JPH04502905A - 新規抗ウイルス剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規抗ウィルス剤 技術分野 この発明はウィルス感染症を治療もしくは予防するのに有用な物質に関する。よ り詳細には自己集合性ナフチルジスルホネートに関し、さらにヒト免疫不全ウィ ルス（ＨＩ　Ｖ）感染症および他のレトロウィルス感染症を抑制するのに有効な ルシファーイエロー（Ｌｕｃｉｆｅｒ　Ｙｅｌｌｏｗ）のセミカルバゾンとその 類似体とに関する。

背景技術 ヒトと他の動物との両方に、レトロウィルスが起源であるとｍ！されている多く のウィルス疾患がある。ヒトのこれら疾患として最も公表されているのは、ヒト 免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）によって起こるＡＩＤＳとＡＲＣである。しかしそ の外のこのような疾患としてはＢ型肝炎とδ型肝炎がある。

ネコのレトロウィルス疾患には、ネコ免疫不全ウィルス（ＦＩＶ）とネコ白血病 ウィルス（ＦｅＬＶ）によって起こる疾患がある。他の多くの動物種、例えば有 蹄動物もビスナウィルス感染症のようなレトロウィルスで起こる感染症にかかる 。

このような疾患を治療するいくつもの方法があるが、いずれも完全には成功して いない。１００万人ものアメリカ人と世界全体では数１００万人もの人がＨＩＶ に感染しており、Ｂｕｒｒｏｕｇｈｓ　Ｗｅｌｌｃｏｍｅ社が製造している実験 的な薬剤ＡＺＴは、ＡＩＤＳを治應させることはできず極めて有毒であることは 明らかであるが、何らかの助けにはなるようである。それにもかかわらずＡＺＴ は商業的にかなり成功している。一般のレトロウィルス感染症と特にＨＩＶに対 して有効な、より有効な抗ウィルス剤が引き続き要望されていることは疑いもな いことである。

生物学的活性物質をその目的とする活性の部位に集合させることは、特にその活 性物質が無害で無毒の前駆体から形成され得る場合には、多くの利点があること は認識されている。

１９８８年１月１４日に公開されたＰＣＴ出願ＷＯ３８１０００４７は、参考文 献としてここに採用するものであるが、微環境に別個に投与され得、集合して活 性結合体を生成し得る各種物質が記載されている。非常に興味深い微環境は、ヒ ト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）による感染部位であり、ＨＩＶ感染部位に自己集 合する薬剤の無毒の前駆体を投与することができれば、このウィルスで起こる疾 患と疾候を治療するのに明らかに有利である。

上記の公開ＰＣＴ出願には、活性結合体の所望の部位への自己集合性の概念が全 般的に記載され、この概念のある例が提供されているが、ＨＩＶ感染症の治療に 有用な特定の化合物は何も開示されていない。

その上、感染部位への自己集合性をあてにするよりはむしろ、集合体の成分とし て用Ｇ―られる化合物に関連するあらかじめ集合させた化合物が用いられ得る。

その他の文献では、ここで記載され、請求されている化合物が検討されている。

ＨＩＶ感染症の治療用に種々の活性化合物が提示されてきたが、最もよく知られ ているのはＡＺＴと硫駿デキストランである。ここで記載されている本発明の結 合体に最も関連が深い化合物はスラミンナトリウム（ｓｕｒａｍｉｎ　ｓｏｄｉ ｕｍ）であるが、これはトリナトリウムスルホネートナフチル誘導体と、アミド 結合で結合した芳香族核との複雑な結合体である。この化ＡＩＤＳの治療に対す るスラミンの効果と、その作用機構１；、多くの研究者によって研究さ九ている （Ｂａｌｚａｒｉｎｉ、　Ｊ、ら、Ｉｓ　ｒｎｔ　Ｍｅｄ　（１９８６）　１０ ５：３２−３７；　Ｂｒｏｄｅｒ、Ｓ、ら、１ａｎｃｅｔ　（１３４７−１３５ １＞。一般にこの化合物は毒性があるため、単独で治療に使うことは無理である が、治療に有益であることは分かっている。副作用としては、眼の損傷、低アド レナリン症、悪心、血小板減少症、および嘔吐があり、これらの副作用による死 亡がいくつか起こっている。

スラミンの抗ウイルス機構が、そのポリアニオン分子が逆転写酵素と結合するた めであると提案されており（ＤｅＣｌｅｒｃｑ。

Ｅ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｌｅｔｔ　（１９７９）　８　：　９−２２）　、多数 のスラミン類似体が調製されている。合計９０種のスラミン類似体をＪｅｎｔｓ ｃｈ、　Ｋ。

