JPH04503451A - Self-sustaining, array replication system - Google Patents
Self-sustaining, array replication systemInfo
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- JPH04503451A JPH04503451A JP2-501879A JP50187990A JPH04503451A JP H04503451 A JPH04503451 A JP H04503451A JP 50187990 A JP50187990 A JP 50187990A JP H04503451 A JPH04503451 A JP H04503451A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.
Description
【発明の詳細な説明】 〔発明の名称〕 自己持続性、配列複製システム 〔関連出願〕 １９８９年７月１９日に出願された米国特許出願第０７１０６４１４１号および １９８８年６月６日に出願されへＰＣＴ国際出願第ＷＯ８Ｂ／１０３１５号とし て公開されたその継続出願米国特許第０７／２０２９７８号が引用さ娠その各々 の出願の全開示内容は明示の引例に含まれている。[Detailed description of the invention] [Name of invention] Self-sustaining, array replication system [Related applications] U.S. Patent Application No. 071064141 filed July 19, 1989; PCT International Application No. WO8B/10315 filed on June 6, 1988 Its continuation application U.S. Patent No. 07/202,978, published in The entire disclosure of the application is incorporated by explicit reference.
本発明は一般的には分子生物学および組換えＤＮＡ技術の進歩に関する。 FIELD OF THE INVENTION This invention relates generally to advances in molecular biology and recombinant DNA technology.
特に、本発明の試験管内および生体外道具量てにおいて生物試料中の標的核酸配 列または対応する標的ＤＮＡ配列からの外挿ＲＮＡ配列の存在およびＲＮＡ（Ｄ ＮＡ）配列がコードしている対応するポリペプチドの推論による検出のための必 要な試薬および装置を含む検定および医薬キットを含む方法および手段を請求の 範囲に含んでいる。In particular, the in vitro and in vitro tools of the present invention can be used to The presence of extrapolated RNA sequences from the sequence or the corresponding target DNA sequence and the presence of RNA (D NA) Requirements for inferential detection of the corresponding polypeptide encoded by the sequence. Requesting methods and means including assay and pharmaceutical kits containing necessary reagents and equipment Included in the range.
本発明は試験管内システムにおいて自己持続性で一つの容器中での特定の核酸標 的配列の増幅を提供する用意があることを特色とし、標的核酸配列の増幅は任意 の自己複製能力を持つ多数の転写体生成物の調製により達成される。この自己持 続性増殖システムは温度サイクルを必要とする核酸デユープレックスの繰返し変 性の必要性を避けることができる０本発明は新規様式で、単−反応道具室てで増 幅生成物を形成するのに必要な試薬、または増幅された形での検出に適した生成 物（標的核酸配列の存在を表わす）を混合する。The present invention provides self-sustaining in vitro systems for the production of specific nucleic acid markers in one container. The amplification of the target nucleic acid sequence is optional. This is achieved by the preparation of multiple transcript products with self-replicating capabilities. this self-possession Continuous propagation systems involve repeated changes in nucleic acid duplexes that require temperature cycling. The present invention is a novel method that avoids the need for Reagents required to form a width product or a product suitable for detection in amplified form (representing the presence of the target nucleic acid sequence).
本発明の使用が可能な応用には、必要な標的核酸配列を含む体液および組織の試 験管内または生体外核酸プローブ ハイブリダイゼーション検定により特定また は一般の病原性疾患または状態に特異的なりＮＡ配列、または外挿によるもの、 ＤＭＡ配列の分析がある。Applications in which the present invention can be used include samples of body fluids and tissues containing the desired target nucleic acid sequences. Identified by in vitro or in vitro nucleic acid probe hybridization assay is a common pathogenic disease or condition-specific NA sequence, or by extrapolation; There is analysis of DMA sequences.
本分野の１つのゴールは与えられた配列（標的核酸と称されている）がＲＮＡ、 ＤＮＡまたはその両方を含む広範囲の種々の他の核酸種の中でのその存在に比較 して少量で存在している生物試料中の種々の核酸配列を検出することである。そ れ故、例えばヒト免疫不全ウィルス（）（ＩＶ−１）の核酸に関連する核酸のご とき病原性疾患または状態に付随するであろうポリペプチドをコードしている核 酸を検出することが望まれている。そのようなポリペプチドをコードしている核 酸の検出に加え、血友病で例示されるごとく欠陥ヒトベータグロビン遺伝子の検 出の場合のような欠陥遺伝子のごとき病原性疾患または状態に特徴的な他の核酸 の検出も望まれている。 One goal of the field is that a given sequence (referred to as a target nucleic acid) is RNA, compared to its presence in a wide variety of other nucleic acid species, including DNA or both. The purpose of this method is to detect various nucleic acid sequences present in small amounts in biological samples. So Therefore, for example, nucleic acids related to the human immunodeficiency virus (IV-1). When a nucleus encodes a polypeptide that would be associated with a pathogenic disease or condition It is desired to detect acids. Nuclei encoding such polypeptides In addition to acid detection, testing for defective human beta globin genes, as exemplified in hemophilia, other nucleic acids characteristic of pathogenic diseases or conditions, such as defective genes, such as in cases of It is also desired to detect
特徴的なことは、そのようなものに付随する核酸は、与えられた血液または他の 体液のごとき生物試料または試験されるべき与えられた個体の組織試料中の全核 酸に比較すると非常に少量しか存在していないことである（あったとしてもわず かである）、そのような核酸種の検出には周りに付随する種々の他の核酸種の中 から検出可能および測定可能であるという特異性（もしあれば）を必要とする。Characteristically, the nucleic acids associated with such Whole nuclei in a biological sample such as a body fluid or a tissue sample of a given individual to be tested Compared to acids, they are present in very small amounts (if at all). Detection of such a nucleic acid species involves the detection of a variety of other nucleic acid species surrounding it. requires specificity (if any) to be detectable and measurable from
これらの種のあるものは標的核酸と近い相同性をもっているであろう（少くとも 単離されたセグメント）。さらに、先に指摘したごとく、これらの標的核酸種は 試験される生物試料中に非常に微量のみしか見いだされないのが普通である。し かも、潜在する疾病状態の適切な診断のためには、たとえそのような標的核酸が 少量でもアッセイ系の忠実さで明確に検出可能であることが必須である。Some of these species will have close homology to the target nucleic acid (at least isolated segment). Furthermore, as pointed out earlier, these target nucleic acid species Usually only very trace amounts are found in the biological sample being tested. death However, for proper diagnosis of the underlying disease state, even if such target nucleic acids are It is essential that even small amounts can be clearly detected with the fidelity of the assay system.
この分野のゴール目ざしていくつかの試みが進展している。Several efforts are progressing toward this goal in this area.
１つの試みは試料中の核酸の量は変化されずまたは影響を受けない。代わりに、 レポーター系が開発されそれにより、容易な検出および観測のために、核酸標的 に対応する多量の検出可能な分子が産み出される。そのようなレポーター系は標 的核酸に付随する信号発生系であり、標的配列の分子の数の代理となる検出可能 な信号を与える。One approach is that the amount of nucleic acid in the sample is not changed or affected. instead, Reporter systems have been developed that allow for easy detection and observation of nucleic acid targets. A large quantity of detectable molecules is produced corresponding to . Such reporter systems are A signal-generating system associated with target nucleic acids that can be detected as a proxy for the number of molecules of the target sequence give a signal.
根本的に異なる別の研究方法が開発されており、そこでは標的核酸配列そ軌自身 のコピー数が増加されている。この事は、標的核酸配列の選択的増幅により実施 可能である。他の核酸配列に優先して標的核酸配列が増幅されるように試料の培 養技術に改良を加えることが可能である。これらの技術は扱いにくく時間がかか るとともに試行錯誤でやらねばならない。Fundamentally different research methods have been developed in which the target nucleic acid sequence itself The number of copies has been increased. This is accomplished by selective amplification of the target nucleic acid sequence. It is possible. The sample is cultured in such a way that the target nucleic acid sequence is amplified in preference to other nucleic acid sequences. Improvements can be made to the feeding techniques. These techniques are cumbersome and time-consuming. You have to do it by trial and error.
この試みの別の例は“ポリメラーゼ連鎖反応” （ＰＣＲ）と称されている標的 核酸配列の増幅法である。この技術は５ａｉｋｉ ｅｔ ａｌ、、 ５ｃｉｅｎ ｃｅ、 ２３０． １３５０（１９８５）およびＭｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ、＋ 欧州特許出願第２００３６２および２０１１８４号（米国特許第４６８３１９ ５および４６８３２０２号も参照されたい）により報告されており、特徴的なこ とには（１）標的核酸配列のセグメントにプライマーをハイブリダイズさせ（２ ）ポリメラーゼで前記プライマーを伸長させ、および（３）プライマー伸長反応 から生じたデユーブレックスを一本鎖にすることが必然的に伴われる。この過程 は多数のサイクル繰り返すことができ、そのようにして潜在的な標的核酸配列を 増幅する。Another example of this approach is the targeting process called “polymerase chain reaction” (PCR). It is a method for amplifying nucleic acid sequences. This technology was developed by 5aiki et al, 5cien. ce, 230. 1350 (1985) and Mullis et al, + European Patent Application Nos. 200362 and 201184 (U.S. Patent No. 468319) 5 and 4683202), and the characteristic (1) hybridize a primer to a segment of the target nucleic acid sequence (2) ) extending the primer with a polymerase; and (3) a primer extension reaction. This entails converting the resulting duplex into a single strand. this process can be repeated for many cycles, thus identifying potential target nucleic acid sequences. Amplify.
改良された新規の方法が米国特許出願第０７１０６４１４１および０７／２０２ ９７８号およびＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ３８／１０３１５号（上記文献）に詳 しく記載されている。そのプロモーターに作用可能なように結合された標的配列 の合成二本鎖ｃＤＮＡコピーと共に（およびそれから誘導される）、新規ＲＮＡ 転写生成工程が用いられる。転写工程が新規性の主たる特色であるため、それは 便宜上転写に基づく増幅系（ＴＡＳ）と称されている。An improved new method is disclosed in U.S. Patent Application Nos. 071064141 and 07/202. No. 978 and PCT International Application Publication No. WO 38/10315 (cited above) for details. It is clearly stated. a target sequence operably linked to its promoter Along with (and derived from) a synthetic double-stranded cDNA copy of A transcription production process is used. Since the transfer process is the main feature of novelty, it For convenience, it is referred to as a transcription-based amplification system (TAS).
それ故その発明は核酸を含む試料中の少くとも１つの特定の核酸配列（標的配列 またはセグメント）の試験管内または生体外検出を包含しており、そのＲＮＡ− ポリメラーゼ プロモーターに作用可能なように結合されている標的配列に対応 する配列を含んでいる二本鎖核酸を調製し、多数のＲＮＡ転写体の調製のための 二本鎖核酸鋳型として前記二本ｖｉ核酸を用い（各々は前記標的配列に対応する ＲＮＡ配列を運んでいる）、および前記ＲＮＡ配列の存在を、および標的配列の 存在の類推として検出する方法から成っている。The invention therefore provides for at least one specific nucleic acid sequence (target sequence) in a sample containing nucleic acids. or segment) in vitro or in vitro detection of its RNA- Compatible with target sequences operably linked to polymerase promoters for the preparation of multiple RNA transcripts. The two vi nucleic acids are used as double-stranded nucleic acid templates (each corresponding to the target sequence). carrying an RNA sequence), and the presence of said RNA sequence, and the presence of the target sequence. It consists of a method of detection as an analogy of existence.
二本鎖核酸鋳型は標的配列のセグメントに対応する配列に作用可能なように結合 されているプロモーター配列を含む第１の核酸プライマーまたはプローブを提供 し、前記第１の核酸プライマーを核酸を含む試料中の標的配列を適切な条件下ハ イブリダイズさせ、ポリメラーゼ伸長反応で標的配列と相補的なハイブリダイズ された前記第１の核酸プライマーを伸長させて対応するデユープレックス核酸を 形成させ、前記デユーブレックス鎖を分離させ、配列鎖を含む分離されたプロモ ーターを前記プロモーター配列の反対の末端に第２の核酸プライマーがつくよう な適切な条件下でハイブリダイズさせ、および前記プロモーター含有配列に相補 的なハイブリダイズされた前記第２の核酸プライマーをポリメラーゼ伸長反応で 伸長させる。Double-stranded nucleic acid template operably binds to a sequence corresponding to a segment of the target sequence a first nucleic acid primer or probe comprising a promoter sequence that is The first nucleic acid primer is used to target the target sequence in a sample containing nucleic acids under appropriate conditions. hybridize and hybridize complementary to the target sequence in a polymerase extension reaction. The first nucleic acid primer obtained is extended to produce the corresponding duplex nucleic acid. forming and separating the duplex strands, and separating the separated promotors containing sequence strands. the promoter so that the second nucleic acid primer is attached to the opposite end of the promoter sequence. hybridize under appropriate conditions and complement the promoter-containing sequence. The hybridized second nucleic acid primer is subjected to a polymerase extension reaction. Stretch it.
それ故、その発明は、標的核酸に対応する配列を持つその情報を妨害するように 測定が行われない時、一本鎖ＲＮＡ転写体またはそれらから形成されたＲＮＡ− ＤＮＡデユープレックスを得る。−重鎖ＲＮＡ転写体生成物は離れ、多少連続性 が低いので、扱いにくく誤る傾向がある反復ＰＣＲサイクルおよび鎖分離の必要 性なく標的セグメントの直接検出を提供する。そのような利点は、二本鎖ＤＮＡ （その１つの鎖は標的セグメントを含み、その他の鎖は標的セグメントの相補体 を含む）を得、検出前に分離を必要とし、および受容可能な増幅レベルに致達す るのに非常に多くの反復サイクルを必要とするＰＣＲ技術によっては提供されな い。Therefore, the invention is designed to interfere with that information with a sequence corresponding to the target nucleic acid. When measurements are not performed, single-stranded RNA transcripts or RNA formed from them Obtain DNA duplex. - Heavy chain RNA transcript products are separated and somewhat continuous The need for repeated PCR cycles and strand separation, which can be cumbersome and error-prone due to low Provides direct detection of target segments without any nuisance. Such an advantage is that double-stranded DNA (one strand contains the target segment, the other strand is the complement of the target segment) ), require separation before detection, and reach acceptable amplification levels. not provided by PCR technology, which requires a large number of repetitive cycles to stomach.
Ｗ１１選実施態櫂として、標的核酸配列の検出を楽にするため増幅の基本的複製 過程を更に利用するのが本発明の目的であり、温度の周期的変化を必要とせずに 対数的コピーが達成され、その他試薬添加その他に関して増幅の過程がモニタさ れる。対応する標的核酸の検出および測定の手段として転写および伸長生成物操 作の利点を新規の様式で組合わせるのも本発明の更なる目的である。As W11 selection embodiment, basic replication of amplification to facilitate detection of target nucleic acid sequences It is an object of the present invention to further exploit the process, without requiring periodic changes in temperature. Logarithmic copies are achieved and the process of amplification is monitored with respect to reagent addition, etc. It will be done. Transcription and extension product manipulation as a means of detecting and measuring the corresponding target nucleic acids. It is a further object of the invention to combine the advantages of the invention in a novel manner.
プライマーの核酸標的配列へのハイブリダイゼーションに続いてのプライマー伸 長により形成されたＲＮＡ／ＤＮＡデユーブレックスのＲＮＡ鎖の酵素的選択消 化を用い、続いてのそれへのプライマー伸長の更なるハイブリダイゼーションの ための鋳型としてＤＮＡ鎖を提供するための手段とすることが本発明の基本的な 目的である。少くとも１つのプロモーター配列を含む二重ｇＤＮＡＤＮＡデユー プレックスはＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識さ瓢それにより、標 的核酸配列の検出および測定手段として最終的に検出および測定される多数の転 写体の生成のための鋳型として働く。この目標は、（３つの）適当な酵素活性お よび少くとも１つのＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼにより効果あるように認 識可能なプロモーターを含むプライマーを含む１つの反応混合物中で温度サイク ルを必要としない自己−持続性である標的配列増幅の利点を提供する。Hybridization of the primer to the nucleic acid target sequence followed by primer extension. Enzymatic selective quenching of RNA strands of RNA/DNA duplexes formed by of further hybridization using conjugation and subsequent primer extension to it. The basic aspect of the present invention is to provide a DNA strand as a template for It is a purpose. Dual gDNA DNA duplex containing at least one promoter sequence The plex is recognized by DNA-dependent RNA polymerase, thereby As a means of detecting and measuring target nucleic acid sequences, many translocations are ultimately detected and measured. It acts as a template for the generation of images. The goal is to achieve (3) appropriate enzyme activities and and at least one DNA-dependent RNA polymerase. Temperature cycling in one reaction mixture containing primers containing recognizable promoters It offers the advantage of target sequence amplification that is self-sustaining and does not require a module.
