JPH04335900A - クラミジア属微生物の検出および識別方法 - Google Patents
クラミジア属微生物の検出および識別方法Info
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- JPH04335900A JPH04335900A JP13336891A JP13336891A JPH04335900A JP H04335900 A JPH04335900 A JP H04335900A JP 13336891 A JP13336891 A JP 13336891A JP 13336891 A JP13336891 A JP 13336891A JP H04335900 A JPH04335900 A JP H04335900A
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、クラミジア属微生物の
検出方法および／または血清型の識別方法に関し、さら
に詳しくはクラミジア属、特にクラミジア・トラコマテ
ィスを高い精度で検出し、種類を識別する方法に関する
。
検出方法および／または血清型の識別方法に関し、さら
に詳しくはクラミジア属、特にクラミジア・トラコマテ
ィスを高い精度で検出し、種類を識別する方法に関する
。
【０００２】
【従来の技術】クラミジア （Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）属
微生物は、クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙ
ｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ） とクラミジア・シッ
タシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）の２種
類に分類され、クラミジア・トラコマティスはさらに１
５種類の血清型に分属されており、多彩な感染像を示す
が、その違いは血清型別に関係している。クラミジア・
トラコマティスの血清型Ａ，Ｂ，Ｂａ，Ｃの４型は眼の
トラコーマを起こし、Ｌ１ ，Ｌ２ ，Ｌ３ の３型は
性病性リンパ肉芽腫の原因となり、Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ
，Ｉ，Ｊ，Ｋの８型は泌尿生殖器感染症、封入体結膜炎
、新生児肺炎などを引起こすことが知られている。これ
らクラミジア・トラコマティスの血清型による抗原性の
違いは、菌体外膜蛋白をコードする遺伝子領域内の４つ
の可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅｄｏｍｅｉｎ： ＶＤ・
Ｉ， ＶＤ・ＩＩ，ＶＤ・ＩＩＩ， ＶＤ・ＩＶ ）に
存在する（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ， Ｒ．Ｓ． ら、Ｊ．Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ．， １６３， ３８７９−３８８５
，（１９８７） およびＢａｅｈｒ， Ｗ．Ｙ． ら、
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．，８５，
４０００−４００４（１９８８） 参照）。
微生物は、クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙ
ｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ） とクラミジア・シッ
タシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）の２種
類に分類され、クラミジア・トラコマティスはさらに１
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が、その違いは血清型別に関係している。クラミジア・
トラコマティスの血清型Ａ，Ｂ，Ｂａ，Ｃの４型は眼の
トラコーマを起こし、Ｌ１ ，Ｌ２ ，Ｌ３ の３型は
性病性リンパ肉芽腫の原因となり、Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ
，Ｉ，Ｊ，Ｋの８型は泌尿生殖器感染症、封入体結膜炎
、新生児肺炎などを引起こすことが知られている。これ
らクラミジア・トラコマティスの血清型による抗原性の
違いは、菌体外膜蛋白をコードする遺伝子領域内の４つ
の可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅｄｏｍｅｉｎ： ＶＤ・
Ｉ， ＶＤ・ＩＩ，ＶＤ・ＩＩＩ， ＶＤ・ＩＶ ）に
存在する（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ， Ｒ．Ｓ． ら、Ｊ．Ｂ
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【０００３】この可変領域ＶＤＩ〜ＩＶ内のいずれかに
型間で異なる塩基配列があり、それによりクラミジア・
トラコマティスの生物学および免疫学的特異性が決定さ
れている（Ｙｉｎｇ Ｙｕａｎ ら、Ｉｎｆｅｃｔ−
Ｉｍｍｕｎ．， ５７， １０４０−１０４９（１９８
９）参照）。
型間で異なる塩基配列があり、それによりクラミジア・
トラコマティスの生物学および免疫学的特異性が決定さ
れている（Ｙｉｎｇ Ｙｕａｎ ら、Ｉｎｆｅｃｔ−
Ｉｍｍｕｎ．， ５７， １０４０−１０４９（１９８
９）参照）。
【０００４】従って、これらの型特異的遺伝子配列を検
出すれば、クラミジア・トラコマティスを血清型別に検
出・分類することが可能であると考えられる。
出すれば、クラミジア・トラコマティスを血清型別に検
出・分類することが可能であると考えられる。
【０００５】既にクラミジア・トラコマティスの検出お
よび型別分類は抗血清もしくはモノクローナル抗体を用
いたマイクロトラック法、エンザイム・イムノアッセイ
（Ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓｅｙ； ＥＩＡ法
）等により行われている（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ， Ｒ．Ｓ
． ら、Ｊ． Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １
６， ４−７（１９８２）およびＳｔｅｐｈｅｎｓ，
Ｒ．Ｓ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １２８， １
０８３−１０８９（１９８２） 等参照）。
よび型別分類は抗血清もしくはモノクローナル抗体を用
いたマイクロトラック法、エンザイム・イムノアッセイ
（Ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓｅｙ； ＥＩＡ法
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． ら、Ｊ． Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １
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Ｒ．Ｓ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １２８， １