の活性を阻害する能力を示し、２４種はその阻害がスラミンより優れていた。ス ラミン類似体の代表的なグループを第１図に示す。これらの化合物はすべてビス （ナフタレンポリスルホン）酸類であり、５〜４２μｇ／ｍ１の範囲のＩＤ、。

値を示し、スラミンと同様に５０μｇ／ｍ１でＭＴ４細胞に対するＨ　Ｉ　Ｖ− Ｉの細胞変性効果を消失させる。

すでに述べたように、スラミンナトリウムは毒性が高いので、ＨＩＶ感染症を治 療するのに臨床で使用するには毒性が強すぎる。これまでに調製された類似体も 同じ欠点をもっている。さらに、スラミンとその類似体は、インビボでの条件下 では容易に形成されないアミド結合もしくは尿素結合によって結合されているの で、生体内原位置での自己集合による局在化形成の機会を示さない。

本発明の前駆体と結合体は、以下に述べるように単球にホーム（ｈｏｍｅ）する ようである。単球とマクロファージは、ＨＩＶと他のレトロウィルスの感染症に 対する抗ウィルス剤の適切な標的のようである。ＡＩＤＳ患者において、ＨＩ　 Ｖ−Ｉ感染症の証拠は、脳、末梢血、リンパ節、皮膚および肺を含む各種の組織 由来の単球中で観察されており（Ｐａｕｚａ、　Ｃ，Ｄ。

の細胞系は、インビトロでウィルスの複製を維持する。さらに他の２つの免疫抑 制レトロウィルス、ＭＬＤＶと有蹄類のビスナ（Ｖｉｓｎａ）ウィルスは、主と して単球に感染することによって免疫抑制を起こす。

他の報告は、単球が感染におけるウィルスの貯蔵所として１−２９６）。ＡＩＤ Ｓ患者においてＴ細胞は実際にはＨＩＶ−Ｉの外被タンパク質を溶解型で脱離し 得ることが知られているので、感染した単球は、これらの患者のヘルパーＴ細胞 の損失を仲介していると推測されている（Ｓｉｌｉｃｉａｎｏ、　Ｒ，Ｐ、ら、 Ｃｅ１ｌ　（１９８ｇ＞　５４：５６１−５７５＞。

本発明のいくつかの化合物は、インビボで自己集合する能力を示し、かつ一般の レトロウィルスのライフサイクルに、恐らくその逆転写酵素の活性に干渉するこ とによって干渉する能力を示し、このように、レトロウィルス感染症の予防剤お よび治療剤として有用である。

発明の開示 本発明は、ヒト被検体におけるＨＩＶ感染を阻害し得る結合体の無毒の前駆体（ 前駆物質）および、ヒトならびに動物の被検体のレトロウィルス感染を阻害し得 る比較的無毒の結合体とを提供するものである。この前駆体は、投与後、選択的 にＨＩＶ感染部位に自己集合し得、ウィルスに対して有毒な結合体を形成する。

このことは、被検体に対しては生物学的に安全な物質であるがそれにもかかわら ず、適切な部位に集合したときに標的の感染に対して有毒となる物質を用いて患 者を治療することを可能とする。その集合が標的ウィルスの部位に大部分限定さ れるので、集合した結合体の治療される患者に対するどの毒性副作用も最小とな る。投与された結合体は、それ自体は、レトロウィルスに対し有毒でもあり、逆 転写酵素を阻害するようである。

このように、ひとつの観点からは、本発明は、ＨＩＶウィルス感染症のようなレ トロウィルス感染症を治療する方法に関する。この方法は治療に必要な量の前駆 体を必要とする被検体にこれを投与することを包含し、この前駆体は、生体内原 位置で有効量の結合体に組み立てられ、そしてその結合体はウィルス感染を阻害 するのに効果的である。

別の観点から、本発明は、得られる結合体に関する。これらの結合体は、市販さ れている無毒の染料、ルシファーイエローＣＨ（ＬＹ−ＣＨ）の誘導体とその類 似体である。一般に、これら結合体は下記式（１）で表される：Ｒ−ＮＨＣＯＮ ）ＩＮ＝ｃＨ−Ｙ−Ｃ）ｌ＝ＮＮ）ＩｃＯＮ）ｌ−Ｒ（１）ここでＲは下記Ｒ− ＮＨＣＯＮＨＮ＝ＣＨ−Ｙ−ＣＨ＝ＮＮＨＣＯＮＨ−Ｒで表される：ここで２は １つもしくは２つの非千渉性置換基を表し、そして Ｙは第２図に示す結合部分からなる群から選択される。

