【発明の詳細な説明】
質量分析器による医薬品中のエンドトキシンの検出法
本発明は、ペプチド組成物中のエンドトキシンの検出法に＠する。更に詳しくは
、本発明はペプチド組成物のサンプル中にあるエンドトキシンの揮発性誘導体化
成分（／−ヒドロキシミリスチン酸）の量を定量してエンドトキシンを測定する
ことに関する。本発明は、例えば遺伝子組換ＤＮＡ技術で製造された生成物とい
った、臨床上用いられる非経口用治療剤として用いられヒト及び獣医用に意図さ
れた生成物（製品）中のエンドトキシン含量を決定するのに用いることができる
。
組！ｉｔ！ＤＮＡ技術によって得られたポリペプチドは、はんの最近臨床的に治
療桑とし１人手し５るよ５になってきたものである。ヒトインシュリン、ヒト成
長ホＡ／モン、α−インターフェロン、組織ブラスミノーアンアクチベーターと
いったポリペプチドがヒトの病気の治療剤に米ｒＭＦＤＡで本誌された。他の数
種のインターフェロン（Ｍ、ｔＧｆ、α−インターフェロン、／−１７ターフエ
ロ／及びｒ−インターフェロンのサブセット）、インターロイキン−２及びＴＮ
Ｆ（ツモアヌクレオシスファクター）は、癌の治療剤に世界中の医療機関で臨床
治験がなされ【いる。数多くのポリペプチド７アクターが製造され、鉄部の５ち
に臨床試験されることが期待され℃いる。
しかしながら、そのような製品を臨床に用（・るにあたつ【の大きな間亀は、米
国ＦＤＡなとでめられるそれら製品の同一性、純度及び生物学的な力価を保償す
る品質的に制麹された方法を開発することである。すべての薬剤に対し℃米国Ｆ
ＤＡなとで要求される最も重畳な品質試験の一つは、最終製剤中のエンドトキシ
ンを＃ｊ定するものである。本試験は、微生物中で組換ＤＮＡ技術によって製造
せしめられる薬物にとって’ＩＫＩ蚤な試験である。エンドトキシン含量定のた
めの標準的な方法は、リムルス テス） （ｌｉｍｕｌｕｓ ｔｅｓｔ ）であ
った。その方法はエンドトキシンがカブトガニ（ｈｏｒｓｅｓｈｏｅ ｃｒａｂ
）のリンパ１ｔＬを凝固せしめる作用を持つことに基づいたものである。この
バイオアッセイ法は比較的感度が鳥いけれども、それは満足し５る程特異的なも
のでなく、また標準化することの欅しい試験法であり、拘楓性が悪いという欠点
を有し℃いる。
本発明は、エンドトキシンに独仲な揮発性の誘導体化された成分を形成さ・せそ
して測定することにより非常に効率よくエンドトキシンを測定する方法を確立す
るものである。
本発明は、次なる１糊からなるポリペプチド組ｍ物中のエントドキシ７のｍｌ定
法に関する：咳エンドＦｌシンを含有するポリペプチド組成物を加水分解し＋Ｃ
，／−ヒドロキシミリスチン酸を形成ゼしめ：得られた加水分解物をアルカノー
ルでもってエステル化せしめ；
七の加水分解物中に存在するカルボアルコキシ基１ｋｔ元せしめ曵、ヒドロキシ
メチル基とし；その還元された加水分解物から揮発性アルコールを分離せしめ；
次に質量分析器（マス スペクトロメトリー）でβ−ヒドロキシミリスチリルア
ルコールを検出する。
本発明は、さらに次なる工程すなわち、ペプチド組成物を加水分解し、その得ら
れた加水分解物をアルカノールでエステル化せしめ、その加水分解物中に存在す
る遊離の７ミノ基をアシル化せしめ、その加水分解物中のカルボアルコキシ基を
還元せしめて、ヒドロキシメチル基とし、その還元せしめられた加水分解物から
！−ヒドロキシミリスチルアルコールを抽出せしめ、その抽出したＩ−ヒドロキ
シミリスチルアルコール＆−誘導体化せしめ、その加水分解物から揮発性の誘導
体化された生成物を分離せしめ、次に質量分析器によって揮発性のＩ−ヒドロキ
