JPH04504360A

JPH04504360A - タンパク質に対するホスファチジルイノシトールの結合

Info

Publication number: JPH04504360A
Application number: JP2506187A
Authority: JP
Inventors: ウォルナー，バーバラ　ピー．
Original assignee: バイオジェン，インコーポレイテッド
Priority date: 1989-04-10
Filing date: 1990-04-05
Publication date: 1992-08-06
Also published as: CA2051694A1; US5223394A; WO1990012099A1; AU5428990A; EP0466806A4; EP0466806A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】タンパク　に・　るホスファチジルイノシトールの　Ａ本発明は、ある種のタンパク質を、そのタンパク質を生産する細胞の表面にインビボにおいて共有結合により固定させる、グリコジル化ホスファチジルイノシトール（“ＰＩ″）結合構造に関する。より詳細には、本発明は、リンパ球機能関連抗原３（“ＬＦＡ−３″）の、ホスファチジルイノシトール結合のシグナルとなる配列をコードするＤＮＡ配列の単離およびＰ！結合構造を細胞外タンパク質（または膜タンパク質の細胞外部分）に供給する方法に関し、それによりこの様なタンパク質にＰＩ結合型が与えられ、結果として遊離可能な原形質膜結合、精製の促進、ミセル形成の能力等の利点が得られる。本発明はまた、ＰＩ結合構造を有する新規なキメラポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするハイブリッドＤＮＡ配列、およびここに詳細に説明されている発明により可能となる製造物、方法および組成物に関する。

及豆立！見細胞内のＤＮＡの発現により製造されるタンパク質は、一般に３つの群：完全に細胞内に留まる細胞質タンパク質；細胞外に分泌される細胞外または「可溶性」タンパク質；および細胞膜のリン脂質二重層に結合するようになる膜タンパク質、に分は得る。

様々な膜タンパク質は、細胞骨格成分の固定、細胞間接着の媒介、細胞内および細胞外への分子の輸送、ホルモンおよび他の化学伝達物質からのシグナルの受取り、および他の多数の機能のような、広範囲の細胞機能で主要な役割を果たす。

膜タンパク質は、様々な様式で形質膜に結合する。゛周辺または「外の」タンパク質は、リン脂質二重層を貫通するのではなく、二重層の一方の表面上の極性頭部と相互作用するか、あるいは二重層に直接固定された他の膜タンパク質と相互作用する。　内在性または「中の」タンパク質は、二重層の疎水性コアと相互作用する領域を有する。細胞表面抗原、細胞レセプター、接着分子および輸送タンパク質のような膜貫通タンパク質は、細胞質および細胞外の領域またはドメインを露出させながら、二重層を１またはそれ以上の回数横切９ているＱ形質膜に結合するさらに他の可能性は、脂質二重層とタンパク質との間の共有結合を介するものである。特に、多くの細胞表面タンパク質は、グリコジル化したホスファチジルイノシトール成分に共有結合したＣ末端を介して、細胞膜に固定されている。例えば、Ｌｏｗら、”’Ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ　Ａｔｔａｃｈｅｄ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ　Ａｓ　Ａ　ＨｙｄｒｏｐｈｏｂｉＣＡｎｃｈｏｒ　Ｆｏｒ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ−、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｌ、　Ｓｅｉ、、　１１．　ｐｐ、　２１２−１ｓ　（１９８６）を参照。

グリコジル化ホスファチジルイノシトール結合、または“Ｐ工”結合は、広範囲の種および細胞タイプに見出される、２ダースを越える特定の膜タンパク質についての、固定化構造であると考えられるｏ　Ｆｅｒｇｕｓｏｎら、−Ｃｅｌｌ　５ｕｒｆａｃｅ　ＡｎｃｈｏｒｉｎｇＯｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　Ｖｉａ　Ｇｌｙｃｏｓｙｌ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅｓ−、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｊｏｃｈｅｍ、、　５７．　ｐｐ、　２８５−３２０　（１９８８）を参照のこと（ここに参考文献として援用される）。これらのＰＩ膜結合性タンパク質生物学的機能も非常に多様であり、表面加水分解酵素、コートタンパク質、表面抗原および接着分子が含まれる。

ＰＩ膜結合性タンパク質Ｃ末端アミノ酸残基は、エタノールアミン−ホスホジエステル−グリカン架橋を介して、膜のホスファチジルイノシトール成分と結合している。Ｆｅｒｇｕｓｏｎら、”Ｇｌｙｃｏｓｙｌ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ　Ｍｏ１ｅｔｙ　Ｔｈａｔ　ＡｎｃｈｏｒｓＴｒ　ａｎｏｓｏｎ＋ａ　ｂｒｕｃｅｉ　Ｖａｒｉａｎｔ　５ｕｒｆａｃｅ　Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｔｏ　ＴｈｅＭｅｏ＋ｂｒａｎｅ−、５ｃｉｅｎｃｅ、　２３９　ｐｐ、　７５３−５９　（Ｌ９８８）；　Ｌｏｗ、−Ｂｉｏｃｈｅ＋ｍｆｓｔｒｙ　Ｏｆ　Ｔｈｅ　Ｇｌｙｃｏｓｙｌ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ　Ｍｅｏ＋ｂｒａｎｅＰｒｏｔｅｉｎ　Ａｎｃｈｏｒｓ−、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｒａ、、　２４４．　ｐｐ、　１−１３　（１９８７）　（ここに参考文献として援用される〉。結合のメカニズムには、前駆タンパク質に存在して、成熟タンパク質がＰｌで固定される前に除去される、Ｃ末端疎水性配列のプロセシングが含まれると考えられる。Ｆｅｒｇｕｓｏｎら、上述、■ｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃ■Ｌ、鉦、　ｐｐ、　３０１−０４゜プロセスされるＣ末端セグメントは、ホスファチジルイノシトールに結合するためのシグナルであると考えられている。

ある研究では、崩壊促進因子（ＤＡＦ）であるＰＩ膜結合性タンパク質Ｃ末端配列の３７個のアミノ酸をコードするＤＮＡが、糖タンパク質Ｄ（ヘルペス単純ウィルス−１由来）の正常分泌されるタンパク質断片をコードするＤＮＡの３′末端に融合されて、その結果、ＰＩ膜結合性融合タンパク質が生じる。　Ｃａｒａｓら、　”Ｓｉｇｎａｌ　Ｆｏｒ　Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　Ｏｆ　Ａ　Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ａｎｃｈｏｒ　Ｉｎ　Ｄｅｃａｙ　Ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ−、５ｃｉｅｎｃｅ、　２３８．　ｐｐ、　１２８０−８３　（１，９８７）を参照。

しかし、ＰＩ膜結合性タンパク質多（の前駆体のＣ末端配列の比較で、コンセンサスなＰＩ膜結合シグナル配列明かにすることはできなかった。Ｌｏｕｔ、上述、図３　：　Ｆｅｒｇｕｓｏｎら、上述。

Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｆｏｃｈｅｔ、　５７．表３を参照。

ホスファチジルイノシトール結合性タンパク質およびホスファチジルイノシトール結合について、かなりの量の研究が存在するが、特定のＰＩ膜結合さらに特徴付け、そして細胞膜へのＰＩ膜結合シグナルおよびメカニズム、および膜結合タンパク質の選択的な遊離についてさらに研究する必要がある。これらの必要は、リンパ球機能関連抗原３（“ＬＦＡ−３”）のＰＩ膜結合型ＰＩ膜結合構造およびＰＩ膜結合性ＦＡ−３に由来するＰＩ膜結合シグナル配列応用に関する本発明の課題である。

本発明のＰｌ結合シグナル配列は、分泌されるポリペプチドまたはポリペプチドの分泌される部分をコードするＤＮＡの３″末端にインフレームで結合された場合、結果として、そのポリペプチドのＰＩ膜結合型発現する。本願のＤＮＡ配列および方法を使用すると、Ｃ末端にホスファチジルイノシトール構造を有する新規なキメラタンパク質、およびこのような生成物の多くの応用が可能となる。