この結合体は、下記式（２）と（３）で表される前駆物質の生体内原位置での反 応によって形成される口 Ｒ−Ｎ　ＨＣＯＮ　ＨＮ　＝　Ｃ）！　−Ｙ　−ＣＨＯ（２）？よび Ｒ−ＮｆｌＣＯＮＦｉＮＨｚ　（３） ここでＲとＹは前記定義と同一である。

したがって、ひとつの観点からは、上記のように、本発明は、ヒト被検体におけ るＨＩＶ感染症のようなレトロウィルス感染症を治療する方法に関し、その方法 は前駆体が式（２）と（３）の：４１造をもつ式（′Ｌ）の抗ウイルス結合体の 前駆体を適切な被検体に投与することを包含し、ここでＲとＹ　４前記定義のと おりであり、これら前駆体はウィルスに敏感なあるいはウィルスに感染した細胞 の存在下自己集合が可能である。

他の観点から、本発明は、式（２）と（３）で表される前駆体を包含する製薬組 成物と、この組成物の調製および感染の治療に有用なある種の新規物質に関する 。

さらに別の観点からは、本発明はヒトもしくは他の動物のレトロウィルス感染症 を治療もしくは予防する方法に関し、その方法はそのような治療を要する被検体 に、ウィルス感染を阻止もしくは予防するのに有効な量の下記結合体を投与する ことを包含する。

他の観点においては、本発明は、これら結合体およびこれら結合体を含有する薬 剤組成物に関する。これらの結合体は、市販されている無毒の染料のルシファー イエローＣＨ（ＬＹ−ＣＨ）の誘導体とその類似体である。一般にその結合体は 、下記式（４）で表される： ここで、ＲはＬＹ−ＣＨもしくは前記定義の類似体残基、Ｒ１はＨもしくはアル キル（１−６Ｃ）；およびＲ２はアルキル（１−６Ｃ）もしくはアリール（６− １０Ｃ）もしくは２−５の前記アリール基を含有する“連結した”アリール（６ −１００）、該アルキルもしくはアリール置換基は１−２の非干渉性基で置換さ れていないかまたは置換されている。Ｒ２のいくつかの典型的な実施態様を第４ 図に示す。

さらに他の観点から、本発明は式ＲＮＨＣＯＮＩ（Ｎ）１２の化合物を式Ｒ’Ｒ ２ＣＯの化合物と接触させ、生成した結合体を回収することを包含する式（４） の化合物の調製方法に関する。

図面の簡単な説明 第１図は、化合物スラミンナｌ−ＩＪウムの代表的な類似体を示す。スラミンナ トリウムは第１図に構造Ａとして示す。

第２図は、本発明の前駆体と結合体中の部分Ｙの実施態様を示す。

第３図は、前駆体Ａｔ−Ａ９と結合体Ｈ１−Ｈ９の合成法を示す。

第４図は、本発明の結合体中の部分Ｒ２の典型的実施態様を示す。

第５図は、結合体Ａ４の合成法を示す。

第６図は、ＨＩＶ−１から単離さた逆転写酵素の阻害に対するＡ４とスラミンの 効果を示す。

第７図は、ネコ免疫不全ウィルス（ＦＩＶ）から単離された逆転写酵素を阻害す るスラミンとＡ４の効果を示す。

第８図は、本発明の化合物Ａ４による、ネコ腎臓細胞中でのＦＩＶの増殖の阻害 を示す。

第９図は、ＦＩＶを含有する感染ネコ細胞の生存度に対するＡ４の効果を示す。

第１０図は、Ａ４がヒトマクロファージ様細胞系Ｕ９３７によって吸収され保持 されていることを実証する蛍光励起細胞分離抽集装置（ＦＡＣ３）の試験結果を 示す。

発明を実施する様式 生体内原位置で形成される結合体とその前駆体は、無毒の市販染料ルシファーイ エロー（ＬＹ−ＣＨ）もしくはその類似体から誘導される。ＬＹ−ＣＨは下記式 を有し、したがって、セミカルバジ・ドである。

Ｈ２ 市販されている物質はリチウム塩の形態である。しかし他のスルホネートの塩、 またはフリーの酸の型でさえも製剤に利用し得る。もちろん、スルホネートのイ オン化状態は、周囲の媒体のｐＨに依存する。化合物を治療のために投与する際 に使用するのに適切な塩には、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウ ム、マグネシウムなどの無毒の無機イ１ンが包含され、かつ四級アミンのような 有機カチオンでもあり得る。一般に無機イオンが好ましく、これらは化合物の溶 解度を太き（し安価である。フリーの酸の型も、ｐＨを生理的に適合した値に調 節する適切な製剤の製造に利用し得る。

