JPH04267898A

JPH04267898A - ｍＲＮＡの検出方法及びｍＲＮＡの取得方法

Info

Publication number: JPH04267898A
Application number: JP2746991A
Authority: JP
Inventors: Kaoru Fukuda; 薫福田
Original assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Current assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Priority date: 1991-02-21
Filing date: 1991-02-21
Publication date: 1992-09-24

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、目的のｍＲＮＡの直接
取得法に関するものであり、詳しくは、非放射性標識法
を用いてｍＲＮＡを検出することにより目的のｍＲＮＡ
を直接取得する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子組換えによる有用な生体物質生産
の成功の鍵は、目的物質のｍＲＮＡの取得の成否にかか
っている。このｍＲＮＡを鋳型として相補するＤＮＡ（
ｃＤＮＡ）を作り、次いで二本鎖ＤＮＡとして発現ベク
ターに組込み、細胞内に導入して物質生産させる仕組み
である。有用な物質を産生している生物からその情報を
有する遺伝子を取り出し、遺伝子組換え技術により、大
量生産に結びつけることにより医学医療、農業、林業、
漁業畜産、食品等の分野に多大に寄与する事が考えられ
る。現に医学医療分野においてはインターフェロン、ワ
クチン等でその成果を認めるところである。

【０００３】従来、ｍＲＮＡの取得法は、目的物質を産
生している細胞より、オリゴｄＴＴＰによるアフィニテ
ィー・クロマトグラフィー（ｍＲＮＡは３′未端にポリ
Ａをもつため）　や遠心法により全ｍＲＮＡとして濃縮
し取得している。この全ｍＲＮＡは逆転写酵素により、
その転写産物であるｃ　ＤＮＡに変換され、クローニン
グ・ベクターに組込み、クローニング用の大腸菌等に形
質導入して全ｍＲＮＡ由来の大腸菌等の組換え体をスク
リーニングする。このスクリーニングは、大腸菌の場合
、通常固形寒天培地によるシャーレ上で行なわれ、生じ
たコロニー（細胞の集団）から全ｍＲＮＡ由来の組換え
体を選択する（この時点では目的の組換え体は選択出来
ない）。次いで、全ｍＲＮＡ由来の組換え体は、直接あ
るいは再度培養して寒天培地上でコロニーを形成させ、
全ｍＲＮＡ由来の組換え体から目的の組換え体コロニー
を選択する。その方法は、シャーレのコロニー上にニト
ロセルロース膜あるいは、ナイロン膜を接触させ、膜に
コロニーの一部を転写させ、直接あるいは膜を寒天上で
培養して菌数を増やしてから、コロニー（大腸菌）をア
ルカリ処理等により溶菌してコロニー由来のＤＮＡ（ク
ローニング・ベクターを含む）を膜に固定する。次いで
、目的物質（蛋白質）のアミノ酸配列から推定されるＤ
ＮＡ配列より特異的部分のオリゴＤＮＡをＤＮＡ合成機
により合成し、放射能標識する（通常、高検出感度が要
求され高エネルギーの３２Ｐ標識が使われる）。

【０００４】ＤＮＡハイブリダイゼーション（ＤＮＡの
二本鎖結合形成）により、膜上の各コロニーのＤＮＡと
標識オリゴＤＮＡとの二本鎖ＤＮＡの形成を放射能検出
することにより、目的物質のＤＮＡを持つ組換え体（コ
ロニー）を選択する。そして、このコロニーを培養によ
り増殖させ、目的のｍＲＮＡ由来ＤＮＡを取得し発現ベ
クターに組込み、産生用細胞に導入して物質生産を行な
う。

