JPH04324345A - 化学発光測定方法及び測定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査や生化学実験
、理化学実験等において、生体物質、化学物質等の化学
発光分析を行うための化学発光測定方法及び測定装置に
関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、抗原−抗体反応やホルモン−レセ
プター反応等、生体中で行われる反応を利用して血液中
の抗原、抗体、ホルモン等の微量物質を定量する方法が
数多く実用化されている。その中で最も一般的なものが
、抗原−抗体反応を利用するラジオイムノアッセイ（Ｒ
ＩＡ）とエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）である。 ラジオイムノアッセイは測定感度がｎｇ／ｍｌ〜ｐｇ／
ｍｌと大変高い、共存物質の影響を受けにくい等の利点
を持つ。その反面、放射性同位元素（ラジオアイソトー
プ、以下ＲＩとする）を用いるため、管理施設、廃棄物
処理、測定装置等に費用がかかる、ＲＩの半減期が短い
ため試薬の有効期限が短いといった欠点を持つ。そこで
、こうしたＲＩＡの欠点を補う方法として、ＲＩの代わ
りに酵素を用いるＥＩＡが開発された。ＥＩＡは非放射
性測定という利点により、急速に普及したが、検出手段
にこれまで主として比色法が用いられていたため、実用
感度ではＲＩＡに劣った。しかし、検出法に化学、生物
発光（以後、本明細書では両者を含め化学発光とする）
を用いることで、ＲＩＡ並の感度が得られるため、最近
注目を集めている。一方、化学発光は、エンザイムイム
ノアッセイだけでなく、Ｈ２Ｏ２、ＡＴＰ、ＮＡＤＰと
いった、直接に発光物質に作用する生体物質の定量にも
応用されている。

【０００３】化学発光を測定する方法としては、化学発
光をポラロイド写真で撮影する方法（例えば、特開昭５
８−３８８４２号公報）や光電子増倍管で検出するルミ
ノメータを用いる方法（例えば、特開昭６１−２０９３
４０号公報）がある。ポラロイド写真を用いる方法は特
殊な装置を必要とせず、複数の発光部位を同時に測定で
きるという利点を持つが、写真撮影に時間がかかる、写
真感度で測定範囲が限定される等の欠点を持つ。一方、
ルミノメータを用いる方法は発光を直接電気信号に変換
するため、広範囲にわたり定量性良く測定できるが、測
定にセルを用いた場合１検体（１発光部位）ごとの測定
となるため、多検体の測定のためには大ががりなセル移
動装置や分注装置が必要となる。また、発光強度は経時
変化するため同時発光している検体を精度よく測定する
には迅速さが要求される。このように従来は同時発光す
る複数の発光部位を有する検体を、迅速かつ高精度で測
定できる方法及び装置はなかった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明はかかる化学発
光測定の問題点を解決するものであり、同時発光してい
る複数の発光部位を有する検体又は多検体の各化学発光
の強度を迅速かつ精度良く測定する方法及び装置を提供
するものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、同時
発光している複数の発光部位を有する検体または多検体
の各発光部位の発光強度を測定する方法であって、該検
体上を測光部を一定速度で走査させるとともに、発光強
度を連続的に測光し、発光強度の連続した波形グラフを
得、該波形グラフの各発光部位に相当するピーク値をも
って各発光部位の発光強度とすることを特徴とする化学
発光測定方法に関する。

【０００６】また、本発明は同時発光している複数の発
光部位を有する検体または多検体の各発光部位の発光強
度を測定する装置であって、該検体上を一定速度で走査
し発光強度を連続的に測光する測光部、発光強度の連続
した波形グラフを得、該波形グラフの各発光部位に相当
するピーク値を解析して各発光部位の発光強度とするデ
ータ解析部を有することを特徴とする化学発光測定装置
に関する。

【０００７】まず、本発明の測定方法について詳述する
。本発明において、同時発光している複数の発光部位を
有する検体とは、種々のものがあげられるが、本発明の
方法が特に有効なものとして、マストイムノシステムズ
（米国マストイムノシステムズ社製、商品名）の測定容
器（図４）の各糸１４の発光の測定が挙げられる。これ
はアレルギー診断薬であり、特開昭５８−５０１６３７
号公報、特開昭６０−８９７５３号公報、特開昭６１−
８２１６５号公報、特開昭６２−２２７７０公報に詳細
が記載されるが、アレルギー特異的ＩｇＥ抗体の定量試
薬で、図４に示す様に血清や発光試薬を注入するプラス
チック容器中に、多種類の各アレルゲン（アレルギーの
原因物質）を結合した各糸が配列されている。アレルギ
ー患者の血清を本容器に注入すると血清中の特異抗体が
アレルゲンに結合する。この複合体に酵素標識二次抗体
（ＩｇＥ）を反応させた後ルミノールと過酸化水素の組
合せで化学発光を誘起し、発光量の測定により血清中の
抗体量を定量する方法である。なお、従来この発光量の
測定はポラロイドフィルムへの露光、得られるフィルム
の透過度電圧の測定により行なわれており、露光に時間
を要し、測定精度も低いものであった。