ルシファーイエロ一部分の”類似体”は下記式で表される：ここで、Ｚは、いず れかの環における１つもしくは２つの無害な置換基を示し、例えば、低級アルキ ル、低級アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、チオ、アルキルアミノ、アルキルチ オもしくはハロゲンである。Ｚの性質は、自己集合性、結合体の効力、または前 駆体の無毒性を阻害しない限り、これら類似体において重要ではない。したがっ て、ルシファーイエローの”類似体”とは、ルシファーイエロー自体に存在する 単一のアミノ基以外の異なる置換基をナフタレン核に有する、ルシファーイエロ ーに関連したナフタレンジスルホネートを意味する。ルシファーイエローの場合 と同様に、類似体スルホネートは、フリーの酸または製薬的に許容される塩の形 態であり得る。

自己集合性ヒドラゾン、ＬＹ−ＣＨの公知の取り込み特性に基づく計算、細胞内 のエンドソームとリソソームの相対容積、およヒドラゾンの生成を表すことが知 られている各種の速度論的パラメーターに関しては、生成物のヒドラゾンの抗ウ イルス濃度が、前駆体の亜細胞毒性濃度を用いて、単球リゾソーム内に、単球の 外側に測り得る結合体を形成させることなく得られ得ることを計算できる。これ らの計算は手作業で、もしくはコンピューターシミュレーションを用いて行われ る。

さらに、自己集合性ヒドラゾンもしくは好適なセミカルバゾンに対する各種パラ メーターの証明は、Ｔ−リンフォトロビックレンチウイルス（Ｔ−１ｙｍｐｈｏ ｔｒｏｐｉｃ　１ｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）であるネコ免疫抑制ウィルス（Ｆ　Ｉ　 Ｖ）を含有するネコのモデルシステムを用いて得られ得、このウィルスは、ネコ ニーリンパ球、ネコの末梢単球由来のマクロファージ、およびＣＣＬ９４ネコ腎 臓由来の繊維芽細胞に、インビトロで感染させ得る。

ＦＩＶの症状がヒトのＡＩＤＳ感染症の症状に類似しているので、これは、一般 にＨＩＶとレトロウィルスの感染に対する適切なモデルシステムを提供する（Ｐ ｅｄｅｒｓｏｎ、　Ｎ、　Ｃ，ら、本発明の範囲内のルシファーイエローとその 類似体の細胞毒性は低い。マウスに静脈注射したＬＹ−ＣＨに対するＬＤ４ｏは １ｇ／ｋｇより太きく　（Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ、　Ｓ、、（１９８７年の個 人的コミュニケーション））、ＬＹ−ＣＨには６００μＭの濃度でマウスのチオ ールマクロファージに対してインビトロで細胞増殖抑制活性は全く観察されない （Ｓｗａｎｓｏｎ、　Ｊ、　Ａ、ら、Ｊ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ　（１９８５）　 １００：８５１−８５９）。

好適な形態の前駆体は、Ｒが、ルシファーイエローの三環式残基で、すなわちＺ が図示した位置にあるＮＨ２である前厘体を含有する。Ｙの好適な実施態様は、 第２図の式１−４で示したものであり、特に最も好適なものは、第２ｒＸＪの式 ２−２で示したものである。したがって前駆体として特に好適なものは、式３の 化合物のような、薬学的に受容され得る塩の形態のルシファー染料ＣＨ自体、ふ よびここてＡ２と命名された、下記式の化合物である。

こ３はＬＹ−ＣＨとベンゼン−１，３−ジアルデヒドとの縮合生成物である。

（以下余白） ｌ　ＬＹ−ＣＨと結合すると、結合体はＲ２と命名される下記）　式を有するよ うになる： 石 （ν人］に倉、自ｐ したがって一連の好適な前駆体と結合体が構築されるが、式（３）の化°合物は ルシファーイエローの薬学的に受容され得る塩で、式（２）の化合物はルシファ ーイエローと第２図に示す各種の式のＹから誘導される。これらの式（２）の化 合物はＡｌ−Ａ９と命名され、これら前駆体はＬＹ−ＣＨと結合体を生成し、式 Ｈ１からＲ９の対応するジヒドラジン（セミカルバゾン）を与える。これらの実 施態様のすべての合成法を第３図に略記する。第３図に示すように、第２図に式 １−９として示されたＹの実施態様のジアルデヒドをまず調製し、１モル当量の ルシファーイエローと反応させて前駆体Ａｌ−Ａ９を得る。次に他の前駆体と反 応させ、ＬＹ−ＣＨが毒性の抗ウイルス結合体Ｈ１−Ｈ９となる。２回目の１モ ルのＬＹ−ＣＨとの反応はもちろん、好適な場合には、生体内原位置で起こり得 る。