本分野で列挙されたゴールを満たし、標的核酸配列の増幅にさらに役立つ選択的 手段を提供するのが本発明の全体の目的である。受容可能な短い時間内に再現性 よく利用でき、等温の反応系で、既知の試薬の都合良さを用い、終始変わらない 科学的結果に到達するのに必要な精密さを持つ直接的な技術がさらに提供される ；再現可能なアッセイの道具立てに使用でき、実験室／臨床的分析のためのキッ トに使用するのに適応可能である。A selective method that meets the goals enumerated in this field and further aids in the amplification of target nucleic acid sequences. It is an overall purpose of the present invention to provide a means. reproducible within an acceptably short time A readily available, isothermal reaction system that uses the convenience of known reagents and remains constant throughout. Provides more direct techniques with the precision needed to reach scientific results can be used to set up reproducible assays and is a kit for laboratory/clinical analysis. It is adaptable for use in
元型Ｑ要約 本発明はＲＮＡポリメラーゼ結合配列（ＰＢＳ）を含むオリゴヌクレオチドとハ イブリダイゼーションのためにＤＮＡ鎖を遊離させ、標的核酸配列の存在のため の演鐸アッセイとして検出および測定を受けやすい多数の対応するＲＮＡ転写体 の調製のための鋳型として働くことができるＤＮＡデユープレックスを形成する ため続いてプライマー伸長を行うＲＮＡ／ＤＮＡデユーブレックス“鎖−分離” 手段の使用に基づいている。ＲＮＡ／ＤＮＡデユープレックスは順に、作用可能 なプロモーター配列を含むＤＮＡプライマーをＲＮＡＮ的標的へブリダイズさせ 、続いてプライマー伸長により作製される。 Archetype Q summary The present invention provides oligonucleotides containing an RNA polymerase binding sequence (PBS) and Release the DNA strand for hybridization and for the presence of the target nucleic acid sequence A large number of corresponding RNA transcripts amenable to detection and measurement as an atomic assay form a DNA duplex that can serve as a template for the preparation of RNA/DNA duplex “strand separation” with subsequent primer extension It is based on the use of means. RNA/DNA duplexes can act in sequence A DNA primer containing a promoter sequence is hybridized to an RNA target. , followed by primer extension.
“鎖−分離”を起こさせるための本発明の手段としては、ＲＮａ ｓ ｅＨのご ときＲＮａ ｓ ｅＨ一様活性を持つ酵素の使用が挙げらワヘそれはさらなる処 理のためのＤＮＡ鎖を遊離するようにデユーブレックスのＲＮＡ鎖を選択的およ び優先的に消化するであろう、そのような酵素の使用は前記デユーブレックスの 変性すするための温度サイクルの使用をなくしている。As a means of the present invention for causing “strand separation”, RNAs such as RNAseH are used. When the use of enzymes with RNAs eH-like activity is mentioned, it is necessary for further processing. Selectively and selectively release the RNA strands of Duplex to release the DNA strands for processing. The use of such enzymes, which will preferentially digest the Eliminates the use of temperature cycles for denaturing sipping.
核酸標的配列は核酸試料中のごとく本来存在しているものでもよいし、対応する ＤＮＡ標的配列外挿生成物であってもよい、外挿生成物は二本鎖ＤＮＡ標的配列 の変性、作用可能なように付随しているプロモーター配列を持つプライマー配列 中へのハイブリダイゼーション続いてのプライマー伸長反応によりＤＮＡデユー プレックスを形成させることにより調製された。このＤＮＡ／ＤＮＡデユーブレ ックスは順に、変性さね−プロモーター配列を含む鎖は第２のプライマーを持つ プロモーターの反対則にその末端でハイブリダイズされ、ＤＮＡデユープレック スを形成し、それはＤＮＡ−依存ＲＮＡポリメラーゼと接触した時対応する転写 、外挿生成物を産生ずる。ＲＮＡは次に本発明の目的のため、標的核酸配列とし て働く。The nucleic acid target sequence may be naturally present, such as in a nucleic acid sample, or it may be a corresponding The extrapolation product may be a double-stranded DNA target sequence extrapolation product. a primer sequence with an operably associated promoter sequence Hybridization into DNA followed by primer extension reaction prepared by forming a plex. This DNA/DNA deubret The strands, in turn, are degenerated - the strand containing the promoter sequence has a second primer. Hybridized at its end to the opposite direction of the promoter, the DNA duplex form a polymerase that, when contacted by DNA-dependent RNA polymerase, transcribes the corresponding transcript. , which produces an extrapolation product. The RNA then serves as a target nucleic acid sequence for the purposes of the present invention. work.
核酸標的配列（その起源が何であり）が提供された後、本発明に従って、プロモ ーター配列に作用可能なように付随しているプライマー配列にハイブリダイズさ れ、続いてプライマー伸長により、ＤＮＡ鎖の５′末端にプロモーター配列を含 むＲＮＡ／ＤＮＡデユープレックスを産生させる。プライマー伸長反応は逆転写 酵素のごとき任意の適したポリメラーゼで実施できるであろう。本発明の基本的 態様では続いてＲＮａ ｓ ｅＨのごときＲＮＡ鎖を選択的に消化する酵素での ＲＮＡ／ＤＮＡデユープレックスの処理でありＲＮＡ／ＤＮＡデユープレックス のＤＮＡ鎖の遊離に働く。そのようにして遊離されたＤＮＡ鎖は１）前の選択的 消化により生じたＲＮＡプライマーを通した自己−発生的プライマー伸長にいく か、または２）作用可能なプロモーター配列を任意に運ぶ外来的に誘導されたオ リゴヌクレオチドプライマーとハイブリダイズされる。プライマー伸長は二本鎖 ＤＮＡデユーブレックス（１つまたは２つのプロモーター配列を含む）を作り出 し、それはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ誘発の転写の鋳型として働き、多数 の転写体を与える。Once the nucleic acid target sequence (whatever its origin) has been provided, according to the invention, the promoter hybridized to a primer sequence that is operably associated with the target sequence. followed by primer extension to generate a promoter sequence at the 5' end of the DNA strand. A RNA/DNA duplex is produced. Primer extension reaction is reverse transcription Any suitable polymerase, such as an enzyme, could be used. Basics of the invention In embodiments, this is followed by treatment with an enzyme that selectively digests the RNA strand, such as RNA seH. RNA/DNA duplex processing. works to release DNA strands. The DNA strands thus released are 1) previously selective Self-generated primer extension through the RNA primer generated by digestion or 2) an exogenously induced promoter optionally carrying an operable promoter sequence. hybridized with a oligonucleotide primer. Primer extension is double stranded Create a DNA duplex (containing one or two promoter sequences) It serves as a template for DNA-dependent RNA polymerase-induced transcription, and many gives a transcript of
前述の反応系列が等温で、３つの適当な酵素活性（例えば、逆転写酵素、ＲＮａ ｓｅＨおよびＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼによって提供されるような）が 同時に存在する混合物中で実施できると仮定すると、前述の方法の種々の工程は 与えられた時間に連続的、同時進行様式で行われる。それ故上で終点として示さ れた時点で生成された転写体は、出発標的核酸配列の演鐸的存在のだめの検出お よび測定が可能である。しかしながら、前述の反応系列の連続性および同時性が 温度サイクルとは独立し、これらの反応の実施に必要とされる酵素活性のただ１ 度の最初の添加を必要としていると仮定すれば、転写体生成物それ自身、ほかの プロモーター配列を働ける状態で随意に運んでいるプライマーとのハイブリ、ダ イゼータ５ンを起こす、このハイブリダイゼーション複合体は続いてのプライマ ー伸長反応により、第２のＲＮＡ／ＤＮＡデユープレックスを産生じ、それは順 に、選択的ＲＮＡ消化の作用を受け、それからＤＮＡ鎖を遊離する。それは順に 自己−発生ＲＮＡプライマーまたはプロモーター配列を働ける状態で随意に運ん でいるであろう反応混合物中に存在する外来的に誘導されたオリゴヌクレオチド ブライマーとハイブリダイズし、第２のＤＮＡデユーブレックスを生成し、それ はＤＮＡ−依存ＲＮＡポリメラーゼによる認識を受け、最初に生成された転写体 と逆の意味を持つ多数の転写体が生成される。The reaction sequence described above is isothermal and contains three appropriate enzyme activities (e.g. reverse transcriptase, RNA seH and as provided by DNA-dependent RNA polymerases) Assuming that they can be carried out in simultaneously present mixtures, the various steps of the aforementioned method are It takes place in a continuous, simultaneous manner at a given time. Therefore shown above as the end point The transcripts produced at the point where the starting target nucleic acid sequence is present are detected and detected. can be read and measured. However, the continuity and simultaneity of the reaction sequence mentioned above Independent of temperature cycling, only one enzyme activity is required to carry out these reactions. Assuming that the initial addition of Hybridization with a primer that freely carries a promoter sequence in a functional state This hybridization complex, which generates izeta5, is used by subsequent primers. - The extension reaction produces a second RNA/DNA duplex, which in turn It is then subjected to selective RNA digestion, from which the DNA strands are released. it is in order Carry the self-generated RNA primer or promoter sequence operably at will. Exogenously derived oligonucleotides that may be present in the reaction mixture hybridizes with Brimer to generate a second DNA duplex, which is recognized by DNA-dependent RNA polymerase and the first produced transcript A large number of transcripts with opposite meanings are generated.
前述の反応系列の機構は完全には解明されてはいないが、反応混合物が３つの適 当な酵素活性（例えば逆転写酵素、ＲＮａｓｅＨおよびＤＮＡ−依存性ＲＮＡポ リメラーゼにより提供されるもののごとき）および少くとも１つのプライマー（ ポリメラーゼにより認識されるプロモーターを含む）を用いるためであり、反応 が温度サイクルに依存しないためだと信じられており、２つのプロモーター含有 オリゴヌクレオチドブライマーが使用される場合、反応はいくつかのサイクルを 自発的に連続的に回ることが期待さ法王および逆の両方の転写体が生成され、そ れは種々な方法で検出および測定さねへ試験された試料中に存在する標的核酸の 量の増幅アッセイ法が提供される。The mechanism of the reaction sequence described above is not completely understood, but the reaction mixture is appropriate enzymatic activities (e.g. reverse transcriptase, RNase H and DNA-dependent RNA polymerase). (such as that provided by a limerase) and at least one primer (such as that provided by a limerase) and at least one primer (such as that provided by a limerase) (contains a promoter recognized by the polymerase), and the reaction It is believed that this is due to the fact that the If oligonucleotide primers are used, the reaction goes through several cycles. Both the Pope and reverse transcripts are expected to spontaneously turn sequentially, and their This is the detection and measurement of target nucleic acids present in the sample being tested by various methods. Quantitative amplification assays are provided.
本発明の本質は、より高いおよびより低い温度の間を循環させる必要なく、およ び酵素または他の試薬を周期的に添加する必要なく、適当な温度で一定期間、本 質的に休止状態のま−にされた反応混合物を提供することであり、それにより標 的核酸配列は、少くとも１つのプロモーター配列を働ける状態で運んでいるプラ イマーおよびＲＮＡポリメラーゼ（プロモーターのポリメラーゼ結合部位を認識 する）により提供されるごとき酵素活性、逆転写酵素、ＲＮａ ｓｅＨ（ＲＮＡ がデユープレックスの形でＤＮＡヘハイブリダイズされている場合に選択的にＲ ＮＡを消化する）のごとき酵素、およびＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素の 基質として必要なヌクレオシド三リン酸の存在下、自己−持続性様式で連続的に および自発的に増幅される。ここに記載したごとき系においては、例えばＴ７Ｒ ＮＡポリメラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素および大腸菌ＲＮａｓｅＨを用い、約３７ °Ｃにて約２時間では１０′の高さの再現可能増幅レベルが達成できる。約４° Ｃおよび約５０℃（好適なのは４ ’０ ’Ｃ周辺の範囲）の温度が実施可能で ある。好適な実施態様においての核酸標的配列の大きさは、約２５０塩基より小 さなものである。使用されるＲＮＡポリメラーゼ、使用される逆転写酵素、ＰＨ １塩濃度、ヌクレオシド三リン酸濃度のごとき他の変化するものも増幅の最適化 に影響を及ぼすであろう。これらの変化するものは当業者の通常の知識範囲内で ある。The essence of the invention is that the This method can be used for a specified period of time at a suitable temperature without the need for periodic addition of enzymes or other reagents. The objective is to provide a reaction mixture that is qualitatively quiescent, thereby allowing the standard The target nucleic acid sequence is a promoter operatively carrying at least one promoter sequence. polymerase and RNA polymerase (recognizes the polymerase binding site in the promoter) enzyme activity such as that provided by reverse transcriptase, RNA seH (RNA is selectively R when hybridized to DNA in a duplex form. enzymes such as RNA polymerase and reverse transcriptase (which digest NA), and RNA polymerase and reverse transcriptase. continuously in a self-sustaining manner in the presence of the required nucleoside triphosphates as substrates. and spontaneously amplified. In systems such as those described here, for example, T7R Using NA polymerase, AMV reverse transcriptase and E. coli RNaseH, approximately 37 Reproducible amplification levels as high as 10' can be achieved in about 2 hours at °C. Approximately 4° Temperatures of approximately 50°C (preferred range around 4'0'C) are feasible. be. In a preferred embodiment, the size of the nucleic acid target sequence is less than about 250 bases. It's a small thing. RNA polymerase used, reverse transcriptase used, PH Other variables such as monosalt concentration and nucleoside triphosphate concentration can also be optimized for amplification. will have an impact on These variables are within the ordinary knowledge of those skilled in the art. be.
それ故、本発明は雑多な集りのＲＮＡを含む試料中の少くとも１つの特定の核酸 標的配列の試験管内または生体外検出を含んでいる０本発明は標的配列に対応す る配列をコードし、動作可能なＲＮＡポリメラーゼ プロモーターを持つ二本鎖 ＤＮＡを調製することから成る方法に縮少され、前記二本鎖ＤＮＡは順にＲＮＡ 選択性消化酵素の作用によりＲＮＡ／ＤＮＡデユープレックス中のそのＲＮＡ相 補体から遊離されたＤＮＡ鎖重鎮ライマー伸長によるハイブリダイゼーションに より調製され、前記ＲＮＡ／ＤＮＡデユープレックスは動作可能なプロモーター 配列を運ぶプライマーの標的核酸配列へのハイブリダイゼーション続いてのプラ イマー伸長により形成されている。二本ｔｉｌＤＮＡは多数のそれからのＲＮＡ 転写体（各々は前記標的核酸配列に対応するＲＮＡ配列を運んでいる）の調製の ための鋳型として働く。前記ＲＮＡ配列の存在が（および標的配列の存在の演鐸 により）検出および測定される。Therefore, the present invention provides a method for detecting at least one specific nucleic acid in a sample containing a heterogeneous collection of RNA. The present invention includes in vitro or in vitro detection of target sequences. A double-stranded protein that encodes a sequence and has an operable RNA polymerase promoter. reduced to a method consisting of preparing DNA, said double-stranded DNA being in turn RNA the RNA phase in the RNA/DNA duplex by the action of selective digestive enzymes. Hybridization by DNA strand heavy primer extension released from complement The RNA/DNA duplex is prepared from an operable promoter. Hybridization of the primer carrying the sequence to the target nucleic acid sequence. It is formed by immersion elongation. Two strands of DNA make up many RNAs from it Preparation of transcripts (each carrying an RNA sequence corresponding to the target nucleic acid sequence) act as a mold for The presence of said RNA sequence (and the effect of the presence of the target sequence) detected and measured).
