FR3139579A1 - Method for in vitro or ex vivo detection of an immunocompromised status in a subject - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un procédé de détection in vitro ou ex vivo d’un statut immunodéprimé chez un sujet, comprenant la quantification, dans un échantillon biologique dudit sujet, de l’expression d’au moins 2 gènes cibles sélectionnés dans le groupe constitué par TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2 ; et l’identification de la présence ou non d’une variation de leur expression par comparaison à une valeur de référence ; ainsi que les outils pour le mettre en œuvre et les utilisations de ceux-ci.The present invention relates to a method for in vitro or ex vivo detection of an immunocompromised status in a subject, comprising the quantification, in a biological sample of said subject, of the expression of at least 2 target genes selected from the group consisting of TAP2, C3AR1, CD177 and IL1R2; and identifying the presence or absence of a variation in their expression compared to a reference value; as well as the tools to implement it and the uses thereof.
Description
La présente invention concerne un procédé de détectionin vitroouex vivode la présence ou de l’absence d’un statut immunodéprimé chez un sujet comprenant une étape de quantification, dans un échantillon biologique dudit sujet, de l’expression d’au moins 2 gènes cibles sélectionnés dans le groupe constitué par TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2, et une étape de comparaison de l’expression de chacun des gènes respectivement à une valeur de référence de sorte à identifier la présence ou non d’une variation de l’expression.The present invention relates to a method for detecting in vitro or ex vivo the presence or absence of an immunocompromised status in a subject comprising a step of quantifying, in a biological sample of said subject, the expression of at least 2 target genes selected from the group consisting of TAP2, C3AR1, CD177 and IL1R2, and a step of comparing the expression of each of the genes respectively to a reference value so as to identify the presence or absence of a variation in the 'expression.
Le sepsis touche près de 50 millions de personnes dans le monde chaque année, dont plus de 40% sont des enfants de moins de 5 ans. Il s’agit d’une des principales causes de décès dans le monde avec plus de 11 millions de décès chaque année. Pourtant, la majorité de ces décès sont évitables. En Europe, on estime que le sepsis est responsable chaque année de près de 700 000 décès, dont près de 57 000 décès en France avec un coût moyen d’environ 16 000 € par hospitalisation.Sepsis affects nearly 50 million people worldwide each year, more than 40% of whom are children under 5 years old. It is one of the leading causes of death worldwide with more than 11 million deaths each year. However, the majority of these deaths are preventable. In Europe, it is estimated that sepsis is responsible for nearly 700,000 deaths each year, including nearly 57,000 deaths in France with an average cost of around €16,000 per hospitalization.
Le sepsis est une réponse inflammatoire systémique à une infection (bactérienne, virale, fongique ou parasitaire) qui se définit comme un état aigu de dysrégulation de la réponse de l’organisme à cette infection entraînant la perte de fonction des organes et un risque vital pour le patient, et dont la forme la plus grave est le choc septique. Le sepsis s’accompagne d’une production exacerbée de médiateurs inflammatoires. On parle par exemple d’un « orage cytokinique » pour évoquer la production massive de cytokines (médiateurs chimiques qui permettent la communication entre nos cellules), qui affectent le fonctionnement des organes vitaux de manière aigue, et peuvent entrainer des séquelles fonctionnelles à plus long terme. Les patients atteints de sepsis sont généralement admis en soins intensifs, où ils reçoivent notamment des antibiotiques et les supports nécessaires au maintien des fonctions vitales. Toutefois, depuis plus de vingt ans, malgré des progrès considérables accomplis dans la compréhension de la physiopathologie associée au sepsis, aucune nouvelle thérapie spécifique au sepsis n’a vu le jour.Sepsis is a systemic inflammatory response to an infection (bacterial, viral, fungal or parasitic) which is defined as an acute state of dysregulation of the body's response to this infection leading to loss of organ function and a vital risk for the patient, and the most serious form of which is septic shock. Sepsis is accompanied by an exacerbated production of inflammatory mediators. For example, we speak of a “cytokine storm” to evoke the massive production of cytokines (chemical mediators which allow communication between our cells), which affect the functioning of vital organs in an acute manner, and can lead to longer-term functional after-effects. term. Patients with sepsis are generally admitted to intensive care, where they receive antibiotics and the supports necessary to maintain vital functions. However, for more than twenty years, despite considerable progress in understanding the pathophysiology associated with sepsis, no new therapy specific to sepsis has emerged.
La grande hétérogénéité des patients est pointée du doigt comme la principale raison expliquant l’échec de décennies de stratégies de traitement, dont les stratégies anti-inflammatoires, dans le sepsis. Cela souligne le besoin crucial de stratification des patients et d’une approche plus individualisée.The great heterogeneity of patients is singled out as the main reason explaining the failure of decades of treatment strategies, including anti-inflammatory strategies, in sepsis. This highlights the crucial need for patient stratification and a more individualized approach.
En ce qui concerne la physiopathologie du sepsis, après l’inflammation initiale, une immunosuppression persistante a été décrite à plusieurs reprises et il a été constaté qu’elle avait des conséquences néfastes sur les patients (augmentation du risque infectieux nosocomial, du risque de mortalité et de la durée de séjour) et sur les coûts des soins de santé. Par conséquent, une immunostimulation adjuvante est désormais envisagée pour contrebalancer cette réponse immunosuppressive et restaurer les fonctions immunitaires des patients. Cependant, cette nouvelle approche repose sur la capacité à identifier ou à enrichir les groupes de patients présentant les fonctions les plus immunosupprimées. Comme il n’existe pas de signe clinique d’immunosuppression, la stratification des patients doit être basée sur des biomarqueurs immunitaires.Regarding the pathophysiology of sepsis, after the initial inflammation, persistent immunosuppression has been repeatedly described and found to have adverse consequences on patients (increased nosocomial infection risk, mortality risk and length of stay) and health care costs. Therefore, adjuvant immunostimulation is now considered to counterbalance this immunosuppressive response and restore patients' immune functions. However, this new approach relies on the ability to identify or enrich the groups of patients with the most immunosuppressed functions. As there are no clinical signs of immunosuppression, patient stratification should be based on immune biomarkers.
Les monocytes sont par nature des cellules extrêmement « plastiques ». Ainsi, tout au long de la progression d’une maladie, les monocytes peuvent être alternativement des cellules pro- et anti-inflammatoires. La résultante de ces forces pro- et anti inflammatoires qui agissent sur les monocytes à un moment donné peut globalement être reflétée par le niveau d’expression du mHLA-DR à leur surface.Monocytes are by nature extremely “plastic” cells. Thus, throughout the progression of a disease, monocytes can alternately be pro- and anti-inflammatory cells. The result of these pro- and anti-inflammatory forces acting on monocytes at a given time can generally be reflected by the level of expression of mHLA-DR on their surface.
Par conséquent, un des tests de référence pour suivre les altérations immunitaires chez les patients en unité de soins intensifs (e.g. patients atteints de sepsis, de traumatismes, ayant subi une chirurgie lourde, brûlés, ou patients atteints de pancréatites) est la diminution de l’expression d’un récepteur de surface appartenant au complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe II, à savoir le HLA-DR (human leucocyte antigen-D related), à la surface des monocytes (mHLA-DR), mesurée par cytométrie en flux. En effet, ce marqueur fournit des informations précieuses en terme de prédiction de mortalité ou encore de l’évaluation du risque d’infections secondaires chez ces patients (Venetet al.(2018) Nat Rev Nephrol 2018;14:121–137). Consequently, one of the reference tests for monitoring immune alterations in patients in intensive care units (eg patients with sepsis, trauma, having undergone major surgery, burns, or patients with pancreatitis) is the reduction in expression of a surface receptor belonging to the major histocompatibility complex (MHC) class II, namely HLA-DR ( human leukocyte antigen-D related ), on the surface of monocytes (mHLA-DR), measured by flow cytometry. Indeed, this marker provides valuable information in terms of mortality prediction or even the assessment of the risk of secondary infections in these patients (Venet et al. (2018) Nat Rev Nephrol 2018;14:121–137) .
La mesure de l’expression du mHLA-DR est une méthode connue dans la littérature pour identifier si un patient, par exemple atteint de sepsis, est immunodéprimé ou non (Monneret et Venet (2016) Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 90B:376-386). Grâce à une mesure standardisée, un seuil de décision clinique a été proposé, à savoir un mHLA-DR d’au moins 5000 anticorps liés par cellule (en anglais :antibodies bound per cellouAB/C), comme par exemple 8000 AB/C, et utilisé pour identifier les patients immunodéprimés en soins intensifs.Measuring mHLA-DR expression is a method known in the literature to identify whether a patient, for example suffering from sepsis, is immunocompromised or not (Monneret and Venet (2016) Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 90B:376 -386). Thanks to a standardized measurement, a clinical decision threshold has been proposed, namely an mHLA-DR of at least 5000 antibodies bound per cell (in English: antibodies bound per cell or AB/C ), such as for example 8000 AB/ C, and used to identify immunocompromised patients in intensive care.
À ce jour, la mesure du mHLA-DR est basée sur la cytométrie en flux, une technologie qui ne peut pas être mise en œuvre dans tous les sites hospitaliers pour la routine clinique en raison de nombreuses limitations. En effet, la cytométrie en flux présente des contraintes pré-analytiques et nécessite des techniciens qualifiés pour exploiter et interpréter les résultats. De plus, les carences en termes d’implantation des cytomètres en flux dans les hôpitaux n’est pas compensée par une accessibilité 24h/24 et 7j/7 lorsqu’ils sont présents (Monneret et Venet (2014),Crit Care 18:102). Enfin, c’est une technologie qui demande du temps dont on ne que rarement lorsque le patient est en service de réanimation ou en unités de soins intensifs.To date, mHLA-DR measurement is based on flow cytometry, a technology that cannot be implemented in all hospital sites for clinical routine due to numerous limitations. Indeed, flow cytometry presents pre-analytical constraints and requires qualified technicians to use and interpret the results. Furthermore, the deficiencies in terms of implementation of flow cytometers in hospitals are not compensated by 24/7 accessibility when they are present (Monneret and Venet (2014), Crit Care 18:102 ). Finally, it is a technology that requires time, which is rarely available when the patient is in the intensive care unit or intensive care units.
