RU2145511C1

RU2145511C1 - Method of separating mixture of fatty acid c2-c7-fraction by liquid chromatography technique

Info

Publication number: RU2145511C1
Application number: RU99106669A
Authority: RU
Inventors: Н.С. Иконников; М.Д. Ардатская; А.В. Дубинин; В.Н. Бабин; О.Н. Минушкин; О.А. Кондракова; В.А. Алешкин
Original assignee: НИФ "Ультрасан"
Priority date: 1999-04-09
Filing date: 1999-04-09
Publication date: 2000-02-20

Abstract

FIELD: analytical methods in organic chemistry. SUBSTANCE: separation is accomplished on column with fixed phase consisting of polyethylene glycol/2-nitroterephthalic acid copolymer. EFFECT: increased determination accuracy. 2 cl, 7 dwg, 6 ex

Description

Изобретение относится к области хроматографического разделения веществ и может быть использовано, в частности, для аналитического исследования биологических субстратов и других объектов, содержащих смесь летучих жирных кислот (уксусной, пропионовой, изомасляной, масляной, изовалериановой, валериановой, капроновой и энантовой). The invention relates to the field of chromatographic separation of substances and can be used, in particular, for the analytical study of biological substrates and other objects containing a mixture of volatile fatty acids (acetic, propionic, isobutyric, butyric, isovalerianic, valerianic, caproic and enanthic).

Известен способ разделения жирных кислот фракции C₂-C₆, включающий подготовку пробы путем гомогенизации в растворе NaOH, центрифугирование, упаривание, добавление H₂SO₄, экстракцию смеси кислот серным эфиром в присутствии сернокислого натрия, введение экстракта в испаритель хроматографа и разделение на колонке из нержавеющей стали длиной 3 метра с внутренним диаметром 3 мм, заполненную 5%-ным полиэтиленгликолятадипинатом на хромосорбе, модифицированным 2% H₃PO₄ (Тамм А.О. и др. "Метаболиты кишечной микрофлоры в диагностике дисбиоза" в журнале "Антибиотики и медицинская биотехнология" т. 32, N 3, 1987, с 191-195)
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ, предусматривающий разделение смеси жирных кислот фракции C₂-C₆ методом газожидкостной хроматографии, включающий пробоподготовку образца биологического субстрата путем добавления H₂SO₄ до pH 2-3, перегонки с паром, добавление NaOH до pH 9-10, упаривания пробы, добавления серного эфира и H₂SO₄ до pH 3, введения подготовленного образца в виде эфирного раствора в испаритель хроматографа и разделение на колонке из нержавеющей стали длиной 1,2 м, внутренним диаметром 3 мм, заполненную неподвижной фазой (15% Carbowax 20М, модифицированной терефталевой кислотой (1,5%) на Chromaton с диаметром зерна 0,16-0,20 мм) ("Комплексная диагностика, лечение и профилактика дисбактериоза (дисбиоза) в клинике внутренних болезней" Методические рекомендации МЦ УДПРФ под редакцией проф. Минушкина О.Н., проф. Минаева В.Н., Москва, 1997, с 16-17)
Недостатками известных способов является сложность пробоподготовки, невысокая степень разделения смеси кислот на фракции, содержащие индивидуальные кислоты, приводящие к появлению систематических ошибок в оценке концентраций кислот.A known method for the separation of fatty acids of the C ₂ -C ₆ fraction, including sample preparation by homogenization in a NaOH solution, centrifugation, evaporation, addition of H ₂ SO ₄ , extraction of the acid mixture with sulfur ether in the presence of sodium sulfate, introduction of the extract into the chromatograph evaporator and column separation stainless steel 3 meters long with an inner diameter of 3 mm filled with 5% polyethylene glycol adipate on chromosorb modified 2% H ₃ PO ₄ (Tamm A.O. et al. "Metabolites of intestinal microflora in the diagnosis of dysbiosis" in the journal "Antibiotics and Medical Biotechnology" vol. 32, No. 3, 1987, from 191-195)
The closest in technical essence and the achieved result is a method involving the separation of a mixture of fatty acids of fraction C ₂ -C ₆ by gas-liquid chromatography, including sample preparation of a sample of a biological substrate by adding H ₂ SO ₄ to pH 2-3, distillation with steam, adding NaOH to pH 9-10, evaporation of the sample, addition of sulfuric ether and H ₂ SO ₄ to pH 3, introduction of the prepared sample in the form of an ethereal solution into the chromatograph evaporator and separation on a stainless steel column 1.2 m long, 3 mm inner diameter filled with a stationary phase (15% Carbowax 20M, modified with terephthalic acid (1.5%) on Chromaton with a grain diameter of 0.16-0.20 mm) ("Comprehensive diagnosis, treatment and prevention of dysbiosis (dysbiosis) in the clinic of internal diseases" Methodical recommendations of MC UDPRF edited by prof. Minushkina O.N., prof. Minaev V.N., Moscow, 1997, 16-17)
The disadvantages of the known methods is the complexity of sample preparation, the low degree of separation of the mixture of acids into fractions containing individual acids, leading to the appearance of systematic errors in the assessment of acid concentrations.