式４の単純なヒドラゾン（セミカルバゾン）に関して、好適な形態の結合体はま た、Ｒがルシファーイエローの三環式残基のもの、すなわちＺが図示した位置の ＮＨ，である結合体を含有する。

Ｒ’の好適な実施態様はＨと低級アルキル（１−４＞であり、最も好適なものは Ｈである。アルキルとは、指定された数の炭素原子を有する直鎮状または分枝状 の飽和ヒドロカルビルを意味し、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プ ロピル、ｔ−ブチル、ｎ−ブチル、ｉ−ヘキシル、ｎ−ヘキシルおよび３−メチ ルペンチルである。

Ｒ２については、特にＲ１がＨでない場合には、Ｒ２はアルキルであり得るが、 Ｒ２がアリールの結合体が好ましい。

アリールとは、芳香族の性質を有する６−１０員の単環もしくは縮合した２環系 を意味する。その環は、環を形づくる物質として炭素だけを含有し得るか、また はＮのようなヘテロ原子を一つまたはそれ以上含有し得る。したがって、アリー ル置換基として代表的なものは、フェニル、ピリジル、ナフチル、キノリル、ピ リミジルなどの部分である。そのアリール置換基は、結合体の薬理学的作用を阻 害しない１−２個の非水素原子の置換基を含有し得る、代表的な置換基としては 、限定されないが、低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、チオ 、アルキルアミノ、アルキルチオ、ハロゲン、力Ｊレボキシ、カルバルコキシも しくはＣＨＯが挙げられる。

置換基Ｒ２としては、複数の“連結”アリール（または恐らくより適正にはアリ ーレン）置換基を挙げることができ、これは、６−Ｉ　ＯＣのアリール部分の合 計１〜５個が非芳香族の置換基または共有結合によって連結されて、伸長鎖のア リール基を形成している。恐らく、これの最も簡単な例は、２つのフェニル基が 単一の共有結合で連結されているビフェニルである％　Ｒ２の実施態様である。

この種の“ネックレス形”のアリール部分の他の例は、第４図に示しであるが、 いくつかの例ではフェニル基が−ＣＯＮＨ−または−ＮＨＣ○ＮＨ−で連結され ている。その外の種類の連結は、ヒドロカルビレン連結と−ＣＨ＝ＣＨ−による 共役型の連結を包含する。単一のアリール置換基の場合のように、伸長類を形成 するアリール基は、１−２の非干渉性の置換基で置換され得る特に好適な置換基 は−ＣＨ０である。特に好適なものぽまた少なくとも二つの連結されたアリール 基が置換基Ｒ２中に存在する実施態様であり、最も好適なものは、第４図に式４ −４として示しである置換ビフェニルである置換基である。

したがって結合体として特に好適なものは、薬学的に受容され得る塩の形態のも のを含有するルシファーイエローＣＨ自体、および下記式の化合物である。

アルデヒドを得る。次にこのジアルデヒドをルシファーイエローのリチウム塩と 、コントロールされた条件下で反応で反）。　応させて単一の結合体Ａ４を得、 次いで、この結合体を標準のクロマトグラフィー法を用いて単離する。リチウム 塩は、所望により、薬学的に受容され得る別の無毒の塩に変換され［ ているこれらの類似体は同様にリソソームによって吸収されい。したがって、こ れらの生物学的利用能は、このようには減少しない。

したがって、ルシファーイエローとその誘導体から誘導される前駆体と結合体の 選択性は、例えば好中球のような非刺激性細胞より、単球のようなウィルス刺激 性細胞の方にホームすると考えられる。こらにルシファーイエローから誘導され る物質がリゾソーム中に濃縮されるとき、ｐＨが比較的低い（４−５＞場合、ヒ ドラゾンもしくはセミカルバゾンを生成する反応が優先される。

ＰＣＴ出願ＷＯ３８１０００４７は、参考文献としてここに採用するものである が、これに記載されているように、所望の標的細胞中に前駆体が濃縮されると、 有毒物質が二次反応によって前駆体から生成した場合に、選択性が拡大される。

したがって例えば、標的細胞中の核前厘体の濃度が他の目的場所に比べて３倍高 いと、標的と残りの組織の間の濃度差は９倍になる。本適用において、これは、 結合体を形成させる標的内に見られる好ましい条件、すなわち正反応に対する速 度定数が増加するような条件によって増強される。

な場合のように、活性の目的部位への投与により、成分の局所濃度が高いことに よって生物学的に活性な結合体の集合が増強され、そして成分の標的部位からの 拡散は、それらの結合する傾向により、自動的に低下する。例えば、Ｒｅ　ｍ　 ｉ　ｎされる。いくつかの例では、本発明の前駆体で形成された結に投与し得る 。しかし前駆体を、別個に、同時にかつ同じ位置に、または異なる場所に同時に 、または同じ場所に異なる時間に投与することが好ましい。

