JPH04334398A - ヒトセントロメア抗原ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト抗セントロメア抗
体によって認識されるヒトセントロメア抗原の少なくと
も特異的抗原性部分を含むポリペプチド、該ポリペプチ
ドをコードする遺伝子、該遺伝子を有するプラスミドま
たはフアージ、該プラスミドまたはファージを宿主に導
入して得られる形質転換体、該形質転換体を用いたヒト
セントロメア抗原ポリペプチドの製造法、および該ヒト
セントロメア抗原ポリペプチドを用いた抗セントロメア
抗体の検出方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】自己免疫疾患は国の指定する難病の一つ
であり、その病因を解明し、治療法を開発することが望
まれている。自己免疫疾患の患者血清中には、自己の様
々な細胞成分に対する様々な抗体（自己抗体）が存在す
る。これらの自己抗体と疾患については何らかの関連性
があるとされている。

【０００３】抗セントロメア抗体は抗核抗体の一つであ
り、有糸分裂細胞の染色体中央部に存在し、分裂期の染
色体の分離に重要な役割をはたす“セントロメア領域”
のタンパク質と反応する抗体である。自己免疫疾患、特
に強皮症をはじめとするいくつかの自己免疫疾患に関係
する自己抗体として抗セントロメア抗体が指摘されてい
る。しかし強皮症といっても様々な病型を含むきわめて
包括的な疾患名であり、その診断および治療のためには
、より簡便で正確な病型分類のできる臨床検査法の確立
が望まれている。

【０００４】現在、患者血清から抗セントロメア抗体を
検出する方法としては、肝切片あるいは培養細胞を核材
として用いた間接螢光抗体法が採用されている。間接蛍
光抗体法で陽性の抗体を、厳密に他に存在する抗体と区
別するには、更に分裂期の細胞の染色体塗沫標本を用い
、抗セントロメア抗体が染色体上のセントロメア領域を
認識する事を確認しなければならない。これらの方法は
染色体標本作成、およびそれを用いた顕微鏡観察に特別
な設備と労力を要するという欠点があり、多数の母集団
を扱う臨床検査には適さない。別の抗セントロメア抗体
活性の検出方法として、ヒト細胞より大量に染色体のセ
ントロメア領域を調製し、これを抗原として臨床検査に
用いる方法が考えられるが、コストと労力の面で実用化
に問題がある。

【０００５】現在までに、分子量の異なるセントロメア
蛋白質Ａ、ＢまたはＣを含むヒトセントロメア抗原の存
在が確認されている。そのうちの主要な抗原はヒトセン
トロメア蛋白質Ｂ（ＣＥＮＰ−Ｂ）であり、これについ
てはコードする遺伝子の一部がクローニングされている
（Ｅａｒｎｓｈａｗ，Ｗ．Ｃ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉ
ｏｌ．，１０４，８１７，１９８７）。しかしＣＥＮＰ
−Ｂに含まれるエピトープの詳細な解析はいまだなされ
ていない。抗セントロメア抗体の正確な検出、分類のた
め、主要なヒトセントロメア抗原であるＣＥＮＰ−Ｂの
エピトープの詳細な解析が望まれている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上記従来の課題を解決
し、抗セントロメア抗体を特異的にかつ簡便に測定する
方法を開発するために、主要なヒトセントロメア抗原で
あるヒトセントロメア蛋白質Ｂのエピトープを解明し、
各エピトープに相当するポリペプチドを大量に製造する
ことが望まれる。

【０００７】本発明の目的はヒトセントロメア蛋白質Ｂ
のエピトープの構造に関する知見を提供し、さらにこの
エピトープを構成するポリペプチドの配列を明かにし、
このポリペプチドを用いた抗セントロメア抗体の検出方
法を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヒトセン
トロメア蛋白質Ｂの遺伝子であるＣＥＮＰ−Ｂ遺伝子を
クローニングするため、ヒトＴ細胞由来のＪｕｒｋａｔ
細胞より抽出したメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を
用いてｃＤＮＡライブラリーを作成し、そこからＣＥＮ
Ｐ−Ｂ遺伝子を単離し、それを元にして各種の欠失変異
遺伝子を作成し、該欠失遺伝子産物と抗セントロメア抗
体を有する患者血清との反応を解析して主要なエピトー
プＩおよびＩＩの領域を決定し、本発明を完成するに至
った。

【０００９】本発明のポリペプチドは、ヒトセントロメ
ア蛋白質Ｂのエピトープを構成し、以下のアミノ酸配列
でなるポリペプチドＩ、ポリペプチドＩＩおよびそれら
の部分配列を有するポリペプチドでなる群から選択され
るポリペプチドである。

【００１０】ポリペプチドＩ（配列番号１に記載）Ａｓ
ｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ
　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　
Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　ＡｌａＭｅｔ　Ｖａ
ｌ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ
　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　
Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　ＨｉｓＩｌｅ　Ｌｅｕ　Ｈｉ
ｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ
　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　
Ｈｉｓ　Ａｌａ　ＡｒｇＧｌｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｖａ
ｌ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｇｌｎ
　ＳｅｒポリペプチドＩＩ（配列番号２に記載）Ｓｅｒ
　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　
Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｖ
ａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　ＧｌｙＧｌｙ　Ｓｅｒ
　Ｐｈｅ　ＧＬｙ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ。

