した
。ただし、チャーコールを用いて、存在し得るいずれの雄性ホルモン作用物質も
前もって培地から除去した。
細胞増殖は、250または500μMの7−0H−1゜2−BP/ml培地の存
在下にて、穴あたり20nMのテストステロンを加えて決定した。その結果を第
9図に示す。結果は、500μMの7− OH−1,2−BPの存在下において
細胞増殖のほとんど完全な阻害が達成されることを示している。さらに、化合物
3−0H−1,2−BPとの比較によって、後者は本質的に効果がないことを証
明している。
【実施例9]
7−0R−12−BPのヒトにおける
異なった悪性膿瘍を患った60人の患者を、耐性試験において?−0H−1.2
−BPで処置した。初期投与量は50■gの物質7日であり、投与量は2000
mg/日にまで継続的に増量させた。8週間以上続けて、患者は週に1回、全身
毒性および臓器不全の徴候についての試験を受けた。8週目の終わりまで全(副
作用は起きなかったので、通常の実験室の化学的対照と共に、試験を続け、毎日
の投与量を7000mg/日にまで段階的に増量させた。毎日の投与量7000
mg/日の長期投与でさえも、毒性の副作用は観察されなかった。
【実施例101
7−01(−12−BPの
ヒトの単核細胞(MMC)によるリンホカイン放出に対する7−OH−1,2−
BPの影響(≠、細胞を、メタノールに溶解した種々の濃度の7−0H−1,2
−BPと48時間インキュベートすることにより調べた(第5図および第6図を
参照のこと)。原液は10B 7− OF! −1,2−BP/ w+1メタノ
ールを含有し、RPI 1640で各々の場合の所望の濃度に合わせた。細胞を
、Boyu+a、 5cand、J、Cl1n、 Lab、 Invest、
21.77 (1968)に記載されている方法に従って密度勾配遠心分離によ
り、健康な提供者の末梢血から単離し、生理食塩水で3回洗浄した後、該細胞を
100M/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンおよび2mM
グルタミンを含有する[lPM+ (完全培地)に懸濁した。リンホカインであ
るインターロイキン−1(ILI)およびインターロイキン−6([L 6)
t−、フィトヘムアグルチニン(PIIIA) 、フンカナバリンA (Con
A)、リポ多糖(LPS)またはOKT 3を用いて誘導し、さらに7−0H−
1,2−BPの投与量を増加させた後に、公知の方法でインビボにて測定した。
測定は、マイクロタイタープレート(問題のりンホカインに対するモノクローナ
ル抗体、結合したリンホカインに対するポリクローナルウサギ抗体、マーカーと
してのアルカリホスファターゼに結合したつ、サギ抗−1gGおよび基質として
のp−ニトロフェニルホスフェートを固定しである)を用いたELISAにて固
相法で行った。
その結果を第5図および第6図に示す。
結果図は、7−0H−1,2−BPで刺激した後のIL 1および[L 6の放
出は、投与量の範囲3.6から33μg/mlで増加したことを示している。(
高投与量範囲における阻害は、溶媒として用いたメタノールの細胞毒性作用に基
づいている。)低濃度では、活性物質はそれに応じて免疫調節因子の放出を刺激
し、それによって免疫調節作用を有する。
さらに、ツー011−1.2− BP (10μg/冒l)およびLPS (1
0から1100p/■l)でMMCを刺激した後の種々のサイトカイン間の相互
作用を、19人の提供者のMMCについて調べた。19人中6人のにおいて(3
2%)、TNF−α、U:lおよび11−6の共同刺激が証明された。スピアマ
ン相関係数の計算は、3つのサイトカインの各々の間の有意な相関を示した(I
I−1−β:+1−69−0゜022、It−1−β: TNF−a p−0,
007、rl−6: TNF−a p−0,007)その結果を東7図にグラフ
として示す。
【実施例111
7−OH−12−BPの ・。
?−0H−1.2−BPの化学予防的特性を、オンコマウス7M型(乳腺膿瘍)
の遺伝子導入マウスで試験した。
7−0H−1,2−BPが腫瘍の発生を防ぐか、あるいは遅らせる範囲、および
動物の生存時間を増加させる範囲を調べた。7−−OH−1,2−BPはZoo
μM/mlの濃度で飲料水に入れて与えた。
その結果を以下の表6に示す。
(以下余白)
L
遺伝子導入マウスで示された7−0H−1,2−BPの化学的予防マウスの数