Pour pallier ces inconvénients, d'autres biomarqueurs, utilisant des outils de biologie moléculaire, ont été proposés. Par exemple, on peut citer un biomarqueur basé sur le ratio du niveau d'expression, au niveau ARN messager (ARNm), de CD74 au jour J3 (suivant l'admission du patient au sein d'une structure médicale) sur le niveau d'expression de CD74 au jour J1. Le CD74 représente la chaîne invariante γ du HLA-DR. Il a été montré que le ratio d'expression CD74 J3/J1 est associé avec l'apparition d'infections secondaires acquises en soins intensifs (Peronnetet al.(2017) Intensive Care Medicine ;43(7):1013-20).To overcome these drawbacks, other biomarkers, using molecular biology tools, have been proposed. For example, we can cite a biomarker based on the ratio of the expression level, at the messenger RNA (mRNA) level, of CD74 on day D3 (following the patient's admission to a medical structure) to the level of expression of CD74 on day D1. CD74 represents the invariant γ chain of HLA-DR. It has been shown that the CD74 J3/J1 expression ratio is associated with the appearance of secondary infections acquired in intensive care (Peronnet et al. (2017) Intensive Care Medicine;43(7):1013-20).
Il a également été proposé, dans le document WO2013/156627, une méthode de détermination du statut immunodéprimé ou non-immunodéprimé, à partir de la détermination de la charge en anellovirus, dans un échantillon biologique.It has also been proposed, in document WO2013/156627, a method for determining the immunocompromised or non-immunocompromised status, based on the determination of the anellovirus load, in a biological sample.
En parallèle, un prototype d’outil moléculaire multiplex permettant d’évaluer sur une plateforme automatisée l’expression d’un ensemble de 16 biomarqueurs, notamment des ARNm, a été mis en œuvre pour identifier le profil immunitaire de patients. (Tawfiket al.(2020) JID 2020 :222 (suppl 2)). Cependant, les biomarqueurs ne sont pas issus d’une étude sur cohorte dédiée et ne sont donc pas suffisamment fiables pour discriminer et stratifier les patients. De plus, les performances obtenues nécessitent d’être améliorées et aucune corrélation n’est faite entre les expressions des différents biomarqueurs et une valeur du mHLA-DR caractéristique de l’immunocompétence.In parallel, a prototype multiplex molecular tool making it possible to evaluate the expression of a set of 16 biomarkers, notably mRNAs, on an automated platform, was implemented to identify the immune profile of patients. (Tawfik et al. (2020) JID 2020:222 (suppl 2)). However, the biomarkers are not derived from a dedicated cohort study and are therefore not sufficiently reliable to discriminate and stratify patients. Furthermore, the performances obtained need to be improved and no correlation is made between the expressions of the different biomarkers and an mHLA-DR value characteristic of immunocompetence.
A ce jour, plusieurs gènes sont identifiés comme un lien potentiel avec le statut immunitaire chez un sujet. A titre d’exemple,
- le gène TAP2 (Antigen peptide transporter 2) code pour une protéine associée aux membranes de la superfamille des transporteurs ABC (ATP-binding cassette), qui est impliquée dans le transport de peptides du cytoplasme au réticulum endoplasmique dans le cadre du processus de présentation de l’antigène des molécules de classe I. L’expression du transcrit de ce gène a par ailleurs été étudiée chez des patients septiques, chez lesquels il a été montré qu’elle permettait d’identifier des patients avec un endotype particulier associé à la survenue du décès à 28 jours (Sciclunaet al.(2017), Lancet Respir Med 5(10) : 816-826) ;
- le gène C3AR1 (complement component 3a receptor 1) code pour le récepteur du complément C3a, une protéine relarguée lors de l’activation du complément. La liaison de l’anaphylatoxin C3a sur son récepteur active la chimiotaxie et l’opsonisation des bactéries. Dans la littérature, il a été montré que le transcrit du gène C3AR1 était plus fortement exprimé chez les patients septiques que chez des volontaires sains (Napieret al.(2016) J. Exp. Med. 213(11):2365-2382) ;
- le gène CD177 code pour la glucoprotéine de membrane des neutrophiles CD177, découverte en 1971 chez un cas de neutropénie néonatale. Il a été mis en évidence dans une étude une augmentation du niveau d’expression de CD177, au niveau ARNm et protéine, dans les neutrophiles circulants de patients ayant eu un choc septique (Demaretet al.(2016), Immunol. Letters 178 :122-130) ;
- le gène IL1R2 code pour un récepteur de l’interleukine-1, et plus particulièrement l’interleukine-1α (IL1A) et l’interleukine-1β (IL1B), qui transmettent des signaux intracellulaires via des voies partagées par d’autres récepteurs comme le récepteur de l’Interleukine 18 (IL18), entrainant la sécrétion de facteurs médiateurs de l’inflammation. Le récepteur IL1R2 est décrit comme un récepteur « leurre », qui fixe IL1A et IL1B et les empêche donc de se lier à leurs récepteurs réguliers, ce qui se traduit par une inhibition de la traduction du signal médiée normalement par ces interleukines. Le transcrit d’IL1R2, a été identifié comme différentiellement exprimé dans les neutrophiles de patients septiques dans une étude bioinformatique (Heet al.(2019) 35(6):481-490). IL1R2 a été proposé comme marqueur de diagnostic du sepsis, sur la base de résultats de mesure de la concentration sérique d’IL1R2 chez des volontaires sains et des patients septiques (Langet al.(2017) Shock 47(1):119-124). Des analyses par immunoprécipitation de chromatine ont montré des différences au niveau de la chromatine (méthylation et acétylation des histones) du promoteur du gène d’IL1R2 entre des patients septiques et des volontaires sains (Weitereret al.(2015) PLoS One 10(3):e0121748).To date, several genes have been identified as a potential link with the immune status in a subject. For exemple,
- the TAP2 ( Antigen peptide transporter 2 ) gene encodes a membrane-associated protein of the ABC transporter ( ATP-binding cassette ) superfamily, which is involved in the transport of peptides from the cytoplasm to the endoplasmic reticulum as part of the presentation process of the antigen of class I molecules. The expression of the transcript of this gene has also been studied in septic patients, in whom it has been shown that it makes it possible to identify patients with a particular endotype associated with occurrence of death at 28 days (Scicluna et al. (2017), Lancet Respir Med 5(10): 816-826);
- the C3AR1 gene ( complement component 3a receptor 1 ) codes for the complement receptor C3a, a protein released during complement activation. Binding of anaphylatoxin C3a to its receptor activates chemotaxis and opsonization of bacteria. In the literature, it was shown that the C3AR1 gene transcript was more highly expressed in septic patients than in healthy volunteers (Napier et al. (2016) J. Exp. Med. 213(11):2365-2382) ;
- the CD177 gene codes for the neutrophil membrane glucoprotein CD177, discovered in 1971 in a case of neonatal neutropenia. In a study, an increase in the level of expression of CD177, at the mRNA and protein level, was demonstrated in the circulating neutrophils of patients who had septic shock (Demaret et al. (2016), Immunol. Letters 178: 122-130);
- the IL1R2 gene codes for an interleukin-1 receptor, and more particularly interleukin-1α (IL1A) and interleukin-1β (IL1B), which transmit intracellular signals via pathways shared by other receptors such as the Interleukin 18 (IL18) receptor, leading to the secretion of factors mediating inflammation. The IL1R2 receptor is described as a “decoy” receptor, which binds IL1A and IL1B and therefore prevents them from binding to their regular receptors, which results in inhibition of signal translation normally mediated by these interleukins. The IL1R2 transcript was identified as differentially expressed in neutrophils of septic patients in a bioinformatics study (He et al. (2019) 35(6):481-490). IL1R2 has been proposed as a diagnostic marker for sepsis, based on results of measuring serum IL1R2 concentration in healthy volunteers and septic patients (Lang et al. (2017) Shock 47(1):119-124 ). Chromatin immunoprecipitation analyzes showed differences in chromatin (histone methylation and acetylation) of the IL1R2 gene promoter between septic patients and healthy volunteers (Weiterer et al. (2015) PLoS One 10(3 ):e0121748).
Bien que ces marqueurs soient décrits individuellement, à ce jour, aucune étude n’a mis en évidence de lien suffisamment robuste entre leurs expressions combinées et l’immunodépression des patients, de même qu’aucune corrélation n’a été démontrée entre ces marqueurs et ceux de l’immunosuppression communément utilisés, tels que l’expression de HLA-DR à la surface des monocytes, le pourcentage des cellules T régulatrices ou le nombre de cellules T CD4+ (Demaretet al.(2016) Immunology Letters 178:122–130). En d’autres termes, il n’existe pas d’alternative aux techniques de cytométrie en flux.Although these markers are described individually, to date, no study has demonstrated a sufficiently robust link between their combined expressions and the immunosuppression of patients, just as no correlation has been demonstrated between these markers and those of commonly used immunosuppression, such as the expression of HLA-DR on the surface of monocytes, the percentage of regulatory T cells or the number of CD4+ T cells (Demaret et al. (2016) Immunology Letters 178:122– 130). In other words, there is no alternative to flow cytometry techniques.
Il subsiste donc un besoin évident d’identifier un moyen fiable (i.e. présentant une sensibilité et/ou une spécificité acceptable) et rapide, qui soit également facile à lire/interpréter, simple d’utilisation et intégrable en routine clinique, afin de statuer sur l’état immunitaire du patient, notamment pour identifier l’immunosuppression.There therefore remains an obvious need to identify a reliable (i.e. presenting acceptable sensitivity and/or specificity) and rapid means, which is also easy to read/interpret, simple to use and integrable into clinical routine, in order to rule on the patient's immune status, particularly to identify immunosuppression.
Après de nombreuses recherches, il est du mérite des inventeurs d’avoir pu identifier, de manière inattendue et surprenante, une signature de plusieurs gènes dont l’expression dérégulée est caractéristique d’un statut immunodéprimé.After much research, it is to the merit of the inventors to have been able to identify, in an unexpected and surprising manner, a signature of several genes whose deregulated expression is characteristic of an immunocompromised status.
Un objectif de la présente invention est d’identifier les mêmes patients immunodéprimés, notamment en service de soins intensifs, que ceux caractérisés par une expression mHLA-DR <8 000 anticorps liés/cellule (AB/C).An objective of the present invention is to identify the same immunocompromised patients, particularly in intensive care units, as those characterized by mHLA-DR expression <8,000 bound antibodies/cell (AB/C).
Ainsi, un premier objet de la présente invention concerne un procédé de détectionin vitroouex vivod’un statut immunodéprimé chez un sujet , comprenant les étapes suivantes :
a. Quantification, dans un échantillon biologique dudit sujet, de l’expression d’au moins 2 gènes cibles sélectionnés dans le groupe constitué par TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2 ;
b. Comparaison de l’expression de chacun des gènes respectivement à une valeur de référence de sorte à identifier la présence ou non d’une variation de l’expression.Thus, a first subject of the present invention relates to a method for in vitro or ex vivo detection of an immunocompromised status in a subject, comprising the following steps:
has. Quantification, in a biological sample from said subject, of the expression of at least 2 target genes selected from the group consisting of TAP2, C3AR1, CD177 and IL1R2;
b. Comparison of the expression of each of the genes respectively with a reference value so as to identify the presence or absence of a variation in expression.