シミリスチン酸の＊導体化されたアルコールを検知定量する工程からなるペプチ
ド組成や中のエンドトキシンの糊定法に関する。
本発明は、ポリペプチド組成物中のエンドトキシンの存在の検知法にもかかわる
ものである。本明細畳及び請求の範囲のうちで用いられ℃いる用＠「エンドトキ
シン」とは、グラ五隘性細−のパイロジエン（発熱物質。
９１ｒｏｇｅｎ ）及びリポポリサッカライド（Ｉ、Ｐａ）をも含むものである
。
本発明の方法は、加水分解によってエンドトキシンをβ−ヒドロキシミリスチン
酸く転化せしめ、次にそのＩ−ヒドロキシミリスチン酸をβ−ヒドロキシミリス
チルアルコールに転化せしめ、さらにその他の加水分解生成物からＩ−ヒドロキ
シミリスチルアルコールを分離した後それを質量分析器で検知することを含むも
のである。
β−ヒドロキシミリスチン酸の揮発性誘導体の生成方法は、エンドトキシンを含
有する生物学的な系を加水分解せしめ、次にその得られた加水分解物をエステル
化せしめ、その加水分解物中に存在し℃いるカルボアルコキシ基な還元によって
ヒドロキシメチル基（−ＣＨ，ＯＨ，）に変換せしめ、その加水分解物から揮発
性アルコールを分離するという工程によってなされうる。
好ましい！−ヒドロ中シミリステン酸の揮発性＃導体の生成方法は、次なる工１
！！：
ａ）該ポリペプチド組成物中にあるエンドトキシンなその成分に加水分解し；
ｂ）その結果得られた加水分解物をアルコールでエステル化し、とりわけ！−ヒ
ドロキシミリスチン瞭のアルキルエステルな形成せしめ；
Ｃ）その加水分解物中に存在するアミノ基をアシル化し；ｄ）その加水分解物中
に形成せしめられたエステルのカルボアルコキシ基を還元してＣＨ，ＯＨ基とし
；ｅ）七の還元せしめられた加水分解物からＩ−ヒドロキシミリスチルアルコー
ルを選択的に抽出せしめ、ｆ）上記工程（ｅｌで抽出せしめられたアルコールを
、好ましくはその遊離のアルコール基をトリメチルシリル化することによって誘
導体化せしめる
ことによって行なうことができる。
次にそのシリル化された生成物は、公知の手段で分離せしめられ、好ましくはガ
スクロマトグラフィーによって分離せしめられるが、カラムクロマトグラフィー
もまた使用することができる。次にその揮発性の誘導体化された成分は、質量分
析の手法により同定され定量することができる。
カルボアルコキシ基を還元してヒドロキシメチル基にする方法は、水素化ホウ素
遡元剤を用いて行なうことができる。このよ５な還元におい℃、その加水分解物
の７ミノ基は、もしそれが存在するなら、還元剤のホウ素化合物と錯体を形成す
るであろうｅ
通常その得られた還元反応混合物を加水分解し℃、その魚元反応混合愉を可溶化
するためそのアミン−ホウ素結合を破壊することが好ましい。
前記した抽出工程におい工、この工程は、ハロゲン化員化水素、例えば、塩化メ
チレン、塩化エチレン、ジクｏｃｘエタン等のような過当な溶媒を選ぶことによ
り選択的に行な５ことができる。
本発明は、組換ＤＮＡ技術により製造されたタンパク質生成物中のエンドトキシ
ン含量の＃ｊ定と組み合わせ１特に用いられて有用であることが見出されている
けれども、本発明は、それに限定されず、例えば抗癌剤、抗高血圧剤、机側血症
剤、抗５つ剤勢の非経口用Ｋｌｌ造されたすべての医薬微晶及びすべての生物学
的な系に等しい利点を持って用いることができるとい５ことか理解されるべきで
ある。
次なる実施例は、本明細書の本発明の詳細な説明するためのものであり、それを
限定するものではない。
実施例
１、エンドトキシンの加水分解