０８３−１０８９（１９８２） 等参照）。
【０００６】しかしながら、これらの方法は検出感度が
低く、従って、検出感度をあげようとすると培養に相当
の時間が必要になり、培養操作が煩雑になる。さらに、
この方法は、抗体を使用するためにクラミジア属の非特
異的選択が起こり、他の細菌との交差反応によってクラ
ミジア属を純粋に検出することができない等の問題点を
有している。
低く、従って、検出感度をあげようとすると培養に相当
の時間が必要になり、培養操作が煩雑になる。さらに、
この方法は、抗体を使用するためにクラミジア属の非特
異的選択が起こり、他の細菌との交差反応によってクラ
ミジア属を純粋に検出することができない等の問題点を
有している。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、クラミジア
属を高い精度で検出することができるとともに、高い精
度でクラミジア属を分類することができる方法の提供を
目的とする。
属を高い精度で検出することができるとともに、高い精
度でクラミジア属を分類することができる方法の提供を
目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、クラミジ
ア属の菌体外膜蛋白をコードする遺伝子領域内の４つの
バリアブル・ドメイン（ＶＤ・Ｉ〜ＶＤ・ＩＶ） を含
む遺伝子領域を増幅し、この増幅遺伝子ＤＮＡを検出す
ることによりクラミジア属の高精度な検出が可能であり
、さらにこの増幅ＤＮＡに、クラミジア属の血清型特異
的塩基配列に結合能を有する標識ＤＮＡプローブを結合
させ、結合標識ＤＮＡプローブを検出し、結合したプロ
ーブの種類と結合パターンを解析することにより、クラ
ミジア属の高精度な血清型の識別が可能なことを見い出
し、本発明を完成するに至った。
ア属の菌体外膜蛋白をコードする遺伝子領域内の４つの
バリアブル・ドメイン（ＶＤ・Ｉ〜ＶＤ・ＩＶ） を含
む遺伝子領域を増幅し、この増幅遺伝子ＤＮＡを検出す
ることによりクラミジア属の高精度な検出が可能であり
、さらにこの増幅ＤＮＡに、クラミジア属の血清型特異
的塩基配列に結合能を有する標識ＤＮＡプローブを結合
させ、結合標識ＤＮＡプローブを検出し、結合したプロ
ーブの種類と結合パターンを解析することにより、クラ
ミジア属の高精度な血清型の識別が可能なことを見い出
し、本発明を完成するに至った。
【０００９】かくして本発明は、
１．（ｉ）クラミジア属の菌体外膜蛋白をコードする遺
伝子領域内の４つの可変領域を含む遺伝子領域の上流共
通部分および下流共通部分に相補性を有するＤＮＡプロ
ーブをプライマーとして、クラミジア属の血清型特異的
塩基配列を含む遺伝子領域を増幅し、（ｉｉ）該増幅遺
伝子ＤＮＡを検出することからなるクラミジア属微生物
の検出方法。
伝子領域内の４つの可変領域を含む遺伝子領域の上流共
通部分および下流共通部分に相補性を有するＤＮＡプロ
ーブをプライマーとして、クラミジア属の血清型特異的
塩基配列を含む遺伝子領域を増幅し、（ｉｉ）該増幅遺
伝子ＤＮＡを検出することからなるクラミジア属微生物
の検出方法。
【００１０】２．（ｉ）クラミジア属の菌体外膜蛋白を
コードする遺伝子領域内の４つの可変領域を含む遺伝子
領域の上流共通部分および下流共通部分に相補性を有す
るＤＮＡプローブをプライマーとして、クラミジア属の
血清型特異的塩基配列を含む遺伝子領域を増幅し、（ｉ
ｉ）該増幅遺伝子ＤＮＡに、クラミジア属の血清型特異
的塩基配列に結合能を有する標識ＤＮＡプローブを結合
させ、（ｉｉｉ） 該結合標識ＤＮＡプローブを検出し
、結合プローブの種類を解析することからなるクラミジ
ア属微生物および血清型識別方法。
コードする遺伝子領域内の４つの可変領域を含む遺伝子
領域の上流共通部分および下流共通部分に相補性を有す
るＤＮＡプローブをプライマーとして、クラミジア属の
血清型特異的塩基配列を含む遺伝子領域を増幅し、（ｉ
ｉ）該増幅遺伝子ＤＮＡに、クラミジア属の血清型特異
的塩基配列に結合能を有する標識ＤＮＡプローブを結合
させ、（ｉｉｉ） 該結合標識ＤＮＡプローブを検出し
、結合プローブの種類を解析することからなるクラミジ
ア属微生物および血清型識別方法。
【００１１】３．４つの可変領域を含む遺伝子領域の上
流共通部分に相補性を有するＤＮＡプローブが下記式（
１） ＧＣＣＧＣＴＴＴＧＡ ＧＴＴＣＴＧＣ
ＴＴＣ Ｃ （１）で示される塩基配
列を有し、下流共通部分に相補性を有するＤＮＡプロー
ブが下記式（２）、 ＧＣＡＡＧＡＴＴＴＴ ＣＴＡＧＡＴＴ
ＴＣＡ Ｔ （２）で示される塩基配
列を有する、上記１又は２のクラミジア属微生物の検出
または識別方法。
流共通部分に相補性を有するＤＮＡプローブが下記式（
１） ＧＣＣＧＣＴＴＴＧＡ ＧＴＴＣＴＧＣ
ＴＴＣ Ｃ （１）で示される塩基配
列を有し、下流共通部分に相補性を有するＤＮＡプロー
ブが下記式（２）、 ＧＣＡＡＧＡＴＴＴＴ ＣＴＡＧＡＴＴ
ＴＣＡ Ｔ （２）で示される塩基配
列を有する、上記１又は２のクラミジア属微生物の検出
または識別方法。
【００１２】４．血清型特異的塩基配列を有する標識Ｄ
ＮＡプローブが、下記式（３）、式（４）、式（５）、
式（６）、式（７）、式（８）または式（９）
ＡＴＧＴＡＧＧＧＣＡ ＡＧＡＡＴＴＣＣＣＴ
（３） ＴＴＴＧＡ
ＴＡＣＴＡ ＣＣＡＣＧＣＴＴＡＡ
（４） ＧＴＣＴＣＴ
ＴＣＣＧ ＣＡＧＡＡＡＡＣＧＡ
（５） ＣＣＴＧＴＴＧ
ＴＡＧ ＡＴＡＴＴＡＣＡＡＣ
（６） ＴＴＣＡＧＡＴＧ
ＧＧ ＡＧＣＧＧＣＧＣＣＴ
（７） ＡＡＡＴＣＴＴＣＴ
Ｇ ＡＴＴＴＴＡＡＴＡＣ
（８） ＣＡＣＡＡＴＡＴＴＣ
ＴＡＡＧＴＴＴＡＡＴ （
９） で示される塩基配列を有するＤＮＡプ
ローブである、上記２のクラミジア属微生物および血清
型の識別方法を提供する。
ＮＡプローブが、下記式（３）、式（４）、式（５）、
式（６）、式（７）、式（８）または式（９）
ＡＴＧＴＡＧＧＧＣＡ ＡＧＡＡＴＴＣＣＣＴ
（３） ＴＴＴＧＡ
ＴＡＣＴＡ ＣＣＡＣＧＣＴＴＡＡ
（４） ＧＴＣＴＣＴ
ＴＣＣＧ ＣＡＧＡＡＡＡＣＧＡ
（５） ＣＣＴＧＴＴＧ
ＴＡＧ ＡＴＡＴＴＡＣＡＡＣ
（６） ＴＴＣＡＧＡＴＧ
ＧＧ ＡＧＣＧＧＣＧＣＣＴ
（７） ＡＡＡＴＣＴＴＣＴ
Ｇ ＡＴＴＴＴＡＡＴＡＣ
（８） ＣＡＣＡＡＴＡＴＴＣ
ＴＡＡＧＴＴＴＡＡＴ （
９） で示される塩基配列を有するＤＮＡプ
ローブである、上記２のクラミジア属微生物および血清
型の識別方法を提供する。
【００１３】以下、本発明のクラミジア属微生物の検出
・識別方法およびそれに用いるＤＮＡプローブについて
更に詳細に説明する。
・識別方法およびそれに用いるＤＮＡプローブについて
更に詳細に説明する。
【００１４】本発明の一つの特徴は、クラミジア属微生
物の遺伝子の一部を増幅させて検出した後、この増幅さ
れた遺伝子に、クラミジア属の血清特異的塩基配列に結
合能を有する標識ＤＮＡプローブを結合させ、このプロ
ーブを検出して、結合したプローブの種類と結合パター
ンを解析することにより、クラミジア属微生物を検出す
ると共に、このクラミジア属の種類を特定することにあ
る。このような方法により、クラミジア属微生物を高い
精度で検出することができると共に、クラミジア属の種
類を高精度で識別することが可能となる。
物の遺伝子の一部を増幅させて検出した後、この増幅さ
れた遺伝子に、クラミジア属の血清特異的塩基配列に結
合能を有する標識ＤＮＡプローブを結合させ、このプロ
ーブを検出して、結合したプローブの種類と結合パター