La présente invention présente donc divers avantages, notamment le fait de permettre une généralisation de l’immunosurveillance des sujets, comme celle des patients en soins intensifs, de manière simple et rapide au moyen d’une technologie (outils et procédé) qui peut être mise en œuvre sur tous les sites hospitaliers, à l’inverse de la cytométrie en flux. La présente invention permet également d’identifier les patients immunodéprimés, pour lesquels il serait pertinent d'administrer des traitements immunostimulants dans le cadre d’essais cliniques, et de permettre ainsi de démontrer l’efficacité de tels traitements. En outre, l’invention ouvre la voie à la médecine personnalisée chez les patients, notamment ceux en soins intensifs.The present invention therefore presents various advantages, in particular the fact of allowing a generalization of the immunomonitoring of subjects, such as that of patients in intensive care, in a simple and rapid manner by means of a technology (tools and method) which can be implemented implemented on all hospital sites, unlike flow cytometry. The present invention also makes it possible to identify immunocompromised patients, for whom it would be relevant to administer immunostimulating treatments in the context of clinical trials, and thus make it possible to demonstrate the effectiveness of such treatments. In addition, the invention paves the way for personalized medicine in patients, particularly those in intensive care.
A la connaissance des inventeurs, il n'a jamais été décrit ni suggéré que la mise en évidence d’une variation de l’expression d’au moins 2 gènes cibles sélectionnés dans le groupe constitué par les gènes TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2 permet de détecter,in vitroouex vivo, un statut immunodéprimé chez un sujet. De surcroît, il n'a jamais été décrit ni suggéré que le résultat de cette détection est corrélé avec une quantification de l’expression du HLA-DR à la surface des monocytes (mHLA-DR) inférieure à 8000 AB/C, avantageusement inférieure à 7500 AB/C , inférieure à 7500 AB/C, de préférence inférieure à 7000 AB/C, inférieure à 6500 AB/C, voire même inférieure à 6000 AB/C, inférieure à 5500 AB/C ou encore inférieure à 5000 AB/C, mesurée par cytométrie en flux.To the knowledge of the inventors, it has never been described or suggested that the demonstration of a variation in the expression of at least 2 target genes selected from the group consisting of the TAP2, C3AR1, CD177 and IL1R2 genes makes it possible to detect, in vitro or ex vivo , an immunocompromised status in a subject. Furthermore, it has never been described or suggested that the result of this detection is correlated with a quantification of the expression of HLA-DR on the surface of monocytes (mHLA-DR) lower than 8000 AB/C, advantageously lower at 7500 AB/C, less than 7500 AB/C, preferably less than 7000 AB/C, less than 6500 AB/C, or even less than 6000 AB/C, less than 5500 AB/C or even less than 5000 AB /C, measured by flow cytometry.
Les gènes cibles dont l’expression est quantifiée dans le procédé objet de la présente invention sont connus de la personne du métier et les localisations chromosomiques sont notamment données dans le tableau 1 ci-dessous.The target genes whose expression is quantified in the process which is the subject of the present invention are known to those skilled in the art and the chromosomal locations are given in particular in Table 1 below.
Dans le cadre de l’invention, et par opposition à un statut immunitaire normal, qualifié d’immunocompétent, les expressions « immunodéprimé », « immunosupprimé », « immunodéficient », « statut immunitaire hypoactif » ou « paralysie immunitaire » sont utilisées indifféremment et désignent un système immunitaire/une réponse immunitaire moins actif que la normale en réponse à une infection ou un état inflammatoire. En particulier, il s’agit d’une immunodépression caractérisée par une altération des réponses immunitaires innées et adaptatives, notamment une apoptose accrue et un dysfonctionnement des lymphocytes, une altération des fonctions phagocytaires, une désactivation des monocytes avec diminution de l’expression de surface du HLA de classe II et une altération de la production de cytokines.In the context of the invention, and as opposed to a normal immune status, qualified as immunocompetent, the expressions “immunocompromised”, “immunosuppressed”, “immunodeficient”, “hypoactive immune status” or “immune paralysis” are used interchangeably and refer to an immune system/immune response that is less active than normal in response to an infection or inflammatory condition. In particular, it is an immunosuppression characterized by an impairment of innate and adaptive immune responses, including increased apoptosis and lymphocyte dysfunction, impaired phagocytic functions, deactivation of monocytes with decreased surface expression. HLA class II and altered cytokine production.
Dans le cadre de l’invention, le terme « sujet » désigne un être humain et de préférence, le sujet est un patient. Le patient est défini comme une personne entrée en contact avec un professionnel de santé, notamment un médecin, une structure médicale ou un établissement de santé.In the context of the invention, the term “subject” designates a human being and preferably, the subject is a patient. The patient is defined as a person who has come into contact with a health professional, in particular a doctor, a medical structure or a health establishment.
Selon un mode de réalisation particulier, le sujet est un patient au sein d’un établissement de santé, de préférence au sein d’un hôpital, de préférence encore au sein du service des urgences, du service de réanimation, en unité de soins intensifs (USI) ou en unité de soins continus, et tout particulièrement, le sujet est un patient en USI.According to a particular embodiment, the subject is a patient within a health establishment, preferably within a hospital, more preferably within the emergency department, the intensive care unit, in an intensive care unit (ICU) or in a continuing care unit, and in particular, the subject is a patient in an ICU.
Dans le cadre de l’invention, les expressions « biomarqueur » et « marqueur » sont utilisées indifféremment et désignent une caractéristique biologique mesurable objectivement qui représente un indicateur des processus biologiques normaux ou pathologiques. Il peut s'agir en particulier d'un biomarqueur moléculaire, de préférence détectable au niveau ARNm. Plus particulièrement, le biomarqueur peut être un biomarqueur endogène ou loci, tel qu'un HERV ou un gène.In the context of the invention, the expressions “biomarker” and “marker” are used interchangeably and designate an objectively measurable biological characteristic which represents an indicator of normal or pathological biological processes. It may in particular be a molecular biomarker, preferably detectable at the mRNA level. More particularly, the biomarker may be an endogenous biomarker or loci, such as a HERV or a gene.
Le « sepsis » est une pathologie dans laquelle la réponse immunitaire est dérégulée chez un individu, suite à une infection, conduisant à une défaillance et des dysfonctions d'organes multiples et potentiellement mortelles. Le « choc septique » est un sous-type de sepsis, dans lequel une hypotension persiste, malgré un remplissage vasculaire adéquat.“Sepsis” is a condition in which the immune response is dysregulated in an individual, following an infection, leading to multiple and potentially fatal organ failure and dysfunction. “Septic shock” is a subtype of sepsis, in which hypotension persists, despite adequate vascular filling.
Dans le cadre de l’invention, l’expression « échantillon biologique » désigne tout échantillon provenant d’un sujet, et pouvant être de différentes natures, comme le sang ou ses dérivés, les expectorations, l’urine, les selles, la peau, le liquide céphalo-rachidien, le liquide de lavage broncho-alvéolaire, le liquide de ponction de la cavité abdominale, la salive, les sécrétions gastriques, le sperme, le liquide séminal, les larmes, la moelle épinière, ganglion du nerf trijumeau, tissu adipeux, tissu lymphoïde, tissu placentaire, tissu du tractus gastro-intestinal, tissu du tractus génital, tissu du système nerveux central. En particulier, cet échantillon peut être un fluide biologique, comme un échantillon de sang ou un échantillon dérivé du sang, qui peut notamment être choisi parmi le sang total (tel que collecté de la voie veineuse, c’est-à-dire contenant les cellules blanches et rouges, les plaquettes et le plasma), le plasma, le sérum, ainsi que tout(tous) type(s) de cellules extraites à partir du sang, telles que les cellules mononuclées sanguines périphériques (ou PBMC, contenant les lymphocytes (B, T et cellules NK), les cellules dendritiques et les monocytes), des sous-populations de cellules B, des monocytes purifiés, ou des neutrophiles.In the context of the invention, the expression "biological sample" designates any sample coming from a subject, and which may be of different natures, such as blood or its derivatives, sputum, urine, stools, skin. , cerebrospinal fluid, bronchoalveolar lavage fluid, abdominal cavity puncture fluid, saliva, gastric secretions, semen, seminal fluid, tears, spinal cord, trigeminal nerve ganglion, adipose tissue, lymphoid tissue, placental tissue, gastrointestinal tract tissue, genital tract tissue, central nervous system tissue. In particular, this sample may be a biological fluid, such as a blood sample or a sample derived from blood, which may in particular be chosen from whole blood (as collected from the venous route, that is to say containing the white and red cells, platelets and plasma), plasma, serum, as well as any type(s) of cells extracted from blood, such as peripheral blood mononuclear cells (or PBMCs, containing lymphocytes (B, T and NK cells), dendritic cells and monocytes), subpopulations of B cells, purified monocytes, or neutrophils.
Dans le cadre de l’invention, les expressions « valeur de référence », « valeur normale », « norme », « valeur usuelle » ou « échantillon biologique de référence » sont utilisées indifféremment et désignent une valeur ou une moyenne des valeurs d’un paramètre (e.g. expression de gène, notamment au niveau ARNm, …) issue d’un ou plusieurs sujets sains, présentant un statut immunitaire normal ou immunocompétent, c’est-à-dire un sujet dont on sait que le statut immunitaire n’est pas immunodéprimé avec notamment une valeur du mHLA-DR supérieure à 5000 AB/C, notamment supérieure à 5500 AB/C, supérieure à 6000 AB/C, supérieure à 6500 AB/C, voire même supérieure à 7000 AB/C, supérieure à 7500 AB/C, et tout particulièrement, supérieure à 8000 AB/C, que le sujet ne présente pas de réponse immunitaire altérée consécutive à une inflammation ou sepsis, par opposition à une « valeur testé », « valeur test » ou « échantillon biologique test ». La valeur de référence et la valeur test sont obtenues par la mise en œuvre du même procédé de détection, quantification, identification…In the context of the invention, the expressions "reference value", "normal value", "standard", "usual value" or "biological reference sample" are used interchangeably and designate a value or an average of the values of a parameter (e.g. gene expression, particularly at the mRNA level, etc.) from one or more healthy subjects, presenting a normal or immunocompetent immune status, that is to say a subject whose immune status is known to not be is not immunocompromised with in particular an mHLA-DR value greater than 5000 AB/C, in particular greater than 5500 AB/C, greater than 6000 AB/C, greater than 6500 AB/C, or even greater than 7000 AB/C, greater at 7500 AB/C, and in particular, greater than 8000 AB/C, that the subject does not present an altered immune response following inflammation or sepsis, as opposed to a “tested value”, “test value” or “sample biological test”. The reference value and the test value are obtained by implementing the same detection, quantification, identification process, etc.