１２０℃で１０分間６ Ｎ Ｈ（Ｊでインキエベーシ冒ン処理し、エンドトキシ
ンなその成分に分解せしめた。
２、誘導体化処理
先ずジアゾメタンを＆１１１１．次にそのジアゾメタンをオリゴペプチド混合物
と反応せしめてエステル化反応を行なった。
ａ、ジアゾメタンの１１Ｉ製
９９■のＮ−メゾルーＮ−ニトロソ−Ｎ−二ト四グアニジン（ＭＮＮＧ）をＰｉ
ｅｒｃｅ Ｍｉｃｒｏｇｅｎｅｒａｔｏｒ ｉｌｉ置の内管に入れた。次に４０
０μｊｆ）Ｈ，０ｔ７Ｉ：そのＭＮＮＧ中に加え、Ｓ淘敷とした。次に１５００
μＩのジエチルエーテルをそのＰｉｅｒｃｅ Ｍｉｃｒｏｇｅｎｅｒａｔｏｒ装
置の底部から充填し、その装置を水浴中に置いた。針を備えた１１の注射器を用
いて、４５０４ｎの５ Ｎ ＭｅＯＨ畝をＭＮＮＧを含有するその内管中にＥＥ
、ｔＬながら注入した。次にその装置を４５分間水浴中に保持し、反応を行なっ
て約６０％の収率でジアゾメタンを得た。
ｂ、ジアゾメタンとエンドトキシンの成分との反応所要量のジアゾメタンは次の
よ５ＫＬ”（推定した＝９９ｍｇのＭＮＮＧは、約４００＃ｍｏｊのジアゾメタ
ンを１５００声ｊ中で生成し、所要のジアゾメタンのモル数は、加水分解された
タンパク質のモル数の約１００倍である。
乾燥したＭｅＯＨを最終容量が１００μｊとなるよ５にＰＩＣＯＴＡＧチェンバ
ー中にピペットを用いて入れ、攪拌した。次に４０−１の乾燥したＭｅＯＨを各
サンプルチューブ中にピペットを用いて入れ、攪拌した。次＜４００μ）のジア
ゾメタン溶液をＰＩＣＯＴＡＧチェンバー中にピペットを用いて入れ、攪拌した
。上記のようにして所要量のジアゾメタン量を計算した後、この量の１０倍量を
各サンプルチューブ中にピペットを用いて入れ、次に攪拌した。ＰＩＣＯＴＡＧ
チェンバー中に残りのジアゾメタン溶液を加えた。密封したＰＩＣＯＴＡＧチェ
ンバーを久に４ｗ＃間室楓に置いた。ＰＩＣＯＴＡＧチェンバーから過剰の試薬
を除去した。久にそのサンプルチューブからの試薬を減圧（３０−６０ｍＴｏｒ
ｒ）下ＰＩＣＯＴＡＧ俟皺中で除去した。
Ｂ、アシル化
新たに島餉したメチルトリフルオロア竜テート（ＭｅＴＦＡ）を１１１１シ、次
に５００ ｐｉのＭｅＴＦＡを５００μＩの乾燥したＭｅＯＨと混合した。２ｆ
ｉｌのトリエチルアミン（ＴＥＡ）を各サンプルチューブに入れ、攪拌した。
減圧（３０−５０ｍＴｏｒｒ）下ＰＩＣ’０ＴＡＧＩＣ中で試薬を除去した。５
００ ｔｓｌのＭｅＴＦＡ ： ＭｅＯＨｔＰＰ Ｉ ＣＯＴＡＧチェンバー中
にピペットを用いて入れ、攪拌した。
２ｓｌのＴＥＡを各サンプルチューブ中に入れ、攪拌した。６μｍのＭｅＴＦＡ
：ＭｅＯＨを各サンプルチューブ中に入れ、攪拌した。次にＰＩＣＯＴＡＧチェ
ンバーの圧力なＮ、で４倍にＰＩＣＯＴＡＧ侠置中で加圧した。次に密封された
ＰＩＣＯＴＡＧチェンバーを室温１暗室中に１晩置いた。次に過剰の試薬をＰＩ
ＣＯＴＡＧチェンバーから除去し、七のＰＩＣＯＴＡＧチェンバーをＭｅＯＨで
洗った。
減圧下（３０ｍＴｏｒｒ）ＰＩＣＯＴＡＧ装置のサンプルチューブから試薬を堆
り除いた。
トリ皇水素化ホウ素（ＩＭ）のテトラヒドロフラン液を本反応の還元剤とし℃用
いた。８００μノのトリ重水素化ホウ素（Ｂ＊Ｄ＊）のテトラヒドロフラン（Ｔ
ＨＦ）ｔ−ＰＩＣＯＴＡＧチェンバー中にピペットを用い１入ね、攪拌した。
１００ ｆｉｌ ｆ） Ｉ Ｍ ＢＨＤ、／ＴＨＦを次に各サンプルチューブ中
にピペットを用いて入れた。ＰＩＣＯＴＡＧチェンバーの圧力なＮ！で４倍に加
圧し、次に９０℃３０分間ＰＩＣＯＴＡＧ装置中で加熱した。そのチェンバーを