ンを解析することにより、クラミジア属微生物を検出す
ると共に、このクラミジア属の種類を特定することにあ
る。このような方法により、クラミジア属微生物を高い
精度で検出することができると共に、クラミジア属の種
類を高精度で識別することが可能となる。
【００１５】先ず、診察時に採取した臨床検体、例えば
子宮頸管綿棒擦過材料等、または臨床検体からの分離培
養株から常法［Ｆｒｅｄｅｒｉｃ Ｍ．Ａ． 編、Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ ｐｕｂｌｉ
ｓｈｉｎｇ ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， ＮＹ， １９８
９参照）によりＤＮＡを抽出する。
子宮頸管綿棒擦過材料等、または臨床検体からの分離培
養株から常法［Ｆｒｅｄｅｒｉｃ Ｍ．Ａ． 編、Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ ｐｕｂｌｉ
ｓｈｉｎｇ ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， ＮＹ， １９８
９参照）によりＤＮＡを抽出する。
【００１６】この抽出ＤＮＡに適当なＤＮＡプローブを
プライマーとして加えて、クラミジア属の菌体外膜蛋白
をコードする遺伝子領域、詳しくは菌体外膜蛋白をコー
ドする遺伝子領域内の４つの可変領域（ｖａｒｉａｂｌ
ｅ ｄｏｍｅｉｎ ： ＶＤ・Ｉ，ＶＤ・ＩＩ ，Ｖ
Ｄ・ＩＩＩ，ＶＤ・ＩＶ ）を含む長さが約１０５０塩
基のＤＮＡ領域を増幅する。
プライマーとして加えて、クラミジア属の菌体外膜蛋白
をコードする遺伝子領域、詳しくは菌体外膜蛋白をコー
ドする遺伝子領域内の４つの可変領域（ｖａｒｉａｂｌ
ｅ ｄｏｍｅｉｎ ： ＶＤ・Ｉ，ＶＤ・ＩＩ ，Ｖ
Ｄ・ＩＩＩ，ＶＤ・ＩＶ ）を含む長さが約１０５０塩
基のＤＮＡ領域を増幅する。
【００１７】遺伝子の増幅は、通常用いられるポリメラ
ーゼ・チエイン・リアクション法（ｐｏｌｙｍｅｒａｓ
ｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ法、以下これをＰＣ
Ｒ法と略記する）（このＰＣＲ法の詳細については、特
開昭６１−２７４６９７号公報、特開昭６２−２８１号
公報、サカイら（Ｓａｋａｉら）、サイエンス（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ） ２３９ 巻、４８７−４９１ 頁等参照）
により容易に行うことができる。
ーゼ・チエイン・リアクション法（ｐｏｌｙｍｅｒａｓ
ｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ法、以下これをＰＣ
Ｒ法と略記する）（このＰＣＲ法の詳細については、特
開昭６１−２７４６９７号公報、特開昭６２−２８１号
公報、サカイら（Ｓａｋａｉら）、サイエンス（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ） ２３９ 巻、４８７−４９１ 頁等参照）
により容易に行うことができる。
【００１８】クラミジア属の菌体外膜蛋白をコードする
遺伝子領域内の４つの可変領域を含む遺伝子領域の増幅
に際して、プライマーとして用いることができるＤＮＡ
プローブとしては、４つの可変領域を含む遺伝子領域の
上流共通部分および下流共通部分に相補性を有するＤＮ
Ａプローブを同時に用いれば、特に限定されない。それ
らの中で、好ましくは、既知の菌体外膜蛋白をコードす
る遺伝子の塩基配列データ［Ｓｔｅｐｈｅｎｓ， Ｒ．
Ｓ． ら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １６９，
３８７９−３８８５（１９８７） 参照）をもとに、ク
ラミジア属に特異的で、かつ種間で共通性の高い塩基配
列をＶＤ・Ｉの５´側（上流共通部分）とＶＤ・ＩＶの
３´側（下流共通部分）に設定し、その配列に基づいて
化学合成したＤＮＡプローブを用いるのが適当である。
遺伝子領域内の４つの可変領域を含む遺伝子領域の増幅
に際して、プライマーとして用いることができるＤＮＡ
プローブとしては、４つの可変領域を含む遺伝子領域の
上流共通部分および下流共通部分に相補性を有するＤＮ
Ａプローブを同時に用いれば、特に限定されない。それ
らの中で、好ましくは、既知の菌体外膜蛋白をコードす
る遺伝子の塩基配列データ［Ｓｔｅｐｈｅｎｓ， Ｒ．
Ｓ． ら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １６９，
３８７９−３８８５（１９８７） 参照）をもとに、ク
ラミジア属に特異的で、かつ種間で共通性の高い塩基配
列をＶＤ・Ｉの５´側（上流共通部分）とＶＤ・ＩＶの
３´側（下流共通部分）に設定し、その配列に基づいて
化学合成したＤＮＡプローブを用いるのが適当である。
【００１９】化学合成したＤＮＡプローブ、すなわち前
記４つの可変領域を含む遺伝子領域の上流共通部分に相
補性を有するＤＮＡプローブとしては、下記式（１）
ＧＣＣＧＣＴＴＴＧＡ ＧＴＴＣＴＧＣＴ
ＴＣ Ｃ （１）で示される塩基配列
を有るＤＮＡプローブ、また、下流共通部分に相補性を
有するＤＮＡプローブとしては、下記式（２）、 ＧＣＡＡＧＡＴＴＴＴ ＣＴＡＧＡＴＴ
ＴＣＡ Ｔ （２）で示される塩基配
列を有するＤＮＡプローブを用いるのがより好ましい。
記４つの可変領域を含む遺伝子領域の上流共通部分に相
補性を有するＤＮＡプローブとしては、下記式（１）
ＧＣＣＧＣＴＴＴＧＡ ＧＴＴＣＴＧＣＴ
ＴＣ Ｃ （１）で示される塩基配列
を有るＤＮＡプローブ、また、下流共通部分に相補性を
有するＤＮＡプローブとしては、下記式（２）、 ＧＣＡＡＧＡＴＴＴＴ ＣＴＡＧＡＴＴ
ＴＣＡ Ｔ （２）で示される塩基配
列を有するＤＮＡプローブを用いるのがより好ましい。
【００２０】上記したＤＮＡプローブの化学合成は、そ
れ自体既知の通常用いられる核酸合成機、例えばアプラ
イド・バイオシステム社製、モデル３８１−Ａ ＤＮ
Ａ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｍ
ｏｄｅｌ ３８１−Ａ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｚｅｒ）等を用いる固相合成法により容易に行うことが
できる。
れ自体既知の通常用いられる核酸合成機、例えばアプラ
イド・バイオシステム社製、モデル３８１−Ａ ＤＮ
Ａ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｍ
ｏｄｅｌ ３８１−Ａ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｚｅｒ）等を用いる固相合成法により容易に行うことが
できる。
【００２１】上記の如くしてＰＣＲ法により増幅したク
ラミジア属の菌体外膜蛋白をコードする遺伝子領域内の
４つの可変領域を含む遺伝子領域ＤＮＡは、通常用いら
れるポリアクリルアミド・ゲル電気泳動、アガロース・
ゲル電気泳動等により分離し、バンドとして検出するこ
とができ、これによりクラミジア属由来の遺伝子ＤＮＡ
を確認することができる。なお、電気泳動後のＤＮＡバ
ンドの検出は、エチジウム・ブロマイドで染色し、紫外
線照射により容易に行うことができる。
ラミジア属の菌体外膜蛋白をコードする遺伝子領域内の
４つの可変領域を含む遺伝子領域ＤＮＡは、通常用いら
れるポリアクリルアミド・ゲル電気泳動、アガロース・