Dans le cadre de l’invention, l’expression « variation de l’expression » désigne une surexpression ou une sous-expression du gène. En particulier :
- le terme « surexpression » signifie que l’expression d’un gène est augmentée par rapport à une valeur de référence, c’est-à-dire obtenue chez un sujet immunocompétent défini par une valeur de mHLA-DR supérieure à 5000 AB/C, notamment supérieure à 5500 AB/C, avantageusement supérieure à 6000 AB/C, en particulier supérieure à 6500 AB/C, de préférence supérieure à 7000 AB/C, notamment supérieure à 7500 AB/C, et tout particulièrement par une valeur mHLA-DR supérieure à 8000 AB/C;
- le terme « sous-expression » signifie que l’expression d’un gène est diminuée par rapport à une valeur de référence, c’est-à-dire obtenue chez un sujet immunocompétent défini par une valeur de mHLA-DR supérieure à 5000 AB/C, notamment supérieure à 5500 AB/C, avantageusement supérieure à 6000 AB/C, en particulier supérieure à 6500 AB/C, de préférence supérieure à 7000 AB/C, notamment supérieure à 7500 AB/C, et tout particulièrement par une valeur mHLA-DR supérieure à 8000 AB/C.In the context of the invention, the expression “variation in expression” designates overexpression or underexpression of the gene. Especially :
- the term “overexpression” means that the expression of a gene is increased compared to a reference value, that is to say obtained in an immunocompetent subject defined by an mHLA-DR value greater than 5000 AB/ C, in particular greater than 5500 AB/C, advantageously greater than 6000 AB/C, in particular greater than 6500 AB/C, preferably greater than 7000 AB/C, in particular greater than 7500 AB/C, and very particularly by a value mHLA-DR greater than 8000 AB/C;
- the term “underexpression” means that the expression of a gene is reduced compared to a reference value, that is to say obtained in an immunocompetent subject defined by an mHLA-DR value greater than 5000 AB/C, in particular greater than 5500 AB/C, advantageously greater than 6000 AB/C, in particular greater than 6500 AB/C, preferably greater than 7000 AB/C, in particular greater than 7500 AB/C, and very particularly by an mHLA-DR value greater than 8000 AB/C.
Les termes « codant » ou « codant pour », « code » ou « code pour » sont utilisés indifféremment et se réfèrent à la propriété inhérente aux séquences spécifiques de nucléotides dans un polynucléotide, tel qu’un gène, un ADNc ou un ARNm, à servir de matrice pour la synthèse d’autres polymères ayant une séquence définie d’acides aminés, et les propriétés biologiques qui en découlent. Ainsi, un gène code pour une protéine si la transcription et la traduction de l’ARNm correspondant à ce gène produisent la protéine dans une cellule ou un autre système biologique. Tant le brin codant, dont la séquence nucléotidique est identique à la séquence d’ARNm et qui est généralement décrite dans les listages de séquences et bases de données, que le brin non codant, utilisé comme matrice pour la transcription d’un gène ou de l’ADNc, peuvent être désignés comme codant pour la protéine ou un autre produit de ce gène ou ADNc.The terms "coding" or "coding for", "code" or "code for" are used interchangeably and refer to the inherent property of specific nucleotide sequences in a polynucleotide, such as a gene, cDNA or mRNA, to serve as a template for the synthesis of other polymers having a defined sequence of amino acids, and the biological properties which result therefrom. Thus, a gene codes for a protein if transcription and translation of the mRNA corresponding to that gene produces the protein in a cell or other biological system. Both the coding strand, whose nucleotide sequence is identical to the mRNA sequence and which is generally described in sequence listings and databases, and the non-coding strand, used as a template for the transcription of a gene or cDNA, may be designated as encoding the protein or other product of this gene or cDNA.
Dans le cadre de l’invention, l’expression « amorce d'amplification » désigne un fragment nucléotidique pouvant comprendre de 5 à 100 nucléotides, de préférence de 15 à 30 nucléotides, et possédant une spécificité d'hybridation avec une séquence nucléotidique cible, dans des conditions déterminées pour l'initiation d'une polymérisation enzymatique, par exemple dans une réaction d'amplification enzymatique de la séquence nucléotidique cible. Généralement, on utilise des « couples d'amorces », constitués de deux amorces. Lorsque l'on souhaite réaliser l'amplification de plusieurs gènes différents, plusieurs couples d'amorces différents sont de préférence utilisés, ayant préférentiellement chacun une capacité à s'hybrider spécifiquement avec un gène différent.In the context of the invention, the expression "amplification primer" designates a nucleotide fragment which may comprise from 5 to 100 nucleotides, preferably from 15 to 30 nucleotides, and which has hybridization specificity with a target nucleotide sequence, under conditions determined for the initiation of an enzymatic polymerization, for example in an enzymatic amplification reaction of the target nucleotide sequence. Generally, “pairs of primers” are used, consisting of two primers. When it is desired to carry out the amplification of several different genes, several different pairs of primers are preferably used, each preferably having the capacity to hybridize specifically with a different gene.
Dans le cadre de l’invention, l’expression « sonde d'hybridation » désigne un fragment nucléotidique comprenant typiquement de 5 à 100 nucléotides, de préférence de 15 à 90 nucléotides, de manière encore plus préférée de 15 à 35 nucléotides, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec une séquence nucléotidique cible. La sonde comporte également un rapporteur (tel qu'un fluorophore, une enzyme ou tout autre système de détection), qui va permettre la détection de la séquence nucléotidique cible. Dans la présente invention, la séquence nucléotidique cible peut être une séquence nucléotidique comprise dans un ARN messager (ARNm) ou une séquence nucléotidique comprise dans un ADN complémentaire (ADNc) obtenu par transcription inverse dudit ARNm. Lorsque l'on souhaite cibler plusieurs gènes différents, plusieurs sondes différentes sont de préférence utilisées, ayant préférentiellement chacune une capacité à s'hybrider spécifiquement avec un gène différent.In the context of the invention, the expression "hybridization probe" designates a nucleotide fragment typically comprising from 5 to 100 nucleotides, preferably from 15 to 90 nucleotides, even more preferably from 15 to 35 nucleotides, having a hybridization specificity under determined conditions to form a hybridization complex with a target nucleotide sequence. The probe also includes a reporter (such as a fluorophore, an enzyme or any other detection system), which will allow detection of the target nucleotide sequence. In the present invention, the target nucleotide sequence may be a nucleotide sequence included in a messenger RNA (mRNA) or a nucleotide sequence included in a complementary DNA (cDNA) obtained by reverse transcription of said mRNA. When it is desired to target several different genes, several different probes are preferably used, each preferably having an ability to hybridize specifically with a different gene.
Dans le cadre de l’invention, par « hybridation », on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux fragments nucléotidiques, tels que par exemple une sonde d'hybridation et un fragment nucléotidique cible, ayant des séquences suffisamment complémentaires, sont susceptibles de former un double brin avec des liaisons hydrogènes stables et spécifiques. Un fragment nucléotidique "capable de s'hybrider" avec un polynucléotide est un fragment pouvant s'hybrider avec ledit polynucléotide dans des conditions d'hybridation, qui peuvent être déterminées dans chaque cas de façon connue. Les conditions d'hybridation sont déterminées par la stringence, c'est-à-dire la rigueur des conditions opératoires. L'hybridation est d'autant plus spécifique qu'elle est effectuée à plus forte stringence. La stringence est définie notamment en fonction de la composition en bases d'un duplex sonde/cible, ainsi que par le degré de mésappariement entre deux acides nucléiques. La stringence peut également être fonction des paramètres de la réaction, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation. La stringence des conditions dans lesquelles une réaction d'hybridation doit être réalisée dépendra principalement des sondes d'hybridation utilisées. Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent être déterminées par l'homme du métier. En général, selon la longueur des sondes d'hybridation utilisées, la température pour la réaction d'hybridation est comprise entre environ 20 et 70°C, en particulier entre 35 et 65°C dans une solution saline à une concentration d'environ 0,5 à 1 M. On réalise ensuite une étape de détection de la réaction d'hybridation.In the context of the invention, by "hybridization" is meant the process during which, under appropriate conditions, two nucleotide fragments, such as for example a hybridization probe and a target nucleotide fragment, having sufficiently complementary sequences , are likely to form a double strand with stable and specific hydrogen bonds. A nucleotide fragment "capable of hybridizing" with a polynucleotide is a fragment capable of hybridizing with said polynucleotide under hybridization conditions, which can be determined in each case in a known manner. The hybridization conditions are determined by stringency, that is to say the rigor of the operating conditions. The hybridization is all the more specific as it is carried out at higher stringency. Stringency is defined in particular as a function of the base composition of a probe/target duplex, as well as by the degree of mismatch between two nucleic acids. The stringency can also be a function of the reaction parameters, such as the concentration and type of ionic species present in the hybridization solution, the nature and concentration of denaturing agents and/or the hybridization temperature. The stringency of the conditions under which a hybridization reaction must be carried out will depend primarily on the hybridization probes used. All these data are well known and the appropriate conditions can be determined by those skilled in the art. In general, depending on the length of the hybridization probes used, the temperature for the hybridization reaction is between approximately 20 and 70°C, in particular between 35 and 65°C in a saline solution at a concentration of approximately 0 .5 to 1 M. A step of detecting the hybridization reaction is then carried out.
Dans le cadre de l’invention, l’expression « réaction d'amplification enzymatique » désigne un processus générant de multiples copies d'un fragment nucléotidique cible, par l'action d'au moins une enzyme. De telles réactions d'amplification sont bien connues de l'homme du métier et on peut citer notamment les techniques suivantes :Polymerase Chain Reaction(PCR),Ligase Chain Reaction(LCR),Repair Chain Reaction(RCR),Self Sustained Sequence Replication(3SR) avec la demande de brevet WO-A-90/06995,Nucleic Acid Sequence-Based Amplification(NASBA),Transcription Mediated Amplification(TMA) avec le brevet US-A-5,399,491, etLoop mediated isothermal amplification(LAMP) avec le brevet US6410278. Lorsque la réaction d'amplification enzymatique est une PCR, on parlera plus particulièrement de RT-PCR (RT pour « reverse transcription »), lorsque l'étape d'amplification est précédée d'une étape de reverse-transcription d'ARN messager (ARNm) en ADN complémentaire (ADNc), et de qPCR ou RT-qPCR lorsque la PCR est quantitative.In the context of the invention, the expression “enzymatic amplification reaction” designates a process generating multiple copies of a target nucleotide fragment, by the action of at least one enzyme. Such amplification reactions are well known to those skilled in the art and the following techniques may be cited in particular: Polymerase Chain Reaction (PCR), Ligase Chain Reaction (LCR), Repair Chain Reaction (RCR), Self Sustained Sequence Replication ( 3SR) with patent application WO-A-90/06995, Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (NASBA), Transcription Mediated Amplification (TMA) with patent US-A-5,399,491, and Loop mediated isothermal amplification (LAMP) with patent US6410278. When the enzymatic amplification reaction is a PCR, we will speak more particularly of RT-PCR (RT for “reverse transcription”), when the amplification step is preceded by a step of reverse transcription of messenger RNA ( mRNA) into complementary DNA (cDNA), and qPCR or RT-qPCR when the PCR is quantitative.