【００１１】本発明は、上記ポリペプチドをコードする
遺伝子を包含する。

【００１２】本発明は、上記該遺伝子を有するプラスミ
ドもしくはファージベクターを包含する。

【００１３】本発明は、上記プラスミドもしくはファー
ジベクターで形質転換された宿主細胞を包含する。

【００１４】本発明の上記ポリペプチドの製造法は、上
記遺伝子を有するプラスミドもしくはファージベクター
により形質転換された宿主細胞を培養する工程、および
該培養物から目的とするポリペプチドを単離、精製する
工程を包含する。

【００１５】本発明のヒト抗セントロメア抗体の検出方
法は、以下の工程（ａ）および（ｂ）を包含する：（ａ
）試料に上記ポリペプチドを加えて、該試料中に含まれ
るヒト抗セントロメア抗体と該ポリペプチドとを接触さ
せる工程、および、（ｂ）該ポリペプチドと結合したヒ
ト抗セントロメア抗体を検出する工程。

【００１６】本発明のＣＥＮＰ−Ｂをコードする遺伝子
は次のようにして得ることができる。まず、ヒト由来の
組織、細胞、細胞株、好ましくはヒトＴ細胞由来のＪｕ
ｒｋａｔ細胞よりｍＲＮＡを分画し、ｃＤＮＡライブラ
リーを調製する。ｃＤＮＡライブラリーの調製は、公知
の適当な方法で行って良いが、例えば、λｇｔ１１ファ
ージベクターを用いたＹｏｕｎｇらの方法（Ｙｏｕｎｇ
，Ｒ．Ａ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ，８０，１９４，１９８３）によって行うこと
ができる。こうして調製されたｃＤＮＡライブラリー（
例えば大腸菌を用いたライブラリー）からのヒトセント
ロメア抗原を発現するクローンのスクリーニングは、抗
セントロメア抗体を用いて行うことができる。すなわち
、調製されたｃＤＮＡライブラリーの発現するタンパク
質と該抗セントロメア抗体との反応の有無を調べれば良
い。上記大腸菌を用いてのヒトセントロメア抗原の発現
においては、ヒトセントロメア抗原そのものを発現させ
てもよいが、ヒトセントロメア抗原と他のタンパク質、
好ましくは大腸菌β−ガラクトシダーゼとの融合蛋白質
として発現させてもよい。この場合、β−ガラクトシダ
ーゼの活性を一つの指標として用いることができる。

【００１７】次に、上記のようにスクリーニングされた
陽性クローン（大腸菌）からファージＤＮＡを常法によ
り分離する。このＤＮＡの制限酵素解析により、目的と
するｃＤＮＡ（ヒトセントロメア抗原のｃＤＮＡ）が該
ファージＤＮＡ中に挿入されていることが確認され、制
限酵素地図が作成され得る。このようにして得られた陽
性クローンの中からヒトセントロメア蛋白質のうちヒト
セントロメア蛋白質Ｂをコードする遺伝子を選択しクロ
ーニングする。これは、例えばＥａｒｎｓｈａｗらによ
ってクローニングされたＣＥＮＰ−Ｂ遺伝子と同じよう
な制限酵素地図を有するクローンを選択する方法により
行われる。このようにして得られたヒトセントロメア抗
原遺伝子を含むＤＮＡ断片のうち最長の断片の制限酵素
地図、および該断片を含むλｇｔ１１Ｓｆｉ−Ｎｏｔベ
クターＤＮＡの制限酵素地図を図１に示す。さらに、ヒ
トセントロメア抗原遺伝子を含むＤＮＡ断片のうちの最
長の断片（上記）および最短の断片の制限酵素地図を図
２に示す。

【００１８】さらに上記のようにして得られるＣＥＮＰ
−Ｂ遺伝子のエピトープが決定される。このＣＥＮＰ−
Ｂ遺伝子のエピトープの決定は、該遺伝子をもとにして
、種々の制限酵素、エキソヌクレアーゼ等を用いて各種
の欠失変異遺伝子を作成し、該欠失変異遺伝子から得ら
れるポリペプチドと抗セントロメア抗体を有する患者血
清との反応を解析することによって行われ得る。具体的
には、次のような方法により行われ得る。まずＣＥＮＰ
−Ｂ遺伝子の３’末端側の塩基が欠失した種々の長さの
断片（図３に示す）を調製する。このような欠失変異を
伴う遺伝子断片の調製法は「続生化学実験講座、第１巻
、遺伝子研究法ＩＩ、２８９−３０５頁、日本生化学会
編」に記載されている。上記断片を含む発現ベクター（
その名称を図３の左端に記す）を用いて発現させたポリ
ペプチドと抗セントロメア抗体を有する患者の血清との
反応をウエスタンブロット法で検定したところ、図３に
示す結果が得られた。患者血清と反応性を有するポリペ
プチドのうちでも該血清４０検体中４０検体と反応する
ものと４０検体中１１検体としか反応しないものがあり
、このことによりｐＣＥＮＰ−Ｂ−１（その調製法を実
施例１（１）〜（４）に示す）によりコードされるＣＥ
ＮＰ−Ｂ抗原ポリペプチドは複数のエピトープを有する
ことが示唆される。