ゲル電気泳動等により分離し、バンドとして検出するこ
とができ、これによりクラミジア属由来の遺伝子ＤＮＡ
を確認することができる。なお、電気泳動後のＤＮＡバ
ンドの検出は、エチジウム・ブロマイドで染色し、紫外
線照射により容易に行うことができる。
【００２２】次にクラミジア属の血清型識別用ＤＮＡプ
ローブとしては、クラミジア属の前記４つの可変領域内
の各血清型に特異的な塩基配列に結合能を有するＤＮＡ
プローブであれば特に限定されないが、好ましくは、前
記既知の菌体外膜蛋白をコードする遺伝子の各血清型別
の塩基配列中の、４つの可変領域（ＶＤ・Ｉ〜ＶＤ・Ｉ
Ｖ）の塩基配列をもとに、各血清型に特異性を有する配
列を選び、その配列に基づいて化学合成したＤＮＡプロ
ーブを用いるのが適当である。
ローブとしては、クラミジア属の前記４つの可変領域内
の各血清型に特異的な塩基配列に結合能を有するＤＮＡ
プローブであれば特に限定されないが、好ましくは、前
記既知の菌体外膜蛋白をコードする遺伝子の各血清型別
の塩基配列中の、４つの可変領域（ＶＤ・Ｉ〜ＶＤ・Ｉ
Ｖ）の塩基配列をもとに、各血清型に特異性を有する配
列を選び、その配列に基づいて化学合成したＤＮＡプロ
ーブを用いるのが適当である。
【００２３】このＤＮＡプローブの塩基の長さは、通常
１０〜３０塩基、好ましくは１０〜２５塩基が適当であ
る。
１０〜３０塩基、好ましくは１０〜２５塩基が適当であ
る。
【００２４】血清型識別用ＤＮＡプローブの具体例とし
ては、例えば、下記式（３）〜式（９）、
ＡＴＧＴＡＧＧＧＣＡ ＡＧＡＡＴＴＣＣＣＴ
（３） ＴＴＴＧＡＴＡ
ＣＴＡ ＣＣＡＣＧＣＴＴＡＡ
（４） ＧＴＣＴＣＴＴＣ
ＣＧ ＣＡＧＡＡＡＡＣＧＡ
（５） ＣＣＴＧＴＴＧＴＡ
Ｇ ＡＴＡＴＴＡＣＡＡＣ
（６） ＴＴＣＡＧＡＴＧＧＧ
ＡＧＣＧＧＣＧＣＣＴ （
７） ＡＡＡＴＣＴＴＣＴＧ
ＡＴＴＴＴＡＡＴＡＣ （８
） ＣＡＣＡＡＴＡＴＴＣ
ＴＡＡＧＴＴＴＡＡＴ （９）
で示される塩基配列を有するＤＮＡプロー
ブを挙げることができる。
ては、例えば、下記式（３）〜式（９）、
ＡＴＧＴＡＧＧＧＣＡ ＡＧＡＡＴＴＣＣＣＴ
（３） ＴＴＴＧＡＴＡ
ＣＴＡ ＣＣＡＣＧＣＴＴＡＡ
（４） ＧＴＣＴＣＴＴＣ
ＣＧ ＣＡＧＡＡＡＡＣＧＡ
（５） ＣＣＴＧＴＴＧＴＡ
Ｇ ＡＴＡＴＴＡＣＡＡＣ
（６） ＴＴＣＡＧＡＴＧＧＧ
ＡＧＣＧＧＣＧＣＣＴ （
７） ＡＡＡＴＣＴＴＣＴＧ
ＡＴＴＴＴＡＡＴＡＣ （８
） ＣＡＣＡＡＴＡＴＴＣ
ＴＡＡＧＴＴＴＡＡＴ （９）
で示される塩基配列を有するＤＮＡプロー
ブを挙げることができる。
【００２５】これらの各ＤＮＡプローブを放射性同位元
素、例えば３２Ｐ等で標識し、各クラミジア血清型標準
株から抽出しＰＣＲ法により増幅した各血清型の４つの
可変領域を含む遺伝子ＤＮＡとの結合パターンを、ドッ
トプロットにより解析することにより、各プローブの各
血清型特異的結合能を知ることができる。
素、例えば３２Ｐ等で標識し、各クラミジア血清型標準
株から抽出しＰＣＲ法により増幅した各血清型の４つの
可変領域を含む遺伝子ＤＮＡとの結合パターンを、ドッ
トプロットにより解析することにより、各プローブの各
血清型特異的結合能を知ることができる。
【００２６】これにより、クラミジア属の血清型の識別
が可能となる。上記した式（３）〜式（９）で示される
ＤＮＡプローブは、各血清型由来の前記４つの可変領域
を含む遺伝子ＤＮＡに特異的な結合パターンを有してお
り、この７種類のＤＮＡプローブを用いることにより、
クラミジア・トラコマティスの少なくともＤ、Ｅ、Ｆ、
Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋの各血清型の識別が可能である。
が可能となる。上記した式（３）〜式（９）で示される
ＤＮＡプローブは、各血清型由来の前記４つの可変領域
を含む遺伝子ＤＮＡに特異的な結合パターンを有してお
り、この７種類のＤＮＡプローブを用いることにより、
クラミジア・トラコマティスの少なくともＤ、Ｅ、Ｆ、
Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋの各血清型の識別が可能である。
【００２７】ここで、上記血清型識別用ＤＮＡプローブ
の合成は、前記ＤＮＡ合成機を用いて容易に行うことが
でき、標識は、５´末端のリン酸化反応により、［γ−
３２Ｐ］ＡＴＰ，Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（東
洋紡績（株）製）を用いて行うことができる。
の合成は、前記ＤＮＡ合成機を用いて容易に行うことが
でき、標識は、５´末端のリン酸化反応により、［γ−
３２Ｐ］ＡＴＰ，Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（東
洋紡績（株）製）を用いて行うことができる。
【００２８】また、ドットプロットによる各ＤＮＡプロ
ーブの結合能の解析は、ＰＣＲ法により増幅された遺伝
子ＤＮＡを試料とし、該ＤＮＡを変性させた後ナイロン
メンブランに滴下し、ＵＶ Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ
ＴＭ （ストラタジーン社製）等により紫外線固着させ
、次に血清型識別用ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼ
ーションを行い、ナイロンメンブランのオートラジオグ
ラフィーを行い、各ＤＮＡプローブとのドットハイブリ
ッド形成の有無を調べることにより行うことができる。
ーブの結合能の解析は、ＰＣＲ法により増幅された遺伝
子ＤＮＡを試料とし、該ＤＮＡを変性させた後ナイロン
メンブランに滴下し、ＵＶ Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ
ＴＭ （ストラタジーン社製）等により紫外線固着させ
、次に血清型識別用ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼ
ーションを行い、ナイロンメンブランのオートラジオグ
ラフィーを行い、各ＤＮＡプローブとのドットハイブリ
ッド形成の有無を調べることにより行うことができる。
【００２９】
【実施例】以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に
説明する。
説明する。
【００３０】実施例１ クラミジア属の血清型の識別
１．実験材料および方法 （Ａ）使用微生物 用いた１５種類の全血清型（Ａ〜Ｋ・Ｂａ・Ｌ１ 〜Ｌ
３ ）クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉ
ａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ） 感染培養細胞は、国立
予防衛生研究所において継代培養されている標準株、 Ａ／Ｇ −１７／ＯＴ ＹＨＬ−１３， Ｂ／ＴＷ−
５／ＯＴ ＹＨＬ−１２，Ｂａ／ＡＰ−２／ＯＴ ＹＨ
Ｌ−２１， Ｃ／ＴＷ− ３／ＯＴ ＹＨＬ−１１，Ｄ
／ＵＷ −３／ＣＸ ＹＨＬ−１３， Ｅ／ＵＷ− ５
／ＣＸ ＹＨＬ−１６，Ｆ／ＵＷ −６／ＣＸ ＹＨＬ
−２１， Ｇ／ＵＷ−５７／ＣＸ ＹＨＬ− ９，Ｈ／
ＵＷ −４／ＣＸ ＹＨＬ−１８， Ｉ／ＵＷ−１２／
ＵＲ ＹＨＬ−１４，Ｊ／ＵＷ−３６／ＣＸ ＹＨＬ−
３９， Ｋ／ＵＷ−３１／ＣＸ ＹＨＬ− ７，Ｌ１／
４４０／Ｂｕｂｏ ＹＨＬ− ６， Ｌ２／４３４／Ｂ