Задачей настоящего изобретения является создание газохроматографического способа разделения жирных кислот C₂-C₇ из биологических субстратов, характеризующегося высокой степенью разделения при значительном упрощении пробоподготовки образцов.The objective of the present invention is to provide a gas chromatographic method for the separation of C ₂ -C ₇ fatty acids from biological substrates, characterized by a high degree of separation with significant simplification of sample preparation of samples.

Поставленная задача решается описываемым способом разделения смеси жирных кислот фракции C₂-C₇ методом газожидкостной хроматографии, включающим обработку пробы биологического субстрата водой или водным раствором хлористоводородной кислоты, или последовательно водой и кислотой, введения надосадочной жидкости в испаритель хроматографа и разделения на кварцевой капиллярной колонке длиной 30±1 метр с внутренним диаметром 0,25±0,02 мм с использованием в качестве неподвижной фазы пленки сополимера полиэтиленгликоля с 2-нитротерефталевой кислотой при толщине пленки 0,25 мкм.The problem is solved by the described method of separating a mixture of fatty acids of the C ₂ -C ₇ fraction by gas-liquid chromatography, including processing a biological substrate sample with water or an aqueous solution of hydrochloric acid, or sequentially with water and acid, introducing a supernatant into the chromatograph evaporator and separating it with a quartz capillary column of length 30 ± 1 meter with an inner diameter of 0.25 ± 0.02 mm using a film of a copolymer of polyethylene glycol with 2-nitroterephthalic as the stationary phase lotoy at a film thickness of 0.25 microns.

Ниже приведены примеры разделения смеси кислот C₂-C₇ с целью определения их содержания в различных биологических объектах.The following are examples of the separation of a mixture of C ₂ -C ₇ acids in order to determine their content in various biological objects.

Однако приведенные ниже примеры не ограничивают сферы применения заявленного способа разделения. However, the following examples do not limit the scope of the claimed separation method.

Пример 1
К пробе препарата (образец фекалий) весом 2,0 г приливают 3 мл дистиллированной воды и 1 мл стандартного раствора (для количественного определения содержания летучих жирных кислот), перемешивают путем встряхивания в течение 10 минут, добавляют 2 мл 1 N HCl, центрифугируют при 7000 об/мин в течение 10 мин. Микрошприцем вводят пробы надосадочной жидкости в испаритель хроматографа с детектором ионизации в пламени, снабженном кварцевой капиллярной колонкой длиной 30 м с внутренним диаметром 0,25 мм с неподвижной фазой - сополимером полиэтиленгликоля с 2-нитротерефталевой кислотой в виде пленки толщиной пленки 0,25 мкм.Example 1
3 ml of distilled water and 1 ml of a standard solution (for quantitative determination of the content of volatile fatty acids) are added to a sample of a preparation (feces sample) weighing 2.0 g, stirred by shaking for 10 minutes, add 2 ml of 1 N HCl, centrifuged at 7000 rpm for 10 minutes Samples of the supernatant are injected into the chromatograph with a flame ionization detector equipped with a quartz capillary column 30 m long with an inner diameter of 0.25 mm with a stationary phase - a copolymer of polyethylene glycol with 2-nitroterephthalic acid in the form of a film with a film thickness of 0.25 μm.