De préférence, la présente invention a pour objet un procédé de détectionin vitroouex vivod’un statut immunitaire déprimé chez un sujet, tel que défini précédemment et présentant les caractéristiques techniques suivantes, prises seules ou en combinaisons :
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression des gènes cibles TAP2 et IL1R2 ;Preferably, the subject of the present invention is a method for in vitro or ex vivo detection of a depressed immune status in a subject, as defined above and having the following technical characteristics, taken alone or in combinations:
- step a) comprises the quantification of the expression of the target genes TAP2 and IL1R2;
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression des gènes cibles TAP2 et C3AR1 ;
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression des gènes cibles TAP2 et CD177 ;
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression des gènes cibles C3AR1 et CD177 ;
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression des gènes cibles C3AR1 et IL1R2 ;
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression des gènes cibles CD177 et IL1R2 ;
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression d’au moins 3 gènes cibles choisis dans le groupe constitué par TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2 ;
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression du gène cible TAP2 et d’au moins un autre gène cible choisi parmi C3AR1, CD177 et IL1R2 ;
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression du gène cible TAP2 et d’au moins deux autres gènes cibles choisi parmi C3AR1, CD177 et IL1R2 ;
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression des 3 gènes cibles TAP2, C3AR1 et IL1R2 ;
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression des 3 gènes cibles TAP2, C3AR1 et CD177 ;
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression des 3 gènes cibles TAP2, CD177 et IL1R2 ;
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression des 4 gènes cibles TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2 ;
- la valeur de référence correspond à l’expression dudit gène cible chez un sujet présentant un statut immunitaire normal ou un sujet dont on sait que le statut immunitaire n’est pas immunodéprimé ;
- le statut immunodéprimé est détecté sur la base d’au moins deux variations de l’expression, lesdites variations étant choisies parmi une sous-expression de TAP2, une surexpression de C3AR1, une surexpression de CD177, et une surexpression de IL1R2 ;
- le statut immunodéprimé est détecté sur la base de deux variations de l’expression, lesdites variations étant choisies parmi une sous-expression de TAP2, une surexpression de C3AR1, une surexpression de CD177, et une surexpression de IL1R2 ;
- le statut immunodéprimé est détecté sur la base de trois variations de l’expression, lesdites variations étant choisies parmi une sous-expression de TAP2, une surexpression de C3AR1, une surexpression de CD177, et une surexpression de IL1R2 ;
- le statut immunodéprimé est détecté sur la base d’une sous-expression de TAP2, d’une surexpression de C3AR1, d’une surexpression de CD177, et d’une surexpression de IL1R2 ;
- le procédé de l’invention comprend, en outre, une étape de quantification de l’expression d’au moins un gène cible additionnel sélectionné dans le groupe constitué par CD3D, CIITA, CD74, CTLA4, CX3CR1, IFNγ et S100A9 ; le statut immunodéprimé est alors en outre détecté en tenant compte d’au moins une variation d’au moins un gène cible additionnel, lesdites variations étant choisies parmi une sous-expression de CD3D, une sous-expression de CIITA, une sous-expression de CD74, une sous-expression de CTLA4, une sous-expression de CX3CR1, une surexpression de IFNγ, et une surexpression de S100A9 ;
- le procédé de l’invention comprend une étape de quantification de l’expression de l’ensemble des gènes cibles suivants : TAP2, C3AR1, CD177, IL1R2, CD3D, CIITA, CD74, CTLA4, CX3CR1, IFNγ et S100A9 ;
- le sujet est un patient, notamment un patient gravement malade en état septique, plus particulièrement, en choc septique ; atteint de brûlures, plus particulièrement, de brûlures graves ; atteint de traumatismes, plus particulièrement, de traumatismes graves ; ou opéré par chirurgie, plus particulièrement, une chirurgie lourde ;
- l’échantillon biologique est un échantillon de sang ;
- l’échantillon biologique est un échantillon de sang total ;
- l’échantillon biologique est un échantillon issu d’un patient au sein du service des urgences, du service de réanimation, en unité de soins intensifs (USI) ou en unité de soins continus, et de préférence, d’un patient en USI ;
- l'échantillon biologique test et/ou l'échantillon biologique de référence selon l'invention est un échantillon de sang, de préférence un échantillon de sang total, de plasma ou de sérum, ou un échantillon de cellules mononucléées sanguines périphériques, extraites à partir d'un échantillon de sang ;
- la valeur de référence d’un gène cible correspond à l’expression dudit gène cible chez un sujet présentant un statut immunitaire normal défini par une valeur de mHLA-DR supérieure à 5000 AB/C, notamment supérieure à 5500 AB/C, avantageusement supérieure à 6000 AB/C, en particulier supérieure à 6500 AB/C, de préférence supérieure à 7000 AB/C, notamment supérieure à 7500 AB/C, et tout particulièrement par une valeur mHLA-DR supérieure à 8000 AB/C ;
- l’expression des gènes cibles est quantifiée au niveau transcrit ARN ou ARN messager (ARNm ) ;
- l’expression des gènes cibles est mesurée au niveau ADN ou ADN complémentaire (ADNc) ;
- l’expression des gènes cibles est mesurée par la mise en œuvre d’une méthode de détection moléculaire et/ou quantification directe par tout procédé connu de l'Homme du métier permettant de déterminer la présence d’un transcrit ARNm dans un échantillon telles que des méthodes d'hybridation, de préférence avec une puce d'hybridation, par hybridationin situou parNorthern blot; des méthodes d'amplification, de préférence parReverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction(RT-PCR), de préférence encore par RT-PCR quantitative (RT-qPCR), notamment la PCR emboîtée (ou PCR nichée,nested PCR), les réactions de PCR peuvent également être multiplexées ; des méthodes de séquençage, de préférence par séquençage haut débit ;
- la quantification de l’expression des gènes cibles est réalisée par RT-PCR, par séquençage ou par hybridation. De préférence, la quantification est réalisée par RT-PCR, et notamment par RT-qPCR ;
- l’expression des gènes cibles est mesurée par la mise en œuvre d’une méthode de détection et/ou quantification indirecte du transcrit ARNm après transformation de ce dernier en ADN, ou après amplification dudit transcrit ou après amplification de l'ADN obtenu après transformation dudit transcrit ARNm en ADN ;
- l’expression des gènes cibles est normalisée par rapport à l’expression d’un ou plusieurs gènes de ménage, avantageusement par rapport à l’expression d’un des gènes de ménage sélectionné dans le groupe constitué par DECR1, HPRT1, PPIB, GAPDH, ACTB et leurs combinaisons ;
- l’expression des gènes cibles est normalisée par rapport à la combinaison de l’expression des gènes de ménage DECR1, HPRT1 et PPIB ;
- le procédé selon l’invention permet d’identifier le statut immunodéprimé chez un sujet avec une sensibilité d’au moins 70%, et une spécificité d’au moins 80% ;
- le procédé de l’invention comprend, en outre, une étape d'administration d'un traitement, de préférence un traitement immunomodulateur et/ou un traitement anti-inflammatoire, adapté au statut immunitaire de l'individu ;
- le traitement immunostimulant est choisi dans le groupe constitué par des interleukines, en particulier IL-7, IL-15 ou IL-3 ; des facteurs de croissance, en particulier le GM-CSF ; des interférons, en particulier IFNy, des Toll agonistes ; des anticorps, en particulier des anticorps anti-PD1, anti-PDL1, anti-LAG3, anti-TIM3, anti-IL-10 ou anti-CTLA4 ; des transferrines et des molécules inhibitrices de l'apoptose ; FLT3L ; Thymosin α1 ; des antagonistes adrénergiques ;
- le traitement anti-inflammatoire est choisi dans le groupe constitué par des glucocorticoïdes, des agents cytostatiques, des molécules agissant sur les immunophilines et les cytokines, des molécules bloquant le récepteur à l'IL-1 et des traitements anti-TNF.- step a) comprises the quantification of the expression of the target genes TAP2 and C3AR1;
- step a) comprises the quantification of the expression of the target genes TAP2 and CD177;
- step a) comprises the quantification of the expression of the target genes C3AR1 and CD177;
- step a) comprises the quantification of the expression of the target genes C3AR1 and IL1R2;
- step a) comprises the quantification of the expression of the target genes CD177 and IL1R2;
- step a) comprises the quantification of the expression of at least 3 target genes chosen from the group consisting of TAP2, C3AR1, CD177 and IL1R2;
- step a) comprises the quantification of the expression of the target gene TAP2 and at least one other target gene chosen from C3AR1, CD177 and IL1R2;
- step a) comprises the quantification of the expression of the target gene TAP2 and at least two other target genes chosen from C3AR1, CD177 and IL1R2;
- step a) comprises the quantification of the expression of the 3 target genes TAP2, C3AR1 and IL1R2;
- step a) comprises the quantification of the expression of the 3 target genes TAP2, C3AR1 and CD177;
- step a) comprises the quantification of the expression of the 3 target genes TAP2, CD177 and IL1R2;
- step a) comprises the quantification of the expression of the 4 target genes TAP2, C3AR1, CD177 and IL1R2;
- the reference value corresponds to the expression of said target gene in a subject having a normal immune status or a subject whose immune status is known to be not immunocompromised;
- the immunocompromised status is detected on the basis of at least two variations in expression, said variations being chosen from underexpression of TAP2, overexpression of C3AR1, overexpression of CD177, and overexpression of IL1R2;
- the immunocompromised status is detected on the basis of two variations in expression, said variations being chosen from underexpression of TAP2, overexpression of C3AR1, overexpression of CD177, and overexpression of IL1R2;
- the immunocompromised status is detected on the basis of three variations in expression, said variations being chosen from underexpression of TAP2, overexpression of C3AR1, overexpression of CD177, and overexpression of IL1R2;
- the immunocompromised status is detected on the basis of underexpression of TAP2, overexpression of C3AR1, overexpression of CD177, and overexpression of IL1R2;