ＨＩＶ感染症の治療として前駆体を用いる全身投与が可能である。というのはＬ Ｙ−ＣＨがマクロファージのエンドソームとリソソームに吸収されて濃縮される ことが知られていが濃縮される。したがってこの化合物が、ウィルス感染が見お よび／または成分の選択に依存する。大部分の実施態様では約０．１−５ｇ／週 のオーダーの結合体の投薬量が適切なようである。ＬＹ−ＣＨと上記の補助的な 好ましい化合物、すなわち前駆体については、各成分を１００ｍｇ−３ｇ／週の 割合で投与するのが適切である。

あらかじめ形成した結合体は、約１−１０００ｍｇ／ｋｇ体重の量で、静脈、筋 肉、経口もしくは腹腔に投与され得る。

必要な投薬量のレベルは、もちろん特定の結合体の選択およびレトロウィルス感 染症を治療する被検体の性質と感染症の程度、もしくはその潜在性に依存する。

投与には、治療もしくは予防の効果または両方の効果がある。はとんどの実施態 様では、約０．１−５ｇ／週のオーダーの結合体の投薬量が適切なようである。

好適な方法において、微粒子形態で投与するために、前駆体を誘導体化すること によって、例えば炭水化物に結合することによって、ウィルスをもっているマク ロファージ細胞を選択的に殺すことができる。薬剤が粒子として認識されるので 、マクロファージによって容易に攻撃される。

下記実施例は例証を目的とするもので、本発明を限定するものではない。

（以下余白） 実施例１ 前駆物質および結合体のＨＩＶに対する作用試験培養系はＭＴ−２細胞を使用す る。この細胞は、ＨＴＬＶ−１（Ｒｉｃｈｍａｎ、Ｄ、Ｄ、ら、Ｊ、ＥｘｐｏＭ ｅｄ。

１６６巻、１１４４〜１１４９頁、１９８７年）に感染したヒトから得られるＴ 細胞由来の白血病細胞系である。これらの細胞を培養し次いでＨＩ　Ｖ−１に感 染させると、これらの細胞は、自己融合によってシンジチア（ｓｙｎｃ　ｉ　ｔ 　ｉａ）と呼ばれる多核巨大細胞を形成する。これらのシンジチアは顕微鏡で観 察して定量することができる。

２　ｒｎ　Ｍ　クルクミン、ポリブレン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ Ｕ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１０％ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ− １６４０培地に６Ｘ１０’細胞／ｍｌのＭＴ−２細胞を含有する懸濁液１０ｍ１ に、ＨＩＶを添加することによって、感染細胞ストックを調製する。

１０ｍ１のＭＴ−２懸濁液に、６０ｔｔｌのＨＩＶウィルス濃縮物〔１０７“組 織５０％感染疾患単位（ｔｉｓｓｕｅ　５０％　１ｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｄｉｓ ｅａｓｅ　ｕｎｉｔｓ）”（Ｔ　ＣＩ　Ｄｓｏ）　／ｍ　ｌ、５７３５株〕を加 える。

試験される前駆物質もしくは結合体の、２×最終濃度の溶液を、２４ウエルの組 織培養プレート中で感染細胞ストックによって希釈した。薬剤ストックおよび感 染細胞ストックの核１００μｌを使用した。３７℃にて５％ＣＯ□、１００％湿 度の雰囲気下で、３〜４日インキュベートした後、細胞をシンジチア形成につい て検査し、０　（シンジチアなし）から４（最大のウィルス細胞変形作用、すな わち抗ウィルス活性なし）までの格付けで評価した。

１０μＭ１４０μＭおよび２００μＭの濃度のルシファーイエローＣＨを試験し たが、すべて抗ウィルス作用を全く示さず４の格付けがなされた。ＬＹ−ＣＨは ８００μＭでも抗ウイルス性を示さなかった。Ａ２を１０μＭ１４０μＭおよび ２００μＭの濃度で試験したところ、２種の低い方の濃度では抗ウィルス作用は なかったが２００μＭではわずかに作用があった（格付け３）。４００μＭおよ び８００μＭの濃度のＡ２はシンジチアの生成を完全に阻害した。薬剤が１００ μＭ濃度のＬＹと１００μＭ　Ａ２とを組み合わせて含有しているときには、顕 著な抗ウィルス作用（２つの異なった測定で格付けは０および１であった）が見 出された。組み合わせた前駆物質が低レベル濃度（各々２０μＭｉよび５μＭ） である場合には、抗ウィルス作用は全く示されなかった。