本発明はそのようなＲＮＡの転写体の調製の方法および手段および使用に付随す るすべてのものを請求の範囲に含んでいる。１つの実施１１捧において、本発明 は上で定義した前記二本ｔＸ核酸鋳型を調製する随意の反復性方法を請求の範囲 に含んでおり、標的核酸配列のセグメントに対応する配列へ使用可能に結合され たプロモーター配列を含む第１の核酸プライマーを提供し、適当な条件下前記第 １の核酸プライマーを核酸を含む試料中の標的核酸配列とハイブリダイズさせ、 ハイブリダイズさせた前記第１の核酸プライマー（標的配列に相補的）をポリメ ラーゼ伸長反応で伸長させて対応するＲＮＡ／ＤＮＡデユーブレックス核酸を形 成し、前記ＲＮＡ／ＤＮＡデユープレックスのＲＮＡを酵素的に切断し、適当な 条件下遊離されたプロモーター含有ＤＮＡ配列鎮へ第２の核酸プライマーを１） 生成物誘導ＲＮＡプライマーまたは２）作用可能をなように結合されているプロ モーター配列を任意に含むオリゴヌクレオチドプライマーを通して前記プロモー ター配列の反対の末端にハイブリダイズさせ、前記プロモーター含有配列に相補 的なハイブリダイズされた前記第２の核酸プライマーを伸長させる。The present invention relates to methods and means for the preparation and uses of such RNA transcripts. All that is included in the scope of the claims. In one implementation, the present invention claims an optional iterative method of preparing said dual tX nucleic acid templates as defined above. containing and operably linked to a sequence corresponding to a segment of a target nucleic acid sequence. a first nucleic acid primer comprising a promoter sequence; Hybridizing a nucleic acid primer of 1 with a target nucleic acid sequence in a sample containing a nucleic acid, The hybridized first nucleic acid primer (complementary to the target sequence) is The corresponding RNA/DNA duplex nucleic acid is formed by elongation using a DNAase extension reaction. The RNA of the RNA/DNA duplex is enzymatically cleaved and an appropriate A second nucleic acid primer to the promoter-containing DNA sequence released under conditions 1) product-guided RNA primer or 2) a protein operably linked to the The promoter is introduced through an oligonucleotide primer optionally containing a motor sequence. hybridizes to the opposite end of the promoter sequence and is complementary to the promoter-containing sequence. The hybridized second nucleic acid primer is extended.
さらなる実施態様における本発明は前記二本鎖核酸をプロモーターを認識するＤ ＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼにより触媒される反応においてそれからの多数 のＲＮＡ転写体の調製のための鋳型として用い、さらに任意に上に記載したごと くサイクルを回した後、前記ＲＮＡ転写体の存在を検出および測定する方法およ び手段について特許請求している。In a further embodiment, the present invention provides that the double-stranded nucleic acid is In reactions catalyzed by NA-dependent RNA polymerases, many used as a template for the preparation of RNA transcripts, and optionally as described above. and a method for detecting and measuring the presence of said RNA transcript after multiple cycles. The patent is claimed for the method and means.
さらなる実施態様における本発明は、そのようにしてまたは標的ＤＮＡ配列から の外挿生成物として発生された標的核酸配列の増幅する方法の改良を請求の範囲 に含んでおり、前記標的配列と作用可能なように結合されたプロモーター配列を 持つＤＮＡプライマーをハイブリダイズさせ、続いてプライマー伸長により対応 するＲＮＡ／ＤＮＡデユープレックスを与え、前記デユープレックスのプロモー ター配列を持つ遊離されたＤＮＡ伸長生成物と第２のプライマーをプロモーター 配列の反対の末端にハイブリダイズさせ、続いてプライマー伸長により、検出の ためまたは前に記載したごときリサイクルのための随意に複製可能なＲＮＡ転写 体の調製に有用な二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成させることを特徴とする。改良は前記 ＲＮＡ／ＤＮＡデユープレックス プライマーのプロモーター配列を持つ伸長生 成物ＤＮＡ鎖の遊離が前記ＲＮＡ／ＤＮＡデユープレックスのＲＮＡ鎖の選択的 酵素消化によることを特徴としている。In a further embodiment, the invention provides that Claims improvements in methods for amplifying target nucleic acid sequences generated as extrapolation products of and a promoter sequence operably linked to the target sequence. Hybridizes the DNA primer with which it is attached, followed by primer extension. providing an RNA/DNA duplex to promote the duplex; The released DNA extension product with the promoter sequence and the second primer Detection is achieved by hybridization to opposite ends of the sequence followed by primer extension. At-will replicable RNA transcripts for storage or recycling as previously described The method is characterized by forming a double-stranded DNA template useful for the preparation of DNA. Improvements are mentioned above. RNA/DNA duplex: extension product with primer promoter sequence The release of the product DNA strand is selective for the RNA strand of the RNA/DNA duplex. It is characterized by enzymatic digestion.
１つの実施態様において、本発明はプロモーター配列のＤＮＡ配列の５′末端に 結合されていたＲＮＡ／ＤＮＡデユーブレックスＲＮＡの選択的ＲＮＡ消化酵素 による処理法の生成物を特許請求している。In one embodiment, the present invention provides a promoter sequence at the 5' end of the DNA sequence. Selective RNA Digesting Enzyme for Combined RNA/DNA Duplex RNA The product of the treatment method is claimed as a patent.
さらなる実施態様において、本発明は前述の方法および手段を用い、ＲＮＡを含 む試料中の少くとも１つの特定の核酸標的配列の試験管内または生体外検出に有 用な必要な試薬および付随する手段から成るキットを特許請求している。In a further embodiment, the present invention provides methods and means for producing RNA-containing useful for in vitro or in vitro detection of at least one specific nucleic acid target sequence in a sample containing A kit comprising the necessary reagents and associated means for use is claimed.
発皿Ω跣桓友説朋 上り因Ω旦単在説朋 図１は本発明の実施態様の模式的表現を表わしている。模式的表現は全部で１２ の工程を与えているが、好適な！！欅では、反応混合物中標的配列と一緒に必要 な３つの酵素が存在し、実施可能な温度が与えられればそれらは連続的な自己発 生工程と考えられる。３つの酵素は掲げられているとうりであり、例えばプライ マー伸長反応に使用されている逆転写酵素、選択的ＲＮＡ消化酵素であるＲＮａ ｓｅＨは本発明の基本的態様を表わし、Ｔ４ ＲＮＡポリメラーゼはＤＮＡデユ ープレックス鋳型から転写体を調製するために有用な酵素の例である。上に示し たごとく本発明の本質は模式的表現の工程３で表わされ、工程６のＲＮＡ転写体 生成物はそのま一検出され測定されるかまたは工程７から１２に掲げであるごと き連続的反応にかけＲＮＡ転写体のアンチセンス鎖を形成される。発生させられ たＲＮＡ転写物は標的核酸配列の存在の結果として生じるものとして検出され測 定される。ＰＢＳはプロモーター配列のポリメラーゼ結合部位を表わす。Ｔｅ３ は標的相補配列を表わす。Dishes Ω Ascending cause Ωdan single presence theory FIG. 1 represents a schematic representation of an embodiment of the invention. There are 12 schematic representations in total. The process is given, but it is suitable! ! In Keyaki, it is necessary together with the target sequence in the reaction mixture. There are three enzymes that exhibit continuous self-initiation given a viable temperature. It is considered to be a raw process. The three enzymes are as listed, for example, ply Reverse transcriptase used in the mer extension reaction, RNA which is a selective RNA digesting enzyme seH represents a basic embodiment of the invention, and T4 RNA polymerase is a DNA duplex. Examples of enzymes useful for preparing transcripts from -plex templates. shown above The essence of the present invention is expressed in step 3 of the schematic representation, and the RNA transcript in step 6 is The product is detected and measured as is or as listed in steps 7 to 12. The antisense strand of the RNA transcript is formed through successive reactions. caused to occur The resulting RNA transcript is detected and measured as a result of the presence of the target nucleic acid sequence. determined. PBS represents the polymerase binding site of the promoter sequence. Te3 represents the target complementary sequence.
２、− ・ および 定義および本発明の基本的技術を実施するための方法および手段を含んでいる分 子生成物の標準的教科書が参考にされた。たとえば：ＤＮＡプローブまたはプラ イマー調製、ＤＮＡ合成または制限酵素切断による天然起源からの配列の単離お よび、ここでプライマーまたはプローブとして使用する為、そのま−または他の ＤＮＡへの結合する時に通するような尾付けを含む；ハイブリダイゼーションに 使用するための異った機能的配列を持つオリゴヌクレオチドの調製； 標的ＤＮＡ配列に対してのプライマーの相同性の程度に必然的に依存するハイブ リダイゼーションを多少生成するためのストリンジエンシー条件の変化を含むハ イブリダイゼーション方法論； プロモーターまたはより特異的なプロモーターまたはバタテリオファージＤＮへ −依存性ＲＮＡポリメラーゼおよびバクテリオファージＲＮＡ−依存性ＲＮＡポ リメラーゼまたは真核生物系を用いた場合のウィルスＤＮＡおよびＲＮＡ−依存 性ＲＮＡポリメラーゼ（例えばアデノウィルス−コード化ＲＮＡポリメラーゼお よびブロームモザイクウィルスＲＮＡポリメラーゼ）により認識される部位の同 定、単離または調製； 上に示した前記プロモーターを認識でき、またはプライマー伸長反応が可能なＲ ＮＡポリメラーゼの同定、単離または調製；ＲＮＡ転写体の産生を導く条件、い わゆる転写−促進配列を含む；ＤＮＡ依存性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの使用 を含むプライマー伸長反応の開始および維持を導く条件； （誘導された）複製のための機構および方法論；など。2, -・and This section contains definitions and methods and means for carrying out the basic techniques of the invention. Standard textbooks on child products were consulted. For example: DNA probe or plastic Isolation and isolation of sequences from natural sources by imer preparation, DNA synthesis or restriction enzyme cleavage and for use as primers or probes herein. Contains a tail that passes through when binding to DNA; for hybridization Preparation of oligonucleotides with different functional sequences for use; hives that necessarily depend on the degree of homology of the primers to the target DNA sequence. A modification that includes changes in stringency conditions to produce some redization. Ibridization methodology; to the promoter or more specific promoter or batataeri phage DN - dependent RNA polymerase and bacteriophage RNA - dependent RNA polymerase Viral DNA and RNA-dependent when using limerase or eukaryotic systems RNA polymerase (e.g. adenovirus-encoded RNA polymerase or and Brohm mosaic virus RNA polymerase). determination, isolation or preparation; R that can recognize the promoter shown above or that can perform a primer extension reaction. Identification, isolation or preparation of NA polymerases; conditions conducive to production of RNA transcripts; Contains so-called transcription-enhancing sequences; use of DNA-dependent polymerases and dNTPs conditions guiding the initiation and maintenance of the primer extension reaction, including; Mechanisms and methodologies for (induced) replication; etc.
例えば、Ｎａｎ１ａｔｉｓ ｅｔ社ユ モレキュー−クローニング： ″″″、 ″、コールドスプリングバ−ラボラトリ−、ニューヨーク（１９８２）、および Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ｅｔ ａｌ、、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ ５ｏｌｏ Ｖｏｌ、１５２．アカデニックプレス。For example, Nan1atis et Yu Molecule Cloning: ″″″, '', Cold Spring Bar Laboratory, New York (1982), and Colowick et al, Methods in Enz 5olo Vol, 152. Academic Press.
Ｉｎｓ、（１９８７） 、および種々の参考文献がそれに引用されている； Ｈ ｏｎｇ。Ins, (1987), and various references cited therein; ong.
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅ ｏｒｔｓ １．２４３ （１９８１） ；Ｃｏｏ ｋｅ ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｗ。Bioscience Records 1.243 (1981); Coo ke et al, J, Biol, Chew.
２５５．６５０２ （１９８０）；およびＺｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ、、 Ｍｅ ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｒ＋ｚ ｓｏｌ。255.6502 (1980); and Zoller et al., Me. thods in Er+z sol.
１００．４６８−５００（１９８３）；Ｃｖｅａｅｔａｌ、、ＮｕｃｌｅｉｃＡ ｃｉｄｓＲｅｓ ４１゜２３３１ （１９８０）；Ｎａｒａｎｇｅｔａｌ、、」 畦Ｌ」叶ル九 旦８．９０ （１９７９）；Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ、、 Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２ ２． １ ８ ５ ９ （１９ ８１） ；Ｂｒｏｗｎｅｔ ａｌ、、 匡止ユバα艶６旦、１０９ （１９７９ ） ：ｃａｒｕｔｈｅｒｓｅｔａｌ、Ｍｅｔｈ。100.468-500 (1983); Cveaetal, Nucleic A cidsRes 41゜2331 (1980);Narangetal,'' 畦L” Kano Le Ku Dan 8.90 (1979); Beaucage et al,, Tetrahedron Letters 2 2. 1 8 5 9 (19 81) ;Brownet al,, 109 (1979 ): caruther setal, Meth.
ｈα艶１５４． ２８７ （１９８５） ；Ｈ４ｔｚｅＩＩａｎ ｅｔ ａｌ、 、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｗ、 ｌ旦五。hα gloss 154. 287 (1985); H4tzeIIan et al. , J., Biol, Chew, ldango.
２０７３ （１９８０）；Ｌｅｅｅｔａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ ２３９，１２８８ （１９８Ｂ）；門用ｉｇａｎ ｅｔａｌ、、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 １５．８７８３ （１９８７） ；Ｍｉｌｌｅｒａｔ ａｌ、、 ｈ 匹ｋｕ 上２５． ２３６ （４９８３） 、 Ａｈｌｑｕｉｓｔｅｔａｌ、、 Ｊ、 Ｍｏ＋。2073 (1980); Leeetal, 5science 239, 1288 (198B); Igan etal for gate, Nucleic Ac1ds Res, 15.8783 (1987); Millerat al, h ku top 25. 236 (4983), Ahlquistetal, J, Mo+.
Ｂｉｏｌ、 １５３． ２３ （１９８１） ；Ｍｉｌｌｅｒａｔ虹、、 Ｎａ ｔｕｒｅ ３上１．６８（１９８５） 、 Ａｈｌｑｕｊｇｔ ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、１７２，３６９ （１９８４）ｉＡｈｌｑｕｉｓ ｔ ｅｔ ａｌ、、 Ｐｌａｎｔ Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、 ３． ３７ （１９ ８４） ；Ｏｕ ｅｔ ａｌ、、 ＰＮＡＳ７９、 ５２３５ （１９８２） ；Ｃｈｕｅｔａｌ、、 Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｉ Ｒｅｓ、＋ １４． ５５９１ （１９８６）；欧州特許出願公開第（ＥＰＡ）１９４８０９号； Ｍｕｒｓｈ ｅｔ ａｌ、。Biol, 153. 23 (1981); Millerat Rainbow, Na ture 3 1.68 (1985), Ahlqujgt et al,, J, Mo1. Biol, 172, 369 (1984) iAhlquis t et al,, Plant Mo1. Biol, 3. 37 (19 84); Ou et al., PNAS79, 5235 (1982) ;Chuetal,, Nucl, ^cidi Res, +14. 5591 (1986); European Patent Application Publication No. 194809; Mursh et al.
Ｐｏ５ｉｔｉｖｅ ５ｔｒａｎｄ ＲＮＡ Ｖｉｒｕｓｅｓ ｐ、３２７ ３３ ６． Ａｌａｓ Ｒ，Ｌｉ５ｓ （発行、ニューヨーク１９８７．ＵＣＬＡシン ポジウム抄録（１９８６） ； Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ、、 Ｊ。Po5itive 5trand RNA Viruses p, 327 33 6. Alas R, Li5s (Published, New York 1987. UCLA Shin Podium Abstracts (1986); Miller et al., J.
Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、１旦ユ、５３７ （１９８６） ；５ｔｏｆｌｅｔｅｔａ １．、５ｃｉｅｎｃｅ ２３旦９４９１ （１９８Ｂ） ；Ｋｒａｓｅｒｅｔａ ｌ、、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、８９． ７１９ （１９７４） ；５ａｒ ｉｓ ｅｔ ａｌ、、 Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、上０． ４８３１ （１９Ｂ２） ； Ｂｒｅｓｓｅｒｅｔａｌ、、 ＰＮＡＳ ８０． ６５２ ３ （１９８３） ； Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ、、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ上旦、３６７１ （１９８Ｂ）；Ｇｕｂｌｅｒｅｔａｌ、、 Ｇｅｎｅ ２５，２６３ （１９８３）およびＤ’ Ａｌｅｓｓｉｏ ｅｔ ａ ｌ、、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ １旦、１９９９ （１９８Ｂ） 、同様にその中に参考文献が引用されている。Mo1. Biol, 1st, 537 (1986); 5tofleteta 1. , 5science 23rd 9491 (198B); Krasereta l,, J, Mo1. Biol, 89. 719 (1974); 5ar is et al, Nucl, Ac1ds Res, top 0. 4831 (19B2); Bresseletal,, PNAS 80. 652 3 (1983); Chu et al, Nucleic Ac1ds Re5earch Kamidan, 3671 (198B); Gubleretal,, Gene 25, 263 (1983) and D' Alessio et a l,, Nucleic Ac1ds Res 1, 1999 (198B) , as well as references cited therein.
前に引用された発表物のすべてがここに特別に引例として含まれている。All previously cited publications are hereby specifically incorporated by reference.
術語′プロモーター”はＲＮＡポリメラーゼにより特異的に認識される核酸配列 （天然に存在するものまたは合成的に生成されたものまたは制限消化の生成物） を意味し、ＲＮＡポリメラーゼは認識される配列に結合し、転写の過程を開始し 、それによりＲＮＡ転写体が産生される。随意に実際の認識部位を越えて拡がる ヌクレオチド塩基を含んでいてもよく （分解過程に対し追加の安定性を添える と考えられる）、転写開始部位に隣接する追加のプラス（＋）ヌクレオチドを含 んでいてもよい、原理的に、任意のプロモーター配列を使用してもよく、それに 対し、開始配列を認識できる既知で入手可能なポリメラーゼがある。典型的には 、既知で有用なプロモーターはバクテリオファージＴ３、丁７またはＳＦ３のご ときある種のバクテリオファージ ポリメラーゼによりＥＥｍされるものである 。The term 'promoter' refers to a nucleic acid sequence that is specifically recognized by RNA polymerase. (naturally occurring or synthetically produced or the product of restriction digestion) means that RNA polymerase binds to a recognized sequence and begins the process of transcription. , thereby producing an RNA transcript. voluntarily extends beyond the actual recognition site May contain nucleotide bases (additional stability against degradation processes) ), containing an additional plus (+) nucleotide adjacent to the transcription start site. In principle, any promoter sequence may be used, and On the other hand, there are known and available polymerases that can recognize the initiation sequence. typically , known and useful promoters include those of bacteriophage T3, D7 or SF3. Sometimes EEm is carried out by certain bacteriophage polymerases. .
５ｉｅｂｅｕｌｊｓｔｅｔａＪ、、 Ｃｅ１ｌ ２０． ２６９ （１９８０） 、これらはしかし、その付随するプロモーター配列と共に本発明の実施に使用す ることができるポリメラーゼの例にすぎない。5iebeuljstetaJ,, Ce1l 20. 269 (1980) , these are however used in the practice of the invention with their associated promoter sequences. These are just examples of polymerases that can be used.
“ＲＮＡ転写体”とはＲＮＡポリメラーゼ プロモーター配列（上記参照）の認 識に続いての転写開始後に産生されるリポ核酸配列である。そのような転写体の 産生は多少連続的であり、存在するポリメラーゼの量に一部依存する。“RNA transcript” refers to the RNA polymerase promoter sequence (see above). A liponucleic acid sequence produced after initiation of transcription following recognition. of such transcripts. Production is more or less continuous and depends in part on the amount of polymerase present.
本文脈中の術語“プローブまたは“プライマー”は標的配列に対し十分な相補的 を持つ一本鎖核酸配列（天然に存在または合成的に生成されたものまたは制限消 化の生成物）を意味し、そのため適したハイブリダイゼーション条件下、適当な （標的）配列にハイブリダイズする（すなわち結合する）ことが可能である。典 型的なプローブまたはプライマーは少くとも１０ヌクレオチドの長さであり、最 も好適には約２０またはそれ以上の長さのヌクレオチド塩基であり、最も好適な 実施態捧においては、適当な（標的）配列と同一性または非常に高い相補性を共 有している。例えば、ＥＰＡ １２８０４２ （８４年１２月１２日公開）を参 照されたい。そのようなプローブまたはプライマーは適当な試薬および条件の存 在下プライマー伸長反応のための相補配列にハイブリダイズするであろうような ものである。The term "probe" or "primer" in this context refers to a probe that is sufficiently complementary to the target sequence. a single-stranded nucleic acid sequence (naturally occurring or synthetically produced or restricted product of hybridization) and therefore under suitable hybridization conditions capable of hybridizing (ie, binding) to a (target) sequence. Noriyoshi Typical probes or primers are at least 10 nucleotides long and is also preferably about 20 or more nucleotide bases in length, and most preferably about 20 or more nucleotide bases in length. Embodiments share identity or very high complementarity with the appropriate (target) sequence. have. For example, see EPA 128042 (published December 12, 1984). I want to be illuminated. Such probes or primers must be prepared in the presence of suitable reagents and conditions. such that it will hybridize to the complementary sequence for the underlying primer extension reaction. It is something.
術語“作用可能なように結合された”または′付随された”またはその文法的変 化体、特にＲＮＡコードＤＮＡ配列内のプロモーター配列の結合に関連して、プ ロモーターが適切なポリメラーゼにより認識された時対応するＲＮＡ転写体を産 生ずるその機能性を示すｍ−上記文献参照。The term “operably linked” or “associated” or its grammatical variations proteins, particularly in connection with the binding of promoter sequences within RNA-encoding DNA sequences. When the promoter is recognized by the appropriate polymerase, it produces the corresponding RNA transcript. m--see above document indicating its functionality.
放射性標識または発色体怒受性酵素を用いる発色体法によるごとき検出信号の生 成技術はまた本分野ではよく知られており、情報が供給されている。Generation of detection signals, such as by radioactive labels or chromophoric methods using chromophoric enzymes. Construction techniques are also well known in the art and information is provided.
本発明のアッセイ法が実施される試料は血清または他の体液、組織培養培地また は食品材料のごとき生物材料の生の試料であってよい。より典型的には、標的の 検出を妨害するであろう（親和性分子の非特異的結合を起こすことにより）物質 を除去するために種々の処理がされた生の試料から誘導された処理試料である試 料に対し本方法が実施される０本発明のアッセイ法により通した試料を得るため の生の試料処理法は本分野ではよく知られている。The sample on which the assay method of the invention is performed may be serum or other body fluid, tissue culture media or may be a raw sample of biological material, such as a food material. More typically, the target's Substances that would interfere with detection (by causing non-specific binding of affinity molecules) A sample that is a treated sample derived from a raw sample that has undergone various treatments to remove The method is carried out on a sample to obtain a sample that has been subjected to the assay method of the present invention. Raw sample processing methods are well known in the art.
転写体（ＲＮＡ）は多数の異った方法で検出できる：例えば接触ホトプリンティ ング法（Ｋｕｔａｔｅｌａｄｚｅ ｅｔ ａｌ、、 Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅ ｍ。Transcripts (RNA) can be detected in a number of different ways: e.g. contact photoprinting. ng method (Kutateladze et al., Anal, Bioche m.
上００，１２９ （１９７９）によるＲＮＡの紫外吸収により検出できる。00, 129 (1979), it can be detected by ultraviolet absorption of RNA.
反応に放射活性標識リボヌクレオシド−５′−三リン酸（例えば３Ｈ−１ｍまた はアルファ〜”ＰＯ，−標ｖｈ）を使用することによりＲＮＡが放射活性であり 、ＲＮＡはその放射活性により多数の既知の方法により検出できる。Radioactively labeled ribonucleoside-5'-triphosphate (e.g. 3H-1m or The RNA is radioactive by using alpha~”PO, -mark vh). , RNA can be detected by a number of known methods due to its radioactivity.
ビオチンまたはイミノビオチンをＲＮＡ内へ取り込ませることもでき、ＲＮＡ− 結合ビオチンに結合し、都合の良い検出可能な発色団の生成を触媒する酵素−ア ビジンまたは酵素−ストレプトアビジン付加物による既知の技術により検出でき る。ビオチンまたばイミノビオチンの取り込みはウラシル部分の炭素−５がスペ ーサーを通してビオチニル化されているＵＴＰを複製反応中の複製の基質として 用いることにより達成される。そのようなＵＴＰは既知の化合物である。さらに 、そのようなＵＴＰがＱＢ複製酵素の基質であり、炭素の５位へ結合されたスペ ーサー基を通してビオチニル化されたウラシルを含むＲＮＡ（その合成にそのよ うなＵＴＰを使用したため）はＱＢ複製酵素触媒複製の鋳型であることが知られ ている。？３Ｉ製ＲＮＡの３′−末端へ蛍光性になるよう改変されたヌクレオチ ドを付けるＴ４ ＲＮＡリガーゼ触媒反応を用いてＲＮＡを蛍光性にすることが できる＊ Ｃｏ５５ｔｉｃｋ ｅｔ ａｌ、、 Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ ｓ、上２ １７９１ （１９８４）参照。Biotin or iminobiotin can also be incorporated into RNA, An enzyme that binds to bound biotin and catalyzes the production of a conveniently detectable chromophore. can be detected by known techniques with vidin or enzyme-streptavidin adducts. Ru. The uptake of biotin or iminobiotin occurs when carbon-5 of the uracil moiety is UTP, which is biotinylated through a primer, as a replication substrate during the replication reaction. This is achieved by using Such UTP is a known compound. moreover , such UTP is a substrate for the QB replicating enzyme, and the spacer bound to the carbon 5 position is RNA containing uracil biotinylated through a (UnaUTP) is known to be a template for QB replication enzyme-catalyzed replication. ing. ? A nucleotide modified to become fluorescent at the 3'-end of the 3I RNA. RNA can be made fluorescent using T4 RNA ligase catalyzed reaction. Can* Co55tick et al, Nucl, Ac1ds Re See No. s, supra 2 1791 (1984).
得られるＲＮＡの蛍光はいくつかの標準的技術よりＲＮＡの検出に用いることが できる。The resulting RNA fluorescence can be used for RNA detection using several standard techniques. can.
ＲＮＡの検出に使用することができる他の方法はｌ／ポーター物質（核酸に特異 的に結合する）を複製が起こっている系または複製されたＲＮＡが単離されてい るＥＣＴＥＯＬＡ紙のごとき陽性に荷電された支持体のような培質へ添加し、レ ポーター物質からの信号が測定される方法である。そのような物質とＬ７では： 発色色素、“全染色”のごとき、（Ｄａｈｌｂｅｒｇ ｅｔ ａｉ、、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、 ４１． １３９（１９６９））；メチレン ブルー（Ｄ ｉｎｇｍａｎ ｅｔ ａｌ、、 肛匹回蛙旦ｎ ユ、６５９（１９６８））およ び銀染色（Ｓａｌｍｏｎｓ ｅｔ ａｌｌ、 Ｅｌｅｃｔｒｏ ｈｏｒｅｓｉｓ ２． １３５（１９８１） ｉ ！ｇｌｏｉ、 Ａｎａｌ、ＢＩｏｃｈｅＷ、 １３４． １８４ （１９８３） ； ＲＮＡへ結合する蛍光性化合物−一例 えば、エチジウム プロミド（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ、、 Ｂｉ。Other methods that can be used to detect RNA include l/porter substances (specific for nucleic acids). in a system in which replication is occurring or in which the replicated RNA has been isolated. Add to the culture medium such as a positively charged support such as ECTEOLA paper, This is the method by which signals from porter substances are measured. With such substances and L7: Chromogenic dyes, such as “total staining” (Dahlberg et ai, J. Mo1. Biol, 41. 139 (1969)); Methylene Blue (D Ingman et al., 659 (1968)) and Silver staining (Salmons et all, Electro horesis) 2. 135 (1981) i! gloi, Anal, BIocheW, 134. 184 (1983); Fluorescent compounds that bind to RNA - an example For example, ethidium bromide (Sharp et al., Bi.
曲Ｐすｕｌ 上ｇ、３０５５ （１９７３） ；Ｂａ１ｌｅｙｅｔａ１．、 Ａ ｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ。Song Psul 1st g, 3055 (1973); Ba1leyeta1. , A nal, Biochem.
１旦、７５ （１９７６））；およびＱＢ複製酵素により複製するための鋳型で あるＲＮＡへ特異的に結合する蛍光性化合物−一例えば、ＱＢ複製酵素のウィル スザブユニットに連結されているフィコビリプロティン（０；」Ｌ旦、、 Ｊ、 Ｃｅ１１」とし９３、９８１ （１９８２） ；５ｔｒｙｅｒｅｔａ１．、米 国特許第４，５２０．１１０号）本発明に従ったアッセイにおいては、試験およ び対照試料に対し可能なかぎり部位の条件Ｆ同時にアッセイが実施される。本分 野で理解されているごとく、対照試料は試験試料と同じであるが、標的を含んで いないかまたは既知の量を含んでいるのが既知である。標的のない対照から°バ ックグラウンド°が確立され、それ以下では標的を含む試料を含まない試料から 区別するのは不可能である。試験試料のアッセイで生成されるＲＮＡ０量または 濃度をアッセイされた対照試料を同時に比較することにより、バックグラウンド より上の試験試料中の標的の存在が決定できる。ある範囲の既知の標的濃度を持 つ対照試料を用いると、試験試料中の標的の濃度を算出することができる。1, 75 (1976)); and a template for replication by QB replication enzyme. Fluorescent compounds that specifically bind to certain RNAs - for example, QB replicase virus Phycobiliprotein (0;' Ldan, J, Ce11” Toshi 93, 981 (1982); 5tryereta1. , rice National Patent No. 4,520.110) In the assay according to the present invention, the test and Assays are performed simultaneously on site conditions F and control samples whenever possible. duty As understood in the field, a control sample is the same as a test sample, but contains the target. It is known that it is absent or contains a known amount. °bar from non-target control background ground° is established, below which samples containing the target are removed from samples containing no target. It is impossible to distinguish. 0 amount of RNA produced in the assay of the test sample or background by simultaneously comparing the concentration to a control sample assayed. The presence of the target in the upper test sample can be determined. have a range of known target concentrations. Using two control samples, the concentration of target in the test sample can be calculated.
本発明の任意に複製可能なＲＮＡ転写体の複製の誘導のための（自己触媒性）“ 複製酵素”の使用は本分野では一般的に既知である。本発明に存用であるそのよ うな複製酵素の適切な例としては与えられたＲＮＡ転写体の末端である種の核酸 配列部位を認識する、いわゆるＱＢウィルス復製酵素および与えられたＲＮＡ転 写体の３′末端で核酸配列部位を認識すると考えられているいわゆるブロームモ ザイム ウィルス（ＢＷＶ）ならびにアルファ ウィルス複製酵素が挙げられる 。これらの複製酵素はＲＮＡ転写体および相補体の複製（再生産である）に働き 、そのコピーを増大させる。そのような酵素が転写の過程の間反応液中に存在し た場合、転写の間に生成される多数の転写体はそれ自身で復製できＲＮＡ転写生 成物量が指数的に増加することが予知できる。(autocatalytic) for the induction of replication of arbitrarily replicable RNA transcripts of the present invention. The use of "replicating enzymes" is generally known in the art. Suitable examples of such replication enzymes include certain nucleic acids at the end of a given RNA transcript. The so-called QB virus replicating enzyme that recognizes the sequence site and a given RNA transducer The so-called Brohm model is thought to recognize the nucleic acid sequence site at the 3' end of the photographic material. Zyme virus (BWV) and alphavirus replication enzymes. . These replication enzymes act on the replication (reproduction) of RNA transcripts and complements. , multiply its copies. If such an enzyme is present in the reaction solution during the transcription process, If the large number of transcripts produced during transcription is able to reproduce itself, the RNA transcription It can be predicted that the amount of the product will increase exponentially.