【０００５】

【本発明が解決しようとする問題点】従来法は、前述し
たように全ｍＲＮＡの取得から出発し、全ｍＲＮＡ由来
のｃＤＮＡを合成し、そのＤＮＡを組込んだ菌を選択す
る工程からなる。この工程の中で特に最後のクローニン
グ工程は多大な労力と時間を費やす。常に、数十万個か
ら数百万個のコロニーをスクリーニングするのが現状で
ある。検出系（ＤＮＡハイブリダイゼーション）では例
え、放射能陽性のコロニーを拾えたとしても非特異的で
ある場合が多く、検出条件も充分とは言えない状況であ
る。さらに、極微量のｍＲＮＡであるがため、高検出感
度の検出系が必須であり、そのため多量の高比活性、高
エネルギーの放射能（３２Ｐ）の使用が要求される。こ
のため、使用上の制約や安全性（被爆）の問題が存在す
る。

【０００６】総じて、現状ではｍＲＮＡの取得に関して
は、取得方法、検出法とも充分とは言えず、目的とする
ｍＲＮＡの取得の成否はクローニングの手法及び検出系
の開発に係わっている。

【０００７】

【問題点を解決するための手段】本発明者は、上記問題
を解決すべく鋭意検討した結果、ｃＤＮＡのクローニン
グを必要とせずに目的のｍＲＮＡを直接取得する方法を
生みだし、本発明に至った。即ち、本発明の要旨は、（
ａ）目的とするｍＲＮＡ鎖に相補性を有するオリゴヌク
レオチドを調製する工程、（ｂ）該オリゴヌクレオチド
を担体に担持する工程、（ｃ）担持された該オリゴヌク
レオチドと試料中のｍＲＮＡをアニールする工程、（ｄ
）アニールされたｍＲＮＡを鋳型として、ジゴキシゲニ
ン又はビオチンで標識されたｄ−Ｘ１　ＴＰ（式中、Ｘ
１　はＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ又はＵで表わされるデオキシリボ
ヌクレオチドを表わす。）、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ及びＵから
選ばれるＸ１　以外の３種のデオキシリボヌクレオチド
及び逆転写酵素の存在下、該鋳型に相補的なｃＤＮＡ鎖
を合成する工程、（ｅ）形成されたｃＤＮＡ鎖中のジゴ
キシゲニン又はビオチンをアルカリホスファターゼと結
合させ、該アルカリホスファターゼとパラニトロフェニ
ルホスフェートとの発色反応により検出する工程、から
成ることを特徴とするｍＲＮＡの検出方法及び該方法に
より検出されたｍＲＮＡを単離する工程から成ることを
特徴とするｍＲＮＡの取得方法に存する。本発明におい
ては、まず、目的とする物質を産生している細胞をグア
ニジンチオサルフェート等のカオトロピックイオンによ
り破壊して、ｍＲＮＡを含む細胞破壊液を得る。別に、
目的のｍＲＮＡの一部に相補するオリゴヌクレオチドを
合成し、５′末端側を担体に固定する。次いで細胞破砕
液からの目的のｍＲＮＡを上記オリゴヌクレオチドに直
接アニールし、このｍＲＮＡを鋳型としてオリゴヌクレ
オチドの伸長を逆転写酵素により行ない標識ＤＮＡを取
り込ませ、標識ＤＮＡとｍＲＮＡの二本鎖結合を形成す
る。この標識したＤＮＡを免疫化学的方法等で検出する
ことにより間接的にｍＲＮＡを検出するものである。次
いで、このｍＲＮＡ：ＤＮＡ結合を加熱処理等により変
性させることにより、ｍＲＮＡをＤＮＡから容易に遊離
することができる。

【０００８】以下に本発明について詳細に説明する。

【０００９】（ａ）オリゴヌクレオチドの調製ｍＲＮＡ
を検出する場合、ｍＲＮＡに相補するオリゴヌクレオチ
ドを使用する。合成するオリゴヌクレオチドはアミノ酸
配列から予測して任意に選べるが、出来るだけ非特異結
合を避けるため特徴ある配列を選択するのか好ましい。又、出来るだけ多く標識出来る様に３′末端域を選択す
ることが有利である。さらに、合成するオリゴヌクレオ
チド長さは精度の低下（非特異結合）、オリゴヌクレオ
チド鎖内のアニーリングを避けるためには、２０個前後
が適当であるが特徴のある配列であれば１０個前後でも
可能である。

