JPH04320692A - Ｍａの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】モエノマイシン（ｍｏｅｎｏｍｙｃｉｎ）
Ａは、家畜類の栄養素中に用いられるフラボマイシンＲ
（Ｆｌａｖｏｍｙｃｉｎ）の主成分である。他の既知リ
ン糖脂質抗生物質と同様に、それは細菌の細胞壁のペプ
チドグリカンのフレーム構造の生合成を阻害する。さら
に詳細な検討により、大腸菌のペニシリン結合蛋白質１
ｂのトランスグリコシレーション反応が、これらの物質
によって阻害されることが明らかにされた〔Ｈｕｇｅｒ
　Ｇ．，　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，　Ｖ−１，　ｐｐ
．　１３５〜１５３（１９７９）〕。リン糖脂質の特異
的な酵素的または微生物的分解の試みは、初期には失敗
した。

【０００２】欧州特許出願ＥＰ　０　３５５　６７９に
は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．　ＤＳＭ　４６７５から
の酵素モエノマイシナーゼおよびＭＢアーゼによって触
媒されるモエノマイシン類（＝リン糖脂質抗生物質）の
ＭＡ、ＭＢおよびＭＣへの分解方法が記載されている。

【０００３】

【表１】

【０００４】モエノマイシン群の抗生物質の例には、ホ
リポマイシン（ｐｈｏｌｉｐｏｍｙｃｉｎ）１）、プラ
シノマイシン（ｐｒａｓｉｎｏｍｙｃｉｎ）類２）、デ
ィウマイシン（ｄｉｕｍｙｃｉｎ）類〔マカルボマイシ
ン（ｍａｃａｒｂｏｍｙｃｉｎ）類〕３）、エサンコマ
イシン（ｅｓａｎｃｈｏｍｙｃｉｎ）、プレノマイシン
（ｐｒｅｎｏｍｙｃｉｎ）およびテイチマイシン（ｔｅ
ｉｃｈｉｍｙｃｉｎ）ならびに相当する機能化ホスホグ
リセリン酸を有する他の構造関連物質がある〔１）　Ｓ
．　Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｔｅｔｒａ
ｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．　１９８３，　４９９、２）
　Ｆ．Ｌ．　Ｗｅｉｓｅｎｂｏｒｎ　ｅｔ　ａｌ．，　
Ｎａｔｕｒｅ　２１３，　１９０２（１９６７）、　３
）　Ｓ．　Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．
　Ａｎｔｉｂｉｏｔ．２６，　５４２（１９７３）〕。

【０００５】さらにＥＰ　０　３５５　６７９には、Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．　ＤＳＭ　４６７５の好気性発
酵、モエノマイシンの分解によって生じた開裂生成物、
その分解を触媒する酵素、ならびに分解生成物の、トラ
ンスグリコシダーゼ・インヒビター製造用合成ブロック
として（ＭＡ）または抗生物質活性を有する物質として
（ＭＢ）の使用が記載されている。

【０００６】上記出願における方法は、生物学的に活性
なすなわち抗生物質として活性なＭＢを目指していて、
ＭＡの収率は１％にすぎない。

【０００７】しかしながら、ＭＡは、新規なＭＡ類縁体
、すなわち新規なトランスグリコシダーゼ・インヒビタ
ーの価値ある合成用ブロックであって、ＭＡの製造のた
めに方法を至適化するという明瞭な要求がある。

【０００８】したがって、本発明は、 １．　　酵素触媒作用をグリシン／ＮａＯＨ緩衝液中で
行わせるリン糖脂質の酵素分解による式Ｉ

【化２】 の化合物の製造方法、 ２．　　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．　ＤＳＭ　４６７５
に対する培養培地はリン酸塩の添加によりモエノマイシ
ナーゼおよびＭＢアーゼの力価に関して至適化する前項
１記載の方法、３．　　酸またはアルカリホスファター
ゼを酵素ＭＢアーゼの代替として使用する前項１記載の
方法、４．　　バイオマスの濾液は酢酸エチルついでア
セトンで抽出し、バイオマス自体はアセトンと撹拌して
抽出する前項１記載の方法に関する。