マウスの数 腫瘍の発生率%7−0H−クマリンなし 7−0H−1,2−BP
あり2g 9/28 32
(以下余白)
【実施例121
7−Oil−12−BPによる”cIC” のa)e−11ye”生産物を過剰
に発現するDUKX細胞(チャイニーズハムスター由来の卵巣癌細胞)を、標準
の条件下で培養し、二つの比較グループを増殖させた。一つのグループは培地に
100μg/■1の7−0H−1,2−BPを含有するが、第二のグループは活
性物質なしの対照グループとして培養した。
培養物の生育は24.48および72時間後に写真で記録した;その結果を第1
0図に示す。それらは?−OH−1,2−BPの存在下で細胞増殖の劇的な阻害
を示している(第10図、blからb3)。
b)a)による試験を繰り返したが、ただし?−0H−1,2−BP存在下での
細胞培養は、24時間後に活性物質を除去し、トリプシンで処理して新たに播種
し、そしてさらに48時間後に7−0H−1,2−BPを含有しない培地にて、
細胞増殖を写真で記録した。
比較のために、対応する培養物を7−OE[−1,2−BPと共に24時間培養
し、トリプシンで処理し、そして7−0H−1,2−BPを含有する培地に新た
に播種した。
48時間後に細胞増殖を同様に写真で記録した。
その結果を第11図に示す。
結果は、24時間後に7− OH−1,2−BPを除去して、それに続く培養期
間の間換えていないこれらの培養物は、かなり細胞増殖していることを示してい
る(第11図b+)。それに比較すると、第二の培養期間も7−0H−1,2−
BPの存在下で行われたこれらの培養物において、細胞増殖はほぼ、完全に阻害
された(第11図b2)。
この結果は、オンコ遺伝子を過度に発現する腫瘍細胞の増殖阻害のためには、活
性物質7−0H−1,2−BPの永久的な入手が可能であることが必要であるこ
とを示唆している。
07−しF吋y−j、L−べ・ンどピ07・ 灯島
Fig、2
◆ ※ 中 Φ ÷
(a)
(b)
シ占−i針胎/mlン
j 丁*+m) ンjg/ml)
B
Sl・IL−6
PDGF−A−RPDGF−B−RPDGF、A PDGF−8クーol−1−
f 、ニーf3PLDf−ステOンt ’z %LIg’ @tJJ(、c−1
’綽Rシシ阻舌
(uM) (uM)
7−OH−1,2−BP 3−0H−1,2−BPφg吋聞扶
り21間fk
Fig、11
0UKX−車Ij4PJ
人
入
平成3年7月24日
Claims (12)
- 1.ヒトの悪性腫瘍の予防的または治療的処置のための薬剤を生産するための、 次の一般式で表される1,2−ベンゾピロン誘導体の使用: ▲数式、化学式、表等があります▼ ここでR1は水素、ハロゲンもしくはヒドロキシ、スルフォニル、アルキル、ヒ ドロキシアルキル、アシルオキシ、アルコキシまたはベンジル基あるいはグリコ シド基である。
- 2.前記アルキル、ヒドロキシアルキル、アシルオキシまたはアルコキシ基のア ルキル基がメチル、エチルまたはプロピル基である、請求項1に記載の使用。
- 3.前記グリコシド基がβ−D−グルコピラノシルオキシ基である、請求項1に 記載の使用。
- 4.前記アシルオキシ基が次の一般式を有する、請求項1に記載の使用: ▲数式、化学式、表等があります▼ ここでR2は水素、ヒドロキシまたはアミノ基であり、そしてR3は水素あるい はメチル、エチルまたはプロピル基である。
- 5.通常の細胞増殖抑制剤を組み合わせて用いる、請求項1から4に記載の使用 。
- 6.サイトカインと組み合わせて用いる、請求項1から4に記載の使用。
- 7.ヒトの悪性腫瘍の予防的処置のための毎日の投与量が50から300mgで ある、請求項1から6に記載の使用。
- 8.ヒトの悪性腫瘍の治療的処置のための毎日の投与量が300から6000m gである、請求項1から6に記載の使用。
- 9.脳腫瘍の処置のための薬剤を生産するための、請求項1から8に記載の使用 。
- 10.ヒトの腎臓、前立腺、皮膚または肺の癌腫あるいは白血病の処置のための 薬剤を生産するための、請求項1から8に記載の使用。
- 11.オンコ遺伝子の発現により誘導される腫瘍の処置のための薬剤を生産する ための、請求項1から8に記載の使用。
- 12.ホルモン依存性の腫瘍の処置のための薬剤を生産するためにホルモンを組 み合わせて用いる、請求項1から4に記載の使用。
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