- the method of the invention further comprises a step of quantifying the expression of at least one additional target gene selected from the group consisting of CD3D, CIITA, CD74, CTLA4, CX3CR1, IFNγ and S100A9; the immunocompromised status is then further detected taking into account at least one variation of at least one additional target gene, said variations being chosen from an underexpression of CD3D, an underexpression of CIITA, an underexpression of CD74, underexpression of CTLA4, underexpression of CX3CR1, overexpression of IFNγ, and overexpression of S100A9;
- the method of the invention comprises a step of quantifying the expression of all of the following target genes: TAP2, C3AR1, CD177, IL1R2, CD3D, CIITA, CD74, CTLA4, CX3CR1, IFNγ and S100A9;
- the subject is a patient, in particular a seriously ill patient in a septic state, more particularly, in septic shock; suffering from burns, more particularly, severe burns; suffering from trauma, more particularly, serious trauma; or operated by surgery, more particularly, major surgery;
- the biological sample is a blood sample;
- the biological sample is a whole blood sample;
- the biological sample is a sample from a patient in the emergency department, the intensive care unit, in an intensive care unit (ICU) or in a continuing care unit, and preferably, from a patient in an ICU ;
- the biological test sample and/or the biological reference sample according to the invention is a blood sample, preferably a sample of whole blood, plasma or serum, or a sample of peripheral blood mononuclear cells, extracted at from a blood sample;
- the reference value of a target gene corresponds to the expression of said target gene in a subject having a normal immune status defined by an mHLA-DR value greater than 5000 AB/C, in particular greater than 5500 AB/C, advantageously greater than 6000 AB/C, in particular greater than 6500 AB/C, preferably greater than 7000 AB/C, in particular greater than 7500 AB/C, and very particularly by an mHLA-DR value greater than 8000 AB/C;
- the expression of target genes is quantified at the transcribed RNA or messenger RNA (mRNA) level;
- the expression of target genes is measured at the DNA or complementary DNA (cDNA) level;
- the expression of the target genes is measured by the implementation of a molecular detection method and/or direct quantification by any method known to those skilled in the art making it possible to determine the presence of an mRNA transcript in a sample such that hybridization methods, preferably with a hybridization chip, by in situ hybridization or by Northern blot ; amplification methods, preferably by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), more preferably by quantitative RT-PCR (RT-qPCR), in particular nested PCR (or nested PCR ), reactions of PCR can also be multiplexed; sequencing methods, preferably high-throughput sequencing;
- quantification of the expression of target genes is carried out by RT-PCR, by sequencing or by hybridization. Preferably, the quantification is carried out by RT-PCR, and in particular by RT-qPCR;
- the expression of the target genes is measured by implementing a method of indirect detection and/or quantification of the mRNA transcript after transformation of the latter into DNA, or after amplification of said transcript or after amplification of the DNA obtained after transformation of said mRNA transcript into DNA;
- the expression of the target genes is normalized in relation to the expression of one or more housekeeping genes, advantageously in relation to the expression of one of the housekeeping genes selected from the group consisting of DECR1, HPRT1, PPIB, GAPDH, ACTB and their combinations;
- the expression of the target genes is normalized relative to the combination of the expression of the housekeeping genes DECR1, HPRT1 and PPIB;
- the method according to the invention makes it possible to identify the immunocompromised status in a subject with a sensitivity of at least 70%, and a specificity of at least 80%;
- the method of the invention further comprises a step of administering a treatment, preferably an immunomodulatory treatment and/or an anti-inflammatory treatment, adapted to the immune status of the individual;
- the immunostimulating treatment is chosen from the group consisting of interleukins, in particular IL-7, IL-15 or IL-3; growth factors, in particular GM-CSF; interferons, in particular IFNy, Toll agonists; antibodies, in particular anti-PD1, anti-PDL1, anti-LAG3, anti-TIM3, anti-IL-10 or anti-CTLA4 antibodies; transferrins and molecules inhibiting apoptosis; FLT3L; Thymosin α1; adrenergic antagonists;
- the anti-inflammatory treatment is chosen from the group consisting of glucocorticoids, cytostatic agents, molecules acting on immunophilins and cytokines, molecules blocking the IL-1 receptor and anti-TNF treatments.
Selon l’invention :
- le gène CD3D (CD3 Delta Subunit Of T-Cell Receptor Complex) code pour une protéine constitutive du complexe récepteur des lymphocytes T/CD3 (complexe TCR/CD3) et est impliquée dans le développement des lymphocytes T et la transduction du signal. La protéine codée par ce gène est la sous-unité delta du complexe CD3 et, avec quatre autres sous-unités CD3, se lie soit au TCR alpha/bêta, soit au TCR gamma/delta pour former le complexe TCR/CD3 à la surface des lymphocytes T. La localisation chromosomique de CD3D est la suivante : chr11:118,338,954-118,342,744 ;
- le gène CIITA (Class II Major Histocompatibility Complex Transactivator) code pour un transactivateur du complexe majeur d’histocompatibilité de classe II. La protéine, une fois dans le noyau cellulaire, agirait comme un co-régulateur positif pour la transcription de gènes du complexe majeur d’histocompatibilité de classe II, un composant majeur de la défense immunitaire. La localisation chromosomique de CIITA est la suivante : chr16:10,866,212-10,943,021 ;
- le gène CD74 (Invariant Polypeptide Of Major Histocompatibility Complex, Class II Antigen-Associated or HLA class II histocompatibility antigen gamma chain) code pour une protéine qui s'associe au complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe II et est une protéine chaperon importante qui régule la présentation de l'antigène pour la réponse immunitaire. Il sert également de récepteur de surface cellulaire pour le facteur inhibiteur de la migration des cytokines macrophages (MIF) qui, lorsqu'il est lié à la protéine codée par le gène CD74, initie les voies de survie et la prolifération cellulaire. Cette protéine interagit également avec la protéine précurseur de l'amyloïde (APP pouramyloid precursor protein) et supprime la production du peptide amyloïde bêta ou β-amyloïde. La localisation chromosomique de CD74 est la suivante : chr5:150,400,041-150,412,936 ;
- le gène CTLA4 (ou CTLA-4 ;Cytotoxic T-Lymphocyte Associated Protein 4) fait partie de la superfamille des immunoglobulines et code pour une protéine qui transmet un signal inhibiteur aux lymphocytes T.; La localisation chromosomique de CTLA4 est la suivante : chr2:203,867,771-203,873,965 ;
- le gène CX3CR1 (C-X3-C Motif Chemokine Receptor 1) code le récepteur à la fractalkine (ou CX3CL1). La fractalkine est une protéine transmembranaire et une chimiokine notamment impliquée dans l'adhésion et la migration des leucocytes. La localisation chromosomique de CX3CR1 est la suivante : chr12:8,058,302-8,066,471.
- le gène IFNγ (Interferon γ) code pour une cytokine soluble appartenant à la classe des interférons de type II. La protéine codée est sécrétée par les cellules des systèmes immunitaires inné et adaptatif. La protéine active est un homodimère qui se lie au récepteur de l'interféron gamma qui déclenche une réponse cellulaire aux infections virales et microbiennes. La localisation chromosomique de IFNG est la suivante : chr12:68,154,768-68,159,741; et
- le gène S100A9 (S100 Calcium Binding Protein A9ou MRP14 pourmigration inhibitory factor-related protein 14) code pour une protéine appartenant à la famille S100 de protéines contenant 2 motifs de liaison au calcium en main EF (i.e. un domaine structurel ou un motif hélice-boucle-hélice). La localisation chromosomique de S100A9 est la suivante : chr12:68,154,768-68,159,741.According to the invention:
- the CD3D gene (CD3 Delta Subunit Of T-Cell Receptor Complex) encodes a constituent protein of the T cell receptor/CD3 complex (TCR/CD3 complex) and is involved in T cell development and signal transduction. The protein encoded by this gene is the delta subunit of the CD3 complex and, along with four other CD3 subunits, binds to either TCR alpha/beta or TCR gamma/delta to form the TCR/CD3 complex on the surface T lymphocytes. The chromosomal location of CD3D is as follows: chr11:118,338,954-118,342,744;
- the CIITA gene (Class II Major Histocompatibility Complex Transactivator) encodes a major histocompatibility complex class II transactivator. The protein, once in the cell nucleus, would act as a positive co-regulator for the transcription of major histocompatibility complex class II genes, a major component of immune defense. The chromosomal location of CIITA is as follows: chr16:10,866,212-10,943,021;
- the CD74 gene (Invariant Polypeptide Of Major Histocompatibility Complex, Class II Antigen-Associated or HLA class II histocompatibility antigen gamma chain) encodes a protein that associates with major histocompatibility complex (MHC) class II and is an important chaperone protein that regulates antigen presentation for the immune response. It also serves as a cell surface receptor for macrophage cytokine migration inhibitory factor (MIF) which, when bound to the protein encoded by the CD74 gene, initiates survival pathways and cell proliferation. This protein also interacts with the amyloid precursor protein (APP foramyloid precursor protein) and suppresses the production of amyloid beta or β-amyloid peptide. The chromosomal location of CD74 is as follows: chr5:150,400,041-150,412,936;
- the CTLA4 gene (or CTLA-4;Cytotoxic T-Lymphocyte Associated Protein 4) is part of the immunoglobulin superfamily and encodes a protein that transmits an inhibitory signal to T lymphocytes.; The chromosomal location of CTLA4 is as follows: chr2:203,867,771-203,873,965;
- the CX3CR1 gene (C-X3-C Motif Chemokine Receptor 1) encodes the fractalkine receptor (or CX3CL1). Fractalkine is a transmembrane protein and chemokine notably involved in the adhesion and migration of leukocytes. The chromosomal location of CX3CR1 is as follows: chr12:8,058,302-8,066,471.
- the IFNγ (Interferon γ) gene codes for a soluble cytokine belonging to the type II interferon class. The encoded protein is secreted by cells of the innate and adaptive immune systems. The active protein is a homodimer that binds to the interferon gamma receptor which triggers a cellular response to viral and microbial infections. The chromosomal location of IFNG is as follows: chr12:68,154,768-68,159,741; And
- the S100A9 gene (S100 Calcium Binding Protein A9or MRP14 formigration inhibitory factor-related protein 14) encodes a protein belonging to the S100 family of proteins containing 2 EF-hand calcium binding motifs (i.e. a structural domain or a helix-loop-helix motif). The chromosomal location of S100A9 is as follows: chr12:68,154,768-68,159,741.