【００１９】次に、図５に示す断片を調製し、同様にポ
リペプチドを発現させて抗セントロメア抗体含有血清と
反応させたところ、図５に示す結果が得られた。このこ
とによりＣＥＮＰ−Ｂのエピトープのひとつは、図５に
示されるｐＳ−１−３５が有するＤＮＡ断片がコードす
るアミノ酸配列、つまり４６２〜４８７位のアミノ酸配
列（このアミノ酸のＮｏ．は、Ｅａｒｎｓｈｏｗ，Ｗ．
Ｃ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１０４，８１７，１
９８７に記載の配列に一致させている；このアミノ酸配
列を配列番号２に示す）中に含まれることがわかる。上
記アミノ酸配列をポリペプチドＩＩとする。さらに図６
に示す断片を調製し、同様にポリペプチドを発現させて
、抗セントロメア抗体含有血清と反応させたところ、図
６に示す結果が得られた。このことにより、ＣＥＮＰ−
Ｂのエピトープのひとつは、図６に示されるｐＢ−２−
６が有するＤＮＡ断片がコードするアミノ酸配列、つま
り５３０〜５９４位のアミノ酸配列（このアミノ酸配列
のＮｏ．は上記同様につけてある；このアミノ酸配列を
配列番号１に示す）中に含まれることがわかる。上記ア
ミノ酸配列をポリペプチドＩとする。 　　このように、ＣＥＮＰ−Ｂのエピトープのひとつは
、該ポリペプチドの４６２番目から４８７番目の２６個
のアミノ酸でなる配列に含まれ、他のエピトープは、該
ポリペプチドの５３０番目から５９４番目の６５個のア
ミノ酸でなる配列に含まれることがわかる。本発明は、
これらのエピトープを構成するポリペプチドを包含する
。 これらのポリペプチドは、該ポリペプチドをコードする
遺伝子を用いて大腸菌や酵母のような微生物あるいは動
物細胞等で製造することが可能である、すなわち、上記
で得られた各ポリペプチドをコードする遺伝子の５’側
に適当なプロモーター領域を付加し、これを適当なプラ
スミドに挿入した後、大腸菌や酵母のような微生物ある
いは動物細胞に導入して培養すれば良い。各エピトープ
に相当するポリペプチドそのものを発現させても良いが
、他の蛋白質、好ましくは大腸菌β−ガラクトシダーゼ
やバクテリオファージＴ７遺伝子１０蛋白質との融合蛋
白質として発現させても良い。（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．
ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８９，１１３，１９８
６）このような操作は公知の技術を用いることにより行
うことができる。各ポリペプチドの単離、精製も公知の
カラムクロマトグラフィーもしくは免疫化学的方法で行
える。

【００２０】あるいはこれらのポリペプチドは、液相ま
たは固相法による通常のペプチド合成法や酵素法を行い
ても合成することが可能である（続生化学実験講座２，
蛋白質の化学下，６６３頁，１９８７）。

【００２１】このようにして得られた各エピトープを構
成するポリペプチドは、抗セントロメア抗体活性の測定
に用いられる。測定法としてはＲＩＡ法，ＥＬＩＳＡ法
、ウェスタンブロット法等の通常の免疫検定法が挙げら
れる。反応方法（固相、液相）、標識方法、検出方法等
については等に限定されない。検体についても特に限定
されることはなく、尿、唾液、血液、血清、組織、糞便
等が用いられる。

【００２２】本発明のポリペプチドＩおよびポリペプチ
ドＩＩを用いて、従来の間接蛍光抗体法で陽性と診断さ
れる患者血清を測定すると、エピトープＩにのみ反応す
る血清とエピトープＩおよびＩＩの両方に反応する血清
とに分かれる。このように、本発明の測定法により、抗
セントロメア抗体を有する患者を、認識する各エピトー
プ毎に細かく分類することができ、この分類は抗セント
ロメア抗体を有する患者の正確な病型分類を行う上で重
要な指標となりうる。

【００２３】

【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳し
く説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。

【００２４】（実施例１） （１）全ＲＮＡの抽出 Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培地に１０％牛
胎児血清を添加した培地で培養し、このＪｕｒｋａｔ細
胞から、常法によりグアニジンチオシアネート（ＧｕＳ
ＣＮ）を用いて次のように全ＲＮＡを抽出した（Ｃｈｉ
ｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
１８，５２９４，１９７９）。まず、Ｊｕｒｋａｔ細胞
（約５×１０７個）をグアニジンチオシアネート／塩化
リチウム溶液（ＧｕＳＣＮ　０．５ｇを２５％塩化リチ
ウム溶液０．５８ｍｌに溶解し、２−メルカプトエタノ
ール２０μｌを加えたもの）に懸濁し、注射器を用いて
粘性がなくなるまでシェアリングをした後、５．７Ｍ塩
化セシウム溶液の上にこの懸濁液を重層して遠心分離を
行った。遠心チューブの底に沈澱した全ＲＮＡをＲＮａ
ｓｅを含まない水に溶解した後、エタノール沈澱を行っ
て回収した。