【０００９】以下に本発明を詳細に、とくに好ましい実
施態様について説明するが、本発明はさらに特許請求の
範囲において定義される。

【００１０】とくに他の指示がない限り、百分率データ
は、重量百分率によるものである。

【００１１】Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．　は、ブダペス
ト条約の規定の下に、ドイツ国、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅ
ｉｇ　のＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ
　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　ｕｎｄ　Ｚｅｌｌ
ｋｕｌｔｕｒｅｎ　ＧｍｂＨ　に１９８８年６月２３日
付けにてＤＳＭ　４６７５として寄託された。

【００１２】微生物Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．　ＤＳＭ
　４６７５の増殖および本発明の分解反応に必要な酵素
の産生は、主成分：クエン酸、グルコン酸ナトリウム、
グリセロール、ペプトン、リン酸塩およびビタミン溶液
の栄養培地中で良好である。リン酸塩たとえばリン酸カ
リウムの濃度は、好ましくは５０〜１００ｍＭである。 しかしながら、栄養培地はまた、リン酸塩を加えないで
も、また所望の任意の生理的濃度のリン酸塩を添加して
も使用できる。 グルコン酸またはその塩の含量は、１〜２％、好ましく
は２％である。

【００１３】発酵は好気的に、すなわち、適当に空気ま
たは酸素を導入して、たとえば、振盪フラスコまたはフ
ァーメンター中で振盪または撹拌しながら、深部培養に
よって行われる。発酵は、ほぼ室温から５０℃までの範
囲の温度で、好ましくは約３５〜３７℃で行うことがで
きる。培養時間は一般に、８〜４８時間、好ましくは１
６〜１８時間である。

【００１４】ＥＰ　０　３５５　６７９に記載されてい
るように、Ｂａｃｉｌｌｕｓ細胞を用いる場合には、た
とえばセチルトリメチルアンモニウムで細菌を透過性に
するか、または凍結乾燥するのが有利である。同様に、
Ｂａｃｉｌｌｕｓ細胞からの蛋白質単離体、または塩析
もしくはクロマトグラフィーで部分濃縮した酵素抽出物
で操作することも可能である。もちろん、精製酵素も使
用できる。さらに、酵素は遊離型または固定化型のいず
れで使用することもできる。

【００１５】本発明の方法におけるモエノマイシンのＭ
Ａへの酵素的切断のための酵素のソースとしては、凍結
乾燥細胞を用いるのが好ましい。

【００１６】前掲の反応図から明らかなように、ＭＡの
製造には２種類の酵素が必要である。１つの酵素はモエ
ノマイシンＡのホスホグリコシド結合の切断に必要であ
って、この酵素は本発明者らによってモエノマイシナー
ゼと名付けられた。モエノマイシナーゼはＢａｃｉｌｌ
ｕｓ　ｓｐ．　ＤＳＭ　４６７５の細胞質膜に会合して
いて、この微生物から、酵素の単離のためのそれ自体公
知の方法で得ることができる。

【００１７】ＭＢアーゼも同様に、その微生物から、既
知方法によって単離できる。たとえば、細胞を超音波で
破壊し、得られた粗抽出液を硫酸アンモニウム分画（２
５〜５５％飽和）または超遠心分離のいずれかによって
さらに濃縮する。これについで透析を行う。モエノマイ
シナーゼとＭＢアーゼは最終的にクロマトグラフィーで
分離される。