Ｒ旦ヱと１１従って、本発明の目的は、ホスファチジルイノシトール結合のシグナルとなる配列をコードするＤＮＡ配列を提供することである。

本発明の目的はさらに、ホスファチジルイノシトール結合のＣ末端構造を有する新規なポリペプチドを、発現される状態でコードするＤＮＡ配列を提供することである。

本発明の目的はさらに、新規なＰＩ膜結合性ポリペプチド提供すること、および可溶性タンパク質の、または膜内在住タンパク質の細胞外ドメインの、ＰＩ結台型を製造するための方法を提供することである。

本発明の目的はさらに、完全なホスファチジルイノシトール結合構造を有する新規ポリペプチドのミセルを提供すること、および本発明に従うＰＩ膜結合ポリペプチドよって決まる表面特性を有する、リポソームを提供することである。

本発明の目的はさらに、細胞培養物の表面タンパク質補体を改変する方法を提供すること、または外因性タンパク質およびポリペプチドのＰＩ膜結合型発現し得る宿主細胞を提供することである。

本発明の目的はさらに、細胞間接着または特定の細胞への標的付けを指向する方法、細胞のスクリーニング方法、およびタンパク質および治療用物質の作用あるいは特異性の増大を指向する方法を提供することである。

これらの目的および他の目的は、以下の記載から明きらかであり、リンパ球機能関連抗原３のホスファチジルイノシトール結合シグナル配列をコードするＤＮＡ配列の発見、およびこのようなりＮＡ配列によって、発現される状態でコードされているポリペプチドを、発現される状態でコードするＤＮＡ配列の発見により、ここで成し遂げられる。

！恋１！呈■皿図１は、ＰＩ膜結合ＦＡ−３のコーディング領域を含有する、ファージλＰ２４の有するＤＮＡ挿入（および推定されるアミノ酸配列）と、ＬＦＡ−３の膜貫通型のコーディング領域を含有する、ファージλＨＴ１６の有するＤＮＡ挿入（および推定されるアミノ酸配列）との比較を示す。

図２は、ＰＩ膜結合ＦＡ−３のＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示し、下線はホスファチジルイノシトール結合シグナル配列を示す。

図３は、Ｔ細胞表面抗原である天然ＣＤ４タンパク質のアミノ酸配列を示す。推定のシグナル配列および膜貫通領域を下線で示す。

図４は、組換えＣＤ４タンパク質の細胞外ドメインおよびＰ１結合ＬＦＡ−３の２８個のＣ末端アミノ酸に対応する末端配列により特徴付けられる融合タンパク質をコードし、プラスミドＴ４／ＬＦＡ−３／ＡＤに含まれるＤＮＡコーディング配列を示す。キメラタンパク質の推定アミノ酸配列も示す。

図５は、組換えＣＤ４タンパク質の細胞外ドメイン、および本発明に従い、ＰＩ結合シグナル配列を表すと考えられる末端配列により特徴付けられるキメラタン／ｆり質をコードし、プラスミドＴ４／ＬＦＡ−３／２に含まれるＤＮＡコーディング配列を示す。キメラタンパク質の推定アミノ酸配列も示す。形質転換された宿主中でのこのコーディング配列の発現により得られる融合タンパク質は、ＣＤ４のＰＩ結合型であることが予想される。

図６は、本発明のハイブリッドＤＮＡ配列Ｔ４／ＬＦＡ−３／２で形質転換されたＣＨＯ細胞クローン番号１１は、ＰＩＰＬＣと共にインキ一ベートすることにより細胞表面から遊離し得る、Ｐｌに結合したＣＤ４を産生ずることを示す実験を表すグラフである。

及豆旦１風ユ■里Ｐｌ結合ＬＦＡ−３をコードするｃＤＮＡの３゛末端部分は、単離され、続いて分泌ポリペプチド（またはポリペプチドの分泌される部分）をフードするＤＮＡ配列の３′末端に結合されて、ポリペプチドにＰｌ結合を授は得ることが、本発明で発見された。分泌ポリペプチドにＰ■結合を授は得る、Ｐ！結合ＬＦＡ−３をコードするＤＮＡから選択された３′部分は、本明細書中では「ホスファチジルイノシトール結合シグナル配列」と呼ばれる。好ましくは、ホスファチジルイノシトール結合シグナル配列は、本明細書に記載のリンパ球機能関連抗原３（“ ＬＦＡ−３”）のＰｌ結合型をコードするＤＮＡに由来する。

ＬＦＡ−３は、例えば赤血球、単球、顆粒球、細胞障害性Ｔリンパ球、Ｂリンパ芽球細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、線維芽細胞のような多くの細胞上に見いだされる表面糖タンパク質である。　Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、＠Ｔｈｅ　Ｌ３＋＋＋ｐｈｏｃｙｔｅ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ＬＦＡ−１，ＣＤ２．　ａｎｄ　ＬＦＡ−３Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｓ：　Ｃｅ１ｌ　Ａｄｈｅｓｉｏｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　Ｏｆ　Ｔｈｅ　Ｉｍ＋ａｕｎｅ　Ｓｙｓｔｅｍ−、ｎｎ、ｅｖ、　Ｉ＋＊ｍｕｎｏ１．、５゜１）ｐ、　２２３−５２　（１９８７）。ＬＦＡ−３はＣＤ２　（Ｔリンパ球付随分子）に結合し、１９７８球の標的細胞への付着を媒介すると考えられている。この付着は、１９７８球の機能的応答の開始に必須である。Ｄｕｓｔｉｎら、　−Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　Ｆｕｎｃｔｉ。

ｎ−Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｄ　Ａｎｔｉｇｅｎ　３　Ｂｉｎ’ｄｓ　Ｔｏ　ＣＤ２　Ａｎｄ　Ｍｅｄｉａｔｅｓ　Ｔ　Ｌｙｍｐｂｏｃｙｔｅ　Ａｄｈｅｓｉｏｎ− 、Ｊ、　Ｅｘ　、　Ｍａｄ、、　１６５．　ｐｐ、　６７７−９２　（１９８７）。

ＬＦＡ−３は２種の異なる細胞表面型、即ち膜貫通型およびＰＩ結合型で存在する。Ｄｕｓｔｉｎら、　−Ａｎｃｈｏｒｉｎｇ　Ｍｅｃｈａｎｉ＠ｍｓ　Ｆｏｒ　ＬＦＡ−３Ｃｅ１ｌ　Ａｄｈｅｓｉｏｎ　Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｔ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　５ｕｒｆａｃｅ−、Ｎａｔｕｒｅ、　３２９．　ｐｐ、　８４Ｇ−４８（１９１１７）。両方の型の前駆体ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列を比較することにより、これらの配列の５°末端は同一であるが３゛末端の配列は異なることが明らかになった。共同で譲渡された、１９８８年８月２６日出願の継属中の米国特許出願第２３７．３０９号（ここに参考文献として援用される）、および本明細書の図１を参照。

ＬＦＡ−３の膜貫通型をコードするＨＴ１６　ｃＤＮＡは、推定の膜貫通領域の２３個の疎水性または非極性アミノ酸をコードする３°セグメント（図１のＨＴ１６のヌクレオチド６５５位から７２３位）、および推定の細胞質尾部の１２個のアミノ酸をコードする３′セグメント（図１のＨＴ１６のヌクレオチド７２４位から７５９位）を含有する。ＬＦＡ−３のＰＩ結合型をコードするＰ２４　ｃＤＮＡは、３′末端が３０ヌクレオチドだけ短く、最後の４個のアミノ酸をコードするヌクレオチド（図１のＰ２４のヌクレオチド７１８位から７２９位）に至るまで膜貫通型と１００％のホモロジーを有する。膜貫通型ＬＦＡ−３に関する研究は、１２個のアミノ酸の細胞質ドメインの除去により、このタンｉ＜り質がＰＩ膜結タンパク質に変化することを示した。従って、ホスファチジルイノシトール結合のための機能的シグナルは、ＬＦＡ−３のカルボキシ末端配列の中に含まれると理論付けられた。