【００２５】（２）メッセンジャーＲＮＡの調製オリゴ
（ｄＴ）セルロースカラム　　タイプ３（コラボレイテ
ィブリサーチ社製）を用いて実施例１で得た全ＲＮＡか
ら、次のようにｍＲＮＡを調製した。まず、上記カラム
をＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ　
ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）で洗浄した後、ＴＥ／ＮａＣｌ
溶液（ＴＥ緩衝液と１Ｍ　ＮａＣｌ溶液を１：１で混合
したもの）で平衡化した。（１）項で得られた全ＲＮＡ
の沈澱をＴＥ緩衝液に溶解し、６５℃で５分間保温した
後に急冷し、等量の１Ｍ　ＮａＣｌ溶液を加えてからカ
ラムに流した。 ベッド容量の５倍量のＴＥ／ＮａＣｌ溶液で洗浄した後
、３倍量のＴＥ緩衝液でｍＲＮＡを溶出した。ｍＲＮＡ
溶出液のＮａＣｌ濃度を０．５Ｍに調整した後、これを
再度カラムに流してｍＲＮＡを精製した。得られた精製
ｍＲＮＡ画分を集めてエタノール沈澱した後、ＴＥ緩衝
液に溶解させた。

【００２６】（３）λｇｔ１１ベクターによるｃＤＮＡ
ライブラリーの作製 （２）で得られたｍＲＮＡ　４μｇとＮｏｔＩプライマ
ー・アダプター（プロメガ社製）１．８μｇを用いてｃ
ＤＮＡを合成した（Ｈａｎ，Ｊ．Ｈ．ら，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ，２６，１６１７，１９８７；Ｇｕｂｌｅ
ｒ，Ｕ．ら，Ｇｅｎｅ，２５，２６３，１９８３）。得
られたｃＤＮＡにＲｉｂｏＣｌｏｎｅ　ＥｃｏＲＩアダ
プターライゲーションシステム（プロメガ社製）を使用
してＥｃｏＲＩアダプターを結合させた。制限酵素Ｎｏ
ｔＩで切断すると同時にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
でＥｃｏＲＩアダプターの５’−ＯＨをリン酸化した。 これらのｃＤＮＡを１％アガロースゲル電気泳動で分離
し、約１．２ｋｂ以上約７ｋｂ以下のｃＤＮＡを分取し
た。得られたｃＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ
で二重切断したλｇｔ１１　Ｓｆｉ−Ｎｏｔベクター（
プロメガ社製）に組込み、ＧＩＧＡＰＡＣＫＩＩ（スト
ラテジーン社製）を用いてファージ粒子へのパッケージ
ングを行い、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。

【００２７】（４）抗体スクリーニングによる陽性クロ
ーンの分離と解析 抗体スクリーニングには、間接蛍光抗体法で抗セントロ
メア抗体陽性と判定された患者血清を用いた。間接蛍光
抗体法は常法に従って行った（茂木著、日本臨床、４８
巻、１９９０年増刊号、５８０〜５８３頁）。

【００２８】抗体スクリーニングは、エクスプレスブロ
ットアッセイキット（バイオラッド社製）を用いて次の
方法で行った。

【００２９】（３）項で得られたファージ粒子を大腸菌
Ｙ１０９０に感染させてプラークを形成させた。生じた
約５０〜６０万個（シャーレ１枚あたり約２万個）のフ
ァージプラークのプレート上に、１０ｍＭ　ＩＰＴＧを
しみこませて風乾したニトロセルロースフィルターをの
せ、３７℃で２時間培養して挿入されたｃＤＮＡからの
遺伝子産物（すなわちβ−ガラクトシダーゼとの融合タ
ンパク）を誘導し、該遺伝子産物をフィルター上に移し
た。４℃で１０分間冷却した後、フィルターをプレート
からはがし、ブロッキング液（３％ゼラチン、２０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１、ｐＨ７．６、０．５Ｍ　ＮａＣｌ
）中で室温で１時間処理した後、ＴＢＳ溶液（２０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１、ｐＨ７．６、０．５Ｍ　ＮａＣｌ
）で洗浄した。上記ヒト抗セントロメア抗体血清を、抗
体用溶液（１％ゼラチン、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１
、ｐＨ７．６、０．５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０５　％　Ｔ
ｗｅｅｎ２０）で約１万倍に希釈し、希釈血清とフィル
ターとを４℃で終夜振盪しながら反応させた。このフィ
ルターをＴ−ＴＢＳ溶液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を
含むＴＢＳ溶液）で３回洗浄した後、抗体用溶液で３０
００倍に希釈したアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ヒ
ト抗体（バイオラッド社製）に浸し、室温で数時間振盪
した。続いてフィルターをＴ−ＴＢＳ溶液で１回、ＴＢ
Ｓ溶液で２回洗浄した後、アルカリホスファターゼ用Ｂ
ＣＩＰ・ＮＢＴ発色液（バイオラッド社製）を用いて発
色させた。

【００３０】上記の操作で発色した陽性クローンについ
て、ヒト抗セントロメア抗体血清を用いて上記と同様の
操作で再度スクリーニングを行った。その結果、再現的
にヒト抗セントロメア抗体と反応するクローンを１３個
得た。これらのクローンをそれぞれλｇｔ１１　ＣＥＮ
Ｐ−１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１
、１２、および１３と命名した。

【００３１】これらの１３個のクローンからファージＤ
ＮＡを常法に従い分離し、該ファージＤＮＡを制限酵素
ＥｃｏＲＩ、Ｎｏｔｌを用いて二重切断した後、１％ア
ガロースゲル電気泳動で分離して挿入ＤＮＡ断片の大き
さを測定した。