定期的に除去し、攪拌した。
該チェンバーから過剰のＷＡ、薬を除去し、次に乾燥したＭｅＯＨで洗った。骸
チェンバーを攪拌した後、ＭｅＯＨ＆除去した。乾燥したＭｅＯＨ（２０声ｌ）
をゆっくりと各サンプルチューブに加え、Ｒｙｃ試薬を分解した０次に試薬を減
圧（２００ｍＴｏｒｒ）下ＰＩＣＯＴＡＧ装置中サンプルチューブから除去した
。完全Ｋｊ１元した彼、すベニのアミン基はホウ素原子と錯体を形成した。
Ｄ、ホウ素化合一の加水分解
本加水分解反応は、アミン−ホウ素結合を破壊するために行なった。この反応は
、ＨＣｊとＭｅＯＨの混合物を用い【行なわれる。ＨＣｊ／ＭｅＯＨ（ＩＮ）液
は、２ｍの乾燥ＭｅＯＨで３ＮＨＣｊのバイアル（ｌ−ンを希釈し、温合処理し
【ＩＮ造される。次に１−のＩ Ｎ ＨＣｊ ／ＭｅＯＨなＰＩＣＯＴＡＧチェ
ンバー中にピペットを用い℃入れ、攪拌した。
次に４０ ｆｉｔのＩ Ｎ ＨＣｊ ／ＭｅＯＨｖ各すンプルチューブ中に入れ
、攪拌した。ＰＩＣＯＴＡＧチェンバーを２０分間９７℃でＰＩＣＯＴＡＧ鋏置
中で加熱した。七〇ＰＩＣＯＴＡＧチェンバーから過剰の試薬を除去した。ＰＩ
ＣＯＴ Ａ Ｇ＊置中のテンプルチューブから、減圧（１００ｍＴｏｒｒ）下試
薬を除去した。
上記の工程をついで次のように繰り返した：ＩＮＨＣｊ／ＭｅＯＨ（１１Ｉｊ）
をＰＩＣＯＴＡＧチェンバーに加え、攪拌した。次Ｋ Ｉ Ｎ ＨＣｊ／ＭｅＯ
Ｈ（４０ｔｇｌ ）液を各サンプルチューブ中に加え攪拌した。ＰＩＣＯＴＡＧ
チェンバーを９７℃で２０分間加熱した。ＰＩＣＯＴＡＧチェンバーから過剰の
試薬を除去した。ただし、この工程においては、サンプルチューブからの試薬の
除去は４５ｍＴｏｒｒの減圧下に行なった。
Ｅ 抽出
誘導体化したエンドトキシンの成分は、メチレｙｐｃｘライド（ＣＨ，ＣＪＩ）
で抽出し、望ましくない副生物によリガスクロマトグラフィーあるいは質量分
析が妨害されないようにした。２００μノのＣＨ１Ｃノ！を各サンプルチューブ
に加え、各チューブをそれぞれ別々に３分間攪拌した。次にＣＨ，ＣＪＩを前も
って重量を計ったパイレックス製の食中にデカンテーションし工入れ、保存した
（バッチｌ）。この工程で副生物を除去し、次にその副生物な有磯密謀Ｋｌ解し
た（ボリアイノアルコール＃導体を含有する水性相からＩ−ヒドロキシミリスチ
ン酸の魚九銹尋体も除かれる）。
畿畝カリウム（ＫｔＣＯｓ ）の飽和＃亀が制振され、Ｃ浅Ｃｊ！で洗われ、次
ＫＦ遇される。そのサンプルチューブを水平位皺にし、１０μＩのＫｔＣＯｓｌ
ｌ！敵を一度に各サンプルチューブの上から加えた。久にそのサンプルをその雫
かそのチューブの紙に落ちて行くと共に攪拌した。鎖サンプルを精け、その雫を
チューブの上ｓＫ動かし、次に攪拌を繰り返した。これはサンプルとに、Ｃｏ、
［１とを混合するために行なった。２００μ）のＣＨ，Ｃｊ、を次に各サンプ
ルチューブ中に入れ、次Ｋ１分閲攪拌し、各相を分離せしめた。次に上澄み液を
前もつ１重量を計っておいたパづレックス管中にデカンテーションし″ｃ注意深
く入れた（バッチ■）。次の上澄み敵はポリアミノアルコールを含有し工いる。
あとに残った水性相は、水にのみ可溶である副生物を含んで−・た。
ＣＨ，ＣＪ、を減圧（１５０ｍＴｏｒｒ）下１’ＩＣ０ＴＡＧ装置中でサンプル
チューブ（バッチｌ及びバッチ■）から除去した。次にサンプルチューブの重さ
を計り、存在する物質の量を計算した。（もし重量がありすぎるなら、Ｋ、Ｃｏ
、を含有し工いる水性相はサンプルで汚染されている可能性かある。もしこのこ
とが起き℃いるなら、そのサンプルを２００μｊ（ＱＣＨ＊Ｃｊｔで洗い、デカ