本発明のホスファチジルイノシトール結合シグナル配列は、ＰＩ膜結ＬＦＡ−３をコードするＤＮＡから単離されるか、または標準法を用いて直接合成され得る。

本発明の、好ましいホスファチジルイノシトール結合シグナル配列は、ＰＩ膜結ＬＦＡ−３をコードするＤＮＡに由来する。最も好ましくは、ホスファチジルイノシトール結合シグナル配列は、５　’　−ＡＧ　ＣＡＡ　ＴＣＣＡ　ＴＴＡ　ＴＴＴＡ　ＡＴＡ　ＣＡＡ　ＣＡＴＣＡＴＣＡＡ　ＴＣＡ　ＴＴＴＴＧＡ　ＣＡＡ　ＣＣＴ　fＴＡＴＣＣＣＡＡＧ　ＣＡＧ　ＣＧＧＴ　ＣＡＴＴＣＡＡ　ＧＡＣＡＣＡＧＡＴＡＴＧ　ＣＡＣＴＴ　ＡＴＡ　ＣＣＣＡ　ＴＡＣＣＡＴＴＡＧＣＡＧ　ＴＡＡＴ　ＴＡ　ＣＡＡ　ＣＡ　ＴＧＴＡＴＴＧＴＧＣＴＧＴＡＴＡＴＧＡＡ　ＴＧＧＴＡＴＧ　ＴＡ　ＴＧ　ＣＴＴ　ＴＴ−３’を含む。

本発明の、ホスファチジルイノシトール構造を他の可溶性タンパク質またはポリペプチドに付着させる能力は、様々な用途をもたらし、その幾つかは以下に議論されている＝１、キメラのポリペプチド本発明のホスファチジルイノシトール結合シグナル配列は、ＰＩ膜結を有する「キメラの」ポリペプチドをコードするハイブリットＤＮＡ配列を構築するために使用され得る。本明細書の用語「キメラの」タンパク質またはポリペプチドは、ここでの教示に従いＰＩ槽構造授けられたタンパク質またはポリペプチドをさしていう。従って「キメラのタンパク質」は、典型的にはタンパク質成分（例えば可溶性タンパク質に対応する）およびホスファチジルイノシトール成分を冑する。

キメラのタンパク質は、好ましくは、本明細書に記載のハイブリッドＤＮＡ分子の発現の結果得られる。このようなハイブリッ）ＤＮＡ分子は、分泌ポリペプチドまたはポリペプチドの分泌部分をコードするＤＮＡセグメントの３９末端に、ホスファチジルイノシトール結合シグナル配列の５′末端を正しいリーディングフレームで結合することにより、都合よく調製される。適当な宿主細胞中での発現に際し、キメラのポリペプチドまたは融合タンパク質は、細胞外ドメインおよびそれを宿主細胞膜に固定するＰＩ膜結を有するように製造される。

本発明のホスファチジルイノシトール構造に結合するための好適なポリペプチドは、通常、その産生される細胞から分泌されるか、あるいはＮ末端に分泌シグナル配列が付くことにより分泌されるように作成され得る、すべてのポリペプチドまたはその断片であり得る。好適なポリペプチドは、例えば正常では膜貫通領域および／または細胞質ドメインを介して細胞表面に固定しているタンパク質についてＰＩ膜結合型製造することが望まれる場合、膜結合タンパク質の細胞外部分をも含む。ホスファチジルイノシトール構造とともに都合よ提供され得る、ポリペプチドの好適な型は、細胞表面リガンド、細胞表面抗原に対する抗体、ホルモン、細胞毒素、細胞活性化リガンド、可溶性レセプター、腫瘍マーカー等を含む。特に好ましい実施態様において、ヘルパーＴ細胞の表面タンパク質であるＣＤ４　（“Ｔ４”としても知られる）の先端が切断された可溶性型をコードするＤＮＡは、本発明に従うＬＦＡ−３ホスフアチジルイノシト一ル結合シグナル配列とインフレームで融合され、ＣＤ４レセプターおよびＣ末端ホスファチジルイノシトール構造を有する新規なキメラのタンパク質が提供される。　（本明細書の図３を参照のこと。）この融合タンパク質をフードするＤＮＡ配列は、宿主細胞を形質転換するのに使用され得、このような宿主を培養すると、宿主表面膜上にＰＩに結合したＣＤ４を有する細胞集団が得られる。

ＣＤ４は、感染の過程で）（ＩＶウィルス（後天的免疫不全症候群を引き起こす）が結合するレセプターとして知られているので、本明細書での記載に従い調製されたキメラのＣＤ４／ホスフアチジルイノシトールタンパク質は、ＨＩＶ感染のための強力な治療を提起する：ＣＤ４レセプターはＨＩＶウィルスを標的とすることに使用でき；ＰＩ膜結合介してＣＤ４レセプターは、ウィルスを破壊し得る細胞上に発現され得る。同様の様式で、ＣＤ４レセプターは、ＨＩＶｇ染細胞（または他のウィルス感染細胞）に対して毒性を示すタンパク質と、ミセルまたはリポソームの形成において用いられるＰＩ槽構造後述）とに融合されて、高濃度の薬物輸送システムが提供され得る。

Ｐ！膜結合ポリペプチド、本発明に従うハイブリッドＤＮＡ分子を用いて、ホスファチジルイノシトール結合を形成可能な宿主中でこのハイブリッドＤＮＡを発現させることにより得られる。ホスファチジルイノシトール結合を形成可能な全ての真核細胞が使用され得る。宿主細胞の選択は、細胞系の安定性、培養の容易さ、他の細胞または生物との適合性、他の細胞系に対する細胞障害性、および形質転換により製造されるＰＩ膜結合ポリペプチドついて予想される最終的な適用に依存し、または形質転換細胞そのものについて予想される適用に依存した多くの他の因子のような、追加の因子に基づいて行われる。予想される宿主生物の賢明な選択により、当業者は本発明の性質を、本明細書に記載の原理に依存しながら彼らの多様な必要性に適合させることができる。

例えば、ＣＨＯ，Ｒ１，１、Ｂ−Ｗ、　およびＬ−Ｍ細胞、７７リカミドリザル細胞（Ｃｏｓｔ、ＣＯ３７、Ｂ５Ｃｌ、Ｂ５Ｃ４０，およびＢＭＴＩＯ細胞を含む）のような哺乳動物細胞培養物、およびヒト細胞（赤血球、単球、顆粒球、細胞障害性Ｔ細胞、Ｂ　’Ｊンパ芽球細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、繊維芽細胞等を含む）および上記から派生した細胞系を含む、広範囲の細胞系および単細胞宿主が好適である。

ハイブリッドＤＮＡ分子は、適当な発現ベクターの発現制御配列に作動可能に結合させ、続いてこれを適当な単細胞宿主を形質転換するのに使用することにより発現する。本発明のハイブリッドＤＮＡ配列を発現制御配列に作動可能に結合することには、ＤＮＡ配列の上流に正しいリーディングフレームで翻訳開始シグナルを与えることが含まれる。

多くの宿主−発現ベクターの組合せが、本発明のＤＮＡ配列の発現に使用され得る。有用な発現ベクターは、染色体、非染色体、または合成りＮＡのセグメントから構築され得る。

好適なベクターには、例えば、様々な公知のＳ　Ｖ　４’　Ｏ誘導体および公知の細菌プラスミド、例えばｃｏｌ　Ｅｌ、ｐＣＲｌ、りＢＲ３２２、ｐＭＢ９および他の誘導体を含むＥ、　ｃｏ１１由来のプラスミド、広域宿主範囲プラスミド、例えばＲＰ４、ファージＤＮＡ　（例えば、ＮＭ９８９のようなλファージの多種の誘導体、およびＭ１３およびＦｉｌａ＋ｍｅｎｔｅｏｕｓ一本鎖ＤＮＡファージのような他のＤＮＡファージ）、２μプラスミドまたはその誘導体のような酵母プラスミド、および例えばファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を用いて修飾されたプラスミドのような、プラスミドとファージＤＮＡとの組合せに由来するベクターが含まれる。動物細胞での発現には、アデノウィルス２の主要後期プロモーターを含むプラスミドである、プラスミドＢＧ３１２が好ましい。

