JPH04258293A - 組換えdna、それを含む形質転換体及びそれを用い たグルコースデヒドロゲナーゼの製造法 - Google Patents
組換えdna、それを含む形質転換体及びそれを用い たグルコースデヒドロゲナーゼの製造法Info
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、バチルス・メガテリウ
ム(Bacillus megaterium)由来
のグルコースデヒドロゲナーゼ(以下「GDH」という
。)をコードするDNAのアミノ酸配列で示される特定
の位置のアミノ酸を他のアミノ酸で置換することによっ
て得られる改良型DNAを大腸菌用DNA導入ベクター
に組み込んだ大腸菌内で複製可能な改良型組換えDNA
、それを含む形質転換体及びそれを用いるGDHの製造
法に関する。
ム(Bacillus megaterium)由来
のグルコースデヒドロゲナーゼ(以下「GDH」という
。)をコードするDNAのアミノ酸配列で示される特定
の位置のアミノ酸を他のアミノ酸で置換することによっ
て得られる改良型DNAを大腸菌用DNA導入ベクター
に組み込んだ大腸菌内で複製可能な改良型組換えDNA
、それを含む形質転換体及びそれを用いるGDHの製造
法に関する。
【0002】
【従来の技術】GDH〔EC 1.1.1.47〕は
、グルコース定量用酵素として臨床検査及び食品工業の
分野において重要な酵素として使用されている。従来、
GDHを生産する微生物としては、バチルス・メガテリ
ウム、バチルス・セレウス(Bacillus ce
reus)等のバチルス属菌が知られている(特開昭5
3−137199号)。
、グルコース定量用酵素として臨床検査及び食品工業の
分野において重要な酵素として使用されている。従来、
GDHを生産する微生物としては、バチルス・メガテリ
ウム、バチルス・セレウス(Bacillus ce
reus)等のバチルス属菌が知られている(特開昭5
3−137199号)。
【0003】バチルス・メガテリウム由来のGDHは分
子量約30,000の同一サブユニットからなる四量体
酵素として知られている。GDHはアルカリ側では可逆
的に解離して失活する性質を有している。しかし、イオ
ン強度が高いときは失活しないことが知られている。
子量約30,000の同一サブユニットからなる四量体
酵素として知られている。GDHはアルカリ側では可逆
的に解離して失活する性質を有している。しかし、イオ
ン強度が高いときは失活しないことが知られている。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】しかしながらグルコー
ス測定用酵素としてGDHを使用するためには、より安
定性に優れた性質を持つことが望まれ、更にイオン強度
が低い場合においてもpHによる影響を受けにくく、熱
に対しても安定性の優れたGDHをより安価に製造する
ことが望まれていた。
ス測定用酵素としてGDHを使用するためには、より安
定性に優れた性質を持つことが望まれ、更にイオン強度
が低い場合においてもpHによる影響を受けにくく、熱
に対しても安定性の優れたGDHをより安価に製造する
ことが望まれていた。
【0005】最近になってバチルス・メガテリウム由来
のGDH遺伝子を大腸菌に組み入れた組換え体を用いた
GDHの生産方法が開示された〔ヨーロピアン・ジャー
ナル・オブ・バイオケミストリー(Eur.J.Bio
chem.)174巻、485〜490、(1988)
〕。
のGDH遺伝子を大腸菌に組み入れた組換え体を用いた
GDHの生産方法が開示された〔ヨーロピアン・ジャー
ナル・オブ・バイオケミストリー(Eur.J.Bio
chem.)174巻、485〜490、(1988)
〕。
【0006】しかし、バチルス・メガテリウム由来のG
DH遺伝子は複数個存在することが示され、それらを用
いて形質転換体を得、GDHを生産しているが、使用し
ているベクターはGDHの大量生産には向かないもので