【００３２】１３個のクローンの１つ（λｇｔ１１　Ｃ
ＥＮＰ−１）を選び、その挿入ＤＮＡ断片をプローブに
して残りの１２個のクローンの挿入ＤＮＡ断片と常法に
よりサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果
９個のクローン（λｇｔ１１　ＣＥＮＰ−３、５、６、
８、９、１０、１１、１２、１３）の挿入ＤＮＡ断片と
ハイブリダイズすることが判明した。残りの３個のクロ
ーンについてもその内の１つ（λｇｔ１１　ＣＥＮＰ−
２）の挿入ＤＮＡ断片をプローブにして同様の操作を行
った。 その結果残り２個のクローン（λｇｔ１１　ＣＥＮＰ−
４、７）の挿入ＤＮＡ断片とハイブリダイズした。これ
らの実験より、１３個のクローンは２つのグループ（Ａ
：λｇｔ１１　ＣＥＮＰ−１、３、５、６、８、９、１
０、１１、１２、１３、およびＢ：λｇｔ１１　ＣＥＮ
Ｐ−２、４、７）に分類されることが明らかになった。

【００３３】これらのグループの挿入ＤＮＡ断片を種々
の制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動により切
断ＤＮＡ断片の大きさを測定して、制限酵素地図を作製
した。その結果、Ａグループの挿入ＤＮＡ断片は、すで
にＥａｒｎｓｈａｗらによってクローニングされたＣＥ
ＮＰ−Ｂ遺伝子と同じグループに属することが判明した
が（Ｅａｒｎｓｈａｗ，Ｗ．Ｃ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂ
ｉｏｌ．，１０４，８１７，１９８７）、Ｂグループの
挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地図はＥａｒｎｓｈａｗらの
ＣＥＮＰ−Ｂ遺伝子とは対応せず、他のヒトセントロメ
ア抗原をコードするものと考えられた。Ａのグループの
うち最長の挿入ＤＮＡを含むクローンの制限酵素地図を
図１に示す。図１において、括弧内の数字の単位はｋｂ
である。矢印は遺伝子の読取方向を示す。

【００３４】ＣＥＮＰ−Ｂ遺伝子を含むと考えられるＡ
グループに属する１０個の挿入ＤＮＡを、プラスミドベ
クターｐＧＥＭＥＸ−１２のＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ部位
に再クローニングして、それぞれｐＣＥＮＰ−Ｂ−１、
３、５、６、８、９、１０、１１、１２および１３と命
名した。ここでｐＧＥＭＥＸ−１２は、プロメガ社製の
プラスミドベクターｐＧＥＭＥＸＴＭ−１を使用し、制
限酵素ＳｆｉＩおよびＳａｃＩで二重切断した後、Ｋｌ
ｅｎｏｗフラグメントで３’突出部分を除去してからラ
イゲーションを行うことにより調製した。この操作によ
りｐＧＥＭＥＸＴＭ−１のマルチクローニングサイトに
存在したＳｆＩ、ＳａｃＩ切断部位は消失する。これら
のプラスミド（ｐＣＥＮＰ−Ｂ−１、３、５、６、８、
９、１０、１１、１２および１３）により形質転換され
た大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をそれぞれＩＰＴＧ存在下
で培養し、１０種類のＣＥＮＰ−Ｂ抗原ポリペプチドを
得た。ｐＧＥＭＥＸ−１２中に再クローニングされた挿
入ＤＮＡは全てＴ７遺伝子１０とインフレームになって
おり、産生されるＣＥＮＰ−Ｂ抗原ポリペプチドはＴ７
遺伝子１０タンパク質との融合タンパク質になっている
。得られたＣＥＮＰ−Ｂ抗原ポリペプチドを、間接蛍光
抗体法で抗セントロメア抗体陽性と判定された患者血清
４０例、および陰性と判定された健常人血清４例を用い
たウエスタンブロット法（Ｔｏｗｂｉｎ，Ｈ．ら，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６，４
３５０，（１９７９））で検定した。その結果、これら
の１０種類のＣＥＮＰ−Ｂ抗原ポリペプチドは、４０例
全ての患者血清に対して陽性を示し、かつ４例全ての健
常人血清に対して陰性を示した。

【００３５】そこでこれらの１０個のクローンの内で最
も短い挿入ＤＮＡ断片を含むｐＣＥＮＰ−Ｂ−１を用い
てＣＥＮＰ−Ｂ抗原のエピトープの解析を行うことにし
た。図２に最長の挿入ＤＮＡ断片を含むクローンの制限
酵素地図と、ｐＣＥＮＰ−Ｂ−１の挿入ＤＮＡ断片の制
限酵素地図とを示す。図２において遺伝子の読取方向は
左から右の方向になっている。