さらに、全ての多様な発現制御配列（作動可能に結合された場合にＤＮＡ配列の発現を制御する配列）が、本発明のＤＮＡ配列を発現するためのベクターに使用され得る。このような有用な発現制御配列には、例えば、ＳＶ４０またはアデノウィルスの初期および後期プロモーター、ｌａｃ系、１Ｌ且系、ＴＡＣまたはＴＲＣ系、λファージの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセレートキナーゼまたは他の解糖系酵素のプロモーター、例えばＰｈｏ５のような酸ホスファターゼのプロモーター、酵母 α接合因子のプロモーター、および他の原核細胞または真核細胞の遺伝子またはそれらのウィルスの遺伝子の発現を制御することが知られている配列、およびこれらの組合せが含まれる。動物細胞の発現では、アデノウィルス２の主要後期プロモーター由来の発現制御配列を使用することが好ましい。

もちろん、必ずしも全てのベクターおよび発現制御配列が、本発明のＤＮＡ配列の発現に同等に有効に機能するわけではないことが理解されるべきである。同じく、全ての宿主が同一の発現系で同等に有効に機能するわけでもない。しかし、当業者はこれらのベクター、発現制御配列、および宿主から、過度の実験なしに、本発明の範囲を逸脱することなく選択することができる。例えば、ベクターを選択するには、ベクターが中で複製されなければならないので、宿主が考慮されなければならない。ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、およびベクターにコードされた抗生物質マーカーのような任意の他のタンパク質の発現もまた考慮されるべきである。

発現制御配列の選択にも、様々な因子が考慮されるべきである。これらには、例えば、系の相対的強度、系の制御し易さ、および本発明の特定のＤＮＡ配列に対する、特に可能な二次構造に関する適合性が含まれる。単細胞宿主は、選択されたベクターとの適合性、本発明のＤＮＡ配列によって発現可能な状態でコードされた生成物の、宿主に対する毒性、宿主の分泌特性、宿主のタンパク質を折り畳む能力、宿主の安定性と培養要件、および本発明のＤＮＡ配列に発現可能な状態でフードされた生成物の精製の容易さを考慮して、選択されるべきである。

これらのパラメーターのうち、当業者は本発明のＤＮＡ配列を発現する様々なベクター／発現制御系／宿主の組合せを選択し得る。

ホスファチジルイノシトール結合を崩壊し、細胞表面からＰＩ結合タンパク質を遊離する、様々な薬剤が知られている。

これらには、例えば、亜硝酸、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（“ＰＩＰＬＣ″）、およびホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＤが含まれ、そしてエンドグリコシダーゼ、ホスホジェステラーゼおよびプロテイナーゼが含まれる可能性がある（Ｌｏｗ、上述）。例えばＴｒ　ａｎｏｓｏｍａ　ｂｒｕｃｅｆ由来のＰＩＰＬＣは、最も広く研究されている薬剤である。Ｐ　Ｉ　ＰＬＣは不可逆的に、高度に特異的にＰＩ結合タンパク質のＰＩ膜結を開裂し、可溶性タンパク質を作る。従って、ＰＩＰＬＣまたは他のＰＩ膜結を開裂する薬剤の使用を介して、本発明に従うＰＩに結合したキメラのポリペプチドが、選択的に、そのポリペプチドを生産する宿主細胞の表面から遊離し得る。

従って本発明は、ハイブリッドＤＮＡ分子で形質転換した宿主を培養してＰＩで固定された組換えタンパク質を得て、次にその培養培地にＰＩＰＬＣまたは他の薬剤を入れてタンパク質を可溶性型に遊離させることにより、組換えタンパク質を可溶性型で得る方法を提供する。本発明は更に、精製困難なタンパク質を、タンパク質を産生ずる細胞に対する遊離可能なＰＩ膜結の利点を利用して精製する方法をも意図する。

例えば、宿主細胞はＰＩ結合タンパク質に関係のない表面レセプターにより基体に固定し得、次にタンパク質はＰＩＰＬＣまたは他のホスファチジルイノシトール結合崩壊剤を溶出剤として用いることにより可溶性型として溶出され得る。

■、ミセル本発明で調製され、従って末端ホスファチジルイノシトール構造を授けられたキメラのタンパク質は、膜を界面活性剤で可溶化することによりホスファチジルイノシトール構造の完全体として精製され得る。界面活性剤溶液中では、キメラのタンパク質は一般に単量体であり、均一に分散しているが、透析により界面活性剤を除去するとホスファチジルイノシトール成分の凝集が起こり、ミセルまたはリポソームが形成される。

ミセル形成は、タンパク質のリン脂質に対する特定の割合を得るためにリン脂質を添加することにより、誘導され、制御される。ミセル内でのキメラタンパク質成分の向きは、外側の表面が主にリン脂質部分を含むか、あるいは外側の表面が主にキメラタンパク質のタンパク質部分を含むミセルとなるように調節可能である。ミセルのサイズもまた、使用される界面活性剤、添加するリン脂質の性質、またはリン脂質／タンパク質比を変化させることにより調節され得る。

一般に、リポソームのサイズは直接、血流から除去される速度に影響する。例えば、小さいリポソームおよび負に荷電されたリポソームは、より安定であり、肺臓および肝臓に蓄積する。従って、本発明のキメラのタンパク質から調製されたミセルおよびリポソームは、所望の期間血流中に残存するように、そして特定の器官に輸送されるように仕立てられる。

例えば、本発明の小さいミセルは、外側の表面がＰ１部分からの負の電荷を主に示すように形成され得、このようなミセルは、特定のタンパク質部分を肺臓または肝臓に輸送するのに理想的である。

キメラタンパク質のミセルは、タンパク質部分が外向きに位置するようにも組み立てられ得る。このタイプの構造は、ミセルを囲む微環境に、高濃度のタンパク質活性をもたらす。

例えば、ミセルになったキメラのタンパク質のタンパク質成分の性質によって、ミセルは多価リガンドあるいはレセプターとして、または多様な活性を有する一元性のタンパク質として機能し得る。リガンド−レセプター相互作用の特性によって、例えば本発明のミセル表面上の多数のリガンドがきわめて接近すると、単量体のリガンドタンパク質に見られるよりも、リガンドに対する数倍高い親和性を（低いオン−オフ速度のために）授は得る。

多くの治療剤は、高濃度で存在する場合にのみ有効であり、希釈およびクリアランス効果を考慮すると多量の投与量セ注射する必要がある。薬剤の標的付けのために、混合されたミセルは、標的の組織または器官に特異的にそのミセルを局在させる第二または第三のタンパク質（これらには、Ｐ１部分が既に結合されている）を含むように操作され得る。例えば、キメラのリガンド成分およびキメラの細胞毒性成分を有する混合ミセルは、前者が特異的病原体の表面レセプターに対して親和性を有し、後者が病原体に対して毒性であるが、このミセル形成によって病原体を特異的に標的とする薬剤が生成され、さらに細胞毒性成分の効果を局在化させる治療剤が生成される。特異的局在化によって、相互作用部位に薬剤の非常に高い濃度が保証される。

ミセルに含まれるべきタンパク質は、細胞標的付はタンパク質（細胞表面リガンド、腫瘍マーカー、腫瘍表面抗原に対する抗体等）、ホルモン、毒素、細胞を活性化するリガンド、可溶性レセプター（例えばＣＤ４）または任意の他のペプチド薬剤またはタンパク質薬剤であり得る。

混合ミセルについての他の研究は、ＰＩ構造の付いた融合タンパク質の構築を介するものである。融合タンパク質は複数の機能を示す。即ち、互いに継合わされて融合タンパク質成分を形成する各タンパク質断片に対応する、複数のドメインを示す。このような融合タンパク質ミセル成分の一つの部分は、標的付はタンパク質（例えば特定のレセプターのリガンド）として作用し得、一方、タンパク質の他の部分は、特定の治療機能（例えば特定の細胞を溶解する毒素、細胞のアクチベーター、ホルモン等）を有し得る。