Un autre objet de la présente invention concerne l'utilisation pour détecterin vitroouex vivo,un statut immunodéprimé chez un sujet, de la quantification, dans un échantillon biologique dudit sujet, de l’expression d’au moins 2 gènes cibles sélectionnés dans le groupe constitué par TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2 ; et la comparaison de l’expression de chacun des gènes respectivement à une valeur de référence de sorte à identifier la présence ou non d’une variation de l’expression, tel que décrit précédemment. L’utilisation selon l’invention comprend, en outre, une étape de quantification de l’expression d’au moins un autre gène cible sélectionné dans le groupe constitué par CD3D, CIITA, CD74, CTLA4, CX3CR1, IFNγ et S100A9.Another object of the present invention relates to the use for detecting in vitro or ex vivo, an immunocompromised status in a subject, of the quantification, in a biological sample of said subject, of the expression of at least 2 target genes selected in the group consisting of TAP2, C3AR1, CD177 and IL1R2; and comparing the expression of each of the genes respectively to a reference value so as to identify the presence or absence of a variation in expression, as described previously. The use according to the invention further comprises a step of quantifying the expression of at least one other target gene selected from the group consisting of CD3D, CIITA, CD74, CTLA4, CX3CR1, IFNγ and S100A9.
Un autre objet de la présente invention concerne également un kit pour la mise en œuvre du procédé de détectionin vitroouex vivod’un statut immunitaire déprimé chez un sujet, tel que défini précédemment, comprenant des moyens d’amplification et/ou des moyens de détection de l’expression d’au moins 2 gènes cibles sélectionnés dans le groupe constitué par TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2.Another object of the present invention also relates to a kit for implementing the method of in vitro or ex vivo detection of a depressed immune status in a subject, as defined above, comprising amplification means and/or means for detecting the expression of at least 2 target genes selected from the group consisting of TAP2, C3AR1, CD177 and IL1R2.
De préférence, la présente invention a pour objet un kit pour la mise en œuvre du procédé de détectionin vitroouex vivod’un statut immunitaire déprimé chez un sujet, tel que défini présentant les caractéristiques techniques suivantes, prises seules ou en combinaison :
- ledit kit comprend les moyens d’amplification et/ou des moyens de détection de l’expression d’au moins 3 gènes cibles sélectionnés dans le groupe constitué par TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2 ;
- le kit comprend les moyens d’amplification et/ou des moyens de détection de l’expression des 4 gènes cibles TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2 ;
- le kit comprend, en outre, des moyens d’amplification et/ou des moyens de détection de l’expression d’au moins un autre cible gène sélectionné dans le groupe constitué par CD3D, CIITA, CD74, CTLA4, CX3CR1, IFNγ et S100A9 et leurs combinaisons ;
- le kit comprend les moyens d’amplification et/ou des moyens de détection de l’expression des 11 gènes cibles suivants : TAP2, C3AR1, CD177, IL1R2, CD3D, CIITA, CD74, CTLA4, CX3CR1, IFNγ et S100A9 ;
- les moyens d’amplifications et/ou de détection sont des réactifs spécifiques des produits d’expression desdits gènes cibles choisis parmi les amorces d’amplification ou les sondes d’hybridation ;
- le kit comprend en outre un échantillon biologique test (échantillon contrôle positif) calibré pour contenir les quantités des ARNm des gènes cibles TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2 qui correspondent à la quantité ou la concentration représentative du niveau d’expression mesuré dans un pool d’échantillon de sujet présentant un statut immunitaire immunocompétent avec une valeur de mHLA-DR supérieure à 5000 AB/C, notamment supérieure à 5500 AB/C, avantageusement supérieure à 6000 AB/C, en particulier supérieure à 6500 AB/C, de préférence supérieure à 7000 AB/C, notamment supérieure à 7500 AB/C, et tout particulièrement par une valeur mHLA-DR supérieure à 8000 AB/C.Preferably, the present invention relates to a kit for implementing the method for in vitro or ex vivo detection of a depressed immune status in a subject, as defined, having the following technical characteristics, taken alone or in combination:
- said kit comprises the means for amplification and/or means for detecting the expression of at least 3 target genes selected from the group consisting of TAP2, C3AR1, CD177 and IL1R2;
- the kit includes the means of amplification and/or means of detection of the expression of the 4 target genes TAP2, C3AR1, CD177 and IL1R2;
- the kit further comprises means for amplification and/or means for detecting the expression of at least one other target gene selected from the group consisting of CD3D, CIITA, CD74, CTLA4, CX3CR1, IFNγ and S100A9 and their combinations;
- the kit includes the means of amplification and/or means of detection of the expression of the following 11 target genes: TAP2, C3AR1, CD177, IL1R2, CD3D, CIITA, CD74, CTLA4, CX3CR1, IFNγ and S100A9;
- the amplification and/or detection means are reagents specific for the expression products of said target genes chosen from amplification primers or hybridization probes;
- the kit further comprises a biological test sample (positive control sample) calibrated to contain the quantities of mRNA of the target genes TAP2, C3AR1, CD177 and IL1R2 which correspond to the quantity or concentration representative of the expression level measured in a pool sample of subject presenting an immunocompetent immune status with an mHLA-DR value greater than 5000 AB/C, in particular greater than 5500 AB/C, advantageously greater than 6000 AB/C, in particular greater than 6500 AB/C, preferably greater than 7000 AB/C, in particular greater than 7500 AB/C, and very particularly by an mHLA-DR value greater than 8000 AB/C.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un kit tel que décrit précédemment, pour détecterin vitroouex vivoun statut immunitaire déprimé chez un sujet, de préférence un patient , notamment un patient gravement malade en état septique (plus particulièrement, en choc septique), atteint de brûlures (plus particulièrement, de brûlures graves), atteint de traumatismes (plus particulièrement, de traumatismes graves), ou opéré par chirurgie (plus particulièrement, une chirurgie lourde.The present invention also relates to the use of a kit as described above, for detecting in vitro or ex vivo a depressed immune status in a subject, preferably a patient, in particular a seriously ill patient in a septic state (more particularly, in septic shock), suffering from burns (more particularly, severe burns), suffering from trauma (more particularly, serious trauma), or operated on by surgery (more particularly, major surgery.
Exemple 1 : DétectionExample 1: Detection ex vivoex vivo d’un statut immunodéprimé chez un sujet par la mise en œuvre du procédé de l’inventionof an immunocompromised status in a subject by implementing the method of the invention
Les patients et les échantillons proviennent de l'étude REALISM, dans laquelle 377 patients gravement malades de différentes étiologies (sepsis, traumatisme, chirurgie élective, brûlures) ont été recrutés, ainsi que 175 volontaires sains. Du sang total périphérique a été prélevé dans des tubes EDTA et dans des tubesPAXgene Blood RNAà différents moments entre l'inclusion dans l'étude et le jour 60 (J60), avec jusqu'à 7 échantillons par patient. Les volontaires sains ont été prélevés une fois.Patients and samples come from the REALISM study, in which 377 critically ill patients of different etiologies (sepsis, trauma, elective surgery, burns) were recruited, as well as 175 healthy volunteers. Peripheral whole blood was collected in EDTA tubes and PAXgene Blood RNA tubes at various time points between study inclusion and day 60 (D60), with up to 7 samples per patient. Healthy volunteers were sampled once.
La détermination du nombre de molécules HLA-DR par monocyte a été réalisée à l'aide de la méthode standardiséeBD Quantibrite(HLA-DR:340827 ; Quantibrite : 340495 ; Becton Dickenson, New Jersey, USA) sur des échantillons de sang EDTA frais, dans les 3h suivant le prélèvement, comme décrit précédemment.Determination of the number of HLA-DR molecules per monocyte was carried out using the standardized BD Quantibrite method ( HLA-DR:340827; Quantibrite: 340495; Becton Dickenson, New Jersey, USA ) on fresh EDTA blood samples. , within 3 hours following collection, as described previously.
1.3. Quantification de l’expression des gènes cibles1.3. Quantification of target gene expression
Les échantillonsPAXgeneont été stabilisés pendant au moins 2h après le prélèvement à température ambiante et congelés à -80°C selon les recommandations du fabricant. L'ARN a ensuite été isolé en utilisant le kitMaxwell® HT simplyRNA(AX2420,Promega Corporation,Madison,WI,USA). La concentration d'ARN a été déterminée à l'aide du systèmeQuantiFluor RNA(E3310,Promega) sur le lecteur de microplaquesGloMax® Discover(Promega). L'intégrité de l'ARN a été évaluée à l'aide du kitRNA 6000 Nano(Agilent Technologies,Santa Clara, CA, USA) sur le bioanalyseurAgilent 2100(Agilent Technologies). PAXgene samples were stabilized for at least 2 h after collection at room temperature and frozen at -80°C according to the manufacturer's recommendations. RNA was then isolated using the Maxwell® HT simplyRNA kit (AX2420, Promega Corporation , Madison , WI , USA ). RNA concentration was determined using the QuantiFluor RNA system (E3310, Promega ) on the GloMax® Discover microplate reader ( Promega ). RNA integrity was assessed using the RNA 6000 Nano kit ( Agilent Technologies , Santa Clara, CA, USA ) on the Agilent 2100 Bioanalyzer ( Agilent Technologies ).
Les échantillons ont été testés en utilisant un prototype de poche FilmArray® optimisée pour détecter par nested PCR les gènes cibles TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2, et les gènes cibles additionnels CD3D, CIITA, CD74, CTLA4, CX3CR1, IFNγ et S100A9.Samples were tested using a prototype FilmArray® pocket optimized to detect by nested PCR the target genes TAP2, C3AR1, CD177 and IL1R2, and the additional target genes CD3D, CIITA, CD74, CTLA4, CX3CR1, IFNγ and S100A9.
La détermination du niveau d'expression des ARNm des gènes cibles a été réalisée sur avec le prototype de poche sur l'instrument FilmArray® Torch (BioFire®, USA), en suivant les recommandations du fabriquant, en injectant 200 ng d'ARN dans ledit prototype de poche. Les résultats des niveaux d’expression sont obtenus de manière automatisée, en moins d’une heure, avant d’être compilés pour être analysés. Les valeurs d'expression normalisées des marqueurs cibles (par rapport aux gènes de références DECR1, HPRT1 et PPIB) ont été calculées et utilisées pour les analyses.The determination of the expression level of mRNA of target genes was carried out with the pocket prototype on the FilmArray® Torch instrument (BioFire®, USA), following the manufacturer's recommendations, by injecting 200 ng of RNA into said pocket prototype. Expression level results are obtained automatically, in less than an hour, before being compiled for analysis. Normalized expression values of target markers (compared to reference genes DECR1, HPRT1 and PPIB) were calculated and used for analyses.