あり、かつGDHをより安定化するための改良は何らな
されていないのであった。
DH遺伝子は複数個存在することが示され、それらを用
いて形質転換体を得、GDHを生産しているが、使用し
ているベクターはGDHの大量生産には向かないもので
あり、かつGDHをより安定化するための改良は何らな
されていないのであった。
【0007】本発明者らは、既にGDHをより安価に製
造するため、バチルス・メガテリウム由来のGDH遺伝
子を高発現ベクターpKK223−3に組み入れて形質
転換体を得、該形質転換体を栄養培地で培養することに
よってGDHを高生産することに成功し、さらに検討し
てバチルス・メガテリウム由来のGDHをコードするD
NAのアミノ酸配列で示される特定の位置のアミノ酸を
他のアミノ酸で置換して得られる改良型DNAを大腸菌
に組み入れた形質転換体を栄養培地で培養したところ、
培養物中に従来のGDHより熱安定性に優れたGDHを
大量に製造せしめることに成功している(特開平2−8
6779)。
造するため、バチルス・メガテリウム由来のGDH遺伝
子を高発現ベクターpKK223−3に組み入れて形質
転換体を得、該形質転換体を栄養培地で培養することに
よってGDHを高生産することに成功し、さらに検討し
てバチルス・メガテリウム由来のGDHをコードするD
NAのアミノ酸配列で示される特定の位置のアミノ酸を
他のアミノ酸で置換して得られる改良型DNAを大腸菌
に組み入れた形質転換体を栄養培地で培養したところ、
培養物中に従来のGDHより熱安定性に優れたGDHを
大量に製造せしめることに成功している(特開平2−8
6779)。
【0008】
【課題を解決するための手段・作用】本発明は前記発明
について更に検討を重ね、一組の特定のアミノ酸を他の
一組の特定のアミノ酸に置換することによって得られる
DNAを大腸菌に組み入れた形質転換体を栄養培地で培
養したところ、熱安定性に優れたGDHを製造すること
ができること、更にどのpHにおいても四量体の形で存
在し、熱にも安定なGDHを製造することができること
を見いだして本発明を完成した。
について更に検討を重ね、一組の特定のアミノ酸を他の
一組の特定のアミノ酸に置換することによって得られる
DNAを大腸菌に組み入れた形質転換体を栄養培地で培
養したところ、熱安定性に優れたGDHを製造すること
ができること、更にどのpHにおいても四量体の形で存
在し、熱にも安定なGDHを製造することができること
を見いだして本発明を完成した。
【0009】バチルス・メガテリウム由来のGDH組換
えDNAを調製するためには、まずGDHをコードする
組換えDNAを調製する必要がある。そのために使用す
る菌株としては、GDH生産能を有するバチルス・メガ
テリウムであればいずれのものも使用できるが、好まし
くはバチルス・メガテリウムIAM1030及び土壌か
ら分離されたバチルス・メガテリウムIWG3を用いる
のがよい。
えDNAを調製するためには、まずGDHをコードする
組換えDNAを調製する必要がある。そのために使用す
る菌株としては、GDH生産能を有するバチルス・メガ
テリウムであればいずれのものも使用できるが、好まし
くはバチルス・メガテリウムIAM1030及び土壌か
ら分離されたバチルス・メガテリウムIWG3を用いる
のがよい。
【0010】このうち土壌から得られた菌株のバチルス
・メガテリウムIWG3は以下のようにして同定された
ものである。
・メガテリウムIWG3は以下のようにして同定された
ものである。
【0011】菌学的諸性質の試験は、ルース・イー・ゴ
ードン著,ザ・ジーナス・バチルス(Ruth E.
Gordon:The Genus Bacill
us(1973)〕に準拠し、分類方法はバージェイス
・マニュアル・オブ・ディタミネイティブ・バクテリオ
ロジー (Bergey’s Manual of De
terminative Bacteriology
)(第8版)及び前記のThe Genus Ba
cillusによった。
ードン著,ザ・ジーナス・バチルス(Ruth E.