■、鼠１１然見立亘庄本発明のキメラのタンパク質は、特定の宿主細胞で発現され得、その細胞を特定の組織または器官に標的付けるために用いられ得る。

ミセルの治療への適用として上記に概説したように、特異的機能を有するヒト細胞（キラー細胞、ヘルパーＴ細胞等）が、特定の作用部位を標的にするように操作され得る。細胞Ｑｉ害性Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞、マクロファージまたは他の型の細胞が、標的細胞に特異的なＰＩ膜結した可溶性レセプターまたはリガンドで形質移入され得る（例えば腫瘍細胞マーカーを細胞障害性Ｔリンパ球に形質移入する）。

このような標的の細胞は、都合よく培養され、インビトロで特異的に活性化され得る。

はとんどの細胞表面タンパク質は、細胞質ドメインを有する膜貫通タンパク賃である。細胞質ドメインはしばしば、その細胞外リガンドとの相互作用によって細胞内シグナルの変換を行う。しかし、細胞質ドメインをＰＩ膜結で置き換えることにより、細胞質シグナル配列なしにそのタンパク質の細胞外部分を付着させ、従って、この分子を完全に標的付分子として使用することが可能である。この様な細胞の標的付けは、通常ではどんな特異性も示さない部位特異的な作用のための多数の細胞溶解細胞を提供する。

ＩＶ、ＤＮＡライブラリーのスクリーニングＰＩ結合をコードする遺伝子は、発現ベクターに組み入れられて、正常では分泌されるタンパク質のｃＤＮＡライブラリーを構築しスクリーニングするために使用され得る。

本発明のホスファチジルイノシトール結合シグナル配列は、発現ベクターに組み入れられ、ｃＤＮＡライブラリーを構築しスクリーニングするために使用され得る。特徴的なこととしては、ＰＩＩ合付与配列は、正常では分泌されるタンパク質をコードするクローン化ＤＮＡが、発現された場合に宿主細胞表面に固定されるように、発現ベクター中に入れられる。

次に、クローン化ＤＮＡを含む細胞は、例えば５ｅｅｄおよびＡｒｕｆｆｏ、　 ”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｏｆ　Ｔｈｅ　ＣＤ２　Ａｎｔｉｇｅｎ、　Ｔｈｅ　Ｔ−ＣｅｌｌＥｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｂｙ　Ａ　Ｒａｐｉｄ　Ｉｍｍｕｎｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ−、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８４．　ｐｐ、３３６５−６９　（１９ｇ７）　（ここに参考文献として援用される）に記載のパンニング法によって、分離され得る。

ｃＤＮＡライブラリーは、好ましくは、動物細胞の発現ベクターを使用して構築され、このベクターは発現するそれぞれのタンパク質がＰＩ膜結を有するように操作されている。

さもなくば分泌されたタンパク質が、このようにして宿主細胞の細胞表面に結合し、そして目的とする特定のタンパク質を発現する細胞は、そのタンパク質に対するモノクローナル抗体を用いて単離され得る。分泌されるタンパク質のｃＤＮＡの単離は、現在確立されている方法によりモノクローナル抗体またはそのタンパク質に対するリガンドを用いると、非常に煩雑であり非効率的である。従って、ここに提案された方法は、効率と信頼性を大きく改善する。

以下の実施例は、本発明の特徴を詳しく説明するために提供されている。以下の記載は、ＣＤ４の細胞外ドメインに基づく、特に好ましいキメラタンパク質に関するが、この実施例は本発明の範囲をいかなるようにも限定しようとするものではない。

Ｋ１五以下の記載は、ＰＩ膜結性ＬＦＡ−３をコードするＤＮＡ由来の末端セグメントを、正常（即ち、ヒト野生型子細胞）では膜タンパク質であるＣＤ４の細胞外ドメインの部分をコードするＤＮＡに結合させることにより、ＣＤ４タンパク質のＰＩ結結盟型製造する実験である。ＣＤ４は４５８個のアミノ酸の糖タンパク質であり、２３個のアミノ酸のシグナル配列（ＡＡｌからＡＡ２３）、３７３個のアミノ酸の細胞外ドメイン（ＡＡ２ＪからＡ　Ａ　５ｅｅ）、膜貫通ドメイン（Ａ　Ａ　３ｅｔからＡＡ４ｔｓ）、および細胞質尾部（Ａ　Ａ　ａｔｅからＡ　Ａ　ａｓｓ）を含む。

ＣＤ４のアミノ酸配列を図３に示す。　Ｌｉｔｔｍａｎら、　−ｃｏｒｒｅｃｔｓｄ　ＣＤ４５ｅｑｕｅｎｃｅ−、Ｃｅ１１．５５．　ｐ、　５４１　（１９８８）もまた参照のこと。推定されるシグナル配列、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインは、シグナル配列および膜貫通配列に下線を付けることにより表す。

ＣＤ４　ＬＦＡ−３ベクーエｎ策以下の構築において、全ての制限酵素および他の材料は、他に説明しない限り、製造業者の指示に従い使用した。

ＰＩ膜結性ＬＦＡ−３をコードするＤＮＡは、前述の共同譲渡された係属中の米国特許出願第２３７，３０９号に記載のプラスミドＰ２４から得た。このプラスミドを有するＬｕ（社）ユのＬＢ穿刺は、米国メリーランド州すンチクムのＩｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ、ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに、１９８８年７月２２日に、寄託番号ＩＶＩ−１０１８０で預けられた。

ＰＩ膜結性ＬＦＡ−３をコードする全長ｃＤＮＡを含有するプラスミドＰ２４（図２を参照）を、制限酵素Ｎｏｔｌ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ製、　Ｂｅｖｅｒｌｙ、　ＭＡ）で消化し、１％アガーゲルでの電気泳動により８４９塩基対（ｂｐ）の断片を単離した。８４９ｂｐ断片（図１のＰ２４の挿入）を制限酵素且ｂ　ｖ　Ｉ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ製）で消化し、２０５ｂｐ断片（図１のＮ　ｓａｓ　Ｎ　８４９）を電気泳動で単離した後、ＤＮＡポリメラーゼ■　（クレノー断片、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ製）で平滑末端化して、発現ベクターＢＧ３９１（寄託番号ＩＶＩ− １０１５１、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、　Ｉｎｃ、　）の唯一のＢｓｔＥ１１制限酵素部位にライゲージコンした。ベクターＢＧ３９１には、図３のアミノ酸１〜３２５位に相当する組換え可溶性ＣＤ４タンパク質の遺伝子が組入れられている。ＰＣＴ公開第ＷＯ３９１０１９４０号を参照。

得られたＴ４／ＬＦＡ−３／ＡＤと呼ばれる組換えＤＮＡ分子は、ＣＤ４のＮ末端の２６７個のアミノ酸に特徴付けられるポリペプチドと、その直後のＰＩ膜結性ＬＦＡ−３のＣ末端の２８個のアミノ酸とをコードするＤＮＡ配列を含有する。Ｔ４／ＬＦＡ−３／ＡＤのコーディング配列および推定アミノ酸配列を図４に示す。

プラスミドＴ４／ＬＦＡ−３／ＡＤをＸｍｎ　Ｉで直鎖状にして、Ｄ　ＨＦ　Ｒ遺伝子を有するプラスミドｐＡｄＤ２６の直鎖状５ｔｕｌ断片と共に、カルシウムリン酸法によりＣＨＯ（Ｄ）ＩＦＲ−）細胞に同時形質移入した。Ｋａｕｆｎ＋ａｎおよび５ｈａｒｐ、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｆｏｌ、、　ｉ、　ｐ、１３０４　（１９４２）参照。形質移入した細胞をα（−）改変イーグル培地（ＭＥＭ）　（Ｇｉｂｃｏ製）中で生育させ選択した。