ンチーシロンし、減圧（１５０ｍＴｏｒｒ ）下そのサンプルチューブからＣＨ
，Ｃｊ、を除去する。）。
Ｆ、シリル化
各５００βＶの当初のサンプルに対し、４μノのピリジン及び３０μｍのＴＭＳ
ＤＥＡ （）リメテルシリルジエチルアミンンをバッチ！及びバッチ■からのサ
ンプルに加え、次に各サンプルを１分間攪拌した。ＰＩＣＵＴＡＧデエンバーを
次に５６℃で２００分間攪拌た。この反応により、遊離のアルコール基にトリメ
デルシリル＆を加えた。そのテンプルチューブにキャブをして、−２０℃で分析
まで保存した。
エンドトキシンの成分をガスクロマトグラフィーで分限し、質量分析器のイオン
源中に導入した。七〇騨尋体化したサンプル（０，５μ））なりｌ ｔｒａ −
１キャピラリーカラム（０，３３４ｍフィルム厚、２００ ｊ１ｍ内径、５０ｍ
の長さ）中にカラムインジェクター（ｏｎ−ｃｏｌｕｍｕｉｎｊｅｃｔｏｒ ）
を用いて注入した。次の条件下に流速０．４１１ＩｌｊＺ分のもと分析を行なっ
た：
当初温度；７０℃、当初時間−〇、速度（Ｃ／ｍ１ｎ）、終点の温度＝３１０℃
、終点の時間＝５分加熱ゾーン：
加熱器（スタンバイ）設定値； ７０℃加熱器（スタンバイ）限界ｉｉ； ３２
５℃注入口Ｂ 設定値； ７０℃
注入ロＢ ＠界値； ３２５℃
イオン諏 ３５０℃
移動ライン 設定値； ３２０℃
移動ライン ＠界値； ３５０℃
これらの条件下、Ｉ−ヒドロキシミリスチン酸のｉｆＩ導体化されたアルコール
は、４７．６７分で（保持甑１９５０）溶出した。ｍ／ｅ２５７及びｍ／ｅ２２
１のイオンは、エンドトキシンの加水分解物の中の他のいかなる化合物のスペク
トルの５ちにも検知されないものである。
手続補正書
平成３年１月１４日 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Method for detecting endotoxin in pharmaceuticals using a mass spectrometer The present invention provides a method for detecting endotoxin in a peptide composition. More particularly, the present invention relates to determining endotoxin by quantifying the amount of the volatile derivatized component of endotoxin (/-hydroxymyristic acid) in a sample of a peptide composition. The present invention refers to products produced by, for example, recombinant DNA technology.
used as a clinically used parenteral therapeutic agent and intended for human and veterinary use.
It can be used to determine the endotoxin content in manufactured products. set! It! Polypeptides obtained by DNA technology have recently been used to treat cancer clinically.