ｕｂｏ ＹＨＬ−１１，Ｌ３／４０４／Ｂｕｂｏ ＹＨ
Ｌ− ６である。これらは、モノクローナル抗体を用い
たマイクロトラック法により血清型が同定されている。 同様に、クラミジア・シッタシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ
ｐｓｉｔｔａｃｉ）の培養細胞も同研究所より供与され
た標準株である。
１．実験材料および方法 （Ａ）使用微生物 用いた１５種類の全血清型（Ａ〜Ｋ・Ｂａ・Ｌ１ 〜Ｌ
３ ）クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉ
ａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ） 感染培養細胞は、国立
予防衛生研究所において継代培養されている標準株、 Ａ／Ｇ −１７／ＯＴ ＹＨＬ−１３， Ｂ／ＴＷ−
５／ＯＴ ＹＨＬ−１２，Ｂａ／ＡＰ−２／ＯＴ ＹＨ
Ｌ−２１， Ｃ／ＴＷ− ３／ＯＴ ＹＨＬ−１１，Ｄ
／ＵＷ −３／ＣＸ ＹＨＬ−１３， Ｅ／ＵＷ− ５
／ＣＸ ＹＨＬ−１６，Ｆ／ＵＷ −６／ＣＸ ＹＨＬ
−２１， Ｇ／ＵＷ−５７／ＣＸ ＹＨＬ− ９，Ｈ／
ＵＷ −４／ＣＸ ＹＨＬ−１８， Ｉ／ＵＷ−１２／
ＵＲ ＹＨＬ−１４，Ｊ／ＵＷ−３６／ＣＸ ＹＨＬ−
３９， Ｋ／ＵＷ−３１／ＣＸ ＹＨＬ− ７，Ｌ１／
４４０／Ｂｕｂｏ ＹＨＬ− ６， Ｌ２／４３４／Ｂ
ｕｂｏ ＹＨＬ−１１，Ｌ３／４０４／Ｂｕｂｏ ＹＨ
Ｌ− ６である。これらは、モノクローナル抗体を用い
たマイクロトラック法により血清型が同定されている。 同様に、クラミジア・シッタシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ
ｐｓｉｔｔａｃｉ）の培養細胞も同研究所より供与され
た標準株である。
【００３１】用いた腟内常在菌、腟炎起因菌の臨床分離
培養株は、エシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・ニューモニー（Ｋｌｅ
ｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ） 、エンテロ
バクター・クロアッカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃ
ｌｏａｃａｅ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅ
ｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ） 、シュードモナス・アエ
ルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎ
ｏｓａ）、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ） 、スタヒロコッカ
ス・エピデルミデス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｅｓ）、エンテロコッカス・フェカ
リス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）
、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔ
ｃｏｃｃｕｓ ａｇａｒａｃｔｉａｅ） 、ラクトバチ
ルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．） Ｎｏ．
９３９、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｐ．） Ｎｏ．９４０、コリネバクテリウム（Ｃｏ
ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．） 、ナイセリア
・コノローエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏ
ｅａｅ） 、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅ
ｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、カンジダ・アルビ
カンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）の１５種
類であり、１０８ ＣＰＵ／ｍｌに調整されたものを用
いた。
培養株は、エシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・ニューモニー（Ｋｌｅ
ｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ） 、エンテロ
バクター・クロアッカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃ
ｌｏａｃａｅ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅ
ｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ） 、シュードモナス・アエ
ルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎ
ｏｓａ）、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ） 、スタヒロコッカ
ス・エピデルミデス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｅｓ）、エンテロコッカス・フェカ
リス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）
、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔ
ｃｏｃｃｕｓ ａｇａｒａｃｔｉａｅ） 、ラクトバチ
ルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．） Ｎｏ．
９３９、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｐ．） Ｎｏ．９４０、コリネバクテリウム（Ｃｏ
ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．） 、ナイセリア
・コノローエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏ
ｅａｅ） 、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅ
ｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、カンジダ・アルビ
カンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）の１５種
類であり、１０８ ＣＰＵ／ｍｌに調整されたものを用
いた。
【００３２】（Ｂ）ＤＮＡの抽出
上記各細胞または細菌の培養液一定量を試験管内にとり
、遠心操作によりペレット状に沈殿させた後、その沈殿
物を１％（ｗ／ｖ） ＳＤＳドデシル硫酸ソーダ、０．
１ｍｇ／ｍｌ プロテナーゼ（ベーリンガーマンハイム
製）にて変性・溶解させた。続いてヘキサデシルトリメ