ＣＤ４形質移入細胞の表面の発現は、蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）分析により決定した：ハングのＢＳＳ緩衝液、０．５　ＥＤＴＡで４℃で１５分間インキコベートすることにより、ｌＸｌ０’個の形質移入細胞およびコントロールのＣＨＯ細胞を組織培養皿から除去した。次に、除去した細胞を沈澱させ、５０ μｍのＰＢＮ緩衝液（１ｘＰＢＳ、０゜５％ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウム）に再懸濁して、１００μｍのモノクローナル抗体ＯＫ　Ｔ　４　Ａ　（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｅｋｉｎｓｏｎ、　Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｖ、　ＣＡ）と共に水上で４５分間インキュベートした。細胞を遠心分離により沈澱させ、ＰＢＮ緩衝液に２回再懸濁した。細胞を再び沈澱させ、細胞の沈澱物をＰＢＮ緩衝液中１＝５０希釈のＰＣＩ（ヒツジ抗マウスＩｇＧの蛍光結合アフィニティー精製Ｆ　（ａｂ’　）２断片；　Ｃａｐｐｅｌ　Ｂｆｏｌｅｅｄｉｃａｌ製、　Ｗｅｓｔｃｈｅｓｔｅｒ、　Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ、　ＵＳＡ）の１００μｍに再懸濁して氷上で３０分間インキュベートした。細胞を３００μｍの１００％胎児仔ウシ血清のクッション上に乗せた後、８００ｇ１のｔｘＰＢＳ緩衝液に再懸濁し、Ｆ　Ａ　ＣＳ　（Ｂｅｃｔ。

ｎ　Ｄｉｅｋｉｎｓｏｎ製、　Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉａｗ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、　ＵＳＡ）により蛍光強度を測定した。

ＦＡＣＳ分析により、キメラのＣＤ４／ＬＦＡ−３ポリペプチドの表面への発現が陽性のクローンが４０個得られた。

４個の陽性クローンをα（−）ＭＥＭ中で培養し、１００μＩＭＥＭ中ｌ：５０希釈のＰ　Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ　Ｕｎｆｖｅｒｓｉｔｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＵＳＡのＭ、　Ｌａｗ氏から贈与）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。ＰＩＰＬＣ処理の前後で、各クローンからｌＸｌ０’細胞を上記のようにＦＡＣＳのために調製した。Ｐ　Ｉ　ＰＬＣ処理されたクローンの蛍光強度は、処理されないクローンと同一であった。このことは、ＣＤ４タンパク質が遊離されなかったこと、およびＴ４／ＬＦＡ−３／ＡＤプラスミドの発現の結果、単純なホスファチジルイノシトール結合を有するキメラのポリペプチドが得られなかったことを示唆する。

次に、ＬＦＡ−３ｃＤＮＡの３′末端に由来する大きな断片を有する組換えＤＮＡ分子を構築した。上記の方法の後に、ＣＤ４の細胞外ドメインのＮ末端の２６６個のアミノ酸、およびＰＩ膜結性ＬＦＡ−３のＣ末端の５１個のアミノ酸をコードする、ＣＤ４／ＬＦＡ−３ハイブリッドＤＮＡ配列を調製した。ライゲーションにより、インロイシン残基が導入された。このハイブリッドＤＮＡ分子はＴ４／ＬＦＡ−３／２と名付けた。Ｔ４／ＬＦＡ−３／２のコーディング配列および推定アミノ酸配列を図５に示す。

プラスミドＴ４／ＬＦＡ−３／２を前述のようにしてＸｍｎＩで直鎖状にし、５ｔｕｌで直鎖状にしたプラスミドｐＡｄＤ２６と共に、リン酸カルシウム法により前述のように２Ｘ　１０７ＣＨＯ（ＤＨＦＲ”）細胞を同時形質移入した。形質移入した細胞をα（−）ＭＥＭ中で生育させ選択した。

１６個の耐性クローンを単離し、拡げ、前述のようにＦＡＣＳによりＣＤ４タンパク質の表面発現をアッセイした。ＣＤ４の表面発現が強い陽性の４個のクローン、Ｔ４／ＬＦＡ−３／２＃３、＃８、＃１１および＃１５はさらに、前述のようにＰＩＰＬＣと共にインキユベーシヨンした後の表面ＣＤ４の遊離についてアッセイした。クローンのうち２個は、ＰＩＰＬＣとのインキユベーシヨンの後に表面ｃＤ４が減少した。このことは、ＣＤ４タンパク質の細胞外部分が、ＣＤ４タンパク質の細胞外部分が、ホスファチジルイノシトール結合（Ｐ２４ＣＤＮＡから切取られた３′ホスフアチジルイノシト一ル結合シグナル配列の発現により授けられた）を介して細胞表面に付着していることを示唆した；２個のクローンは、ＰＩＰＬＣとのインキユベーシヨンの後ＣＤ４の表面発現が減少せず、これらの特定のクローンの表面ＣＤ４はＰＩ膜結していないことが示唆された。図６は、クローンＴ４−ＬＦＡ−３−２＃１１　（Ｐ　Ｉ結合性ＣＤ４の発現が陽性）およびクローンＴ４／ＬＦＡ−３／２＃１５　（コントロール、ＰＩ結合性の発現が陰性）のＰＩＰＬＣインキニベーションの結果をグラフで示している。

本発明の微生物およびハイブリッドＤＮＡ分子は、１ｎＶｔｔｒｏ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、　Ｉｎｃ、　６１１（Ｐ）ＨａＩｌｍｏｎｄｓ　Ｆｅｒｒｙ　Ｒｏａｄ、　Ｌｉｎｔｈｉｃｕｍ、　ＭＤのカルチャーコレクシコンに１９８９年４月５日に寄託された培養物により例証される。培養物は以下のように同定されたニプラスミド　監−１−二　艷ｆｕ豆Ｔ４／ＬＦＡ−３／２　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＡ２２１（ｐＴ４／ＬＦＡ−３／２）　ＩＶＩ−１０２０２本発明の製造物および方法を、特定のＤＮＡ配列およびポリペプチドに関して本明細書に述べているが、広い範囲の他の実施態様が考えられる。例えば、上記の記載はＣＤ４／ＬＦＡ−３構築物についてのものであるが、この開示から多くの同様の構築物が明白である。このような構築物には、例えば、好ましいＬＦＡ−３ＰＩＩ合シグナル配列に結合したＣＤ４の細胞外ドメインをコードする、より長いまたはより短いＤＮＡ配列の部分が含まれる。さらに、ＬＦＡ−３のＰＩ結結盟型由来する、実施例の特定の配列よりも長いまたは短いＰＩＩ合シグナル配列が考えられる。同じように、遺伝子コードの退縮に基づく相同ではないＤＮＡ配列も考えられる。このＤＮＡ配列は、ＰＩ膜結性ＬＦＡ −３に直接に由来するＰＩＩ合シグナル配列がコードするのと同じ、作動可能なＣ−末端ペプチドを、発現される状態でコードする。本発明はもちろん、ＣＤ４以外の可溶性タンパク質またはタンパク質の細胞外部分に由来するＮ末端細胞外領域により特徴付けられる、キメラのポリペプチドも考慮する。このような他の実施態様および自明な改変は全て、添付の請求の範囲で定義される本発明の意図する範囲のなかにある。

ＨＴＩｂ　ｃｌ）ＮＡｈよｐ／）２チ　ｅＪ）ＮＡａｙ　ｃｃｉｉ（ＩＩＹＧＶＶＹＧＮＶＴＦＨＶＰｓＦＩＧ、　ｆＦＩＧ、イ（ＣＯｎｔ、）Ｐ２４　ＧＣＣＧＣ９００ＦＩＧ、　Ｉ（ｃｏｎｔ、）８　８　８　８８８８ｇ −Ｎ　−４１／Ｉ　ψ　ト　ロｍ　ｊ　＋１　＋１−＋＋　＋１−一９　０　０　０　９、　３　０　藁Ｔ５ＬＬｆ−Ａ−３ＡＤアミノ＃交りよび’ＤＮ△δ乙列ＦＩＧ、４１００１　人ＭＧＣＧＧＣＣ１００９ＦＩＧ、　４　（ｃｏｎｔ、）８ｔ８８８８ｇ −〜　ｎ４／１　’−１３Ｋａｕｆｓａｎおよび５ｈａｒｐ、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　２．　ｐ、１３０４　（１９８２）参照。形質移入した細胞をα（−）改変イーグル培地（ＭＥＭ）　（Ｇｉｂｅｏ製）中で生育させ選択した。