【００３６】（５）３’末端側の配列が欠失した変異株
およびそれを用いたカルボキシル末端側を欠失させたポ
リペプチドの作成 ｐＣＥＮＰ−Ｂ−１に含まれるＣＥＮＰ−Ｂ抗原遺伝子
の３’末端側、即ち図２のＮｏｔＩ側からの欠失変異株
を、ニッポンジーン社製のデリーションキットを用いて
作成した。まずｐＣＥＮＰ−Ｂ−１を制限酵素ＮｏｔＩ
およびＥｃｏＴ２２Ｉで切断後、大腸菌エキソヌクレア
ーゼＩＩＩと反応させ、一方向に欠失が導入された二本
鎖ＤＮＡを調製した。エキソヌクレアーゼＩＩＩを利用
した一方向欠失挿入プラスミドの作成法に関しては、「
続生化学実験講座、第１巻、遺伝子研究法ＩＩ、日本生
化学会編」の２８９〜３０５頁に詳しく記載されている
。前記の方法により得られた一方向に欠失が挿入された
各欠失プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に形質転換して、
一方向に欠失が挿入されたプラスミドクローンを作成し
た。各プラスミドクローンから二本鎖ＤＮＡを調製して
、制限酵素による切断パターンから欠失の程度を調べ、
適当なクローンからＤＮＡを調製した。これらの各プラ
スミド、ｐ１−２６、ｐ１−３５、ｐ２−１６、ｐ１−
１およびｐ２−６（これらの制限酵素地図を図３に示す
）によって大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、Ｉ
ＰＴＧ存在下で培養して各種ポリペプチド（各欠失プラ
スミドにコードされたポリペプチドとＴ７遺伝子１０タ
ンパク質との融合タンパク質）を得た。得られた各種ポ
リペプチドと（４）項で使用した４０例の抗セントロメ
ア抗体陽性の患者血清との反応性を、各種ポリペプチド
を抗原とするウエスタンブロット法で検定した。血清と
の反応性は、以下の例においても、この方法を採用して
調べた。結果を、対応する各種欠失プラスミドと共に図
３に示す。図３の実線は翻訳領域を、破線は非翻訳領域
を示す。最上部スケール上に示した数字は塩基数（ｋｂ
）を示し、各プラスミドの制限酵素地図の下の数字はア
ミノ酸番号を示す。アミノ酸番号はＥａｒｎｓｈａｗら
の文献（上記）中のアミノ酸番号に対応している。図５
および図６においても同様である。結果より、ｐＣＥＮ
Ｐ−Ｂ−１によってコードされたＣＥＮＰ−Ｂ抗原ポリ
ペプチドには、少なくとも４８７アミノ酸までの部分と
５９４アミノ酸までの部分とに分かれる、複数のエピト
ープが含まれることが判明した。

【００３７】（６）塩基配列の決定 （５）項で得られた各種の欠失プラスミド（図３参照）
を鋳型にして、ＳＰ６プライマー（プロメガ社製）とＳ
ｅｑｕｅｎａｓｅＴＭ（Ｕ．Ｓ．バイオケミカル社製）
を用いて、ジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，ら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，
５４６３，（１９７７））によって各ＤＮＡ断片の塩基
配列を決定した。さらに各ＤＮＡ断片の塩基配列を繋ぎ
合わせることにより、ｐＣＥＮＰ−Ｂ−１に挿入されて
いるＣＥＮＰ−Ｂ遺伝子（図２に示す５’末端側の短い
断片）のコード領域の全塩基配列を決定した。全塩基配
列および推定されるアミノ酸配列を配列表の配列番号３
および図４に示す。図３および図４中のアミノ酸番号は
、共にＥａｒｎｓｈａｗらの文献（上記）中のアミノ酸
番号と対応して付けられた。その結果、Ｅａｒｎｓｈａ
ｗらのデータとわれわれのデータとの間に３箇所塩基配
列の食い違うところがあり、それぞれに対応するアミノ
酸も同様に３箇所で食い違っていた（図４中のアンダー
ラインを施した箇所）。この箇所は、対応するＥａｒｎ
ｓｈａｗらのデータにおいてはそれぞれＡＧＧ（Ａｒｇ
）がＡＴＧ（Ｍｅｔ）に、ＧＴＴ（Ｖａｌ）がＣＴＴ（
Ｌｅｕ）に、そしてＣＧＡ（Ａｒｇ）がＣＴＡ（Ｌｅｕ
）となっている。

【００３８】（７）ｐＣＥＮＰ−Ｂ−１中にコードされ
るエピトープ（エピトープＩＩ）の特定 （５）項で得られた欠失プラスミド、ｐ１−２６、ｐ１
−３５、ｐ２−１６、ｐ１−１、およびｐ２−６；（図
３参照）のうち、ｐ１−３５にコードされたポリペプチ
ドとｐ２−６にコードされたポリペプチドの両方に陽性
の患者血清（以下グループＩＩと呼ぶ）を用いてエピト
ープＩＩ領域の解析を行った。まず、ｐＣＥＮＰ−Ｂ−
１を制限酵素ＡｐａＩおよびＮｏｔＩで切断した後、Ｋ
ｌｅｎｏｗフラグメントで処理して平滑末端にしてから
再結合することにより、ｐＣＥＮＰ−Ｂ−１のＡｐａＩ
−ＮｏｔＩ断片を欠失したプラスミドｐ１−Ａ（該プラ
スミドが有する断片を図５に示す）を作成した。ｐ１−
Ａにコードされたポリペプチドは、グループＩＩの患者
血清と反応しなかった。次に（５）に示したｐ１−３５
を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩで切断した後、Ｋ
ｌｅｎｏｗフラグメントで処理して平滑末端にしてから
再結合することにより、ｐ１−３５のＥｃｏＲＩ−Ｓａ
ｃＩ断片を欠失したプラスミドｐＳ−１−３５を調製し
た。該プラスミドが有する断片を図５に示す。この断片
はＴ７遺伝子１０とインフレームになっている。このプ
ラスミドを用いて得られたポリペプチドは、グループＩ
Ｉの患者血清と反応した。 各々のプラスミドが有する断片と該プラスミドを用いて
得られたポリペプチドの反応性とを図５に示す。図中、
反応性の項において、＋は陽性を、そして−は陰性を示
す。図５において（）内に示した制限酵素部位は、Ｋｌ
ｅｎｏｗフラグメント処理により消失している。図６に
おいても同様である。実線はコード領域を、破線は非コ
ード領域を示す。