チルアンモニウムブロミドにて細胞壁断片・蛋白・ポリ
サッカライドを選別し、フェノール／クロロホルム／イ
ソアミルアルコール（２５／２４／１）にてＤＮＡ抽出
を行い、イソプロパノールを用いて沈殿させた。
、遠心操作によりペレット状に沈殿させた後、その沈殿
物を１％（ｗ／ｖ） ＳＤＳドデシル硫酸ソーダ、０．
１ｍｇ／ｍｌ プロテナーゼ（ベーリンガーマンハイム
製）にて変性・溶解させた。続いてヘキサデシルトリメ
チルアンモニウムブロミドにて細胞壁断片・蛋白・ポリ
サッカライドを選別し、フェノール／クロロホルム／イ
ソアミルアルコール（２５／２４／１）にてＤＮＡ抽出
を行い、イソプロパノールを用いて沈殿させた。
【００３３】（Ｃ）ＰＣＲ用ＤＮＡプローブの合成クラ
ミジア・トラコマティスの全ての血清型およびクラミジ
ア・シッタシの遺伝子の一部を共通に増幅できるＤＮＡ
プローブを、クラミジア属の菌体外膜蛋白をコードする
遺伝子の塩基配列（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ， Ｒ．Ｓ． ら
、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １６９， ３８７９−
３８８５（１９８７） 参照）をもとにＶＤ・Ｉの５´
側とＶＤ・ＩＶ の３´側の各々に相補性を有する下記
式（１）および式（２）、 ＧＣＣＧＣＴＴＴＧＡ ＧＴＴＣＴＧＣ
ＴＴＣ Ｃ （１） ＧＣ
ＡＡＧＡＴＴＴＴ ＣＴＡＧＡＴＴＴＣＡ Ｔ
（２）の塩基配列で示される２１塩基のＤ
ＮＡプローブをホスホアミダイト（Ｐｈｏｓｐｈｏｒａ
ｍｉｄｉｔｅ） 法により合成し、ＯＰＣＴＭ（アプラ
イド・バイオシステムズ製）カートリッジを用いて精製
し、ＰＣＲのプライマーとして使用した。
ミジア・トラコマティスの全ての血清型およびクラミジ
ア・シッタシの遺伝子の一部を共通に増幅できるＤＮＡ
プローブを、クラミジア属の菌体外膜蛋白をコードする
遺伝子の塩基配列（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ， Ｒ．Ｓ． ら
、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １６９， ３８７９−
３８８５（１９８７） 参照）をもとにＶＤ・Ｉの５´
側とＶＤ・ＩＶ の３´側の各々に相補性を有する下記
式（１）および式（２）、 ＧＣＣＧＣＴＴＴＧＡ ＧＴＴＣＴＧＣ
ＴＴＣ Ｃ （１） ＧＣ
ＡＡＧＡＴＴＴＴ ＣＴＡＧＡＴＴＴＣＡ Ｔ
（２）の塩基配列で示される２１塩基のＤ
ＮＡプローブをホスホアミダイト（Ｐｈｏｓｐｈｏｒａ
ｍｉｄｉｔｅ） 法により合成し、ＯＰＣＴＭ（アプラ
イド・バイオシステムズ製）カートリッジを用いて精製
し、ＰＣＲのプライマーとして使用した。
【００３４】（Ｄ）遺伝子ＤＮＡの増幅（ＰＣＲ法）反
応液として、１０Ｘ反応用緩衝液（Ｒｅａｃｔｉｏｎ
Ｂｕｆｆｅｒ） １０μｌ 、デオキシヌクレオチド３
−リン酸混合液（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴ
ＴＰ；各１．２５ｍＭ含有）１６μｌ 、上記合成ＤＮ
Ａプローブ 式（１）（５０μＭ ）２．０μｌ 、
上記合成ＤＮＡプローブ 式（２）（５０μＭ ）２
．０μｌ 、テンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）ＤＮＡ
１００ｎｇ〜１μｇ およびＴａｑポリメラーゼ（
宝酒造製）１μｌ （５Ｕｎｉｔｓ）にＨ２ Ｏを加え
、計１００μｌ としたものを調整した。１サイクルは
、塩基鎖の変性工程を９２℃１分、アニーリング工程を
５４℃１分、塩基鎖伸長工程を７２℃５分に設定し、ア
ンプリフィケーション・システム（ａｍｐｌｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ； シータス社）を用いて、
前記（Ｂ）で抽出した標的ＤＮＡを３０サイクル増幅し
た。
応液として、１０Ｘ反応用緩衝液（Ｒｅａｃｔｉｏｎ
Ｂｕｆｆｅｒ） １０μｌ 、デオキシヌクレオチド３
−リン酸混合液（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴ
ＴＰ；各１．２５ｍＭ含有）１６μｌ 、上記合成ＤＮ
Ａプローブ 式（１）（５０μＭ ）２．０μｌ 、
上記合成ＤＮＡプローブ 式（２）（５０μＭ ）２
．０μｌ 、テンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）ＤＮＡ
１００ｎｇ〜１μｇ およびＴａｑポリメラーゼ（
宝酒造製）１μｌ （５Ｕｎｉｔｓ）にＨ２ Ｏを加え
、計１００μｌ としたものを調整した。１サイクルは
、塩基鎖の変性工程を９２℃１分、アニーリング工程を
５４℃１分、塩基鎖伸長工程を７２℃５分に設定し、ア
ンプリフィケーション・システム（ａｍｐｌｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ； シータス社）を用いて、
前記（Ｂ）で抽出した標的ＤＮＡを３０サイクル増幅し
た。
【００３５】（Ｅ）ゲル電気泳動法
０．８％のアガロースゲルにエチジウムブロマイドを０
．５μｇ／ｍｌ加え、上記で増幅したＤＮＡの電気泳動
を行った。泳動後２５４ｎｍの紫外線を照射し、エチジ
ウムブロマイドの発色反応によりＤＮＡバンドを検出し
、クラミジア属の菌体外膜蛋白をコードする遺伝子領域
に由来する１０５０塩基の標的ＤＮＡバンドを確認した
。
．５μｇ／ｍｌ加え、上記で増幅したＤＮＡの電気泳動
を行った。泳動後２５４ｎｍの紫外線を照射し、エチジ
ウムブロマイドの発色反応によりＤＮＡバンドを検出し
、クラミジア属の菌体外膜蛋白をコードする遺伝子領域
に由来する１０５０塩基の標的ＤＮＡバンドを確認した
。
【００３６】（Ｆ）血清型識別用ＤＮＡプローブの合成
と標識 血清型識別用ＤＮＡプローブは、前記クラミジア・トラ
コマティス（血清型：Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｊ，Ｋ
）の菌体外膜蛋白をコードする遺伝子領域内の４つの可
変領域（ＶＤ・Ｉ〜ＶＤ・ＩＶ）の塩基配列から、各血
清型に特異的な塩基配列を選び、下記式（３）〜式（９
）、 ＡＴＧＴＡＧＧＧＣＡ ＡＧＡＡＴＴＣ
ＣＣＴ （３） Ｔ
ＴＴＧＡＴＡＣＴＡ ＣＣＡＣＧＣＴＴＡＡ
（４） ＧＴ
ＣＴＣＴＴＣＣＧ ＣＡＧＡＡＡＡＣＧＡ
（５） ＣＣＴ
ＧＴＴＧＴＡＧ ＡＴＡＴＴＡＣＡＡＣ
（６） ＴＴＣＡ
ＧＡＴＧＧＧ ＡＧＣＧＧＣＧＣＣＴ
（７） ＡＡＡＴＣ
ＴＴＣＴＧ ＡＴＴＴＴＡＡＴＡＣ
（８） ＣＡＣＡＡＴ
ＡＴＴＣ ＴＡＡＧＴＴＴＡＡＴ
（９） の塩基配列で示される各々２
０塩基のＤＮＡプローブをホスホアミダイト（Ｐｈｏｓ
ｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ） 法により合成し、ＯＰＣＴ
Ｍ（アプライド・バイオシステムズ製）カートリッジを
用いて精製した。
と標識 血清型識別用ＤＮＡプローブは、前記クラミジア・トラ
コマティス（血清型：Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｊ，Ｋ
）の菌体外膜蛋白をコードする遺伝子領域内の４つの可
変領域（ＶＤ・Ｉ〜ＶＤ・ＩＶ）の塩基配列から、各血
清型に特異的な塩基配列を選び、下記式（３）〜式（９
）、 ＡＴＧＴＡＧＧＧＣＡ ＡＧＡＡＴＴＣ
ＣＣＴ （３） Ｔ