ｌ−某施態梯Ω詳栂秦脱甲 本発明の真髄は、熱にサイクルまたは補給酵素の添加の必要なく、試験管内で増 幅の完全多サイクルをなす能力である。本明細書に付随する図は好適な実施態様 のスキームを図式様式で略述したものである。本発明の原理的および注目すべき 態様は酵素ＲＮａｓｅＨの包含である。図をさらに参照すると、工程１および２ はいわゆるＴＡＳプロトコール（この明細書の初めの部分で参考にされている特 許出願およびＰＣＴ国際出願参照）に用いられるものと同一であるが、工程３に おいては熱変性工程の代わりにＲＮａｓｅＨの使用によりＲＮＡ／ＤＮＡハイブ リッド デユーブレックスは“鎖−分離”される、ＲＮａｓｅＨ活性はＲＢＮＡ ／ＤＮＡハイブリッド デユーブレックス中に存在している場合のみ、ＲＮＡに 対する特異性を持っている。この消化の生成物は独特のＲＮＡオリゴマーまたは 多数のＲＮＡオリゴマーであろう（工程４）、順に、これらのオリゴマーはＣＤ ＮＡ反応の触媒として逆転写酵素（ＲＴ）を用いるＤＮＡ合成のためのプライマ ーとして働くことができる（工程５）、、工程５に示された二本ｌＤＮＡはＴ７ ＲＮ Ａポリメラーゼ配向性転写のための鋳型として働くことができる（工程６ ）。l-certain status ladder Ω detailed Toga Qin armor removal The essence of the invention is that the enzymes are grown in vitro without the need for heat cycling or the addition of supplemental enzymes. It is the ability to complete multiple cycles of width. The figures accompanying this specification illustrate preferred embodiments. The scheme is outlined in a diagrammatic style. Principle and notable aspects of the invention An embodiment is the inclusion of the enzyme RNaseH. With further reference to the figure, steps 1 and 2 is the so-called TAS protocol (specifically referred to in the beginning of this specification). (see patent application and PCT international application), but in step 3. In some cases, the use of RNaseH instead of a heat denaturation step allows RNA/DNA hives to be Lid duplex is “chain-separated”, RNaseH activity is RBNA /DNA hybrid Only when present in duplex, RNA It has specificity for The products of this digestion are unique RNA oligomers or There will be a large number of RNA oligomers (step 4); these oligomers, in turn, are CD Primers for DNA synthesis using reverse transcriptase (RT) as a catalyst for the NA reaction (Step 5), the two DNAs shown in Step 5 are T7 RNA polymerase can serve as a template for directed transcription (step 6 ).
この増幅されたＲＮＡ生成物ばここで標的配列のための検出レポーター分子とし て働くかおよび／または自己−サイクル反応を続けるための更なる標的分子とし て働く（工程７から１２）。This amplified RNA product now serves as a detection reporter molecule for the target sequence. and/or as a further target molecule to continue the self-cycling reaction. (Steps 7 to 12).
約１０”倍の標的増幅が得られる最も成功した反応は、３つの酵素およびＴ７Ｒ ＮＡポリメラーゼ結合配列（ＰＢＳ）を含む２つのオリゴヌクレオチド プライ マーで作用させたものである。必要な酵素はＡＭＶ逆転写酵素、Ｔ７ ＲＮＡポ リメラーゼおよび大ＪＩＪ！菌ＲＮａｓｅＨである９反応液への大腸菌ＲＮａｓ ｅＨの添加はＡＭＶ逆転写酵素に存在するＲＮａｓｅＨ活性を補充し、高いレベ ルの増幅を産み出すようである。標的配列の長さの領域の中央におく最適なオリ ゴヌクレオチド プライマーの選択、１つまたは両方のプライマー上でのポリメ ラーゼ結合配列の包含および転写プロモーターとしてのポリメラーゼ結合配列− 含有プライマーの効率。３つすべてが増幅のレベルに影響を及ぼす。２つのオリ ゴヌクレオチド プライマー（各々ＰＢＳを含んでいる）の包含は単Ｉ ＰＢＳ −含有プライマーおよび非−ＰＢＳ−含有プライマーの包含での増幅よりも大き な増幅が起こった。The most successful reaction, which resulted in approximately 10”-fold target amplification, involved three enzymes and T7R. Two oligonucleotide plies containing NA polymerase binding sequences (PBS) It was made to work with mer. The necessary enzymes are AMV reverse transcriptase and T7 RNA port. Limerase and Dai JIJ! E. coli RNase to 9 reaction solution which is bacterial RNaseH Addition of eH replenishes the RNaseH activity present in AMV reverse transcriptase, resulting in high levels of It seems to produce an amplification of LE. Optimal orientation centered in the length of the target sequence. Gonucleotide primer selection, polymerization on one or both primers Inclusion of polymerase binding sequences and polymerase binding sequences as transcription promoters - Efficiency of included primers. All three affect the level of amplification. two cages Inclusion of oligonucleotide primers (each containing PBS) is a single PBS -containing primers and non-PBS-containing primers. An amplification occurred.
付随する図を参考にして： （１）ｍＲＮＡ標的分子がＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター結合配列をと り入れている標的特異性合成オリゴデオキシリボヌクレオチドとアニール化され る、 （２）このプライマーがＡＭＶ逆転写酵素のＤＮＡポリメラーゼ活性により伸長 されて第１のｅ ＤＮＡｔＪ（が合成され、（３）ＡＭＶ逆転写酵素および大腸 菌ＲＮａｓｅＨのＲＮａｓｅＨ活性がＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド デユーブレ ックスのＲＮＡを分解し、第２のｃ ＤＮＡ鎖重鎮のための鋳型としてＤＮＡが 利用できるようになし、（４）ＲＮａ ｓ ｅＨ消化から生じた自己−発生オリ ゴリポヌクレオチドまたは好適にはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ プロモーター結 合配列（図には示されていない）をとり込んでいる合成オリゴデオキシリボヌク レオチドで第２ｃＤＮＡ鎖合成の用意する。ＡＭＶ逆転写酵素がプライマーを伸 長させ、作用可能なＴ７ＲＮＡポリメラーゼ プロモーター結合配列をとり込ん だ二本鎖ＤＮＡが形成される。With reference to the accompanying diagram: (1) The mRNA target molecule has a T7 RNA polymerase promoter binding sequence. is annealed with target-specific synthetic oligodeoxyribonucleotides. Ru, (2) This primer is extended by the DNA polymerase activity of AMV reverse transcriptase. (3) AMV reverse transcriptase and colon The RNaseH activity of bacterial RNaseH is an RNA/DNA hybrid duplex. DNA is used as a template for the second cDNA strand heavyweight. (4) auto-generated oligonucleotides resulting from RNAseH digestion. goliponucleotide or preferably T7 RNA polymerase promoter linkage Synthetic oligodeoxyribonucs incorporating binding sequences (not shown) Prepare for second cDNA strand synthesis with leotide. AMV reverse transcriptase extends the primer. lengthened and incorporates an operational T7 RNA polymerase promoter binding sequence. double-stranded DNA is formed.
（５）Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが二本鎖プロモーター結合配列へ結合し標的核 酸に相補的なＲＮＡのコピーを転写する、（６）ＰＢＳを持つ第２のオリゴデオ キシリポヌクレオシド プライマーがＲＮＡ転写体ヘアニール化される、 （７）ＡＭＶ逆転写酵素がｃＤＮＡｔｊｊの合成を触媒する、（８）ＲＮａ ｓ ｅＨがＲＮＡ／ＤＮＡハイフ゛リントデユーブレックスのＲＮＡを分解しＤＮ Ａを第２の鎖合成のための鋳型として利用可能なようにする、（９）オリゴデオ キシリボヌクレオチド プライマーを第２のｃＤＮＡｌｌとハイブリダイズされ 、ＡＭＶ逆転写酵素でＤＮＡを合成する。転写が起こり、サイクルは引き続く。(5) T7 RNA polymerase binds to the double-stranded promoter binding sequence and targets the target nucleus. (6) a second oligodeo with PBS that transcribes a copy of the RNA complementary to the acid; The xyliponucleoside primer is hair-annealed to the RNA transcript. (7) AMV reverse transcriptase catalyzes the synthesis of cDNAtjj, (8) RNAs eH decomposes the RNA of the RNA/DNA hybrid duplex and converts it into DNA. (9) Oligodeo, which makes A available as a template for second strand synthesis. The xyribonucleotide primer is hybridized with the second cDNA , synthesizes DNA with AMV reverse transcriptase. Transcription occurs and the cycle continues.
■−犬施倒 １、１−ＨＩＶ−１ｅｎｖ ＠ の −ＨＩＶ−Ｉ ＲＮＡの１領域が等温酵素 反応で増幅され、反応の終了時にはこの領域の１０６倍以上のコピーが発生した 。■-Dog treatment 1, 1-HIV-1env @ -HIV-I RNA region is an isothermal enzyme was amplified in the reaction, and at the end of the reaction, more than 106 copies of this region were generated. .
ａ、増幅反応 出発核酸材料は、Ｍａｎｉａｔａｓ ｅｔ ａｌ、、前記文献、により記載され ているグアニジニウム イソチオシアネート−塩化セシウム勾配法によりＨＩＶ −１−感染ＣＥＭ細胞（ヒトリンパ芽球細胞株： Ｆｏｌｋｓ ｅｔ ａｌ、＋ Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。a. Amplification reaction The starting nucleic acid material is as described by Maniatas et al., supra. guanidinium isothiocyanate-cesium chloride gradient method -1- Infected CEM cells (human lymphoblastoid cell line: Folks et al, + Proc, Natl, Acad, Sci.
ＵＳ八 ８２．４５３１ （１９８５））から抽出されたセシウム−ペレット化 ＲＮＡであった（ＨＩＶ−１特異的配列は存在する全核酸の１−１０％と推定さ れた）。Cesium extracted from US 82.4531 (1985) - pelletized RNA (HIV-1-specific sequences are estimated to account for 1-10% of all nucleic acids present). ).
十分の−アトモルの標的核酸を、最終濃度で４０ｍＭ Ｔｒｉｓ；ＨＣｌ、ｐ８ ．１１２ｍＭ Ｍｇ Ｃｊ２ｔ ２５ｍＭ ＮａＣｆ ２ｍＭ スペルミジン−（ＨＣｌ）３ ５ｍＭ ジチオスレイトール ８０μｇ／ｒｒｌ ＢＳＡ 各々１ｍＭの ｄＡＴＰｍ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ各々１ｍＭの ＡＴ Ｐ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ各々０．２５μｇ 開始オリゴヌクレオチド（８８ −２１，１および８Ｂ−３４７、以下参照） を含む反応混合物（全量１００μ２）に置いた。Sufficient attomoles of the target nucleic acid were added to a final concentration of 40 mM Tris; HCl, p8. ．． 112mM Mg Cj2t 25mM NaCf 2mM spermidine-(HCl)3 5mM dithiothreitol 80μg/rrl BSA 1mM each dATPm, dCTP, dGTP, dTTP 1mM each AT P, CTP, GTP, UTP 0.25 μg each Start oligonucleotide (88 -21,1 and 8B-347, see below) (total volume 100 μ2).
反応成分は１．５ｍｌのエフペンドルフ チューブ中で混合し、続いてポルテッ クスで簡単に軽くかきまぜた。標的核酸は水浴中６５℃にて１分間チューブを加 熱することにより変性させた。３７°Ｃに１分間冷却した後以下の酵素が添加さ れた： ２５単位 ＡＭＶ逆転写酵素（１５−２５単位／μり１００単位 Ｔ７ ＲＮＡ ポリメラーゼ（１００単位／μ２）４単位 大腸菌ＲＮａ ｓｅＨ（２単位／ｕ ｌ）反応は３７°Ｃで３時間、さらに何の操作をすることなく進行させた。The reaction components were mixed in a 1.5 ml Efpendorf tube, followed by Stir briefly with a whisk. Target nucleic acids were incubated in tubes for 1 minute at 65°C in a water bath. Denatured by heating. After cooling to 37°C for 1 minute, the following enzymes were added: Was: 25 units AMV reverse transcriptase (15-25 units/μl 100 units T7 RNA Polymerase (100 units/μ2) 4 units E. coli RNA seH (2 units/u l) The reaction was allowed to proceed for 3 hours at 37°C without any further manipulation.
ｂ、増輻止成物９挟比 約１時間後、生成物は増幅断片内の３０塩基対領域に相補的な３２Ｐ−標識オリ ゴヌクレオチドを用いて検出された（８８−２９８）。b. Increasing stop composition 9 ratio After approximately 1 hour, the product is a P-labeled oligonucleotide complementary to a 30 base pair region within the amplified fragment. (88-298).
全容量のｌ／４０の反応液の１部を取り、９５．０μｌの７．４％ホルムアルデ ヒドおよび１０ Ｘ Ｓ Ｓ Ｃ（１１ａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、前記文献 ）中９．水浴に入れ５５°Ｃで２０分間変性させる。すぐ、氷冷し、スロット− プロット装置を通してニトロセルロース膜上へ詰める。核酸はＵＶ照射により（ ２５４ｎｍ）ニトロセルロースへ固定化された。Take 1/40 of the total volume of the reaction solution and add 95.0 μl of 7.4% formaldehyde. Hyde and 10XSSC (11aniatis et al., supra. ) middle school 9. Denature in a water bath at 55°C for 20 minutes. Immediately cool on ice and slot. Pack through a plotting device onto a nitrocellulose membrane. Nucleic acids are extracted by UV irradiation ( 254 nm) was immobilized on nitrocellulose.
固定化後、フィルターを０．５％ＢＳＡ、０．５％ポリビニルピロリドン、５ｘ ｓｓＰＥ（２０ｘ＝３．６Ｍ ＮａＣ１，２００ｍＭ ＮａＨｚ ＰＯ−１２０ ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７−８）および１％ＳＤＳを含むフィルター平方センチ当 り５Ｏ−１００ｔｔｌの緩衝液中５５°Ｃにて１５分間プレハイブリダイズさせ た。After immobilization, filters were coated with 0.5% BSA, 0.5% polyvinylpyrrolidone, 5x ssPE (20x=3.6M NaCl, 200mM NaHz PO-120 filter per square centimeter containing mM EDTA, pH 7-8) and 1% SDS. Prehybridize for 15 minutes at 55°C in 5O-100ttl buffer. Ta.
ハイブリダイゼーションは２−５Ｘ１０’ ｃｐｍ／ｍｌのリン酸化オリゴヌク レオチドプローブを含む同じ緩衝液中５５゛Ｃで２時間行った。プローブをプリ ハイブリダイゼーション緩衝液に添加された。フィルターは１ｍｆｆ１衝液／ｃ ｍ”フィルター、１ｘｓｓＰＥ、１％ＳＤＳを用いて各々３分間室温で３回洗浄 し、次に同じ緩衝液中５５°Ｃにて１分間洗浄した。Hybridization was carried out using 2-5X10' cpm/ml phosphorylated oligonucleotides. Tests were carried out for 2 hours at 55°C in the same buffer containing the leotide probe. Pre-probe added to hybridization buffer. Filter is 1mff1 buffer/c m” filter, washed 3 times with 1xssPE, 1% SDS for 3 minutes each at room temperature. and then washed for 1 minute at 55°C in the same buffer.
フィルターは一７０°Ｃにて１つの補力スクリーンによりオートラジオグラフィ ーを行った。Filters were autoradiographed with one intensifying screen at -70°C. I went to
増幅のレベルは増幅された生成物によりひき起こされる信号の強度を既知の量の ＨＩＶ−Ｉ ＲＮＡまたはｐＡＲＶ７Ａ／２ （Ｌｕｃｉｗ ｅｔ ａｔ、、 Ｎａｔｕｒｅ ３土又。The level of amplification measures the strength of the signal caused by the amplified product by a known amount. HIV-I RNA or pARV7A/2 (Luciw et at,... Nature 3 Tsutomata.
７６０ （１９８４）Ｌ ｐＵｃ１９の旦且皇Ｒ１部位内へ挿入されたＨＩＶ− １ゲノムのｃＤＮＡコピーを含むプラスミド、によりひき起こされる信号の強度 と比較することにより算出した。760 (1984) HIV- inserted into the R1 site of L pUc19 The intensity of the signal caused by a plasmid containing a cDNA copy of one genome. Calculated by comparing with
上に記載した実施例において、増幅のレベルはｌＸｌ０’であった。検出プロー ブ８８−２９７および８８−２９８を用いる生成物のノーサンプロットおよびサ ザン プロットは生成物がＲＮＡが優性な種であるＤＮＡおよびＲＮＡの混合物 であったことを示している。生成物は狭い範囲（２０−４０ｂｐ）内の不連続の 大きさであった（〜２１０ｂｐ）。In the example described above, the level of amplification was 1X10'. detection probe 88-297 and 88-298. The Zan plot is a mixture of DNA and RNA in which the product is the predominant species RNA. It shows that it was. The products are discrete within a narrow range (20-40 bp) (~210 bp).