Режим работы хроматографа: изотермический с температурой термостата 140^oC, температурой испарителя и детектора 230^oC. Газ-носитель - азот, с давлением на входе в колонку 1,8 ати. Расход газа-носителя 2,0 мл/мин, воздуха 300 мл/мин. Соотношение потоков газа-носителя на сброс и в колонку 50:1. Время хроматографирования 15 мин.Chromatograph operating mode: isothermal with a thermostat temperature of 140 ^o C, an evaporator and a detector temperature of 230 ^o C. The carrier gas is nitrogen, with a pressure of 1.8 atm at the inlet to the column. Carrier gas flow rate 2.0 ml / min, air 300 ml / min. The ratio of carrier gas flows to the discharge and to the column 50: 1. Chromatography time 15 min.

Результат разделения представлен на фиг. 1
Примеры 2-5
(Разделение кислот C₂-C₇ с целью их определения в слюне, церебральной жидкости, асцитической жидкости, сыворотке крови).The separation result is shown in FIG. 1
Examples 2-5
(Separation of C ₂ -C ₇ acids in order to determine them in saliva, cerebral fluid, ascitic fluid, and blood serum).

Образец жидкого биологического субстрата 2 мл помещают в пробирку для центрифуги, приливают к содержимому 1 мл 6 N HCl и 1 мл стандартного раствора (для количественного определения содержания C₂-C₇). Скоагулированные белки отделяют центрифугированием 7000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость вводят в испаритель хроматографа и ведут разделение при тех же условиях хроматографирования, как в примере 1. Время хроматографирования 15 мин.A sample of a liquid biological substrate 2 ml is placed in a centrifuge tube, poured into the contents of 1 ml of 6 N HCl and 1 ml of standard solution (for quantification of the content of C ₂ -C ₇ ). Coagulated proteins are separated by centrifugation at 7000 rpm for 10 minutes. The supernatant is introduced into the evaporator of the chromatograph and separation is carried out under the same chromatographic conditions as in Example 1. Chromatography time 15 min.

Результаты разделения приведены на фиг. 2-5. The separation results are shown in FIG. 2-5.

Пример 6. (без обработки биосубстрата хлористоводородной кислотой)
К пробе препарата (образец фекалий) весом 2,0 г приливают 3 мл дистиллированной воды и 1 мл стандартного раствора (для количественного определения содержания летучих жирных кислот), перемешивают путем встряхивания в течение 10 мин, центрифугируют при 7000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость вводят в испаритель хроматографа и ведут разделение при тех же условиях хроматографирования, как в примере 1.Example 6. (without treatment of the biosubstrate with hydrochloric acid)
3 ml of distilled water and 1 ml of a standard solution (for quantitative determination of the content of volatile fatty acids) are added to a sample of a preparation (feces sample) weighing 2.0 g, stirred by shaking for 10 min, centrifuged at 7000 rpm for 10 min . The supernatant is introduced into the evaporator of the chromatograph and separation is carried out under the same chromatographic conditions as in Example 1.

Результаты разделения приведены на фиг. 6. The separation results are shown in FIG. 6.

Представленные хроматограммы показывают четкие пики индивидуальных кислот, пригодные для точного расчета их содержания в анализируемых образцах. The presented chromatograms show clear peaks of individual acids, suitable for the exact calculation of their content in the analyzed samples.

На фиг. 7 представлена хроматограмма разделения кислот C₂-C₇ из стандартной смеси.In FIG. 7 is a chromatogram of the separation of C ₂ -C ₇ acids from a standard mixture.

Содержание индивидуальных кислот в смеси осуществляется путем расчета площадей хроматографических пиков как методом "треугольника", так и методом компьютерной обработки хроматограмм. The content of individual acids in the mixture is carried out by calculating the areas of chromatographic peaks both by the "triangle" method and by the method of computer processing of chromatograms.

Из представленных хроматограмм следует, что предложенный способ обеспечивает высокую степень разделения. From the presented chromatograms it follows that the proposed method provides a high degree of separation.

Claims

1. The method of separation of a mixture of fatty acids of fraction C ₂ - C ₇ by gas-liquid chromatography, including the preparation of a sample of a biological substrate, introducing a sample into the evaporator of the chromatograph and separation on a column with a stationary phase, characterized in that the supernatant is introduced into the evaporator, and the separation is carried out a quartz capillary column with a length of 30 ± 1 m and an inner diameter of 0.25 ± 0.02 mm using a copolymer of polyethylene glycol with 2-nitroterephthalic acid as a stationary phase in the form of a film 0.25 μm thick.

2. The method according to claim 1, characterized in that the sample is prepared by treating it with distilled water, or hydrochloric acid, or sequentially distilled water and hydrochloric acid.