上記の結果においては、ウェルに添加される薬剤溶液の最終濃度の１０倍の濃度 の組み合わせ薬剤を調製するために使用されるストック溶液は、希釈してインキ ュベーションを開始する前に、細胞培養物々共に２５℃で１時間インキュベート された。

同様におこなった次の実験では、上記の再結合を行わなかったので、培養物に添 加する前の結合は起こらなかった。これらの条件下では、より高い濃度の組合せ が必要であった。

この検定試験で、１００μＭ濃度のＡ２＋１００μＭ濃度のＬＹ−ＣＨで予備結 合なしの場合には、抗ウィルス作用は示さなかった。しかし両成分の濃度を２０ ０μＭに上げたときには、中位（２〜３）の抗ウィルス作用が示され、両者の濃 度が４００μＭである組合せの場合には抗ウィルス作用が強かった（０）。しか し、４００μＭのＡ２単独および８００μＭのＡ２単独の場合にはまた顕著な抗 ウィルス作用が示され、そして２．００μＭのＡ２単独の場合には中位の抗ウィ ルス作用（３）が示される。試験されたＬＹ−ＣＨのすべての濃度（１００〜８ ００μＭ）においては、抗ウィルス作用は見られなかった。

同様の検定を、抗ウィルス活性の基準として、ＭＤＭ中で（７）ＨＩ　Ｖウィル ス抗原の発現を利用して行った。これらの検定では、発現をＯ（完全な阻害）か ら１８０まで（薬剤の作用なし）の格付けを行った。この検定においては、表１ に示す下記の結果が得られた。

表１ ４０μＭＬＹ　１７０ ２００μＭＬＹ　、９５ ４０μＭ　Ａ２　２００ ２００μＭＡ２１３５ ■００μＭ　ＬＹ ＋１００μＭ　Ａ２　８３ 表１に示すように、この検定によれば、ＬＹの作用を、Ａ２を添加することによ り劇的に増大させることができる。

使用した化合物はいずれも、上記の使用濃度で、ネコ腎臓上皮細胞に対して４日 後、またはヒト単球由来のマクロファージに対して５日後に、細胞毒性でなかっ た。しかし、予備インキュベーションを行った１５０μＭ　Ａ２＋２５０μＭＬ Ｙ−ＣＨは、未反応成分が阻害作用を示さなかった全増殖期間において、５０％ の阻害を示した。

標準法を用いて、ＨＩＶ−１もしくはＦｒＶから単離した逆転写酵素を阻害する 能力について、化合物Ａ４を最初に試験した。試験結果を、ＨＩ　Ｖ−１および ＦＩＶのそれぞれについて、第６図および第７図に示す。各々の場合に、Ａ４は スラミンよりも強く上記酵素を阻害した。ＩＣ，。の近似値は、ＨＩＶ−１に対 しては２００μＭであり、ＦＩＶに対しては２０μＭである。

またＡ４は、ネコ腎臓細胞を含有する培養物中でＦＩＶの増殖を阻害する能力に ついて、標準検定法を用いて試験された。第８図に示すように、３０μｇ／ｍｌ の濃度のＡ４を用いることによって、ＦＩＶの成長および増殖は、感染に続く２ ０日間以内において、実質的に完全に阻害され、２０μｇ／ｍ１のＡ４を投与し た場合には、相当する阻害が感染に続く４０日後に得られた。低濃度でも同様の 作用をもっているが余り劇的ではない。

第９図に示す試験結果では、感染した細胞の生存度に対するＡ４（２０μｇ／ｍ ｌ）の作用を示す。この濃度のＡ４によって、感染後５０日間以内に感染細胞は ′１００％の生存度を回復した。

最後に第１０図は、マクロファージ細胞系Ｕ９３７がＡ４を吸収し保持すること を示している。

インビボによる試験では、化合物Ａ４を６０ｍｇ／ｋｇの投与量で２匹のマウス の腹腔内に注射した。１５日後にも明らかな毒性は現れなかった。これはこの結 合体が比較的無毒であることを示している。