ＣＤ４形質移入細胞の表面の発現は、蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣ３）分析により決定した：ハングのＢ５Ｓｍ１ｉ液、０．５　ＥＤＴＡで４℃で１５分間インキュベートすることにより、Ｉ　Ｘ　１０Ｉ！１個の形質移入細胞およびコントロールのＣＩ（Ｏ細胞を組織培養皿から除去した。次に、除去した細胞を沈澱させ、５０μｌのＰＢＮ緩衝液（ＩＸＰＢＳ、０゜５％ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウム）に再懸濁して、１００μｍのモノクローナル抗体ＯＫ　Ｔ　４　Ａ　（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、　Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｆｅｗ、　ＣＡ）と共に水上で４５分間インキュベートした。細胞を遠心分離により沈澱させ、ＰＢＮ緩衝液に２回再懸濁した。細胞を再び沈澱させ、細胞の沈澱物をＰＢＮ緩衝液中１：５０希釈のＦＣＩ（ヒツジ抗マウスＩｇＧの蛍光結合アフィニティー精製Ｆ　（ａｂ’　）２断片；　Ｃａｐｐｅｌ　Ｂｉｏ＋ｅｅｄｉｃａｌ製、　Ｗｅｓｔｃｈｅｓｔｅｒ、　Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ、　ＵＳＡ）の１００ｔｌｌに再懸濁して水上で３０分間インキュベートした。細胞を３゜Ｏｕｌの１００％胎児仔ウシ血清のクッション上に乗せた後、８００μｌのＩＸＰＢＳ緩衝液に再懸濁し、Ｆ　Ａ　ＣＳ　（Ｂｅｃｔ。

ｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製、　Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｖ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、　ＵＳＡ＞により蛍光強度を測定した。

４個の陽性クローンをα（−）ＭＥＭ中で培養し、１００μＩＭＥＭ中１：５０希釈のＰ　Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＵＳＡのＭ、　Ｌｏｗ氏から贈与）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。ＰＩＰＬＣ処理の前後で、各クローンからｌＸｌ０’細胞を上記のようにＦＡＣ３のために調製した。Ｐ　Ｉ　ＰＬＣ処理されたクローンの蛍光強度は、処理されないクローンと同一であった。このことは、ＣＤ４タンパク質が遊離されなかったこと、およびＴ４／ＬＦＡ−３／ＡＤプラスミドの発現の結果、単純なホスファチジルイノシトール結合を有するキメラのポリペプチドが得られなかったことを示唆する。

次に、ＬＦＡ−３ｃＤＮＡの３′末端に由来する大きな断片を有する組換えＤＮＡ分子を構築した。上記の方法の後に、ＣＤ４の細胞外ドメインのＮ末端の２６６個のアミノ酸、およびＰＩ膜結性ＬＦＡ−３のＣ末端の５１個のアミノ酸をコードする、ＣＤ４／ＬＦＡ−３ハイブリッドＤＮＡ配列を調製した。ライゲージ覆ンにより、インロイシン残基が導入された。このハイブリ・ラドＤＮＡ分子はＴ４／ＬＦＡ−３／２と名付けた。Ｔ４／ＬＦＡ−３／２のコーディング配列および推定アミノ酸配列を図５に示す。

プラスミドＴ４／ＬＦＡ−３／２を前述のようにしてＸｍｎ１で直鎖状にし、Ｓ　ｔｕｌで直鎖状にしたプラスミドｐＡｄＤ２６と共に、リン酸カルシウム法により前述のように２Ｘ　１０’ＣＨＯ（ＤＨＦＲつ細胞を同時形質移入した。形質移入した細胞をα（−）ＭＥＭ中で生育させ選択した。

１６個の耐性クローンを単離し、拡げ、前述のようにＦＡＣ８によりＣＤ４タンパク質の表面発現をアッセイした。ＣＤ４０表面発現が強い陽性の４個のクローン、Ｔ４／ＬＦＡ−３／２＃３、＃８、＃１１および＃１５はさらに、前述のようにＰＩＰＬＣと共にインキュベージ１ンした後の表面ＣＤ４の遊離についてアッセイした。クローンのうち２個は、ＰＩＰＬＣとのインキュベージ１ンの後に表面ＣＤ４が減少した。このことは、ＣＤ４タンパク質の細胞外部分が、ホスファチジルイノシトール結合（Ｐ２４ｃＤＮＡから切取られた３′ホスフアチジルイノシト一ル結合シグナル配列の発現により授けられた）を介して細胞表面に付着していることを示唆した；２個のクローンは、ＰＩＰＬＣとのインキ具ベージ璽ンの後ＣＤ４の表面発現が減少せず、これらの特定のクローンの表面ＣＤ４はＰＩ膜結していないことが示唆された。

図６は、クローンＴ４−ＬＦＡ−３−２＃１１　（ＰＩ結合性ＣＤ４の発現が陽性）およびクローンＴ４／ＬＦＡ−３／２＃１５（コントロール、ＰＩ結合性の発現が陰性）のＰＩＰＬＣイン牛ユベーシヲンの結果をグラフで示している。