【０００８】その他、本発明の方法が特に有効なものと
して、制限酵素で切断したＤＮＡ断片、ＲＮＡを電気泳
動し、セルロース等の膜にこれを移してＤＮＡプローブ
で相補的配列を調べるサザンブロッティング法及びノザ
ンブロッティング法、タンパク質を電気泳動し、セルロ
ース等の膜にこれを移して特異抗体で抗原検索するウェ
スタンブロッティング法を化学発光を用いて測定する場
合がある。これらは全て後述のように１次元に走査する
ことで結果を得られるが、後述の２次元に走査すること
でも測定が可能である。現在は一晩または数日培養して
目視判定している抗生物質の薬剤耐性を調べる感受性デ
ィスク試験において化学発光系で菌を阻害する面積を求
めたり、同じく一晩または数日培養して目視判定してい
る腸内細菌等の同定に用いる各種培養のシャーレ上のコ
ロニーの計測にも化学発光系を応用し、本発明の方法及
び装置を用いて２次元走査してコロニー数を数えること
も可能である。

【０００９】本発明の方法においては、上記検体を測定
装置にセットし発光強度を測定するが、セットされた検
体は測定時には外部光に対して完全に遮蔽される必要が
ある。セットされた検体上を、測定装置における測定部
を一定速度で一定方向に走査させ、連続的に発光強度を
測定する。ここで、測光部を一定速度で走査させ、発光
強度を連続的に測定するとは、発光強度のデータをデジ
タル信号で取り込むために、０．０５ｍｍ〜０．５ｍｍ
程度のピッチで停止させ、データを取り込み、移動する
ことを連続的に繰返すこと、すなわち結果的に肉眼では
一定速度に見える場合を含む。　　また、本発明の方法
は、測定部を固定し、検体の方を一定速度で走査させる
場合も含むものである。これは測定部と検体の相対的な
動作という面では相違しないからである。また、電気信
号のノイズの影響を除去するため、その前後何点かの信
号の実測値を平均する移動平均法、ザービッキーゴーレ
イの提出した重み付き移動平均法等を用いて、平滑化処
理をすることもできる。

【００１０】本発明の方法において、複数の発光部位が
一直線上に存在する検体（上記マストイムノシステムズ
、ブロッティング法におけるセルロース等）の場合、測
定は発光部位が存在する直線方向に沿って測光部を一回
走査させて連続的に発光強度を測定し、波形グラフを得
、得られた該波形グラフの各発光部位に相当するピーク
値をもってその発光部位の発光強度とすることができる
（１次元の走査）。これは、複数の検体を直線上に配列
したもの、例えばマイクロタイタープレートのウェル中
での発光強度も同様に測定できる。これらの場合、複数
の発光部位が一直線上に存在する検体または複数の検体
を直線上に配列したものを、複数個さらに並列に並べて
おけば、上記の走査を、上記走査方向と垂直方向に測光
部又は検体を一回ごとに移動させて繰り返すことにより
一度に測定することも可能である。

【００１１】一方、複数の発光部位が平面上に不規則に
存在する検体（例えば、感受性ディスクや細菌培養シャ
ーレ上の細菌コロニー）を測定する場合には、検体の端
部から検体上を測定部を直線的に走査させ、該走査方向
と垂直方向に僅かづつ移動させて、該走査を繰り返すこ
とにより検体の全面に渡って連続的に発光強度を測定し
、発光強度の波形面を得、該波形面のピーク点をもって
、そこに発光部位が存在し、該発光部位の発光強度の値
とすることができる（２次元の走査）。