【００３９】上記結果から、グループＩＩの患者血清に
認識されるエピトープＩＩは、４６２番目から４８７番
目までの２６個のアミノ酸の配列に含まれるポリペプチ
ドであると特定された。

【００４０】（８）ｐＣＥＮＰ−Ｂ−１中にコードされ
るエピトープ（エピトープＩ）の特定 （５）項に示したｐ２−６（図３参照）にコードされた
ポリペプチドとのみ反応した（陽性の）患者血清（グル
ープＩ）を用いてエピトープＩの領域の解析を次のよう
に行った。

【００４１】まず、ｐＣＥＮＰ−Ｂ−１を制限酵素Ｎｃ
ｏｌおよびＮｏｔＩで二重切断した後，Ｋｌｅｎｏｗフ
ラグメントで処理して平滑末端にしてから再結合するこ
とにより、ｐＣＥＮＰ−Ｂ−１のＮｃｏｌ−ＮｏｔＩ断
片が欠失したプラスミドｐ１−Ｎを作成した（該プラス
ミドが有する断片を図６に示す）。

【００４２】次に、ｐＣＥＮＰ−Ｂ−１を制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩおよびＮｏｔＩで二重切断して得られた約１．３
ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片を、プラスミドベクタ
ーｐＧＥＭＥＸＴＭ−１（プロメガ社製）のＥｃｏＲＩ
−ＮｏｔＩ部位に再クローニングした後、制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩで切断し、制限酵素ＮｃｏＩで部分分解した。こ
れをＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理して全ての末端を
平滑化した後再結合させることによって、ｐＬＮおよび
ｐＳＮの２種類の欠失プラスミドを作成した。ｐＬＮお
よびｐＳＮが有するＤＮＡ断片を図６に示す。（ｐ１−
Ｎ、ｐＬＮ、およびｐＳＮはすべてＴ７遺伝子１０とイ
ンフレームになっている。）これらの欠失プラスミドに
コードされたポリペプチドは、上記グループＩの患者血
清とは反応しなかった。

【００４３】そこで、ｐＬＮにコードされたポリペプチ
ドのアミノ末端側をさらに延長したポリペプチドの反応
性を調べることにした。図７に示す２本鎖ＤＮＡフラグ
メントＩを、それぞれの１本鎖ＤＮＡをファルマシア製
の自動ＤＮＡ合成装置を用いて合成し、次いで両鎖をア
ニールさせることにより、作成した。このフラグメント
は、５３０番目のＡｓｐから５４８番目のＭｅｔまでの
アミノ酸配列（配列番号３においては９８番目から１１
６番目のアミノ酸配列）をコードするＤＮＡ配列であり
、アミノ末端側にはＥｃｏＲＩ切断部位が付加され、カ
ルボキシル末端側はＮｃｏＩ切断部位を有するように変
化している。このＤＮＡフラグメントＩを用いて以下の
ような欠失プラスミドを作成した。（５）項に示したｐ
２−６（図３参照）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｃｏ
Ｉで二重切断した後、ＤＮＡフラグメントＩを組み込ん
で再結合してｐＢ−２−６を作成した。同様にしてｐ１
−１を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｃｏＩで二重切断し
た後、ＤＮＡフラグメントＩを組み込んでｐＢ−１−１
を作成し、さらにｐ２−１６を制限酵素ＥｃｏＲＩおよ
びＮｃｏＩで切断した後ＤＮＡフラグメントＩを組み込
みｐＢ−２−１６を作成した。ｐＢ−２−６、ｐＢ−１
−１およびｐＢ−２−１６が有するＤＮＡ断片を図６に
示す。これらの断片は、各プラスミド内において、すべ
てＴ７遺伝子１０とインフレームになっている。ｐＢ−
２−６にコードされたポリペプチドは、上記グループＩ
の患者血清と反応したが、ｐＢ−１−１及びｐＢ−２−
１６にコードされたポリペプチドは反応しなかった。こ
れらの結果を図６に示す。

【００４４】これらの結果より、グループＩの患者血清
に認識されるエピトープ（エピトープＩ）は、５３０番
目から５９４番目までの６５個のアミノ酸配列に含まれ
るポリペプチドであると特定された。エピトープＩには
、（６）項に示したＥａｒｎｓｈａｗらのデータとは食
い違うアミノ酸部分（計３カ所）が含まれている。