国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】１．リンパ球機能関連抗原３（ＬＦＡ−３）のホスファチジルイノシトール結合シグナル配列をコードするＤＮＡ配列。２．請求項１に記載のＤＮＡ配列であって、【配列があります】および、前述のＤＮＡ配列に発現される状態でコードされるポリペプチドを、発現される状態でコードするＤＮＡ配列、からなる群から選択される、配列。３．ハイブリッドＤＮＡ配列であって、（ａ）分泌タンパク質、分泌タンパク質の一部または膜タンパク質の細胞外領域をコードする第一のＤＮＡ配列、および、該第一のＤＮＡ配列の下流に（ｂ）リンパ球機能関連抗原３のホスファチジルイノシトール結合シグナル配列をコードする第二のＤＮＡ配列であって、ハイブリッドＤＮＡ配列がホスファチジルイノシトール結合ポリペプチドとなるように該第一のＤＮＡ配列に作動可能に結合している第二のＤＮＡ配列、を含むＤＮＡ配列。４．請求項３に記載のハイブリッドＤＮＡ配列であって、前記第二のＤＮＡ配列が、【配列があります】および、前述のＤＮＡ配列に発現される状態でコードされるポリペプチドを、発現される状態でコードするＤＮＡ配列、からなる群から選択される、ＤＮＡ配列。５．請求項３に記載のハイブリッドＤＮＡ配列であって、前記第一のＤＮＡ配列が、細胞表面リガンド、細胞表面抗原に対する抗体、ホルモン、細胞毒素、細胞活性化リガンド、表面プロテアーゼ、可溶性レセプター、および分泌または内在性タンパク質からなる群から選択される、タンパク質またはタンパク質の一部をコードする、ＤＮＡ配列。６．前記第一のＤＮＡ配列が、ＣＤ４の細胞外ドメインをコードする、請求項５に記載のハイブリッドＤＮＡ配列。７．組換えＤＮＡ分子であって、（ａ）分泌タンパク質、分泌タンパク質の一部または膜タンパク質の細胞外領域をコードする第一のＤＮＡ配列、（ｂ）該第一のＤＮＡ配列の下流に位置し、リンパ球機能関連抗原３のホスファチジルイノシトール結合シグナル配列をコードする第二のＤＮＡ配列であって、該第一および第二のＤＮＡ配列の発現の結果、ホスファチジルイノシトール結合ポリペプチドが得られるように作動可能に第一のＤＮＡ配列に結合している第二のＤＮＡ配列、および（ｃ）該第一のＤＮＡ配列に作動可能に結合した発現制御配列を含む、ＤＮＡ分子。８．請求項７に記載の組換えＤＮＡ分子であって、前記第二のＤＮＡ配列が、【配列があります】および、前述のＤＮＡ配列に発現される状態でコードされるポリペプチドを、発現される状態でコードするＤＮＡ配列からなる群から選択される、ＤＮＡ分子。９．請求項７に記載の組換えＤＮＡ分子であって、前記第一のＤＮＡ配列が、細胞表面リガンド、細胞表面抗原に対する抗体、ホルモン、細胞毒素、細胞活性化リガンド、可溶性レセプター、表面プロテアーゼ、および分泌または内在性タンパク質からなる群から選択されるタンパク質またはタンパク質の一部をコードする、ＤＮＡ分子。１０．前記第一のＤＮＡ配列がＣＤ４の細胞外ドメインをコードする、請求項７に記載の組換えＤＮＡ分子。１１．前記発現制御配列が、ＳＶ４０またはアデノウイルスの初期および後期プロモーターからなる群から選択される、請求項７に記載の組換えＤＮＡ分子。１２．組換えＤＮＡ分子で形質移入された、真核宿主細胞培養物であって、該組換え分子は、（ａ）分泌タンパク質、分泌タンパク質の一部または膜タンパク質の細胞外領域をコードする第一のＤＮＡ配列、（ｂ）該第一のＤＮＡ配列の下流に位置し、リンパ球機能関連抗原３のホスファチジルイノシトール結合シグナル配列をコードする、第二のＤＮＡ配列であって、該第一および第二のＤＮＡ配列の発現の結果、ホスファチジルイノシトール結合ポリペプチドが得られるように作動可能に該第一のＤＮＡ配列に結合している第二のＤＮＡ配列、および（ｃ）該第一のＤＮＡ配列に作動可能に結合した発現制御配列、を含む、真核宿主細胞培養物。１３．請求項１２に記載の真核宿主細胞培養物であって、前記第二のＤＮＡ配列が、【配列があります】および、前述のＤＮＡ配列に発現される状態でコードされるポリペプチドを、発現される状態でコードするＤＮＡ配列、からなる群から選択される、真核宿主細胞培養物。１４．請求項１２に記載の真核細胞培養物であって、前記第一のＤＮＡ配列が、細胞表面リガンド、細胞表面抗原に対する抗体、ホルモン、細胞毒素、細胞活性化リガンド、可溶性レセプター、表面プロテアーゼ、および分泌または内在性タンパク質からなる群から選択されるタンパク質またはタンパク質の一部をコードする、真核宿主細胞培養物。１５．前記第一のＤＮＡ配列が、ＣＤ４の細胞外ドメインをコードする、請求項１２に記載の真核宿主細胞培養物。１６．前記発現制御配列が、ＳＶ４０またはアデノウイルスの初期および後期プロモーターからなる群から選択される、請求項１２に記載の真核宿主細胞培養物。１７．前記宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、Ｒ１．１細胞、ＣＯＳ細胞、キラー細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞障害性Ｔリンパ球およびマクロファージからなる群から選択される、請求項１２に記載の真核宿主細胞培養物。１８．請求項３から６のいずれかに記載のハイブリッドＤＮＡ配列がゴードずる、末端にホスファチジルイノシトール構造を有するポリペプチド。１９．請求項１８に記載のポリペプチドの多数から実質的になるミセル。２０．前記ホスファチジルイノシトール構造が、主にミセルの外側の表面に向いている、請求項１９に記載のミセル。２１．前記ホスファチジルイノシトール構造が、主にミセルの内側の表面に向いている、請求項１９に記載のミセル。２２．膜タンパク質の可溶性型を製造する方法であって、（１）リンパ球機能関連抗原３のホスファチジルイノシトール結合シグナル配列をコードするＤＮＡ配列に、膜タンパク質の細胞外部分をコードするＤＮＡ配列を作動可能に結合させて、ハイブリッドＤＮＡ配列を形成する工程；（２）該ハイブリッドＤＮＡ配列を含有する発現ベクターにより形質移入された真核宿主細胞を培養して、ホスファチジルイノシトール結合によって該宿主細胞の細胞膜に固定された細胞外ポリペプチドを製造する工程；（３）ホスファチジルイノシトール結合を破壞し得る試薬で細胞培養物を処理する工程；および（４）細胞外培地から、ポリペプチドの可溶性型を回収する工程、を包含する、方法。２３．請求項２２に記載の方法であって、前記ホスファチジルイノシトール結合シグナル配列が、【配列があります】および、前述のＤＮＡ配列のうちのいずれかに、発現される状態でコードされるポリペプチドを、発現される状態でコードするＤＮＡ配列、からなる群から選択される、方法。２４．前記試薬が、亜硝酸、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣまたはホスファチジルイノシトール特異的ホスホリバーゼＤから選択される、請求項２２に記載の方法。２５．前記試薬が、ホスファチジルイノシトール特異的ホズホリバーゼＣ（ＰＩＰＬＣ）である、請求項２４に記載の方法。２６．標的付けされた宿主細胞を製造する方法であって、（１）標的細胞上の表面レセプターに対するりかンドをコードするＤＮＡ配列を単離する工程；（２）該単離されたＤＮＡ配列、および、その単離されたＤＮＡ配列の下流に作動可能に結合されたリンパ球機能関連抗原３のホスファチジルイノシトール結合シグナル配列をコードするＤＮＡ配列を含む、ハイブリッドＤＮＡ配列を調製する工程；および（３）該ハイブリッドＤＮＡ配列を含有する発現ベクターで宿主細胞を形質移入することにより、標的細胞のレセプターに対するリガンドを細胞表面に有する宿主細胞を得る工程、を包含する、方法。２７．分泌タンパク質のＤＮＡをＤＮＡ発現ライブラリーからスクリーニングする方法であって、（１）一連の発現ベクターを調製する工程であって、各ベクターが、発現制御配列、リンパ球機能関連抗原３のホスファチジルイノシトール結合シグナル配列をコードするＤＮＡ配列、およびＤＮＡライブラリーからのＤＮＡ単離物を含有し、該発現制御配列、ＤＮＡ配列、およびＤＮＡ単離物は、該ＤＮＡ単離物が該発現制御配列に作動可能に連結し、該ＤＮＡ配列が、該ＤＮＡ単離物によりコードされる任意の分泌ポリペプチドが発現されるときにホスファチジルイノシトール結合のシグナルとなるように向けられる形で方向付けられる工程；（２）工程（１）に従って調製きれた発現ベクターを真核宿主細胞に形質移入し、そしてその形質移入された細胞を培養する工程；および（３）１つまたはそれ以上の該ＤＮＡ単離物のコードするポリペプチドの、結合レセプターあるいはそのリガンド、または該ポリペプチドに対する抗体の１つまたはそれ以上を有する基質に、該形質移入された宿主細胞をさらす工程、を包含する、方法。２８．末端ホスファチジルイノシトール構造を有するポリペプチドの多数を含むミセルを製造する方法であって、（１）分泌タンパク質、分泌タンパク質の一部または膜タンパク質の細胞外領域をコードするＤＮＡ配列を単離ずる工程（２）該単離ＤＮＡ配列および、該単離ＤＮＡ配列の下流に作動可能に連結された、リンパ球機能関連抗原３のホスファチジルイノシトール結合シグナル配列をコードするＤＮＡ配列を含む、ハイブリッドＤＮＡ配列を調製する工程；（３）該ハイブリッドＤＮＡ配列を含む発現ベクターを宿主細胞に形質移入し、そして培養し、該単離ＤＮＡ配列のコードするポリペプチドのホスファチジルイノシトール結合型を宿主細胞表面上に有する宿主細胞を得る工程；（４）形賃移入細胞の培養物を界面活性剤で溶解し、完全なホスファチジルイノシトール構造を有する単量体ポリペプチドを含む分散物を得る工程；および（５）完全なホスファチジルイノシトール構造を有する該単量体ポリペプチドのミセル凝集が形成されるまで、随意にリン脂質を添加して、透析により該界面活性剤を除去する工程、を包含する、方法。