【００１２】本発明の測定方法が有用な発光反応として
は、化学発光所謂ケミルミネッセンスと生物発光所謂バ
イオルミネッセンスに基づく発光反応がある。分析方法
としては、抗原または抗体を化学発光物質で標識して抗
原抗体反応を行い発光を検出するケミルミネッセントイ
ムノアッセイ、抗原または抗体をペルオキシダーゼ等の
酵素で標識して抗原抗体反応を行い化学発光を検出する
ケムルミネッセントエンザイムイムノアッセイ、抗原ま
たは抗体を生物発光関連酵素で標識して抗原抗体反応を
行い発光を検出するバイオルミネッセントエンザイムイ
ムノアッセイ、抗原または抗体を生物発光反応の補酵素
でで標識して抗原抗体反応を行い補酵素の不活化を生物
発光で検出するホモジニアスなバイオルミネッセントコ
ファクターイムノアッセイ等の各種イムノアッセイ、目
的のＤＮＡやＲＮＡに相補的な塩基配列のＤＮＡやＲＮ
Ａに化学発光物質や酵素を標識して目的のＤＮＡやＲＮ
Ａとのハイブリッドを形成させこれを発光で検出するＤ
ＮＡプローブ法等がある。

【００１３】本発明に用いられる化学発光物質には、過
酸化水素と反応して発光するルミノール（５−アミノ−
２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン）及びイ
ソルミノールとその誘導体、ルシゲニン（１０，１０’
ージメチルー９，９’ビアクリジウム二硝酸塩）、アク
リジウム塩やそのエステル、熱的冷気で発光する１，２
ージオキセタン、強塩基存在下酸素により発光するロフ
ィン（２，４，５ートリフェニルイミダゾール）、３ー
メチルインドール等のインドール誘導体、酸素や空気に
さらされると発光するテトラキス（ジメチルアミノ）エ
チレン、シジメチルホルムアミド溶液中ｔ−ブチル存在
下で発光するシッフ塩基等がある。中でもルミノールま
たはイソルミノールと過酸化水素存在下でペルオキシダ
ーゼを用いる系が最も良く使われる。また、シュウ酸ジ
エステル等のシュウ酸誘導体にペレリン、８−アニリノ
ナフタレン−１−スルホン酸、ダンシルアミノ酸等の蛍
光物質を共存させ蛍光物質を励起させて発光させる方法
もある。

【００１４】本発明に用いられる生物発光物質にはホタ
ル、発光バクテリア等のルシフェラーゼ、オワンクラゲ
から得られるエクオリン等の各種発光蛋白がある。これ
らの発光物質は発光を増幅する成分所謂エンハンサーと
共に用いることができる。これらエンハンサーとしては
６−ヒドロキシベンゾチアゾールやヨウドフェノール等
のフェノール誘導体がある。

【００１５】次に、本発明の化学発光測定方法を実施す
るための本発明の化学発光測定装置について詳述する。 本発明の測定装置は、検体上を一定速度で走査し発光強
度を連続的に測光する測光部、発光強度の連続した波形
グラフを得、該波形グラフの各発光部位に相当するピー
ク値を解析して各発光部位の発光強度とするデータ解析
部を有する。

【００１６】該測光部の一例を図１（斜視図）および図
２（側面断面図）に示す。図１では、検体として、マス
トイムノシステムズの専用反応容器１０　　５本を固定
台１１上に固定し、プレートホルダ１２上に設置してい
る。図１に示されるように測光部１はレンズ２、３、移
動方向と垂直方向に長いスリット４、５、光電子増倍管
８及び増幅器７から構成される。該測光部１はガイド棒
９に沿って、図中に示されるＸ方向に一定速度で走査し
連続的に発光強度を測定することが可能である。また、
プレートホルダ１２は図中で示されるＹ方向に移動が可
能である。図２の断面図に示すように発光の光は測光部
の下面から入り反射ミラー６を介して光電子増倍管８方
向へ反射して電気信号に変換される。

【００１７】測光部１で測定され、電気信号に変換され
た光強度はデータ解析部において、発光強度の連続した
波形グラフを得、該波形グラフの各発光部位に相当する
ピーク値を解析して各発光部位の発光強度に換算される
。該データ解析部としては、マイクロプロセッサが使用
される。図３に本発明の測定装置の１例の概略図を示す
。サンプルからの光は反射ミラーを経て光電子増倍管に
入り、増幅器、Ａ／Ｄコンバータを経てマイクロプロセ
ッサーに取り込まれ、演算処理されてプリンタに出力さ
れる。一方マイクロプロセッサーは測光部やプレートホ
ルダーの駆動モータも制御する。特に測光部は所定のサ
ンプリング回数のデータを取り込んだ後、測光部を次の
位置へ微小送りする。