【００１０】（ｂ）オリゴヌクレオチドの固定方法上記
のようにして得られたオリゴヌクレオチドを担持する担
体としては、酵素免疫反応用プレート、ラテックス粒子
、カラムクロマトグラフィー用樹脂（セルロースセファ
デックス等）、蛋白質等の疎水性を有するか、または官
能基を有する材質のものが用いられる。各担体への担持
は、該オリゴヌクレオチドの５′末端側をアミノ化後行
われる。

【００１１】疎水性材質の担体を用いる場合、アミノ化
オリゴヌクレオチドとの結合は、該疎水性材質に抗原，
抗体，ストレプトアビジン等の蛋白質を被覆し、抗原−
抗体結合、ビオチン−ストレプトアビジン結合等を介し
て行うことができる。例えば、ビオチン−ストレプトア
ビジン結合を介して行う場合には、まず、アミノ化オリ
ゴヌクレオチドにＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ等の市販
のビオチン化した架橋剤を反応させ、ビオチン化オリゴ
ヌクレオチドを合成した後、これにストレプトアビジン
で被覆した疎水性材質を接触させることによりオリゴヌ
クレオチドを担持させる。

【００１２】官能基を有する担体を用いる場合には、市
販の２官能基を有する架橋剤（ジスクシンイミドスベリ
ン酸等）を加えて結合させる。

【００１３】（ｃ）アニーリング上記の方法で担持されたオリゴヌクレオチドと、目的と
するｍＲＮＡとのアニーリングは、目的物質の産生細胞
の破壊に使用したカオトロピックイオン溶液中で常温、
１〜２分間反応させるか、または、ＲＴＣ緩衝液（５０
ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３，５０ｍＭ　　
ＫＣｌ，８ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　，４ｍＭ　　ジチオス
レイトール（ＤＴＴ）中で５５℃，１〜２分間反応させ
て行われる。

【００１４】（ｄ）標識ＤＮＡとｍＲＮＡ二本鎖の合成
アニールされたｍＲＮＡを鋳型として、ジゴキシゲニン
またはビオチンで標識されたｄ−Ｘ１　ＴＰ（式中Ｘ１
　はＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ又はＵで表わされるデオキシリボヌ
クレオチドを表わす。）、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ及びＵから選
ばれるＸ１　以外の３種のデオキシリボヌクレオチド及
び逆転写酵素（ＲＴＣ）の存在下、ＲＴＣ用緩衝液中、
４２℃，３０分間反応させ、該鋳型に相補的なｃＤＮＡ
鎖を合成することができる。通常ｄ−Ｘ１　ＴＰとして
はｄ−ＵＴＰが用いられる。

【００１５】（ｅ）標識ＤＮＡの検出上記で形成されたｃＤＮＡ鎖中のジゴキシゲニンまたは
ビオチンの検出は、該ジゴキシゲニンまたはビオチンに
アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を結合させ、ＡＬＰ
の基質であるパラニトロフェニルホスフェートとの発色
反応により行うことができる。例えば、ポリクロ−ナル
ヒツジ抗ジゴキシゲニンＦａｂ断片にＡＬＰを結合させ
たもの等の抗ジゴキシゲニン抗体−ＡＬＰ複合体を加え
て抗原−抗体反応を行うか、または、ストレプトアビジ
ン−ＡＬＰ複合体を加えてビオチン−アビジン結合を行
って、ＡＬＰを結合させる。発色反応は、目的とするｍ
ＲＮＡがアニールされていれば黄色を呈する。