【００４５】（実施例２）実施例１（７）項で得られた
プラスミドｐＳ−１−３５と、実施例１（８）項で得ら
れたプラスミドｐＢ−２−６とによってそれぞれ形質転
換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をＩＰＴＧの存在下
で培養した。得られた各ポリペプチド（それぞれ、エピ
トープＩＩおよびエピトープＩを含む）とＴ７遺伝子１
０タンパク質との融合タンパク質を抗原として、間接蛍
光抗体法で抗セントロメア抗体陽性と判定された患者血
清４０例、及び陰性と判定された健常人血清４例を用い
てウェスタンブロット法で、抗原に対する反応性を検定
した。 その結果を表１に示す。

【００４６】

【表１】

【００４７】

【発明の効果】本発明によれば、このように、ヒトセン
トロメア蛋白質Ｂのエピトープ部分が明らかにされ、該
エピトープを構成するポリペプチドが提供される。この
ポリペプチドは化学合成、酵素法ならびに遺伝子操作の
技術により大量に生産され得る。得られたポリペプチド
を用いてヒト抗セントロメア抗体を簡便かつ正確に検出
することが可能となる。さらに、各エピトープを有する
ポリペプチド用いた測定により、ヒト抗セントロメア抗
体を有する患者の疾患の正確な病型分類が可能となる。

【００４８】

【配列表】

【００４９】

【配列番号：１】配列の長さ：６５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：ヒト 配列

【００５０】

【配列番号：２】配列の長さ：２６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：ヒト 配列

【００５１】

【配列番号：３】配列の長さ：４８９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．．．４８９ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列

【図面の簡単な説明】

【図１】λｇｔ１１　　Ｓｆｉ−ＮｏｔベクターＤＮＡ
（上図）およびＣＥＮＰ−Ｂ遺伝子を含む挿入ＤＮＡ断
片の内の最長の断片（下図）の制限酵素地図である。

【図２】ＣＥＮＰ−Ｂ遺伝子を含む挿入ＤＮＡ断片の最
長の断片（図１と同じ断片）と最も短い断片（ｐＣＥＮ
Ｐ−Ｂ−１に含まれる挿入ＤＮＡ断片）の制限酵素地図
である。

【図３】ｐＣＥＮＰ−Ｂ−１の一方向に欠失変異を導入
した欠失プラスミドの挿入断片を示す図面である。左端
にそれぞれのプラスミドの名称を示し、右端に該プラス
ミドにコードされたポリペプチドと抗セントロメア抗体
陽性の患者血清（４０例）との反応性（ウエスタンブロ
ット法による検定）を示す。

【図４】ｐＣＥＮＰ−Ｂ−１に挿入されたＣＥＮＰ−Ｂ
遺伝子（断片）のコード領域の全塩基配列および対応す
るアミノ酸配列を示す配列図である。

【図５】ｐＣＥＮＰ−Ｂ−１由来の欠失プラスミドの挿
入断片を示す図面である。ｐＳ−１−３５の有する断片
の領域がエピトープＩＩの最小領域を示す図面である。 右端に該プラスミドにコードされたポリペプチドとグル
ープＩＩの患者血清との反応性を示す。

【図６】ｐＣＥＮＰ−Ｂ−１由来の欠失プラスミドの挿
入断片を示す図面である。ｐＢ−２−６の有する断片の
領域がエピトープＩの最小領域を示す図面である。右端
に該プラスミドにコードされたポリペプチドとグループ
Ｉの患者血清との反応性を示す。

【図７】ｐＢ−２−６、ｐＢ−１−１およびｐＢ−２−
１６の調製に用いたＤＮＡフラグメントＩの塩基配列と
、相当するアミノ酸配列を示す配列図である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒトセントロメア蛋白質Ｂのエピトープを
   構成し、以下のアミノ酸配列でなるポリペプチドＩ、ポ
   リペプチドＩＩ、およびそれらの部分配列を有するポリ
   ペプチドでなる群から選択されるポリペプチド：ポリペ
   プチドＩ Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｖ
   ａｌ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｌ
   ａ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　ＡｌａＭｅｔ　
   Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｓ
   ｅｒ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｒ
   ｇ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　ＨｉｓＩｌｅ　Ｌｅｕ　
   Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｖ
   ａｌ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｓ
   ｎ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　ＡｒｇＧｌｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　
   Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｇ
   ｌｎ　ＳｅｒポリペプチドＩＩ Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａ
   ｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｇｌ
   ｙ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　ＧｌｙＧｌｙ　
   Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　ＧＬｙ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ａ
   ｌａ。
2. 【請求項２】請求項１のポリペプチドをコードする遺伝
   子。
3. 【請求項３】請求項２に記載の遺伝子を有するプラスミ
   ドもしくはファージベクター。
4. 【請求項４】請求項３に記載のプラスミドもしくはファ
   ージベクターで形質転換された宿主細胞。
5. 【請求項５】請求項２に記載の遺伝子を有するプラスミ
   ドもしくはファージベクターにより形質転換された宿主
   細胞を培養する工程、および該培養物から目的とするポ
   リペプチドを単離、精製する工程を包含する、請求項１
   または２に記載のポリペプチドの製造法。
6. 【請求項６】以下の工程（ａ）および（ｂ）を含むヒト
   抗セントロメア抗体の検出方法： （ａ）請求項１に記載のポリペプチドを試料に加えて、
   該試料中に含まれるヒト抗セントロメア抗体と該ポリペ
   プチドとを接触させる工程、および、（ｂ）該ポリペプ
   チドと結合したヒト抗セントロメア抗体を検出する工程
   。