It's been a long time since I've been in the middle of a long time since I've been in the middle of a long time since I've been in the middle of a long time. human insulin, human insulin
Choho A/mon, α-interferon, tissue plasmino anactivator and
This polypeptide has been approved by the US rMFDA as a therapeutic agent for human diseases. Several other species of interferon (M, tGf, α-interferon,
Interleukin-2 (a subset of interferon), interleukin-2, and TNF (tumor nucleosis factor) are being used in clinical trials as therapeutic agents for cancer at medical institutions around the world. It is expected that a large number of polypeptide 7 actors will be produced and clinically tested in the near future. However, the major problem with using such products clinically is that
Guarantee the identity, purity and biological potency of these products as certified by the National FDA.
The goal is to develop a quality-oriented method for making koji. One of the most redundant quality tests required by the US FDA and others for all drugs is the determination of endotoxicity in the final drug product.
This determines #j. This test is a critical test for drugs produced by recombinant DNA technology in microorganisms. For determination of endotoxin content
The standard method for testing is the limulus test.
It was. The method is based on the fact that endotoxin has the effect of coagulating 1 tL of horseshoe crab lymph. Although this bioassay method is relatively sensitive, it is also satisfactorily specific.
However, it is a test method that requires standardization, and has the disadvantage of poor rigidity. The present invention provides the ability to form and induce endotoxins to form uniquely volatile derivatized components.
We have established a highly efficient method for measuring endotoxin by measuring
It is something that The present invention provides the following ml determination of entodoxy 7 in a polypeptide composition consisting of one glue.
Concerning the method: Hydrolyzing a polypeptide composition containing Cough EndoFl to form +C,/-hydroxymyristic acid: The resulting hydrolyzate was treated with alkaline
The carbalkoxy group present in the hydrolyzate was esterified with a hydroxyl methyl group; the volatile alcohol was separated from the reduced hydrolyzate; mass spectrometry)
Detect lucor. The present invention further includes the next step, that is, hydrolyzing the peptide composition and obtaining the resulting product.
The obtained hydrolyzate is esterified with an alkanol, and the hydrolyzate present in the hydrolyzate is
The free 7-mino group is acylated, the carbalkoxy group in the hydrolyzate is reduced to a hydroxymethyl group, and from the reduced hydrolyzate! -Hydroxymyristyl alcohol is extracted, and the extracted I-hydroxy
Similistyl alcohol &-derivatized and volatile derivatization from its hydrolyzate
The incorporated product is separated and then the volatile I-hydroxyl is detected by mass spectrometry.
Peptide consisting of the process of detecting and quantifying the *conductorized alcohol of simiristic acid.
Concerning the composition of carbon fibers and the method for determining the amount of endotoxin contained therein. The present invention also relates to a method for detecting the presence of endotoxin in a polypeptide composition. Used within the scope of this specification and claims.
"Sin" also includes pyrogene (pyrogen) and lipopolysaccharide (I, Pa). The method of the present invention involves converting endotoxin to β-hydroxymyristic acid by hydrolysis, and then converting the I-hydroxymyristic acid into β-hydroxymyristic acid.
I-hydroxyl alcohol is converted into alcohol, and I-hydroxy
It also involves separating the similistyl alcohol and then detecting it with a mass spectrometer.
It is. The method for producing volatile derivatives of β-hydroxymyristic acid contains endotoxin.
The resulting hydrolyzate is then esterified to form hydroxymethyl groups (-CH, OH, ) and separating the volatile alcohol from the hydrolyzate. preferable! -The method for producing a volatile #conductor of simiristic acid in hydro is the next step 1! ! a) hydrolyzing the polypeptide composition to its components, such as endotoxins; b) esterifying the resulting hydrolyzate with an alcohol, inter alia! -Hi
forming an alkyl ester of droximyristine; C) acylating the amino group present in the hydrolyzate; d) reducing the carbalkoxy group of the ester formed in the hydrolyzate to CH, OH group; e) I-hydroxymyristyl alcohol from the reduced hydrolyzate of 7;
f) inducing the alcohol extracted in the above step (el), preferably by trimethylsilylation of its free alcohol groups;
This can be done by making it a conductor. The silylated product is then separated by known means, preferably
Separation is performed by chromatography, although column chromatography can also be used. The volatile derivatized components are then separated by mass
It can be identified and quantified using analytical techniques. A method of reducing a carbalkoxy group to a hydroxymethyl group can be carried out using a borohydride reductant. In such a reduction, the 7-mino group of the hydrolyzate, if present, forms a complex with the boron compound of the reducing agent.