【００１６】（ｆ）ｍＲＮＡの単離ＲＴＣによる伸長反応により形成された標識ＤＮＡ：ｍ
ＲＮＡ二本鎖結合からｍＲＮＡを単離するには加熱処理
が有利である。標識ＤＮＡは担体に担持されているため
加熱処理により、ｍＲＮＡのみが媒体中に遊離してくる
。これを回収することによりｍＲＮＡを得ることが出来
る。例えば、媒体が、滅菌濾過した蒸留水の場合は、８
０℃，５分間，２．５Ｍ　　ＧｕＳＣＮの場合は、６０
℃，５分間の処理によりｍＲＮＡを単離することができ
る。

【００１７】

【実施例】本発明について、以下に実施例を挙げてより
詳細に述べるが、その要旨を越えない限り、これらに限
定されるものではない。（実施例１）５００ｍｌ用ローラー・ボトル（ファルコ
ン社製・米国）にてＰＬＣ（ヒト肝癌由来）より導いた
Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ　Ａｇ　）　産生ＣＨＯ細胞
株を培養する（３７℃、４日間）。

【００１８】Ｈａｍ′ｓ　　　Ｆ−１２培地（日水製薬
社製）に７．５％のＦＢＳ（子牛血清、三菱化成社製）
を加えて細胞を増殖させた後、同培地のＦＢＳ濃度を１
％として生産培養する。培養途中に培養装置より一本の
ローラー・ボトルを取り出し、クリーン・ベンチ内に於
いて、ＨＢｓ　Ａｇ　が含まれる培養液を回収し、その
一部を採取し、１２．５％ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ）にてＨＢｓ　Ａｇ　産生を確認
した。次いで、ローラー・ボトル内壁に付着している産
生細胞をスクレイパーにより手早く掻き取り、１０ｍｌ
の５Ｍ　　ＧｕＳＣＮ溶液に添加し細胞を破壊する。当
初は、相当粘性のある液であるが、凍結融解を繰り返す
ことにより、粘性のとれたほぼ均一の透明溶液となる。

【００１９】酵素標識免疫反応用９６穴プレートを用意
し、５μｌ（ｍｇ／ｍｌ）のストレプトアビジンを含む
１００μｌのカーボネート・バイカーボネート緩衝液（
ｐＨ９．６，Ｎａ２　ＣＯ３　１．５９ｇ／１，ＮａＨ
ＣＯ３　２．９３ｇ）でウェルをコーティングする（３
７℃、１時間）。次いで、該溶液を排除して１％　　Ｂ
ｌｏｃｋｉｎｇ　　Ｒｅａｇｅｎｔ（ベーリンガー・マ
ンハイム山の内社）を含むＢｕｆｆｅｒ−１（１００ｍ
Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ　　ＮａＣｌ，ｐ
Ｈ７．５）の２００μｌ／ウェルにてブロッキング（３
７℃、１時間）する。ブロッキング溶液を排除後、これ
に、別途ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍ社　　米国）によりＨＢｓ　Ａｇ　のｍＲＮＡ
３′末端域に相補するセンス鎖の５′末端にアミノ基を
持つオリゴマーを合成し、これにビオチン誘導体を付加
したビオチン−オリゴマーを過剰量加えて１００μｌ／
ウェル、３７℃、３０分間のビオチン−ストレプトアビ
ジン結合形成反応を行なう。

【００２０】過剰のビオチン−オリゴマーを回収し、ウ
ェルをＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰ
ＢＳ）、次いでＢｕｆｆｅｒ−１で洗浄後精製水により
、２．５Ｍ　　ＧｕＳＣＮ濃度とした細胞破壊液１００
μｌをウェル内に加え、室温３０分のｍＲＮＡとオリゴ
マーとのアニーリングを行う。破壊液を排除し、ウェル
をＰＢＳＴ、次いでＢｕｆｆｅｒ−１で各々３回洗浄後
、ＲＴＣ用緩衝液（５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　　
ｐＨ８．３，５０ｍＭ　　ＫＣｌ，１０ｍＭＭｇＣｌ２
　，３ｍＭ　　ＤＴＴ　　９８μｌ）、ジゴキシゲニン
（Ｄｉｇ）で標識されたｄＵＴＰ（Ｄｉｇ−ｄＵＴＰ）
ｄＸＴＰ（Ｘ＝Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ）混合液　　１μｌ（ベ
ーリンガー・マンハイム山の内社製）及びＲＴＣ（同）
１μｌ（２５ｕｎｉｔｓ）を加えて、４２℃、３０分の
ＤＮＡ伸長反応を行なう。反応後、反応液を排除し、Ｐ
ＢＳＴ、Ｂｕｆｆｅｒ−１で十分洗浄を行なう。次に４
μｌの抗ジゴキシゲニン−アルカリホスファターゼを含
む１０ｍｌ　　Ｂｕｆｆｅｒ−１の１００μｌをウェル
に加えて、抗原抗体反応を行なう（（Ｄｉｇ−抗Ｄｉｇ
−アルカリホスファターゼ複合体の形成（室温、３０分
、振盪下））。