Modèle pour l'identification des échantillons avec mHLA-DR <8,000 AB/C : Tous les échantillons pour lesquels les mesures de mHLA-DR étaient disponibles ont été utilisés dans l'analyse. Les échantillons ont été considérés comme immunodéprimés lorsque la quantification de mHLA-DR est inférieure à 8 000 AB/C, sinon, ces échantillons ont été considérés comme immunocompétents. Les données ont été divisées en un set d’apprentissage contenant 1300 échantillons (70%) et un set de test contenant 541 échantillons (30%). La répartition entre le set d’apprentissage et le set de test était équilibrée en fonction de la distribution des valeurs de mHLA-DR, du moment de l'échantillonnage et de l'étiologie du patient. Un modèle de régressionPLS(Partial Least Square) combinant le niveau d'expression des marqueurs de la poche prototype a été entraîné par validation croisée répétée 20X-5 fois pour la prédiction de mHLA-DR inférieur à 8 000 AB/C. Le suréchantillonnage SMOTE (Synthetic Minority Over-Sampling Technique) a été utilisé pour équilibrer le set d’apprentissage entre les catégories. Le nombre de composantes a été évalué manuellement de 1 jusqu'au maximum possible Les performances du modèle ont été évaluées sur l'ensemble de test en calculant l'aire sous la courbe ROC (AUC), la précision, la sensibilité, la spécificité, la valeur prédictive positive et la valeur prédictive négative. Model for identification of samples with mHLA-DR <8,000 AB/C: All samples for which mHLA-DR measurements were available were used in the analysis. Samples were considered immunocompromised when mHLA-DR quantification was less than 8,000 AB/C, otherwise, these samples were considered immunocompetent. The data was divided into a training set containing 1300 samples (70%) and a test set containing 541 samples (30%). The distribution between the training set and the test set was balanced according to the distribution of mHLA-DR values, the sampling time and the etiology of the patient. A Partial Least Square ( PLS ) regression model combining the expression level of prototype pocket markers was trained by repeated 20X-5-fold cross-validation for the prediction of mHLA-DR below 8,000 AB/C. Synthetic Minority Over-Sampling Technique (SMOTE) was used to balance the training set across categories. The number of components was manually evaluated from 1 to the maximum possible. The performance of the model was evaluated on the test set by calculating the area under the ROC curve (AUC), accuracy, sensitivity, specificity, the positive predictive value and the negative predictive value.
Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du logiciel R, version 3.6.2.Statistical analyzes were carried out using R software, version 3.6.2.
Les données du mHLA-DR et de l’expression des gènes cibles étaient toutes deux disponibles pour 1841 échantillons répartis comme suit : 163 échantillons provenant de volontaires sains et 1678 échantillons de patients correspondant à 106 sepsis, 136 traumatismes, 109 chirurgies et 24 brûlures.Both mHLA-DR and target gene expression data were available for 1841 samples distributed as follows: 163 samples from healthy volunteers and 1678 patient samples corresponding to 106 sepsis, 136 trauma, 109 surgeries and 24 burns.
Dans l’ensemble, les valeurs mHLA-DR variaient de 439 à 80 066 AB/C, avec 36 % des valeurs inférieures à 8 000 AB/C.Overall, mHLA-DR values ranged from 439 to 80,066 AB/C, with 36% of values below 8,000 AB/C.
La détection de variations de l’expression des marqueurs du prototype de poche (gènes cibles et additionnels) selon l’invention a été effectuée.The detection of variations in the expression of markers of the pocket prototype (target and additional genes) according to the invention was carried out.
Les données sont représentées par la
Dans le groupe immunodéprimé, une régulation à la baisse de l’expression de: CD3D, CD74, CIITA, CTLA4, CX3CR1, IFNγ et TAP2 a été observée; tandis que les marqueurs suivant ont vu leur expression régulée à la hausse: C3AR1, CD177, IL1R2, S100A9.In the immunocompromised group, downregulation of the expression of: CD3D, CD74, CIITA, CTLA4, CX3CR1, IFNγ and TAP2 was observed; while the following markers saw their expression upregulated: C3AR1, CD177, IL1R2, S100A9.
Les niveaux d’expression normalisés individuels des marqueurs d’ARNm TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2, ainsi que ceux des différentes combinaisons des marqueurs TAP2, C3AR1, CD177, IL1R2, CD3D, CIITA, CD74, CTLA4, CX3AR1, IFNγ et S100A9 ont été combinés dans un modèle entraîné pour l’identification des patients immunodéprimés (mHLA-DR <8 000 AB/C).The individual normalized expression levels of the mRNA markers TAP2, C3AR1, CD177 and IL1R2, as well as those of the different combinations of the markers TAP2, C3AR1, CD177, IL1R2, CD3D, CIITA, CD74, CTLA4, CX3AR1, IFNγ and S100A9 were were combined into a model trained for the identification of immunocompromised patients (mHLA-DR <8,000 AB/C).
Les données des performances des différentes combinaisons de gènes cibles selon l’invention sont représentées dans le tableau 2.The performance data of the different combinations of target genes according to the invention are represented in Table 2.
(0,82-0,88)0.85
(0.82-0.88)
(0,81-0,88)0.85
(0.81-0.88)
(0,78-0,85)0.82
(0.78-0.85)
(0,79-0,86)0.82
(0.79-0.86)
(0,79-0,86)0.82
(0.79-0.86)
(0,78-0,85)0.82
(0.78-0.85)
(0,83-0,89)0.86
(0.83-0.89)
(0,80-0,87)0.83
(0.80-0.87)
(0,81-0,88)0.84
(0.81-0.88)
(0,81-0,88)0.85
(0.81-0.88)
(0,83-0,89)0.86
(0.83-0.89)
Le modèle a obtenu de très bonnes performances pour l’identification des patients ayant un statut immunodéprimé, avec une AUC supérieure à 0,82 pour l’ensemble des jeux de gènes testés.The model obtained very good performance for identifying patients with an immunocompromised status, with an AUC greater than 0.82 for all the gene sets tested.
A titre de comparatif, la performance obtenue sur le set de test avec CD74 (qui représente la chaîne invariante γ du HLA-DR) en tant qu’unique substitut du mHLA-DR dans un modèle linéaire généralisé, était plus faible, avec une AUC de 0,77 (IC 95% [0,73-0,81]), démontrant ainsi tout l’intérêt des combinaisons de gènes cibles selon l’invention.For comparison, the performance obtained on the test set with CD74 (which represents the invariant γ chain of HLA-DR) as the sole substitute for mHLA-DR in a generalized linear model, was lower, with an AUC of 0.77 (95% CI [0.73-0.81]), thus demonstrating the full benefit of the combinations of target genes according to the invention.
La concordance a été effectuée entre les résultats du mHLA-DR et l’identification avec les gènes cibles sur le set d’apprentissage (n=1300 échantillons ;
Il apparait clairement que le procédé de l’invention de détectionin vitroouex vivod’un statut immunodéprimé chez un sujet est efficace et apparait comme une excellente alternative à la quantification mHLA-DR, puisque la corrélation des données de la poche prototype et du mHLA-DR montre une similitude dans l’identification des patients immunodéprimés ou immunocompétents.It clearly appears that the method of the invention for in vitro or ex vivo detection of an immunocompromised status in a subject is effective and appears to be an excellent alternative to mHLA-DR quantification, since the correlation of the data from the prototype bag and of mHLA-DR shows similarity in identifying immunocompromised or immunocompetent patients.
Plus important encore, le procédé de l’invention présente plusieurs autres avantages. Par exemple, le processus pré-analytique est facilité par la stabilisation de l'ARN du sang total dans le tubePAXgene, ne nécessitant aucune préparation de l'échantillon. En outre, les résultats sont obtenus en une heure, sans manipulation, grâce à sa mise en œuvre sur la plateforme entièrement automatisée telle que leFilmArray®(BioFire®),déjà largement utilisée dans les cliniques pour le diagnostic microbiologique. A minima, le procédé selon l’invention permet ainsi une identification précoce du statut immunodéprimé d’un patient, le temps par exemple qu’il soit possible de réaliser la mesure mHLA-DR.More importantly, the method of the invention has several other advantages. For example, the pre-analytical process is facilitated by stabilizing whole blood RNA in the PAXgene tube, requiring no sample preparation. In addition, the results are obtained in one hour, without manipulation, thanks to its implementation on the fully automated platform such as the FilmArray® (BioFire®) , already widely used in clinics for microbiological diagnosis. At a minimum, the method according to the invention thus allows early identification of the immunocompromised status of a patient, for example until it is possible to carry out the mHLA-DR measurement.
Malgré une bonne concordance entre les données issues de la quantification mHLA-DR et ceux du procédé de l’invention, quelques échantillons sont mal classés. Cela pourrait être dû à la variabilité intrinsèque des deux techniques. Une autre explication pourrait être les différences de régulation entre une protéine (mHLA-DR) et l'expression de plusieurs marqueurs ARNm. En outre, alors que le HLA-DR est mesuré au niveau cellulaire uniquement dans les monocytes, le procédé de l’invention permet la quantification au niveau ARNm dans le sang total, comprenant les monocytes mais aussi d'autres cellules exprimant HLA-DR (par exemple les lymphocytes B), et capte ainsi d'autres altérations immunitaires, non nécessairement liées à la régulation de mHLA-DR. Cependant, cela n’enlève en rien les avantages du procédé selon l’invention pour l’identification d’un statut immunodéprimé chez un sujet.
Despite good agreement between the data from mHLA-DR quantification and those of the method of the invention, some samples are poorly classified. This could be due to the intrinsic variability of the two techniques. Another explanation could be the regulatory differences between a protein (mHLA-DR) and the expression of several mRNA markers. Furthermore, while HLA-DR is measured at the cellular level only in monocytes, the method of the invention allows quantification at the mRNA level in whole blood, including monocytes but also other cells expressing HLA-DR ( for example B lymphocytes), and thus captures other immune alterations, not necessarily linked to the regulation of mHLA-DR. However, this in no way detracts from the advantages of the method according to the invention for the identification of an immunocompromised status in a subject.
Claims (16)
- Quantification, dans un échantillon biologique dudit sujet, de l’expression d’au moins 2 gènes cibles sélectionnés dans le groupe constitué par TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2 ;
- Comparaison de l’expression de chacun des gènes respectivement à une valeur de référence de sorte à identifier la présence ou non d’une variation de l’expression.
- Quantification, in a biological sample from said subject, of the expression of at least 2 target genes selected from the group consisting of TAP2, C3AR1, CD177 and IL1R2;
- Comparison of the expression of each of the genes respectively to a reference value so as to identify the presence or absence of a variation in expression .
- une sous-expression de TAP2,
- une surexpression de C3AR1,
- une surexpression de CD177, et
- une surexpression de IL1R2.Method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the immunocompromised status is detected on the basis of at least two variations of the expression, said variations being chosen from:
- an underexpression of TAP2,
- overexpression of C3AR1,
- overexpression of CD177, and
- overexpression of IL1R2.
des gènes cibles TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2.Kit according to claim 13, characterized in that it comprises means for amplification and/or means for detecting the expression of at least 3 target genes selected from the group consisting of TAP2, C3AR1, CD177 and IL1R2, preferably, the amplification means and/or means for detecting the expression
target genes TAP2, C3AR1, CD177 and IL1R2.
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Also Published As
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