ＴＴＧＡＴＡＣＴＡ ＣＣＡＣＧＣＴＴＡＡ
（４） ＧＴ
ＣＴＣＴＴＣＣＧ ＣＡＧＡＡＡＡＣＧＡ
（５） ＣＣＴ
ＧＴＴＧＴＡＧ ＡＴＡＴＴＡＣＡＡＣ
（６） ＴＴＣＡ
ＧＡＴＧＧＧ ＡＧＣＧＧＣＧＣＣＴ
（７） ＡＡＡＴＣ
ＴＴＣＴＧ ＡＴＴＴＴＡＡＴＡＣ
（８） ＣＡＣＡＡＴ
ＡＴＴＣ ＴＡＡＧＴＴＴＡＡＴ
（９） の塩基配列で示される各々２
０塩基のＤＮＡプローブをホスホアミダイト（Ｐｈｏｓ
ｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ） 法により合成し、ＯＰＣＴ
Ｍ（アプライド・バイオシステムズ製）カートリッジを
用いて精製した。
【００３７】このＤＮＡプローブの標識は、５´末端の
燐酸化反応により、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ，Ｔ４ ポリ
ヌクレオチドキナーゼ（東洋紡績（株）製）を用いて行
った。
燐酸化反応により、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ，Ｔ４ ポリ
ヌクレオチドキナーゼ（東洋紡績（株）製）を用いて行
った。
【００３８】（Ｇ）ドットプロット法
前記ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片を試料とし、そ
の分子数を２６０ｎｍの吸光度により算出した。そして
、この１０１２ ｍｏｌｅｃｕｌｅ／１〜２μｌ を９
０℃で変性させた後ナイロンメンブレンに滴下し、２５
４ｎｍの紫外線１．２×１０５ μＪＯＵＬＥＳ／ｃｍ
２（ＵＶ ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒＴＭ ；ストラタ
ジーン製）により固着させた。３２Ｐで標識されたＤＮ
Ａプローブは、１回のハイブリダイゼーションにつき１
０６ ｃｐｍ／ｍｌ使用した。プレハイブリダイゼーシ
ョンは、反応液として６×クエン酸標準緩衝液、５×デ
ンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）試薬、０．５％ＳＤ
Ｓ（ドデシル硫酸ソーダ）、１００μｇ／ｍｌ変性サケ
精子ＤＮＡを用い、６５℃２時間行った。ハイブリダイ
ゼーションは、反応液として３．０Ｍ テトラメチルア
ンモニウムクロライド、０．０１Ｍ リン酸ナトリウム
（ｐＨ６．８）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）、
０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ
、０．１％脱脂粉乳を用い、６２℃２時間行った。ハイ
ブリダイゼーション後、ナイロンメンブレンをラップに
包み、オートラジオグラフィーを−７０℃４時間行い、
各プローブとのドットハイブリッド形成の有無により試
料の血清型を識別した。
の分子数を２６０ｎｍの吸光度により算出した。そして
、この１０１２ ｍｏｌｅｃｕｌｅ／１〜２μｌ を９
０℃で変性させた後ナイロンメンブレンに滴下し、２５
４ｎｍの紫外線１．２×１０５ μＪＯＵＬＥＳ／ｃｍ
２（ＵＶ ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒＴＭ ；ストラタ
ジーン製）により固着させた。３２Ｐで標識されたＤＮ
Ａプローブは、１回のハイブリダイゼーションにつき１
０６ ｃｐｍ／ｍｌ使用した。プレハイブリダイゼーシ
ョンは、反応液として６×クエン酸標準緩衝液、５×デ
ンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）試薬、０．５％ＳＤ
Ｓ（ドデシル硫酸ソーダ）、１００μｇ／ｍｌ変性サケ
精子ＤＮＡを用い、６５℃２時間行った。ハイブリダイ
ゼーションは、反応液として３．０Ｍ テトラメチルア
ンモニウムクロライド、０．０１Ｍ リン酸ナトリウム
（ｐＨ６．８）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）、
０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ
、０．１％脱脂粉乳を用い、６２℃２時間行った。ハイ
ブリダイゼーション後、ナイロンメンブレンをラップに
包み、オートラジオグラフィーを−７０℃４時間行い、
各プローブとのドットハイブリッド形成の有無により試
料の血清型を識別した。
【００３９】２．結果
用いたクラミジア・トラコマティスおよびクラミジア・
シッタシ標準株の全てについて、ＰＣＲ後のゲル電気泳
動により増幅された標的ＤＮＡバンドが検出された。一
方、腟内常在菌、腟炎起因菌の臨床分離培養株から抽出
したＤＮＡを試料としてＰＣＲを行った場合、標的とす
るＤＮＡバンドは検出されず、交差反応は認められなか
った。
シッタシ標準株の全てについて、ＰＣＲ後のゲル電気泳
動により増幅された標的ＤＮＡバンドが検出された。一
方、腟内常在菌、腟炎起因菌の臨床分離培養株から抽出
したＤＮＡを試料としてＰＣＲを行った場合、標的とす
るＤＮＡバンドは検出されず、交差反応は認められなか
った。
【００４０】クラミジア・トラコマティス標準株から抽
出したＤＮＡをＰＣＲ法で増幅した後、血清型識別用の
各ＤＮＡプローブとドットプロットを行った結果、各血
清型由来のＤＮＡと血清型識別用ＤＮＡプローブ間で、
表１に示す結合パターンが認められた。
出したＤＮＡをＰＣＲ法で増幅した後、血清型識別用の
各ＤＮＡプローブとドットプロットを行った結果、各血
清型由来のＤＮＡと血清型識別用ＤＮＡプローブ間で、
表１に示す結合パターンが認められた。
【００４１】
【表１】
【００４２】この結合パターンからクラミジア・トラコ
マティスの各血清型の識別が可能であることが判明した
。
マティスの各血清型の識別が可能であることが判明した
。
【００４３】実施例２ クラミジア属の検出帯下感、
下腹痛などを主訴とする治療前臨床患者９４症例より採
取された子宮頸管綿棒擦過材料を、１ｍＭの１Ｍ 塩酸
グアニジン、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭトリス塩
酸および０．０５％アジ化ナトリウムの入ったチューブ
内で４℃に保存した。保存検体から、実施例１（Ｂ）記
載の方法によりＤＮＡを抽出し、同（Ｄ）記載の方法で
ＰＣＲを行い、同（Ｅ）記載の方法でＤＮＡバンドの検
出を行った結果、９４例中３３例（３５．１％）で標的
ＤＮＡが検出され、クラミジア属の感染が認められた。
下腹痛などを主訴とする治療前臨床患者９４症例より採
取された子宮頸管綿棒擦過材料を、１ｍＭの１Ｍ 塩酸
グアニジン、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭトリス塩
酸および０．０５％アジ化ナトリウムの入ったチューブ
内で４℃に保存した。保存検体から、実施例１（Ｂ）記
載の方法によりＤＮＡを抽出し、同（Ｄ）記載の方法で
ＰＣＲを行い、同（Ｅ）記載の方法でＤＮＡバンドの検
出を行った結果、９４例中３３例（３５．１％）で標的
ＤＮＡが検出され、クラミジア属の感染が認められた。
【００４４】一方、同時に採取された子宮頸管綿棒擦過
材料のクラミジア属感染を、ＥＩＡ法（クラミジアザイ
ムＴＭ；アボット社製）で行った場合、検出症例は２４
例（２４．５％）であった。
材料のクラミジア属感染を、ＥＩＡ法（クラミジアザイ
ムＴＭ；アボット社製）で行った場合、検出症例は２４
例（２４．５％）であった。