【００１８】本発明の方法によれば、酵素的分解、すな
わちモエノマイシンのＭＡへの変換は、１つの混合物中
で起こさせるのが好ましい（実施例２）。

【００１９】モエノマイシンの切断は、凍結乾燥細胞ま
たは酵素単離体を用いて行われるが、凍結乾燥細胞を用
いるのが好ましい。

【００２０】反応はグリシン／ＮａＯＨ緩衝液中で行わ
れる。この緩衝液のｐＨは８．０〜８．５とすることが
好ましく、あるいはｐＨ７．５〜１０の範囲とする。反
応は３４〜３９℃、好ましくは３７℃で行われる。酵素
反応のｐＨは、ｐＨ７．５〜９．０の範囲、好ましくは
７．８である。反応時間は一般的に５〜４８時間、好ま
しくは約２４時間である。基質濃度は０．１〜５％、好
ましくは１〜２％の範囲でなければならない。

【００２１】反応は、以上述べたよりももっと高いまた
はもっと低い温度またはｐＨ値で行うことも同様に可能
ではある。しかしながら、その場合、酵素活性は低下す
る。

【００２２】ＭＢのＭＡへの分解には、ＭＢアーゼのほ
か、ＥＰ　０　３５５　６７９に記載されているように
、ホスファターゼも使用できる。好ましくは、ジャガイ
モからの酸ホスファターゼおよび子ウシ腸からのアルカ
リホスファターゼが用いられる。これらの酵素は、市販
品を入手できる（Ｓｉｇｍａ）。両酵素とも、固定化ま
たは非固定化いずれの型でも使用できる。

【００２３】切断反応で得られた式ＩのＭＡは、ついで
単離され、精製される。これはバイオマスの濾液または
バイオマス自体の有機溶媒による抽出で行われる。溶媒
としては、０．２〜１好ましくは０．３容量比でのアセ
トンの使用が好ましい。クロマトグラフィーによる精製
は、洗浄液として、石油エーテル／アセトンまたは石油
エーテル／酢酸エチル混合物を用いて行われる。メタノ
ールはＭＡの溶離剤として使用される。

【００２４】得られた反応生成物ＭＡは、トランスグリ
コシダーゼ・インヒビターの合成用ブロックとして使用
できる。

【００２５】本発明を、さらに実施例によって説明する
。 実施例１ Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．　ＤＳＭ　４６７５株の維持
この株の維持および前培養体の培養については、欧州特
許出願０　３５５６７９号（実施例１および２）に記載
されている。

【００２６】ａ）　　以下の組成の培地９リットルを含
有する１２リットルの実験室用ファーメンターを主培養
段階として使用する。 ペプトン　　　　　　　　　　　　　　　　１２．５ｇ
／リットルグリセロール　　　　　　　　　　　　２０
．０ｇ／リットルクエン酸塩　　　　　　　　　　　　
　　　　２．０ｇ／リットルグルコン酸ナトリウム　　
　　１０．０ｇ／リットルＫ２ＨＰＯ４　　　　　　　
　　　　　　　１０．０ｇ／リットルＭｇＳＯ４×７Ｈ
２Ｏ　　　　　　　　０．５ｇ／リットルＦｅＣｌ３×
６Ｈ２Ｏ　　　　　　　　０．０４ｇ／リットルビタミ
ン溶液　　　　　　　　　　　　　　１ｍｌビタミン溶
液： ニコチン酸　　　　　　　　　　　　　　　　０．３５
ｇ／リットルチアミン塩酸塩　　　　　　　　　　　　
０．３０ｇ／リットルＤ−ビオチン　　　　　　　　　
　　　　　０．０１ｇ／リットルｐ−アミノ安息香酸　
　　　　　　　０．２０ｇ／リットルピリドキサール塩
酸塩　　　　　　０．１０ｇ／リットルパントテン酸カ
ルシウム　　　　０．１０ｇ／リットルビタミンＢ１２
　　　　　　　　　　　　　　０．０５ｇ／リットル