２．２のＨＩＶ−１ｅｎｖ ｐ、ｌΩ増暢第２のＨＩＶ−１ｅ且、９５域の増幅 は実施例１に記載した方法に従って達成された、ただし、開始オリゴヌクレオチ ド８７−２８４および８Ｂ−３４７（下記参照）が増幅のために使用され、検出 には検出オリゴヌクレオチド８６−２７２および８６−２７３ （下記参照）が 使用された。１０１倍の増幅が達成された。2.2 HIV-1env p, lΩ amplification second HIV-1e and 95 range amplification was achieved according to the method described in Example 1, with the exception that the starting oligonucleotide 87-284 and 8B-347 (see below) were used for amplification and detection. contains detection oligonucleotides 86-272 and 86-273 (see below). used. A 101-fold amplification was achieved.
成れれた。ただし、増幅のためには開始オリゴヌクレオチド８８−７７および８ ７−２９２ （下記参照）が使用され、検出には検出オリゴヌクレオチド８６− ３１および８６−３２ （下記参照）が使用された。１０３倍の増幅が達成され た。I was able to become one. However, for amplification, starting oligonucleotides 88-77 and 8 7-292 (see below) was used, and detection oligonucleotide 86-292 was used for detection. 31 and 86-32 (see below) were used. Amplification of 103 times was achieved. Ta.
４、ＡＩＤＳ、畠 １”の゛の °１゛の １のＨＩＶ−１ｅｎｖ ｐ域Ω増幅 ３つのＨＩＶ−１感染臨床試料からのＲＮＡが増幅された。ＲＮＡは有機抽出プ ロトコール（下記参照）により抽出された。4. AIDS, Hatake 1"'s 1's 1's HIV-1 env p-range Ω amplification RNA from three HIV-1 infected clinical samples was amplified. RNA is extracted using an organic extraction protein. Extracted by rotor (see below).
開始オリゴヌクレオチド８８−２１１および８Ｂ−３４７（下記参照）および検 出オリゴヌクレオチド８８−２９７および８８−２９８ （下記参照）を用いて 実施例１のごとく増幅が実施された。Starting oligonucleotides 88-211 and 8B-347 (see below) and test using oligonucleotides 88-297 and 88-298 (see below). Amplification was performed as in Example 1.
試料の２つの陽性の結果を示した。これらの実験の反応において全体の増幅は１ ０Ｓ倍であった。増幅後に検出される信号は反応の初期に存在する出発物質の量 に直接比例するので（実施例５参照）、第３の臨床試料はＨＩＶ−１に感染され ていないと同定することが可能であり、なぜなら出発標的ＨＩＶ−１配列をほと んど含んでいないからである。Two positive results of the samples were shown. In the reactions of these experiments, the overall amplification was 1 It was 0S times. The signal detected after amplification is a reflection of the amount of starting material present at the beginning of the reaction. (see Example 5), the third clinical sample was infected with HIV-1. It is possible to identify that the starting target HIV-1 sequence is This is because it does not include much of it.
５、々０） （７）ＨＩＶ−１＋ＩＰＣＥＭ ト ムレｆ、−感”ＣＥＭ （７ ）のＨＴＶ−１ｅｎｖ の 開始オリゴヌクレオチド８８−２１１および８８−３４７（下記参照）および検 出オリゴヌクレオチド８Ｂ−２９７および８８−２９８ （下記参照）を用いて 実施例４のごとく、増幅が実施された。5. ) of HTV-1env Starting oligonucleotides 88-211 and 88-347 (see below) and test using oligonucleotides 8B-297 and 88-298 (see below). Amplification was performed as in Example 4.
１０″の非感染ＣＥＭ細胞の集団中の１０３から１のＨＩＶ−１感染ＣＥＭ細胞 からの全核酸抽出物を用いる標的増幅（実施例７参照）は信号が試料中に存在す る感染細胞の数に比例することを示した。陰性対照物（１０６非怒染ＣＥＭ細胞 ）はわずかなバックグラウンド信号を示した。このバックグラウンド信号は１０ の感染ＣＥＭ細胞試料から得られた信号よりも有為に小さかった。103 to 1 HIV-1 infected CEM cells in a population of 10'' uninfected CEM cells Target amplification (see Example 7) using whole nucleic acid extracts from The number of infected cells was shown to be proportional to the number of infected cells. Negative control (106 non-angry stained CEM cells ) showed a slight background signal. This background signal is 10 was significantly smaller than the signal obtained from infected CEM cell samples.
ｌ および第１ゴヌクレオチド ａ、Ｕ：ヌクレオチド三リン酸はシグマから、ＡＭＶ逆転写酵素はライフサイエ ンスから、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼはストラータジ −一ンから大腸菌リボヌ クレアーゼＨおよびＢＳＡはベセスダリサーチ ラボから入手された。l and the first gonucleotide a, U: Nucleotide triphosphates are from Sigma, AMV reverse transcriptase is from Lifescience. From the beginning, T7 RNA polymerase is derived from E. coli ribonuclease from stratagin. Crease H and BSA were obtained from Bethesda Research Labs.
ｂ、ｔユコ剋；オリゴヌクレオチドはアプライド バイオシステムズ３８０Ａを 用いてホスホルミルアミダイト化学により合成され、ＨＰＬＣにより精製された 。b, tYuko; Oligonucleotides were from Applied Biosystems 380A. was synthesized by phosphomylamidite chemistry and purified by HPLC using .
プライマーおよびプローブとして使用されたオリゴヌクレオチドはＨＩＶ−１お よびｅｎｖおよびｓ ｏ ｒＮ域に対しＲａｔｎｅｒリエｍｌよ、匝に朋 １１ ３．２７７ （１９５）により報告されている対応する配列に特異的であった。The oligonucleotides used as primers and probes were and Ratner rie ml for env and sorN area, 11 3.277 (195).
８８−２１１ ： （開始オリゴヌクレオチド；ｎｕ ６４５０−６４７９；Ｇ ＴＴＴＴＧＣＧＡＴＴＣＴＡ−３’ ８Ｂ−２９７： （検出オリゴヌクレオチド；ｎｔ ６５６０−６５３１；見立 ヱ） ５’−ＴＧＧＣＣＴＡＡＴＴＣＣＡＴＧＴＧＴＡＣＡＴＴＧＴＡＣＴＧＴ−３’ ８８−２９８：（検出オリゴヌクレオチド；ｎｔ、６５３１−６５６０；立ユＶ ） ５’−ＡＣＡＧＴＡＣＡＡ丁ＧＴＡＣＡＣＡＴＧＧＡＡＴ丁ＡＧＧＣＣＡ−３’ ８Ｂ−３４７： （開始オリゴヌクレオチド；ｎｔ ６６６１−６６３２；見ユ ヱ） ５’−ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡ乃ＧＧＧＡＴＧＴＡＣＴＡＴＴ ＡＴＧＧＴＴＴＴＡＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＴＧＡ−３’ ８８−７７ ：（ｎｔ ５０１Ｂ−４９８８；ｓユニ）開始５’ −ＡＡＴＴＴ ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＣＡＣＣＴＡＧ［；ＧＣＴＡＡＣＴ ＡＴＧ丁ＧＴＣＣＴＡＡＴＡＡＧＧ−３’ ８７−２９２： （ｎｕ ４７６６−４７９６；５ｏｒ）開始５’−ＴＡＡＴＡ ＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＡＴＡＡＧＴＴＣＡＧＡＡＧＴＡＣ ＡＣＡＴＣＣＣＡＣＴ−３’８６−３１ ： （ｎｔ ４９０１−４９３２；５ ｏｒ）検出５’−ＧＣＡＣＡＣＡＡＧＴＡＧＡＣＣＣＴＧＡＡＣＴＡＧＣＡＧＡ ＣＣＡ−３’８６−３２ ：（ｎｔ ４９３２−４９０１；５ｏｒ）検出５’− ＴＧＧＴＣＴＧＣＴＡＧＴＴＣＡＧＧＧＴＣＴＡＣＴＴＧＴＧＴＧＣ−３’８７ −２８４： （ｎｔ ６５５１−６５７９；見立ｙ）開始５’−ＴＡＡＴＡＣＧ ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＡＴＴＡＧＧＣＣＡＧＴ八ＧＴＡＴＣＡＡＣＴ ＣＡＡＣＴ−３’８６−２７２：（ｎｔ ６５へ１−６６２０；ｅｖｒつ検出５ ’ −ＴＣＴＡＡＴＴＡＣＴＡＣＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴＡＧＡＣＴ−３’ ８６−２７３：（ｎｕ ６６２０−６５９１；見旦Ｖ）検出５’−ＡＧＴＣＴＡ ＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＴＡＧＴＡＡＴ丁ＡＧＡ−３’各々の開始オリゴヌ クレオチドは５′末端にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ結合配列（下ＭＡ）および好 適な転写開始部位（ボールド）である配列を含んでいる。呵責の残りは標的配列 に対し相補的である。88-211: (starting oligonucleotide; nu 6450-6479; G TTTTGCGATTCTA-3' 8B-297: (Detection oligonucleotide; nt 6560-6531; Mitate ヱ) 5'-TGGCCTAATTCCATGTGTACATTGTACTGT-3' 88-298: (Detection oligonucleotide; nt, 6531-6560; Standing V ) 5'-ACAGTACAATGTACACATGGAATAGGCCA-3' 8B-347: (starting oligonucleotide; nt 6661-6632; ヱ) 5'-AATTTAATACGACTCACTAノGGGATGTACTATT ATGGTTTTAGCATTGTCTGTGA-3' 88-77: (nt 501B-4988; s Uni) Start 5'-AATTT AATACGACTCACTATAGGGACACCTAG[;GCTAACT ATG DingGTCCTAATAAGG-3' 87-292: (nu 4766-4796; 5or) start 5'-TAATA CGACTCACTATAGGGAAAGAATAAGTTCAGAAGTAC ACATCCCACT-3'86-31: (nt 4901-4932; 5 or) detection 5'-GCACACAAGTAGACCCTGAACTAGCAGA CCA-3'86-32: (nt 4932-4901; 5or) detection 5'- TGGTCTGCTAGTTCAGGGTCTACTTGGTGTGC-3'87 -284: (nt 6551-6579; Mitate y) Start 5'-TAATACG ACTCACTATAGGGAAATTAGGCCAGT8GTATCAACT CAACT-3'86-272: (nt 65 to 1-6620; evr detection 5 '-TCTAATTACTACCTCTTCTTCTGCTAGACT-3' 86-273: (nu 6620-6591; Midan V) detection 5'-AGTCTA GCAGAAGAAGAGGTAGTAATDINGAGA-3' Each starting oligonucle The cleotide has a T7 RNA polymerase binding sequence (lower MA) and a preferred Contains a sequence that is a suitable transcription initiation site (bold). The rest of the blame is the target sequence complementary to
ＨＩＶ−１標的配列に関し、オリゴヌクレオチド８８−２１１．８Ｂ−２９８， ８７−２９２，８６−３１，８７−２８４および８６−２７３は負の鎖に対して ８６−３２および８６−２７２は正の鎖に対し相補的である。For the HIV-1 target sequence, oligonucleotide 88-211.8B-298, 87-292, 86-31, 87-284 and 86-273 for negative strand 86-32 and 86-272 are complementary to the positive strand.
７、凡ＮΔ９亘機抽出 感染細胞試料の核酸調製のためのプロトコール：ペレット細胞＝１ｍトリス緩衝 化塩溶液から５Ｋｒｐｍ １０分。7. Extraction of ordinary NΔ9 Protocol for nucleic acid preparation of infected cell samples: pellet cells = 1 m Tris buffer 5Krpm for 10 minutes from the salt solution.
上清を取り捨てる（５０μ２をベレットと共に残す）。Discard the supernatant (50 μ2 remain with the pellet).
６００μβの溶菌緩衝液にベレットを再懸濁する。Resuspend the pellet in 600 μβ of lysis buffer.
激しく渦を巻かせ、５０°Ｃで４５分インキュベートする、１０分毎に１０−１ ５秒渦を巻かせてかき混ぜる。Vortex vigorously and incubate for 45 min at 50 °C, 10-1 every 10 min. Stir by swirling for 5 seconds.
６００１Ｉｔのフェノール：クロロホルム：イソアミル アルコール（５０：４ ８＋２）を加える。振とうおよび渦を巻かせて混合物を乳化させる。相分離のた めの２分間１４ｋｒｐｍで遠心分離する。6001It phenol:chloroform:isoamyl alcohol (50:4 Add 8+2). Shake and swirl to emulsify the mixture. For phase separation Centrifuge at 14 krpm for 2 minutes.
水Ｆｉ（上層）から５７５μＰを抜＜、６００μ！のフェノール：クロロホルム ：イソアミルアルコール（５０：４８：２）を添加する。振とうし、渦を巻かせ て混合物を乳化させる。相分離のため２分間１４Ｋｒｐｍで遠心分離する。Extract 575μP from water Fi (upper layer) <, 600μ! Phenol: Chloroform : Add isoamyl alcohol (50:48:2). Shake and swirl emulsify the mixture. Centrifuge for 2 minutes at 14K rpm for phase separation.
水層から５２５μ２を抜＜、６００μＥのクロロホルム：イソアミルアルコール （２４：］）を加える。振とうし、渦を巻かせて混合物を乳化させる０分離のた め２分間１４Ｋｒｐｍで遠心分離する。Remove 525 μ2 from the aqueous layer, 600 μE of chloroform: isoamyl alcohol Add (24:]). Shake and vortex for 0 minutes to emulsify the mixture. Centrifuge for 2 minutes at 14K rpm.
水層から４００μｒを抜く（界面に存在するであろう細胞破片を移さないように する）。Remove 400 μr from the water layer (to avoid transferring cell debris that may be present at the interface) do).
１／１０容１１（４０μｉ）の８Ｍ ＬｉＣｊ！を加える。この工程で試料は処 理のため分離される。8M LiCj with 1/10 volume 11 (40μi)! Add. During this process, the sample is Separated for reasons of safety.
分離されている試料に３容量の１００％冷エタノールを加える。分離されていな い試料には２．５容量の水冷１００％エタノールを加える。よく混合する。＝２ ０°Ｃで一夜またはドライアイス／エタノール浴で１５分間沈殿させる。Add 3 volumes of 100% cold ethanol to the sample being separated. not separated Add 2.5 volumes of water-cooled 100% ethanol to the sample. Mix well. =2 Precipitate overnight at 0°C or for 15 minutes in a dry ice/ethanol bath.
試薬 Ｉ榎衡櫃 ２０ｍＭ ）リス ｐＨ７，５ １５０ｍＭ ＮａＣｊ！ １０ｍＭ ＥＤＴＡ ０．２％ ５ＤＳ ２００μｇ ／ ｍ ４１！ 蛋白質リン酸化酵素に上エムニ復街化塩搭戒 １３７ｍＭ ＮａＣｊ！ ５．１ｍＭ ＫＣｌ ２４．８ｍＭ）リス塩基 ＩＮＨ（ｌでｐＨを７．４に調製する。reagent I Enoki Hiroshi 20mM) Squirrel pH 7.5 150mM NaCj! 10mM EDTA 0.2% 5DS 200μg/m 41! Protein Phosphorase Enzymes 137mM NaCj! 5.1mM KCl 24.8mM) Lis base Adjust the pH to 7.4 with INH (l).
オートクレーブ滅菌する。Sterilize by autoclaving.