【００２１】反応液を排除後、ＰＢＳＴ、Ｂｕｆｆｅｒ
−１により十分洗浄を行なう。

【００２２】続いて、５ｍｇのパラニトロフェニルホス
フェートを含む１０ｍｌのＢｕｆｆｅｒ−２（１００ｍ
Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　　１００ｍＭ　　ＮａＣｌ，
５０ｍＭＭｇＣｌ２　，ｐＨ９．５）１００μｌ／ウェ
ルを加え、アルカリホスファターゼとの酵素反応を行な
う（室温、静置）。

【００２３】ＤＮＡに取り込まれたＤｉｇ−ｄＵＴＰに
反応した抗Ｄｉｇ−アルカリホスファターゼにより、そ
の基質であるパラニトロフェニルホスフェートとの反応
から生ずる黄色色素の遊離により、本反応において、Ｄ
ＮＡと相補するｍＲＮＡが鋳型となるオリゴマーの伸長
によりＤｉｇ−ｄＵＴの取り込みがおこなわれた事を示
し、目的のｍＲＮＡを捕獲したことを示す。

【００２４】本文において、ＰＢＳＴ、Ｂｕｆｆｅｒ−
１等による洗浄とあるが、この洗浄は自動プレート洗浄
機Ｉｍｍｕｎｏ　　Ｗａｓｈｅｒ　　ＮＫ−３００（Ｉ
ｎｔｅｒＭｅｄ社製　　米国）により行なった。次に、
ｍＲＮＡの捕獲の証明の確認のためノーザン・ブロット
を実施した。