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Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒト被検体のレトロウィルス感染症の治療法であって、そのような治療を必 要とする被検体に抗ウィルス結合体の前駆物質を投与することを包含し、該結合 体が次式（１）で示され、そして、 該前駆物質が、ウィルス感染した細胞もしくはウィルス感受性細胞の存在下で自 己集合して該結合体になり得る、治療法： Ｒ−ＮＨＣＯＮＨＮ＝ＣＨ−Ｙ−ＣＨ＝ＮＮＨＣＯＮＨ−Ｒ（１）ここで、Ｒは 下記式を有し： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｚは、１もしくは２個の非干渉性置換基を示す）、Ｙは、第２図に２− １から２−９として示される部分でなる群から選択される。
2. ２．前記前駆物質が、式（２）および（３）で示される、請求項１に記載の方法 ： Ｒ−ＮＨＣＯＮＨＮ＝ＣＨ−Ｙ−ＣＨＯ（２）およびＲ−ＨＨＣＯＮＨＮＨ２（ ３） ここで、ＲおよびＹは、請求項１で定義したとおりである。
3. ３．前記Ｒが下記式で示され、薬学的に受容され得る塩として存在する、方法： ▲数式、化学式、表等があります▼
4. ４．式（３）および（２）の前駆物質がＬＹ−ＣＨおよびＡ２であり、そして該 結合体がＨ２である、請求項３に記載の方法。
5. ５．式：Ｒ−ＮＨＣＯＮＨＮ＝ＣＨ−Ｙ−ＣＨ＝ＮＮＨＣＯＮＨＲで示される化 合物：ここで、Ｒは下記式を有し： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｚは１もしくは２個の非干渉性置換基を示す）、そして、 Ｙは、第２図に２−１から２−９として示される部分でなる群から選択される。
6. ６．ＨＩＶ感染症を治療するのに有用な薬剤組成物であって、次式で示される化 合物の前駆物質を活性成分として含有し、該前駆物質がウイルス感染した細胞の 存在下で自己集合して該接合体となり得る、薬剤組成物：Ｒ−ＮＨＣＯＮＨＮ＝ ＣＨ−Ｙ−ＣＨ＝ＮＮＨＣＯＮＨＲここで、Ｒは下記式を有し： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｚは、１もしくは２個の非干渉性置換基を示す）、Ｙは、第２図に２− １から２−９として示される部分でなる群から選択される。
7. ７．レトロウィルス感染症の治療に有用な薬剤組成物であって、活性成分として 次式（２）および（３）の化合物を含有する、組成物： Ｒ−ＮＨＣＯＮＨＮ＝ＣＨ−Ｙ−ＣＨＯ（２）およびＲ−ＮＨＣＯＮＨＮＨ２（ ３） ここで、Ｒは下記式を有し： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｚは、１もしくは２個の非干渉性置換基を示す）、Ｙは、第２図に２− １から２−９として示される部分でなる群から選択される。
8. ８．動物被検体のレトロウィルス感染症を治療もしくは予防する方法であって、 そのような治療または予防を必要とする動物被検体に、次式で示される抗ウィル ス結合体またはその薬学的に受容され得る塩を投与することを包含する、方法： ▲数式、化学式、表等があります▼（４）ここで、Ｒは下記式を有し： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｚは、１もしくは２個の非干渉性置換基を示す）、そして、 Ｒ１はＨもしくはアルキル（１−６Ｃ）；そして、Ｒ２はアルキル（１−６Ｃ） またはアリール（６−１０Ｃ）、またはそのようなアリール基２個から５個を含 有する連結アリール（６−１０Ｃ）であり、該アルキルまたはアリール置換基は 置換されていないかもしくは１個から２個の非干渉性置換基で置換されている。
9. ９．前記結合体が下記式で示される、請求項８に記載の方法： ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、Ｒは請求項８で定義したとおりである。
10. １０．前記結合体が、次式で示される化合物またはその薬学的に受容され得る塩 である請求項９に記載の方法：▲数式、化学式、表等があります▼
11. １１．式（４）で示される化合物またはその薬学的に受容され得る塩： ▲数式、化学式、表等があります▼（４）ここで、Ｒは下記式を有し： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｚは１もしくは２個の非干渉性置換基を示す）、Ｒ１はＨもしくはアルキ ル（１−６Ｃ）；そして、Ｒ２はアルキル（１−６Ｃ）またはアリール（６−１ ０Ｃ）、またはそのようなアリール基２個から５個を含有する連結アリール（６ −１０Ｃ）であり、該アルキルまたはアリール置換基は置換されていないかもし くは１個から２個の非干渉性置換基で置換されている。
12. １２．レトロウィルス感染症の予防または治療に有用な薬剤組成物であって、活 性成分として有効量の請求項１１の化合物を含有する組成物。
13. １３．次式の化合物を合成する方法であって、▲数式、化学式、表等があります ▼ 式：Ｒ−ＮＨＣＯＮＨＮＨ２ （Ｒは前記で定義したとおりである） で示される化合物を、 式：▲数式、化学式、表等があります▼（式中Ｒ１およびＲ２は前記で定義した とおりである）で示される化合物と接触させること、および式（４）で示される 化合物を回収すること、を包含する方法。