前述の記載は本発明の実施に用いることができるであろう特定の方法を詳述した ものである。この文書の等温増幅系の説明に最初に使用された詳細な特定の方法 を知ると、当業者は等温単−容器道具立てにおけるものと類憤の増幅を生し、お よびこの情報を特定的に記載されている以外の標的核酸に拡大する別の等価な方 法をどのように工夫すればよいかを十分に知るであろう。それ故、本文には前述 のものが詳述されて現れているであろうが、全体の範囲を制限するものと解釈し てはならない；むしろ、本発明の範囲は付随する請求の範囲の法律上盲動な解釈 のみに支配されるべきである。The foregoing description details certain methods that may be used to practice the present invention. It is something. Detailed specific methods originally used to describe the isothermal amplification system in this document Knowing this, a person skilled in the art would understand that it is similar to that in isothermal single-container utensils, and and another equivalent that extends this information to target nucleic acids other than those specifically listed. He will know fully how to devise the law. Therefore, the text mentioned above may appear detailed, but should not be construed as limiting the overall scope. rather, the scope of the invention shall be determined on a blind legal interpretation of the appended claims. should be controlled only by
浄書（内容に変更なし） １傅ｌ １２ 、、 ３＋ （号（ンズ）補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成 ３年 ６月１７日Engraving (no changes to the content) 1 傅 12 、、3＋ (No.(ns) Translation submission form (Article 184-8 of the Patent Law) June 17, 1991
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| US5130238A (en) * | 1988-06-24 | 1992-07-14 | Cangene Corporation | Enhanced nucleic acid amplification process |
| CA2020958C (en) * | 1989-07-11 | 2005-01-11 | Daniel L. Kacian | Nucleic acid sequence amplification methods |
| US6589734B1 (en) | 1989-07-11 | 2003-07-08 | Gen-Probe Incorporated | Detection of HIV |
| KR100242252B1 (en) * | 1989-07-11 | 2000-03-02 | 다니엘 엘. 캐시앙 | Nucleic acid sequence amplification methods |
| US7009041B1 (en) | 1989-07-11 | 2006-03-07 | Gen-Probe Incorporated | Oligonucleotides for nucleic acid amplification and for the detection of Mycobacterium tuberculosis |
| US5766849A (en) * | 1989-07-11 | 1998-06-16 | Gen-Probe Incorporated | Methods of amplifying nucleic acids using promoter-containing primer sequence |
| WO1991004340A1 (en) * | 1989-09-20 | 1991-04-04 | Cambridge Biotech Corporation | In vitro, isothermal nucleic acid amplification |
| US7049102B1 (en) | 1989-09-22 | 2006-05-23 | Board Of Trustees Of Leland Stanford University | Multi-gene expression profile |
| US5545522A (en) * | 1989-09-22 | 1996-08-13 | Van Gelder; Russell N. | Process for amplifying a target polynucleotide sequence using a single primer-promoter complex |
| EP0540693B1 (en) * | 1990-07-24 | 1999-01-20 | F. Hoffmann-La Roche Ag | THE REDUCTION OF NON-SPECIFIC AMPLIFICATION DURING $i(IN VITRO) NUCLEIC ACID AMPLIFICATION USING MODIFIED NUCLEIC ACID BASES |
| IE913930A1 (en) * | 1990-11-13 | 1992-06-17 | Siska Diagnostics | Nucleic acid amplification by two-enzyme, self-sustained¹sequence replication |
| EP0557456A4 (en) * | 1990-11-14 | 1995-11-15 | Siska Diagnostics Inc | Non-isotopic detection of nucleic acids using a polystyrene support-based sandwich hybridization assay and compositions useful therefor |
| DE69128077T2 (en) | 1990-12-31 | 1998-02-26 | Promega Corp., Madison, Wis. | NUCLEIC ACID AMPLIFICATION WITH DNA-DEPENDENT RNS POLYMERASES ACTIVITY OF RNS REPLICASES |
| AU8997991A (en) * | 1991-01-31 | 1992-08-06 | Becton Dickinson & Company | Exonuclease mediated strand displacement amplification |
| WO1992020820A1 (en) * | 1991-05-15 | 1992-11-26 | Vanderbilt University | Method to determine metastatic potential of tumor cells |
| DE69233285T2 (en) * | 1991-08-02 | 2004-11-25 | bioMérieux B.V. | Quantification of nucleic acids |
| DE4129653A1 (en) * | 1991-09-06 | 1993-03-11 | Boehringer Mannheim Gmbh | PROCESS FOR DETECTION OF SIMILAR NUCLEIC ACIDS |
| DE4132133A1 (en) * | 1991-09-26 | 1993-04-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | METHOD FOR THE SPECIFIC PRODUCTION OF RIBONUCLEIC ACIDS |
| DE4213029A1 (en) * | 1991-09-26 | 1993-04-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | METHOD FOR THE SPECIFIC REPRODUCTION OF NUCLEIN'S SEQUENCES |
| KR100249110B1 (en) * | 1992-05-06 | 2000-04-01 | 다니엘 엘. 캐시앙 | Nucleic acid sequence amplification method, composition and kit |
| US5843640A (en) * | 1992-06-19 | 1998-12-01 | Northwestern University | Method of simultaneously detecting amplified nucleic acid sequences and cellular antigens in cells |
| AU686616B2 (en) | 1993-03-26 | 1998-02-12 | Gen-Probe Incorporated | Detection of human immunodeficiency virus type 1 |
| US5814442A (en) * | 1994-06-10 | 1998-09-29 | Georgetown University | Internally controlled virion nucleic acid amplification reaction for quantitation of virion and virion nucleic acid |
| FR2724934B1 (en) * | 1994-09-26 | 1997-01-24 | Bio Merieux | CHIMERIC OLIGONUCLEOTIDE AND ITS USE IN OBTAINING NUCLEIC ACID TRANSCRIPTS |
| FR2726277B1 (en) | 1994-10-28 | 1996-12-27 | Bio Merieux | OLIGONUCLEOTIDE FOR USE AS PRIMER IN AN AMPLIFICATION METHOD BASED ON REPLICATION WITH MOVEMENT OF STRAND |
| US5770368A (en) * | 1996-05-09 | 1998-06-23 | Metropolitan Water District Of Southern California | Cryptosporidium detection method |
| US6436638B1 (en) | 1996-05-09 | 2002-08-20 | Metropolitan Water District Of Southern California | Cryptosporidium detection method |
| US6235479B1 (en) | 1999-04-13 | 2001-05-22 | Bio Merieux, Inc. | Methods and devices for performing analysis of a nucleic acid sample |
| AT410218B (en) | 1999-08-20 | 2003-03-25 | Baxter Ag | METHOD FOR PRODUCING A QUALITY-ASSURED POOL OF BIOLOGICAL SAMPLES |
| US6893847B2 (en) | 2001-01-17 | 2005-05-17 | Tosoh Corporation | Oligonucleotide for detecting Salmonella and method of detecting Salmonella |
| US7338805B2 (en) | 2001-05-04 | 2008-03-04 | Bio Merieux | Labeling reagents, methods for synthesizing such reagents and methods for detecting biological molecules |
| US7504215B2 (en) | 2002-07-12 | 2009-03-17 | Affymetrix, Inc. | Nucleic acid labeling methods |
| EP1564301A4 (en) | 2002-10-29 | 2007-07-11 | Riken | Method of amplifying nucleic acid |
| FR2855832B1 (en) | 2003-06-03 | 2007-09-14 | Biomerieux Sa | DIAGNOSTIC AND / OR PROGNOSTIC METHOD OF SEPTIC SYNDROME |
| CA3084542A1 (en) | 2003-06-10 | 2005-01-06 | The Trustees Of Boston University | Gene expression analysis of airway epithelial cells for diagnosing lung cancer |
| FR2857375B1 (en) | 2003-07-10 | 2007-11-09 | Biomerieux Sa | PROCESS FOR THE DETECTION AND / OR IDENTIFICATION OF STAPHYLOCOCCUS GENE BACTERIA |
| EP1709198B1 (en) | 2003-11-26 | 2013-08-14 | AdvanDx, Inc. | Peptide nucleic acid probes for analysis of certain staphylococcus species |
| EP2415878A1 (en) | 2003-12-25 | 2012-02-08 | Riken | Method of amplifying nucleic acid and method of detecting mutated nucleic acid using the same |
| CA2497324A1 (en) | 2004-02-17 | 2005-08-17 | Affymetrix, Inc. | Methods for fragmenting and labelling dna |
| FR2868071B1 (en) | 2004-03-26 | 2006-06-09 | Biomerieux Sa | MARKING REAGENTS, METHODS FOR SYNTHESIZING SUCH REAGENTS AND METHODS FOR DETECTING BIOLOGICAL MOLECULES |
| FR2868433B1 (en) | 2004-04-06 | 2008-01-18 | Biomerieux Sa | METHOD FOR THE PROGNOSIS AND / OR DIAGNOSIS OF CANCER |
| US20060073506A1 (en) | 2004-09-17 | 2006-04-06 | Affymetrix, Inc. | Methods for identifying biological samples |
| US20060073511A1 (en) | 2004-10-05 | 2006-04-06 | Affymetrix, Inc. | Methods for amplifying and analyzing nucleic acids |
| US7682782B2 (en) | 2004-10-29 | 2010-03-23 | Affymetrix, Inc. | System, method, and product for multiple wavelength detection using single source excitation |
| JP2006126204A (en) | 2004-10-29 | 2006-05-18 | Affymetrix Inc | Automated method for manufacturing polymer array |
| FR2881437B1 (en) | 2005-01-31 | 2010-11-19 | Biomerieux Sa | METHOD FOR THE DIAGNOSIS / PROGNOSIS OF A SEPTIC SYNDROME |
| EP1874955A4 (en) | 2005-02-28 | 2009-05-06 | Bioquest Inc | Methods for performing direct enzymatic reactions involving nucleic acid molecules |
| US20100035244A1 (en) | 2005-04-14 | 2010-02-11 | The Trustees Of Boston University | Diagnostic for lung disorders using class prediction |
| EP1882036B1 (en) | 2005-05-17 | 2012-02-15 | Ozgene Pty Ltd | Sequential cloning system |
| FR2886735B1 (en) | 2005-06-01 | 2015-09-11 | Biomerieux Sa | PROCESS FOR MARKING OR PROCESSING A BIOLOGICAL SAMPLE CONTAINING BIOLOGICAL MOLECULES OF INTEREST, IN PARTICULAR NUCLEIC ACIDS |
| US7550264B2 (en) | 2005-06-10 | 2009-06-23 | Datascope Investment Corporation | Methods and kits for sense RNA synthesis |
| FR2902430B1 (en) | 2005-11-25 | 2012-11-02 | Biomerieux Sa | OLIGONUCLEOTIDES, USE, DETECTION METHOD AND KIT FOR DIAGNOSING THE PRESENCE OF INFLUENZA VIRUS H5 AND N1 GENES |
| EP1999472A2 (en) | 2006-03-09 | 2008-12-10 | The Trustees Of Boston University | Diagnostic and prognostic methods for lung disorders using gene expression profiles from nose epithelial cells |
| WO2007149269A2 (en) | 2006-06-12 | 2007-12-27 | Oncomethylome Sciences S.A. | Methylation markers for early detection and prognosis of colon cancers |
| EP2057465A4 (en) | 2006-08-09 | 2010-04-21 | Homestead Clinical Corp | Organ-specific proteins and methods of their use |
| FR2906537A1 (en) | 2006-09-28 | 2008-04-04 | Biomerieux Sa | METHOD FOR IN VITRO DIAGNOSIS OF BRONCHO-PULMONARY CANCER BY DETECTION OF ALTERNATIVE MAJORITY TRANSCRIPTS OF KLK8 GENE ENCODING KALLICREIN 8 AND USE THEREOF FOR THE PROGNOSIS OF SURVIVAL |
| US9845494B2 (en) | 2006-10-18 | 2017-12-19 | Affymetrix, Inc. | Enzymatic methods for genotyping on arrays |
| WO2008066655A2 (en) | 2006-11-02 | 2008-06-05 | Yale University | Assessment of oocyte competence |
| US8293684B2 (en) | 2006-11-29 | 2012-10-23 | Exiqon | Locked nucleic acid reagents for labelling nucleic acids |
| GB0701253D0 (en) | 2007-01-23 | 2007-02-28 | Diagnostics For The Real World | Nucleic acid amplification and testing |
| EP1956097A1 (en) | 2007-02-06 | 2008-08-13 | bioMerieux B.V. | Method for discriminating single nucleotide polymorphisms (SNPs) |
| FR2917090B1 (en) | 2007-06-11 | 2012-06-15 | Biomerieux Sa | MARKING REAGENTS HAVING DIAZO AND NITRO FUNCTIONS, METHODS FOR SYNTHESIZING SUCH REAGENTS AND METHODS FOR DETECTING BIOLOGICAL MOLECULES |
| JP2009000063A (en) | 2007-06-22 | 2009-01-08 | Tosoh Corp | Improved method for detecting norovirus rna |
| US20100291564A1 (en) | 2007-07-09 | 2010-11-18 | Microsen Medtech Limited | Methods for Detection of Micro-Organisms |
| DK2198042T3 (en) | 2007-09-17 | 2017-01-23 | Mdxhealth Sa | New markers for bladder cancer detection |
| CN101932723B (en) | 2007-09-17 | 2014-09-10 | 肿瘤甲基化科学公司 | Improved detection of mage-a expression |
| KR20100083133A (en) | 2007-10-04 | 2010-07-21 | 도소 가부시키가이샤 | Primer for amplification of rrna of bacterium belonging to the genus legionella, detection method, and detection kit |
| EP2071034A1 (en) | 2007-12-12 | 2009-06-17 | bioMérieux | Method for treating a solution in order to destroy any ribonucleic acid after amplification |
| WO2009105549A2 (en) | 2008-02-19 | 2009-08-27 | Oncomethylome Sciences Sa | Detection and prognosis of lung cancer |
| CA2718092C (en) | 2008-03-21 | 2019-03-19 | Oncomethylome Sciences S.A. | Detection and prognosis of cervical cancer |
| FR2934595B1 (en) | 2008-07-29 | 2013-04-05 | Biomerieux Sa | MARKING REAGENTS HAVING A PYRIDINE CORE HAVING DIAZOMETHYL FUNCTION, METHODS FOR SYNTHESIZING SUCH REAGENTS AND METHODS FOR DETECTING BIOLOGICAL MOLECULES |
| CA2679750A1 (en) | 2008-09-23 | 2010-03-23 | Nexus Dx, Inc. | Methods for detecting nucleic acids in a sample |
| EP2172563A1 (en) | 2008-09-24 | 2010-04-07 | bioMérieux S.A. | Method for lowering the dependency towards sequence variation of a nucleic acid target in a diagnostic hybridization assay |
| JP5428272B2 (en) | 2008-10-06 | 2014-02-26 | 東ソー株式会社 | Survivin mRNA measurement method |
| FR2940805B1 (en) | 2009-01-05 | 2015-10-16 | Biomerieux Sa | METHOD FOR AMPLIFYING AND / OR DETECTING NUCLEIC ACIDS, KITS AND USES THEREOF |
| KR20180026561A (en) | 2009-01-19 | 2018-03-12 | 비오메리으 | Methods for determining the likelihood of a patient contracting a nosocomial infection and for determining the prognosis of the course of a septic syndrome |
| US20120164238A1 (en) | 2009-02-03 | 2012-06-28 | Mdxhealth Sa | Methods of detecting colorectal cancer |
| EP3722810A3 (en) | 2009-02-11 | 2021-01-13 | Caris MPI, Inc. | Molecular profiling of tumors |
| WO2010102823A1 (en) | 2009-03-13 | 2010-09-16 | Oncomethylome Sciences Sa | Novel markers for bladder cancer detection |
| KR20120002534A (en) | 2009-03-17 | 2012-01-05 | 엠디엑스헬스 에스에이 | Improved detection of gene expression |
| US10174368B2 (en) | 2009-09-10 | 2019-01-08 | Centrillion Technology Holdings Corporation | Methods and systems for sequencing long nucleic acids |
| US10072287B2 (en) | 2009-09-10 | 2018-09-11 | Centrillion Technology Holdings Corporation | Methods of targeted sequencing |
| FR2950358B1 (en) | 2009-09-18 | 2015-09-11 | Biomerieux Sa | SIMPLIFIED NUCLEIC ACID AMPLIFICATION DEVICE AND METHOD FOR IMPLEMENTING THE SAME |
| WO2011036173A1 (en) | 2009-09-24 | 2011-03-31 | Oncomethylome Sciences S.A. | Detection and prognosis of cervical cancer |
| WO2011056688A2 (en) | 2009-10-27 | 2011-05-12 | Caris Life Sciences, Inc. | Molecular profiling for personalized medicine |
| US8835358B2 (en) | 2009-12-15 | 2014-09-16 | Cellular Research, Inc. | Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels |
| TWI518325B (en) | 2010-02-04 | 2016-01-21 | 自治醫科大學 | Identification, assessment, and therapy of cancers with innate or acquired resistance to alk inhibitors |
| WO2011135058A2 (en) | 2010-04-30 | 2011-11-03 | Mdxhealth Sa | Methods for detecting epigenetic modifications |
| KR101176139B1 (en) | 2010-05-20 | 2012-08-22 | 광주과학기술원 | Transgenic Mice Overexpressing HIF-2α as an Animal Model of Arthritis and Uses Thereof |