It is usually preferable to hydrolyze the resulting reduced reaction mixture at °C to break the amine-boron bonds in order to solubilize the raw reaction mixture. The above-mentioned extraction process odor treatment is performed using halogenated hydrogen chlorides, such as chlorinated hydrogen.
By choosing suitable solvents like tyrene, ethylene chloride, diocx ethane etc.
This can be done selectively. The present invention provides a method for reducing endotoxins in protein products produced by recombinant DNA technology.
However, the present invention is not limited thereto, and the present invention is not limited thereto. It is to be understood that the parenteral pharmaceutical preparations can be used with equal advantage in all pharmaceutical microcrystals and in all biological systems. The following examples serve as a detailed illustration of the invention herein without limiting it. Example 1. Hydrolysis of endotoxin.
It was broken down into its components. 2. Derivatization treatment First, diazomethane was converted into &1111. Next, the diazomethane was reacted with the oligopeptide mixture to perform an esterification reaction. a. Diazomethane 11I 99 N-mesol-N-nitroso-N-nito-tetraguanidine (MNNG) was placed in the inner tube of a Pierce Microgenerator illi. Next, 400μjf)H,0t7I: was added to the MNNG to make an S layer. Next, add 1500 μI of diethyl ether to the Pierce Microgenerator.
The device was filled from the bottom and placed in a water bath. Uses 11 syringes with needles
Then, a 5 N MeOH tube of 4504n was injected into the inner tube containing MNNG at EE, tL. The apparatus was then held in a water bath for 45 minutes and the reaction was carried out to give diazomethane in approximately 60% yield. b. The amount of diazomethane required for the reaction between diazomethane and the endotoxin component is as follows:
The number of moles of diazomethane required is approximately 100 times the number of moles of hydrolyzed protein. Add the dried MeOH to a final volume of 100 μj in a PICOTAG chamber.
- using a pipette and stir. 40-1 dry MeOH was then pipetted into each sample tube and stirred. <400μ)
The zomethane solution was pipetted into the PICOTAG chamber and stirred. After calculating the required amount of diazomethane as described above, 10 times this amount was pipetted into each sample tube and then stirred. The remaining diazomethane solution was added to the PICOTAG chamber. Sealed PICOTAG check
I put the number on 4w# Kaede Mamuro for a long time. Excess reagent was removed from the PICOTAG chamber. The reagents from the sample tube were then removed in a PICOTAG tube under reduced pressure (30-60 mTorr). B. Acylation 1111 μl of freshly oxidized methyl trifluorotate (MeTFA) was then mixed with 500 pi of MeTFA with 500 μl of dry MeOH. 2fil of triethylamine (TEA) was added to each sample tube and vortexed. Reagents were removed in the PIC'0TAGIC under reduced pressure (30-50 mTorr). 500 tsl of MeTFA:MeOHtPP I was pipetted into the COTAG chamber and vortexed. 2 sl of TEA was placed into each sample tube and vortexed. 6 μm of MeTFA:MeOH was placed in each sample tube and vortexed. Next, PICOTAG check
The pressure in the PICOTAG chamber was increased to 4 times the pressure of N in the PICOTAG chamber. The sealed PICOTAG chamber was then placed in the dark at room temperature overnight. Excess reagent was then removed from the PICOTAG chamber and the seven PICOTAG chambers were washed with MeOH. Reagents were removed from the sample tube of the PICOTAG device under reduced pressure (30 mTorr). A solution of trifluoroboron hydride (IM) in tetrahydrofuran was used as the reducing agent in this reaction. One portion of 800 μm of boron trideuteride (B*D*) was placed in a t-PICOTAG chamber using a pipette and stirred. 100 fil f) IMBHD,/THF was then pipetted into each sample tube. The pressure of the PICOTAG chamber is N! The mixture was pressurized to 4 times the pressure and then heated at 90° C. for 30 minutes in a PICOTAG apparatus. The chamber was periodically removed and agitated. Excess WA, drug was removed from the chamber and then washed with dry MeOH. After stirring the carcass chamber, MeOH& was removed. Slowly add dry MeOH (20 liters) to each sample tube to decompose the Ryc reagent and reduce the reagent to zero.