【００２５】９６穴プレートの黄色反応液を廃棄し、Ｂ
ｕｆｆｅｒ−１で十分洗浄後、２．５Ｍ　　ＧｕＳＣＮ
の１００μｌ／ウェルを加えて６０℃、３０分間加温す
ると、ｍＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖結合からｍＲＮＡが遊離
する。ＤＮＡはビオチン−ストレプトアビジン結合によ
りプレートに固定化されている。ウェル内のｍＲＮＡを
含む液をポリビニリデンジフロライド（ＰＶＤＦ）膜（
予め、メタノール処理、１Ｍ酢酸アンモニウムにより平
衡化したもの）にＤｏｔ　　Ｔｅｍｐｌａｔｅ（Ｂｉｏ
Ｒａｄ社製）装置によりスポットする。ウェルを１Ｍ、
酢酸アンモニウムにより洗浄後、風乾、８０℃の加熱（
１時間）を行ない、１％ブロッキング試薬、０．１％Ｎ
−ラウロイルザルコシンＮａ塩、０．０２％ナトリウム
ドデシルサルフェート（ＳＤＳ）、５×ＳＳＣ溶液（５
倍のＳＳＣ溶液）で６８℃、１時間のブロッキングを行
なう（攪拌下）。別に、ＣＨＯ細胞染色体に挿入されて
いるＨＢｓ　Ａｇ　遺伝子（遺伝子組換えにより形質導
入された）を含むプラスミドを制限酵素（ＥｃｏＲｌ）
により一本鎖とし、ランダムプライマーによるＤＮＡ鎖
伸長反応によりＤｉｇ−ｄＵＴＰを取り込ませた。この
標識プラスミドを１００℃、１５分の加熱処理により一
本鎖とし、ブロッキングを終えたＰＶＤＦ膜に加えて（
同新溶液に置換して）６８℃、一昼夜のハイブリダイゼ
ーションを行なう。続いて膜は２×ＳＳＣ溶液，０．１
％ＳＤＳ溶液で室温、５分で２回、０．１×ＳＳＣ溶液
，０．１％ＳＤＳ溶液で６８℃、１５分で２回洗浄を行
なう（震盪下）。さらに、１％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　　Ｒ
ｅａｇｅｎｔを含むＢｕｆｆｅｒ−１で３７℃、１時間
ブロッキングを行なった後、抗Ｄｉｇ−アルカリホスフ
ァターゼを加え（４μｇ／１００ｃｍ２　膜）、３７℃
、３０分間インキュベートする。Ｂｕｆｆｅｒ−１で膜
を良く洗浄後、アルカリホスファターゼの基質であるＢ
ＣＩＰ（ブロムクロロインド−ルホスフェート、ＮＢＴ
（ニトロブル−テトラゾリウム）を含むＢｕｆｆｅｒ−
２と暗所下接触させる（静置）。膜に固定化したｍＲＮ
Ａが標識ＨＢｓ　Ａｇ　遺伝子とハイブリダイズしてい
るならば、アルカリホスファターゼと基質との反応が起
こり、膜にスポットした部位は濃紫色を呈する。この結
果は、膜に固定したｍＲＮＡが、ＨＢｓ　Ａｇ　遺伝子
に相補し、ＨＢｓ　Ａｇ　遺伝子をコードしていること
を意味している。

【００２６】（実施例２）目的ｍＲＮＡを直接捕獲する
ため、担体としてラテックス粒子（ポリスチレン）を使
用した。ラテックス粒子（Ｓｅｒａｄｙｎ社製　　米国
）、直径０．３０５ｕｍの縣濁液１０μｌを１．５ｍｌ
エッペンドルフチューブに取り、５μｇのストレプトア
ビジンを含むＢｕｆｆｅｒ−１を加えて攪拌下、ラテッ
クス粒子をストレプトアビジンでコーティングする（３
７℃、１時間）。次いでストレプトアビジンの付着しな
かったラテックス粒子表面部分をＢｌｏｃｋｉｎｇ　　
Ｒｅａｇｅｎｔの１％を含むＢｕｆｆｅｒ−１でブロッ
キングする（３７℃、１時間）。

【００２７】続いて、ラテックス粒子に過剰のビオチン
−オリゴマー（前述）を加えて３７℃、１時間攪拌を行
ないストレプトアビジン−ビオチン−オリゴマー結合を
形成させる。過剰のビオチン−オリゴマーを回収（これ
までの操作はいずれもエッペンドルフチューブ内でおこ
なっているため各種液の排除はラテックス粒子を分離さ
せるため、１６，０００ｒｐｍ、２０分の同チューブ用
遠心器で行なっている。又、本操作は不均一系であるた
め各種反応等は常に攪拌を要する。後記載に於いても同
様である）し、ＰＢＳＴ、Ｂｕｆｆｅｒ−１による洗浄
後、１００μｌの細胞破壊液（前述）を直接加えてオリ
ゴマーに相補するｍＲＮＡのアニーリングを行う（３７
℃、２時間）。破壊液を排除しＰＢＳＴ、Ｂｕｆｆｅｒ
−１により十分洗浄後、２μｌのＤｉｇ−ｄＵＴＰ、ｄ
ＸＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ）混合液を含む
１００μｌのＲＴＣ緩衝液、１μｌ（２５Ｕｎｉｔｓ）
のＲＴＣを加えてｍＲＮＡを鋳型とするオリゴマーの伸
長反応を行なう（４２℃、２時間）。反応後、反応液を
排除しＰＢＳＴ、Ｂｕｆｆｅｒ−１により、粒子を十分
洗浄した後、２μｌの抗Ｄｉｇ−アルカリホスファター
ゼを含むＢｕｆｆｅｒ−１１００μｌを加えて３７℃、
３０分反応させる。