| KR101223660B1 (en) | 2010-05-20 | 2013-01-17 | 광주과학기술원 | Pharmaceutical Compositions for Preventing or Treating Arthritis Comprising HIF-2α Inhibitor as an Active Ingredient |
| JP5916718B2 (en) | 2010-06-04 | 2016-05-11 | ビオメリューＢｉｏｍｅｒｉｅｕｘ | Method and kit for determining prognosis of colorectal cancer |
| US20140342940A1 (en) | 2011-01-25 | 2014-11-20 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Detection of Target Nucleic Acids using Hybridization |
| US20130261003A1 (en) | 2010-08-06 | 2013-10-03 | Ariosa Diagnostics, In. | Ligation-based detection of genetic variants |
| US20120034603A1 (en) | 2010-08-06 | 2012-02-09 | Tandem Diagnostics, Inc. | Ligation-based detection of genetic variants |
| US8700338B2 (en) | 2011-01-25 | 2014-04-15 | Ariosa Diagnosis, Inc. | Risk calculation for evaluation of fetal aneuploidy |
| US11031095B2 (en) | 2010-08-06 | 2021-06-08 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Assay systems for determination of fetal copy number variation |
| US10167508B2 (en) | 2010-08-06 | 2019-01-01 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Detection of genetic abnormalities |
| US10533223B2 (en) | 2010-08-06 | 2020-01-14 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Detection of target nucleic acids using hybridization |
| US20130040375A1 (en) | 2011-08-08 | 2013-02-14 | Tandem Diagnotics, Inc. | Assay systems for genetic analysis |
| US11203786B2 (en) | 2010-08-06 | 2021-12-21 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Detection of target nucleic acids using hybridization |
| EP2606150B1 (en) | 2010-08-20 | 2016-03-16 | Life Technologies Corporation | Quantitative real-time pcr assay using fret dual-labeled primers |
| US9110079B2 (en) | 2010-09-29 | 2015-08-18 | Biomerieux | Method and kit for establishing an in vitro prognosis on a patient exhibiting SIRS |
| US9994897B2 (en) | 2013-03-08 | 2018-06-12 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Non-invasive fetal sex determination |
| US20120190021A1 (en) | 2011-01-25 | 2012-07-26 | Aria Diagnostics, Inc. | Detection of genetic abnormalities |
| US11270781B2 (en) | 2011-01-25 | 2022-03-08 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Statistical analysis for non-invasive sex chromosome aneuploidy determination |
| US10131947B2 (en) | 2011-01-25 | 2018-11-20 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Noninvasive detection of fetal aneuploidy in egg donor pregnancies |
| FR2970975B1 (en) | 2011-01-27 | 2016-11-04 | Biomerieux Sa | METHOD AND KIT FOR DETERMINING IN VITRO THE IMMUNE STATUS OF AN INDIVIDUAL |
| EP2673380B1 (en) | 2011-02-09 | 2018-12-12 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Analysis of nucleic acids |
| ES2590263T3 (en) | 2011-02-24 | 2016-11-21 | Hill's Pet Nutrition, Inc. | Compositions and methods for the diagnosis of renal disorders in a feline |
| US20120219950A1 (en) | 2011-02-28 | 2012-08-30 | Arnold Oliphant | Assay systems for detection of aneuploidy and sex determination |
| WO2012129758A1 (en) | 2011-03-25 | 2012-10-04 | Biomerieux | Method and kit for determining in vitro probability for individual to suffer from colorectal cancer |
| US20120252682A1 (en) | 2011-04-01 | 2012-10-04 | Maples Corporate Services Limited | Methods and systems for sequencing nucleic acids |
| KR101291668B1 (en) | 2011-04-21 | 2013-08-01 | 서울대학교산학협력단 | Shuttle Vectors for Mycobacteria-Escherichia coli and Uses Thereof |
| WO2012174294A1 (en) | 2011-06-15 | 2012-12-20 | Hill's Pet Nutrition, Inc. | Compositions and methods for diagnosing and monitoring hyperthyroidism in a feline |
| US20140275211A1 (en) | 2011-06-21 | 2014-09-18 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Assays and methods for determining activity of a therapeutic agent in a subject |
| WO2013024175A2 (en) | 2011-08-17 | 2013-02-21 | Technische Universität München | Diagnostic means and methods for type 2 diabetes |
| GB201206209D0 (en) | 2012-04-06 | 2012-05-23 | Univ Leuven Kath | Marker gene based diagnosis, staging and prognosis of prostate caner |
| FR2981088B1 (en) | 2011-10-06 | 2013-11-29 | Biomerieux Sa | RNA POLYMERASES MUTEES |
| BR112014014907A2 (en) | 2011-12-19 | 2017-06-13 | Hills Pet Nutrition Inc | compositions and methods for diagnosis and treatment of hyperthyroidism in pet animals |
| ES2776673T3 (en) | 2012-02-27 | 2020-07-31 | Univ North Carolina Chapel Hill | Methods and uses for molecular tags |
| CA2865575C (en) | 2012-02-27 | 2024-01-16 | Cellular Research, Inc. | Compositions and kits for molecular counting |
| ES2928691T3 (en) | 2012-05-21 | 2022-11-22 | Scripps Research Inst | Sample preparation methods |
| US10289800B2 (en) | 2012-05-21 | 2019-05-14 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Processes for calculating phased fetal genomic sequences |
| US9206417B2 (en) | 2012-07-19 | 2015-12-08 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Multiplexed sequential ligation-based detection of genetic variants |
| FR3000966B1 (en) | 2013-01-11 | 2016-10-28 | Biomerieux Sa | METHOD FOR ESTABLISHING IN VITRO A PROGNOSIS OF SEVERITY IN A SEPTIC SHOCK PATIENT |
| KR101403507B1 (en) | 2013-03-21 | 2014-06-09 | 주식회사 현일바이오 | Methods for Selectively Detecting Mycobacterium tuberculosis complex and Nontuberculous mycobacteria and Kits Using the Same |
| KR101507505B1 (en) | 2013-04-18 | 2015-04-07 | 사회복지법인 삼성생명공익재단 | A Method for Diagnosing Myotonic Dystrophy Type 1 |
| CN104178562B (en) | 2013-05-21 | 2018-11-09 | 生物梅里埃股份公司 | A kind of colorectal cancer prognosis kit |
| JP6426162B2 (en) | 2013-06-13 | 2018-11-21 | アリオサ ダイアグノスティックス インコーポレイテッドＡｒｉｏｓａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． | Method of noninvasively calculating the risk of fetal sex chromosome aneuploidy |
| WO2015018943A2 (en) | 2013-08-08 | 2015-02-12 | Institut Pasteur | Correlation of disease activity with clonal expansions of human papillomavirus 16-specific cd8+ t-cells in patients with severe erosive oral lichen planus |
| SG10201806890VA (en) | 2013-08-28 | 2018-09-27 | Cellular Res Inc | Massively parallel single cell analysis |
| CN105940115B (en) | 2013-11-15 | 2021-07-06 | 巴斯德研究所 | Molecular marker of plasmodium falciparum artemisinin resistance |
| GB201322034D0 (en) | 2013-12-12 | 2014-01-29 | Almac Diagnostics Ltd | Prostate cancer classification |
| EP3913066A1 (en) | 2014-09-09 | 2021-11-24 | Igenomx International Genomics Corporation | Compositions for rapid nucleic acid library preparation |
| KR101718800B1 (en) | 2015-01-21 | 2017-03-24 | 주식회사 디알나노 | Nanocomplexs for Co-delivering a Drug and siRNA and Uses Thereof |
| GB201510684D0 (en) | 2015-06-17 | 2015-08-05 | Almac Diagnostics Ltd | Gene signatures predictive of metastatic disease |
| RU2706203C1 (en) | 2015-10-18 | 2019-11-14 | Эффиметрикс, Инк. | Multi-allelic genotyping of single nucleotide polymorphisms and indel mutations |
| KR101651817B1 (en) | 2015-10-28 | 2016-08-29 | 대한민국 | Primer set for Preparation of NGS library and Method and Kit for making NGS library using the same |
| KR101845957B1 (en) | 2016-02-23 | 2018-04-05 | 전남대학교기술지주회사(주) | Kit for diagnosis of leukemia and diagnostic method targeting prohibitin gene |
| GB201605110D0 (en) | 2016-03-24 | 2016-05-11 | Mologic Ltd | Detecting sepsis |
| ES2919927T3 (en) | 2016-08-10 | 2022-07-29 | Pasteur Institut | Methods and reagents for the detection of piperaquine-resistant Plasmodium falciparum malaria |
| KR101936799B1 (en) | 2017-01-09 | 2019-01-11 | 주식회사 엠이티라이프사이언스 | Pharmaceutical Composition for Treating Oral Precancer and Method for Predicting or Detecting of Oral Precancer or Oral Cancer |
| WO2018202864A1 (en) | 2017-05-05 | 2018-11-08 | bioMérieux | Method for detecting an immune cellular response |
| CN110914448A (en) | 2017-06-02 | 2020-03-24 | 昂飞股份有限公司 | Array-based method for analyzing mixed samples using differentially labeled allele-specific probes |
| US11441174B2 (en) | 2017-06-02 | 2022-09-13 | Affymetrix, Inc. | Array-based methods for analysing mixed samples using differently labelled allele-specific probes |
| KR101956315B1 (en) | 2017-07-19 | 2019-03-08 | 국민대학교 산학협력단 | miR494 as a biomarker for parkinson’s disease and diagnostic kit using thereof |
| WO2019017680A2 (en) | 2017-07-19 | 2019-01-24 | 국민대학교 산학협력단 | miRNA AS BIOMARKER FOR PARKINSON'S DISEASE AND DIAGNOSTIC KIT USING SAME |
| EP3707278A1 (en) | 2017-11-09 | 2020-09-16 | Alnylam Pharmaceuticals Inc. | Assays and methods for determining expression of the lect2 gene |
| FR3080185A1 (en) | 2018-04-16 | 2019-10-18 | Biomerieux | EVALUATION OF THE RISK OF COMPLICATION IN A PATIENT SUSPECTED TO HAVE AN INFECTION HAVING A SOFA SCORE LESS THAN TWO |
| FR3085689A1 (en) | 2018-09-12 | 2020-03-13 | Biomerieux | PROCESS FOR DETERMINING IN VITRO OR EX VIVO THE IMMUNE STATUS OF AN INDIVIDUAL |
| WO2020002602A1 (en) | 2018-06-29 | 2020-01-02 | bioMérieux | Method for determining in vitro or ex vivo the immune status of an individual |
| WO2020113237A1 (en) | 2018-11-30 | 2020-06-04 | Caris Mpi, Inc. | Next-generation molecular profiling |
| GB201902458D0 (en) | 2019-02-22 | 2019-04-10 | Mologic Ltd | Treatment stratification for an excerbation of inflamation |
| EP3708678A1 (en) | 2019-03-15 | 2020-09-16 | Adisseo France S.A.S. | Process for identifying a stress state in a subject |
| CN114051537A (en) | 2019-04-17 | 2022-02-15 | 艾基诺米公司 | Improved method for early diagnosis of uterine leiomyoma and leiomyosarcoma |
| FR3101358A1 (en) | 2019-09-27 | 2021-04-02 | Bioaster | Method for determining the risk of occurrence of an infection associated with care in a patient |
| WO2021064327A1 (en) | 2019-10-01 | 2021-04-08 | bioMérieux | Method for determining an individual's ability to respond to a stimulus |
| FR3101423A1 (en) | 2019-10-01 | 2021-04-02 | bioMérieux | Method for determining the ability of an individual to respond to a stimulus |
| GB201914538D0 (en) | 2019-10-08 | 2019-11-20 | Momentum Bioscience Ltd | Microorganism capture from antimicrobial-containing solution |
| WO2021112918A1 (en) | 2019-12-02 | 2021-06-10 | Caris Mpi, Inc. | Pan-cancer platinum response predictor |
| WO2021246820A1 (en) | 2020-06-05 | 2021-12-09 | 주식회사 씨젠 | Specimen transport kit for detecting respiratory pathogens and methods for detecting respiratory pathogens using same |
| FR3112210A1 (en) | 2020-07-06 | 2022-01-07 | bioMérieux | Method for determining the risk of occurrence of an infection associated with care in a patient |
| FR3112207A1 (en) | 2020-07-06 | 2022-01-07 | bioMérieux | Method for determining the risk of occurrence of an infection associated with care in a patient |
| FR3112208A1 (en) | 2020-07-06 | 2022-01-07 | bioMérieux | Method for determining the risk of occurrence of an infection associated with care in a patient |
| FR3112209A1 (en) | 2020-07-06 | 2022-01-07 | bioMérieux | Method for determining the risk of complications in a patient |
| FR3112211A1 (en) | 2020-07-06 | 2022-01-07 | bioMérieux | Method for determining the risk of occurrence of an infection associated with care in a patient |
| WO2022106795A1 (en) | 2020-11-20 | 2022-05-27 | bioMérieux | Method for classifying an individual |
| FR3125065A1 (en) | 2021-07-08 | 2023-01-13 | bioMérieux | Method and kit for detecting a replicative respiratory virus |
| WO2023075394A1 (en) | 2021-10-29 | 2023-05-04 | 주식회사 씨젠 | Sample collecting swab tool and method for detection of respiratory pathogen |
| FR3139579A1 (en) | 2022-09-09 | 2024-03-15 | bioMérieux | Method for in vitro or ex vivo detection of an immunocompromised status in a subject |
| WO2024110392A1 (en) | 2022-11-22 | 2024-05-30 | bioMérieux | New nucleic acid binding compounds and uses |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4520110A (en) | 1981-10-06 | 1985-05-28 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Fluorescent immunoassay employing a phycobiliprotein labeled ligand or receptor |
| EP0128042A3 (en) | 1983-06-06 | 1985-01-16 | Genentech, Inc. | A process for indentifying or isolating a dna sequence, and a dna hybridization probe therefor |
| CA1288073C (en) | 1985-03-07 | 1991-08-27 | Paul G. Ahlquist | Rna transformation vector |
| US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| DK171161B1 (en) | 1985-03-28 | 1996-07-08 | Hoffmann La Roche | A method for detecting the presence or absence of at least one specific nucleic acid sequence in a sample or for distinguishing two different nucleic acid sequences in this sample |
| IL86724A (en) * | 1987-06-19 | 1995-01-24 | Siska Diagnostics Inc | Method and kits for the amplification and detection of nucleic acid sequences |
| AU618965B2 (en) * | 1987-07-31 | 1992-01-16 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Selective amplification of target polynucleotide sequences |
| CA1340843C (en) * | 1987-07-31 | 1999-12-07 | J. Lawrence Burg | Selective amplification of target polynucleotide sequences |
| CA1340807C (en) * | 1988-02-24 | 1999-11-02 | Lawrence T. Malek | Nucleic acid amplification process |
| GB9807888D0 (en) | 1998-04-09 | 1998-06-10 | Chirotech Technology Ltd | Asymmetric hydrogenation |
-
1989
- 1989-12-14 AU AU48296/90A patent/AU4829690A/en not_active Abandoned
- 1989-12-14 ZA ZA899593A patent/ZA899593B/en unknown
- 1989-12-14 BR BR898907830A patent/BR8907830A/en not_active IP Right Cessation
- 1989-12-14 KR KR1019900701772A patent/KR0148265B1/en not_active IP Right Cessation
- 1989-12-14 WO PCT/US1989/005631 patent/WO1990006995A1/en active IP Right Grant
- 1989-12-14 RU SU4895764A patent/RU2107729C1/en active
- 1989-12-14 CA CA002005589A patent/CA2005589C/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-14 HU HU1165/90A patent/HU216105B/en unknown
- 1989-12-14 JP JP50187990A patent/JP3152927B2/en not_active Expired - Lifetime
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