【
００２７】これを、前培養体５００ｍｌと３７℃、３０
０ｒｐｍ、通気速度０．５ｖｖｍで１６〜１８時間イン
キュベートする。

【００２８】完全に増殖した培養体を遠心分離し、つい
で凍結乾燥する。

【００２９】新規な培地を用い反応時間を短縮して培養
を続けると、バイオマスの収量は倍加する。バイオマス
は光学密度によって特徴づけられる。ＯＤの測定値は７
であった。さらに、得られた細胞は、高収率でモエノマ
イシンをＭＡに分解する。

【００３０】１００μｌの粗抽出液、１２ｍｇのモエノ
マイシンＡおよび９００μｌの５０ｍＭリン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ８．０）の試験混合物中では、使用した基
質の５０％が、３７℃で７〜２４時間以内に分解する。 認められた反応生成物はＭＡ、ＭＢおよびＭＣである。

【００３１】ｂ）　　リン酸塩を添加しない上記ａ）の
培地を用いた場合は、バイオマスは明らかに減少する。 ＯＤの測定値は３であった。

【００３２】実施例２モエノマイシンのＭＡへの変換（
酵素的分解）変換にはＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．　ＤＳ
Ｍ　４６７５の凍結乾燥細胞を使用した。

【００３３】ａ）　　凍結乾燥物９０〜２２０ｇを９リ
ットルのグリシン／ＮａＯＨ緩衝液、１００ｍＭ、ｐＨ
８．５に懸濁し、モエノマイシン混合物１３５ｇの添加
後またはＭＢ、１．８ｇのナトリウムアジドおよび２１
４ｍｇのＣＯＣｌ２の添加後、３７℃、１９０ｒｐｍで
６〜４８時間インキュベートする。

【００３４】ＴＬＣ分析で追跡した反応の経過では、基
質の８０％までがＭＢおよびＭＡに分解した。切断生成
物の約１０〜２０％はＭＢ、８０〜９０％はＭＡからな
る。

【００３５】この方法での反応の実施により、ＭＡの大
規模生産が可能になる。

【００３６】ｂ）　　同一の組成ではあるが、ｐＨを９
．０にした緩衝液を使用すると、収率６０％でＭＡが得
られる。

【００３７】ｃ）　　トリス塩酸塩緩衝液〔１００ｍＭ
，ｔｒｉｓ，ｐＨ７．８，他の組成はａ）に述べた緩衝
液に一致する〕を用いた場合には、ＭＡの収率は同じく
６０％に低下する。

【００３８】実施例３ ホスファターゼを用いるＭＢの酵素的切断ＭＢからのＭ
Ａの製造に、ジャガイモからの酸ホスファターゼおよび
子ウシ腸からのアルカリホスファターゼの使用を検討し
た。

【００３９】ＭＢ（５ｍｇ／ｍｌ）のＭＡへの変換は、
酸ホスファターゼ（１０Ｕ／ｍｌ混合物）を用いｐＨ４
．８、室温において約５０％、アルカリホスファターゼ
（５０Ｕ／ｍｌ）を用いｐＨ８．０、１４４時間以内で
９０％以上である。アルカリホスファターゼの変換率（
＜２４時間）は０．１ｍＭ　ＺｎＣｌ２およびＭｇＣｌ
２の存在下、ｐＨ１０．５（グリシン／ＮａＯＨ緩衝液
、１００ｍＭ）および３７℃の条件で明らかに上昇する
。

【００４０】同様に、固定化アルカリホスファターゼを
使用することも可能である。この場合、上記条件下、３
５Ｕ／ｍｌで基質の９０％以上が２８時間以内に変換さ
れる。

【００４１】実施例４ フラボマイシン分解生成物ＭＡの単離 酵素的変換から得られた懸濁液中に存在する固体を遠心
分離によって分離する。

【００４２】得られたバイオマスを、同容のアセトンと
室温で数回、薄層クロマトグラフィーで有機相にＭＡが
もはや検出されなくなるまで、撹拌して抽出する。ＭＡ
含有抽出液を合わせる。