【００２８】ＰＢＳＴ、Ｂｕｆｆｅｒ−１により十分粒
子を洗浄してから、アルカリホスファターゼの基質であ
るパラニトロフェニルホスフェートを含むＢｕｆｆｅｒ
−２を１００μｌ加えて酵素反応を行なう。エッペンド
ルフチューブ内は数十分で黄色を呈し、ｍＲＮＡを鋳型
としたオリゴマーをプライマーとする伸長反応が進行し
てＤｉｇ−ｄＵＴＰが取り込まれたことを示した。この
事実をフォローするため、前述のごとく、ノーザンブロ
ット法からＨＢｓ　Ａｇ　に相補するｍＲＮＡであるこ
とを確認した。

【００２９】

【発明の効果】本発明によれば、従来のように放射性標
識法を利用することなく、高感度かつ安全にｍＲＮＡを
検出でき、また、本発明方法は、従来法において多大な
時間及び労力を要していたクローニング過程を必要とし
ないため、労力は元よりｍＲＮＡの検出に数ケ月かかる
操作を数日に短縮した（ｍＲＮＡの検出に必要な日数は
１日）。さらに、スクリーニングやハイブリダイゼーシ
ョン等の諸工程も不要であるため、迅速、簡便にｍＲＮ
Ａを取得することが可能である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　（ａ）目的とするｍＲＮＡ鎖に相補性
を有するオリゴヌクレオチドを調製する工程、（ｂ）該
オリゴヌクレオチドを担体に担持する工程、（ｃ）担持
された該オリゴヌクレオチドと試料中のｍＲＮＡをアニ
ールする工程、（ｄ）アニールされたｍＲＮＡを鋳型と
して、ジゴキシゲニン又はビオチンで標識されたｄ−Ｘ
１　ＴＰ（式中、Ｘ１　はＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ又はＵで表わ
されるデオキシリボヌクレオチドを表わす。）、Ａ、Ｇ
、Ｃ、Ｔ及びＵから選ばれるＸ１　以外の３種のデオキ
シリボヌクレオチド及び逆転写酵素の存在下、該鋳型に
相補的なｃＤＮＡ鎖を合成する工程、及び、（ｅ）形成
されたｃＤＮＡ鎖中のジゴキシゲニン又はビオチンをア
ルカリホスファターゼと結合させ、該アルカリホスファ
ターゼとパラニトロフェニルホスフェートとの発色反応
により検出する工程、から成ることを特徴とするｍＲＮ
Ａの検出方法。
【請求項２】　　（ａ）目的とするｍＲＮＡ鎖に相補性
を有するオリゴヌクレオチドを調製する工程、（ｂ）該
オリゴヌクレオチドを担体に担持する工程、（ｃ）担持
された該オリゴヌクレオチドと試料中のｍＲＮＡをアニ
ールする工程、（ｄ）アニールされたｍＲＮＡを鋳型と
して、ジゴキシゲニン又はビオチンで標識されたｄ−Ｘ
１　ＴＰ（式中、Ｘ１　はＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ又はＵで表わ
されるデオキシリボヌクレオチドを表わす。）、Ａ、Ｇ
、Ｃ、Ｔ及びＵから選ばれるＸ１　以外の３種のデオキ
シリボヌクレオチド及び逆転写酵素の存在下、該鋳型に
相補的なｃＤＮＡ鎖を合成する工程、（ｅ）形成された
ｃＤＮＡ鎖中のジゴキシゲニン又はビオチンをアルカリ
ホスファターゼと結合させ、該アルカリホスファターゼ
とパラニトロフェニルホスフェートとの発色反応により
検出する工程、（ｆ）検出されたｍＲＮＡを単離する工
程から成ることを特徴とするｍＲＮＡの取得方法。