It was removed from the sample tube in a PICOTAG instrument under pressure (200 mTorr). The amine group of the completely Kj1 element formed a complex with the boron atom. D. Hydrolysis of boron compound This hydrolysis reaction was carried out to break the amine-boron bond. This reaction is carried out using a mixture of HCj and MeOH. The HCj/MeOH (IN) solution is prepared by diluting a 3 N HCj vial (l-) with 2 m of dry MeOH and heating it.
Using a pipette, the mixture was placed in a chamber at ℃ and stirred. Next, each sample was placed in a 40 fit IN HCj /MeOHv tube and stirred. The PICOTAG chamber was heated for 20 minutes at 97°C in a PICOTAG scissor holder. 70 Excess reagent was removed from the PICOTAG chamber. PI COT A G* Test under reduced pressure (100 mTorr) from the temple tube in the
The drug was removed. The above steps were then repeated as follows: INHCj/MeOH (11Ij) was added to the PICOTAG chamber and stirred. Next, K I N HCj/MeOH (40 tgl) solution was added to each sample tube and stirred. The PICOTAG chamber was heated to 97°C for 20 minutes. Excess reagent was removed from the PICOTAG chamber. However, in this step, the reagents were removed from the sample tube under reduced pressure of 45 mTorr. E. Extraction The derivatized endotoxin components are extracted with methylene chloride (CH, CJI) and subjected to gas chromatography or mass spectroscopy to remove unwanted by-products.
The analysis was made unobstructed. 200 μ no CH1C no! was added to each sample tube and each tube was stirred separately for 3 minutes. Next, CH, CJI as well.
It was then decanted into a weighed Pyrex container and stored (Batch 1). In this process, by-products are removed, and then the by-products are removed.
(I-hydroxymyristi) from the aqueous phase containing the boriainoalcohol #conductor.
(Also excluded) Saturation of Kiune Potassium (KtCOs) #Turtle is damped, C shallow Cj! After that, he was washed and then treated with KF. The sample tube was crumpled horizontally and 10 μI of KtCOsl l! Enemy was added to the top of each sample tube at a time. I stirred the sample for a while as the drops fell onto the paper in the tube. Drain the strand sample, move the drops over the tube, and then repeat the stirring. This was done to mix the sample with Co and [1]. 200μ) CH, Cj, then each sample
The mixture was placed in a tube and stirred for 1 minute to separate each phase. Next, carefully decant the supernatant liquid into a weighed Pazurex tube.
I put it in (batch ■). The next supernatant contains polyamino alcohol. The aqueous phase that remained contained by-products that were only soluble in water. CH, CJ, were removed from the sample tubes (Batch I and Batch) in a 1' IC0TAG instrument under reduced pressure (150 mTorr). The sample tube was then weighed and the amount of material present was calculated. (If the weight is too high, the aqueous phase containing K, Co, etc. may be contaminated with the sample.
If this occurs, wash the sample with 200μj (QCH*Cjt) and
CH 2 , Cj, are removed from the sample tube under reduced pressure (150 mTorr). ). F, Silylation Batch 4 μm of pyridine and 30 μm of TMS DEA ()rimethersilyldiethylamine for each 500βV original sample! and support from batch
samples and then each sample was stirred for 1 minute. The PICUTAG deember was then stirred at 56°C for 200 minutes. This reaction gives the free alcohol group trimester.
Added Delcyril &. The temple tube was capped and stored at -20°C until analysis. The endotoxin components were isolated using gas chromatography and introduced into the ion source of the mass spectrometer. The sample (0.5 μm) was injected into a TRA-1 capillary column (0.334 m film thickness, 200 mm inner diameter, 50 m length) using an on-columu injector. . Analysis was conducted at a flow rate of 0.411 IljZ min under the following conditions: Initial temperature: 70°C, initial time -〇, speed (C/mln), end point temperature = 310°C, end point time = 5 minutes heating Zone: Heater (standby) setting value; 70°C heater (standby) limit ii; 32 5°C Inlet B setting value; 70°C Injection Lo B @ limit value; 325°C Ion Sui 350°C Moving line setting value; 320 C. Transfer line @ limit; 350.degree. C. Under these conditions, the ifI-conducted alcohol of I-hydroxymyristic acid eluted in 47.67 minutes (retention pot 1950). The m/e257 and m/e22 1 ions do not meet the spectra of any other compounds in the endotoxin hydrolyzate.
It is something that is not detected even in the 5th place. Procedural amendment January 14, 1991