【００４５】
【配列表】配列番号 ：１
配列の長さ：２１
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
ＧＣＣＧＣＴＴＴＧＡ ＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣ Ｃ
【０
０４６】配列番号 ：２ 配列の長さ：２１ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＡＡＧＡＴＴＴＴ ＣＴＡＧＡＴＴＴＣＡ Ｔ
０４６】配列番号 ：２ 配列の長さ：２１ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＡＡＧＡＴＴＴＴ ＣＴＡＧＡＴＴＴＣＡ Ｔ
【０
０４７】配列番号 ：３ 配列の長さ：２０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＡＴＧＴＡＧＧＧＣＡ ＡＧＡＡＴＴＣＣＣＴ
０４７】配列番号 ：３ 配列の長さ：２０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＡＴＧＴＡＧＧＧＣＡ ＡＧＡＡＴＴＣＣＣＴ
【００４
８】配列番号 ：４ 配列の長さ：２０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＴＴＴＧＡＴＡＣＴＡ ＣＣＡＣＧＣＴＴＡＡ
８】配列番号 ：４ 配列の長さ：２０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＴＴＴＧＡＴＡＣＴＡ ＣＣＡＣＧＣＴＴＡＡ
【００４
９】配列番号 ：５ 配列の長さ：２０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＴＣＴＣＴＴＣＣＧ ＣＡＧＡＡＡＡＣＧＡ
９】配列番号 ：５ 配列の長さ：２０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＴＣＴＣＴＴＣＣＧ ＣＡＧＡＡＡＡＣＧＡ
【００５
０】配列番号 ：６ 配列の長さ：２０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＣＴＧＴＴＧＴＡＧ ＡＴＡＴＴＡＣＡＡＣ
０】配列番号 ：６ 配列の長さ：２０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＣＴＧＴＴＧＴＡＧ ＡＴＡＴＴＡＣＡＡＣ
【００５
１】配列番号 ：７ 配列の長さ：２０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＴＴＣＡＧＡＴＧＧＧ ＡＧＣＧＧＣＧＣＣＴ
１】配列番号 ：７ 配列の長さ：２０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＴＴＣＡＧＡＴＧＧＧ ＡＧＣＧＧＣＧＣＣＴ
【００５
２】配列番号 ：８ 配列の長さ：２０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＡＡＡＴＣＴＴＣＴＧ ＡＴＴＴＴＡＡＴＡＣ
２】配列番号 ：８ 配列の長さ：２０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＡＡＡＴＣＴＴＣＴＧ ＡＴＴＴＴＡＡＴＡＣ
【００５
３】配列番号 ：９ 配列の長さ：２０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列
３】配列番号 ：９ 配列の長さ：２０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列
Claims (4)
- 【請求項１】 （ｉ）クラミジア属の菌体外膜蛋白を
コードする遺伝子領域内の４つの可変領域を含む遺伝子
領域の上流共通部分および下流共通部分に相補性を有す
るＤＮＡプローブをプライマーとして、クラミジア属の
血清型特異的塩基配列を含む遺伝子領域を増幅し、（ｉ
ｉ） 該増幅遺伝子ＤＮＡを検出することを特徴とする
クラミジア属微生物の検出方法。 - 【請求項２】 （ｉ）クラミジア属の菌体外膜蛋白を
コードする遺伝子領域内の４つの可変領域を含む遺伝子
領域の上流共通部分および下流共通部分に相補性を有す
るＤＮＡプローブをプライマーとして、クラミジア属の
血清型特異的塩基配列を含む遺伝子領域を増幅し、（ｉ
ｉ） 該増幅遺伝子ＤＮＡに、クラミジア属の血清型特
異的塩基配列に結合能を有する標識ＤＮＡプローブを結
合させ、（ｉｉｉ）該結合標識ＤＮＡプローブを検出し
、結合プローブの種類を解析することを特徴とするクラ
ミジア属微生物および血清型の識別方法。 - 【請求項３】 ４つの可変領域を含む遺伝子領域の上
流共通部分に相補性を有するＤＮＡプローブが、下記式
（１）、 ＧＣＣＧＣＴＴＴＧＡ ＧＴＴＣＴＧＣ
ＴＴＣ Ｃ （１）で示される塩基配
列を有し、下流共通部分に相補性を有するＤＮＡプロー
ブが下記式（２）、 ＧＣＡＡＧＡＴＴＴＴ ＣＴＡＧＡＴＴ
ＴＣＡ Ｔ （２）で示される塩基配
列を有する、請求項１又は２のクラミジア属微生物の検
出または識別方法。 - 【請求項４】 血清型特異的塩基配列に結合能を有す
る標識ＤＮＡプローブが、下記式（３）、式（４）、式
（５）、式（６）、式（７）、式（８）または式（９）
ＡＴＧＴＡＧＧＧＣＡ ＡＧＡＡＴＴＣ
ＣＣＴ （３） Ｔ
ＴＴＧＡＴＡＣＴＡ ＣＣＡＣＧＣＴＴＡＡ
（４） ＧＴ
ＣＴＣＴＴＣＣＧ ＣＡＧＡＡＡＡＣＧＡ
（５） ＣＣＴ
ＧＴＴＧＴＡＧ ＡＴＡＴＴＡＣＡＡＣ
（６） ＴＴＣＡ
ＧＡＴＧＧＧ ＡＧＣＧＧＣＧＣＣＴ
（７） ＡＡＡＴＣ
ＴＴＣＴＧ ＡＴＴＴＴＡＡＴＡＣ
（８） ＣＡＣＡＡＴ
ＡＴＴＣ ＴＡＡＧＴＴＴＡＡＴ
（９） で示される塩基配列を有する
ＤＮＡプローブである、請求項２のクラミジア属微生物
および血清型の識別方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13336891A JPH04335900A (ja) | 1991-05-10 | 1991-05-10 | クラミジア属微生物の検出および識別方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13336891A JPH04335900A (ja) | 1991-05-10 | 1991-05-10 | クラミジア属微生物の検出および識別方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04335900A true JPH04335900A (ja) | 1992-11-24 |
Family
ID=15103095
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13336891A Pending JPH04335900A (ja) | 1991-05-10 | 1991-05-10 | クラミジア属微生物の検出および識別方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04335900A (ja) |
-
1991
- 1991-05-10 JP JP13336891A patent/JPH04335900A/ja active Pending
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