【００４３】バイオマスの分離後に得られた濾液を最初
に１回、その１／３容の酢酸エチルで抽出する。水−有
機溶媒、コロイド状溶液をついでその１／３容のアセト
ンで、各回分離した有機相にＭＡがＴＬＣでもはや検出
されなくなるまで抽出する。

【００４４】ＭＡ含有抽出液をバイオマスのアセトン抽
出液と合わせ、溶媒を真空中で除去する。

【００４５】フラボマイシンの成分ＭＢは、残った水性
反応溶液から、ｎ−ブタノールで数回抽出して単離でき
る。溶媒を真空中で蒸留して除去したのち、得られた粗
製のＭＢは、ＭＡ製造のための酵素反応にもう一度使用
できる。

【００４６】平均すると、約５００ｇのフラボマイシン
Ａ／Ｃ複合体から上述の抽出方法により、粗製ＭＡ約１
１０ｇおよび粗製ＭＢ約８５ｇが得られる。

【００４７】実施例５ クロマトグラフィーによるＭＡの精製 溶媒の蒸発後に得られたＭＡは、次に、シリカゲル上カ
ラムクロマトグラフィーにより精製する。

【００４８】このためには、粗製のＭＡ約２０ｇを最少
量の１：１石油エーテル／アセトン混合物に溶解し、固
定相としてのシリカゲル６０（ｐＨ＝７．５）約２．１
ｋｇを含有するスティールカラムに、７〜１０ｂａｒ、
流速５リットル／ｈで負荷する。ついで、約１０リット
ルの石油エーテル／アセトン（６：４）混合物を用い、
同一条件下に洗浄を行う。洗浄液は単一画分として集め
る。次に、約５リットルの純粋なメタノールで溶出を行
う。

【００４９】メタノール溶離液を、各０．１リットルの
画分として収集する。ＴＬＣで検出してＭＡ活性の純粋
な画分を合わせ、溶媒を真空中で除去する。ＭＡが淡黄
色の著しく粘稠な油状物として得られる。辺縁画分は再
クロマトグラフィーに付すことができる。約２０ｇの粗
製ＭＡから純粋な物質約１３ｇが得られる。

【００５０】薄層クロマトグラフィーによるＭＡの検出
には、予めシリカゲルでコーティングしたプレートを用
いる。使用した移動相は、クロロフォルム／メタノール
／酢酸（８０：１０：１）からなる溶媒混合物である。 検出は、展開したプレートをＰＭＳで染色し、ついで１
３０℃で乾燥して行う。比較物質としてＭＡ、ＭＢおよ
びフラボマイシンＡ／Ｃも適用する。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　酵素触媒作用をグリシン／ＮａＯＨ緩
   衝液中で行わせるリン糖脂質の酵素分解による式Ｉ【化
   １】 の化合物の製造方法。
2. 【請求項２】　　グリシン／ＮａＯＨ緩衝液のｐＨは８
   ．０〜８．５とする請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】　　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．　ＤＳＭ　
   ４６７５に対する培養培地はリン酸塩の添加によりモエ
   ノマイシナーゼおよびＭＢアーゼの力価に関して至適化
   する請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】　　リン酸塩は緩衝液に５０〜１００ｍＭ
   の濃度で添加する請求項３記載の方法。
5. 【請求項５】　　酸またはアルカリホスファターゼが酵
   素ＭＢアーゼの代替として使用する請求項１記載の方法
   。
6. 【請求項６】　　ジャガイモからの酸ホスファターゼが
   用いられる請求項５記載の方法。
7. 【請求項７】　　子ウシ腸からのアルカリホスファター
   ゼが用いられる請求項５記載の方法。
8. 【請求項８】　　バイオマスの濾液は酢酸エチルついで
   アセトンで抽出し、そしてバイオマス自体はアセトンと
   撹拌して抽出する請求項１記載の方法。
9. 【請求項９】　　バイオマスの濾液およびバイオマス自
   体をアセトンと容量比１：０．３で混合する請求項８記
   載の方法。