【００１８】以上のような本発明の化学発光測定方法及
び測定装置によれば、例えば検体がマイクロプレートの
ウェル中の多検体の場合には、発光物質の付着、沈降の
不均一性などの影響を受けず、またマストイムノシステ
ムズを検体とした場合にはプラスチック容器中の糸の間
隔のバラツキによらず高精度のデータを得ることができ
る。また、測光部が一回一回発光部位で停止して測定を
行うのに比べ、測光部が一定速度で移動するために、短
時間で測定が完了する。

【００１９】

【実施例】以下に本発明の実施例を示す。本実施例では
図１に示す測光部を有し、図３に示す化学発光測定装置
を使用した。被測定検体は、アレルギー診断薬マストイ
ムノシステムズ（米国マストイムノシステムズ社製、輸
入元日立化成工業（株））の反応容器（図４、該商品の
使用説明書に従って、検体血清、酵素標識抗体を反応さ
せた後、化学発光用ルミノール溶液を充填したもの）を
、図１に示すように５本分を１回で測定するようにセッ
トして用いた。測光部の実際の移動と測定は、０．１８
８ｍｍ間隔で移動し停止する度に発光強度を測定するこ
とを繰返すことにより行ない、１つの反応容器について
約１，０００点発光強度を連続的に測定した。図１に示
すように、プラスチック容器に沿って（Ｘ方向）、測光
部を走査し発光強度を測定したところ、図５に示すよう
な波形グラフを得た。１本あたりの走査時間は２０秒で
あった。これをマイクロプロセッサーで数値解析し、各
ピーク値を各アレルゲンの発光量に割当て、表１に示す
結果を得た。

【００２０】

【表１】

【００２１】なお、実施例で用いたプラスチック容器中
の糸は約２．８ｍｍ間隔で並んでいるが、間隔のバラツ
キを精査したところ、最大でおよそ±０．３ｍｍであっ
た。この様に寸法精度に誤差があっても本発明はピーク
値から計算で発光量を得るため、高精度なデータを得る
ことができる。

【００２２】

【発明の効果】本発明の化学発光測定方法及び測定装置
によれば、同時に発光している複数の発光部位を有する
検体又は多検体の各化学発光の強度を迅速かつ精度良く
測定することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の化学発光測定装置の１例の要部を示す
斜視図である。

【図２】本発明の化学発光測定装置の１例の要部を示す
側面断面図である。

【図３】本発明の化学発光測定装置の１例を示す概略図
である。

【図４】本発明の化学発光測定方法が有用である同時発
光している複数の発光部位を有する検体（マストイムノ
システムズの反応容器）を示す斜視図である。

【図５】本発明の実施例において測定された発光強度の
波形グラフである。

【符号の説明】

１…測光部 ２…レンズ ３…レンズ ４…スリット ５…スリット ６…反射ミラー ７…増幅器 ８…光電子増倍管 ９…ガイド棒 １０…専用反応容器 １１…固定台 １２…可動式プレートホルダ １３…プレートガイド １４…糸

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　同時発光している複数の発光部位を有
   する検体または多検体の各発光部位の発光強度を測定す
   る方法であって、該検体上を測光部を一定速度で走査さ
   せるとともに、発光強度を連続的に測光し、発光強度の
   連続した波形グラフを得、該波形グラフの各発光部位に
   相当するピーク値をもって各発光部位の発光強度とする
   ことを特徴とする化学発光測定方法。
2. 【請求項２】　　検体が直線上に配列された複数の発光
   部位を有するものである請求項１記載の化学発光測定方
   法。
3. 【請求項３】　　同時発光している複数の発光部位を有
   する検体または多検体の各発光部位の発光強度を測定す
   る装置であって、該検体上を一定速度で走査し発光強度
   を連続的に測光する測光部、発光強度の連続した波形グ
   ラフを得、該波形グラフの各発光部位に相当するピーク
   値を解析して各発光部位の発光強度とするデータ解析部
   を有することを特徴とする化学発光測定装置。
4. 【請求項４】　　測光部が、レンズ、移動方向と垂直方
   向に長いスリット、光電子増倍管及び増幅器を有するこ
   とを特徴とする請求項３記載の化学発光測定装置。
5. 【請求項５】　　測光部により電気信号に変換された発
   光強度の連続した波形グラフをデータ解析部としてマイ
   クロプロセッサーで解析して各発光部位に相当するピー
   ク値を得、これから各発光部位の発光強度を得ることを
   特徴とする請求項３又は４記載の化学発光測定装置。