Gordon:The Genus Bacill
us(1973)〕に準拠し、分類方法はバージェイス
・マニュアル・オブ・ディタミネイティブ・バクテリオ
ロジー (Bergey’s Manual of De
terminative Bacteriology
)(第8版)及び前記のThe Genus Ba
cillusによった。
【0012】A.形態
(1) 細胞の大きさは1.1〜1.6μ×3.0〜
5.0μで桿菌である。またグルコース栄養培地(gl
ucosenutrient agar)で生育した
細胞をフクシンで染めると細胞内は粒状である。 (2) 運動性はない。 (3) 胞子を形成し、大きさは1.0〜1.3μ×
2.0〜2.5μで、卵形ないしは円柱形である。胞子
のうは膨らまない。中立ないしは準端立である。 (4) グラム染色性は陽性である。
5.0μで桿菌である。またグルコース栄養培地(gl
ucosenutrient agar)で生育した
細胞をフクシンで染めると細胞内は粒状である。 (2) 運動性はない。 (3) 胞子を形成し、大きさは1.0〜1.3μ×
2.0〜2.5μで、卵形ないしは円柱形である。胞子
のうは膨らまない。中立ないしは準端立である。 (4) グラム染色性は陽性である。
【0013】B・生理学的性質
(1) 硝酸塩の還元:陰性
(2) 脱窒反応 :陰性(3)
VPテスト :陰性。ブロスのpHは7日間の培養で
4.6〜5.0である。 (4) インドールの生成:陰性(5)
デンプンの加水分解:陰性(6) クエン酸塩の
利用:陽性(7) 無機窒素源の利用:アンモニ
ウム塩と硝酸塩を共に利用する。 (8) 色素の生成:チロシン培地で茶褐色の水
溶性色素を生成する。 (9) ウレアーゼ:弱陽性 (10) カタラーゼ:陽性 (11) 酸素に対する態度:好気性(12) 糖
類からの酸及びガスの生成:アラビノース,キシロース
,グルコース,フラクトース,ガラクトース,マルトー
ス,シュクロース,ラクトース,トレハロース,マンニ
ット,イノシット,グリセリン,デンプンから酸を生成
するが、ガスは生成しない。マンノース,ソルビットか
らは酸もガスも生成しない。 (13) 7% NaCl培地での生育:生育しな
い(14) 45℃における生育:生育する(15)
65℃における生育:生育しない(16) サブ
ロー・デキストローズ(Sabouraud dex
trose)培地における生育:生育する(17)
フェニルアラニンのデアミネーション:陽性(18)
ゼラチンの液化性:陽性 (19) カゼインの分解性:陽性 (20) チロシンの分解性:陽性 (21) 卵黄反応:陰性
VPテスト :陰性。ブロスのpHは7日間の培養で
4.6〜5.0である。 (4) インドールの生成:陰性(5)
デンプンの加水分解:陰性(6) クエン酸塩の
利用:陽性(7) 無機窒素源の利用:アンモニ
ウム塩と硝酸塩を共に利用する。 (8) 色素の生成:チロシン培地で茶褐色の水
溶性色素を生成する。 (9) ウレアーゼ:弱陽性 (10) カタラーゼ:陽性 (11) 酸素に対する態度:好気性(12) 糖
類からの酸及びガスの生成:アラビノース,キシロース
,グルコース,フラクトース,ガラクトース,マルトー
ス,シュクロース,ラクトース,トレハロース,マンニ
ット,イノシット,グリセリン,デンプンから酸を生成
するが、ガスは生成しない。マンノース,ソルビットか
らは酸もガスも生成しない。 (13) 7% NaCl培地での生育:生育しな
い(14) 45℃における生育:生育する(15)
65℃における生育:生育しない(16) サブ
ロー・デキストローズ(Sabouraud dex
trose)培地における生育:生育する(17)
フェニルアラニンのデアミネーション:陽性(18)
ゼラチンの液化性:陽性 (19) カゼインの分解性:陽性 (20) チロシンの分解性:陽性 (21) 卵黄反応:陰性
【0014】以上の諸性質をバージェイス・マニュアル
・オブ・ディタミネイティブ・バクテリオロジー(第8
版)の分類方法にしたがって検索すると、本菌株はグラ
ム陽性の好気性桿菌で胞子を形成するのでバチルス属に
分類される。
・オブ・ディタミネイティブ・バクテリオロジー(第8
版)の分類方法にしたがって検索すると、本菌株はグラ
ム陽性の好気性桿菌で胞子を形成するのでバチルス属に
分類される。
【0015】種については、
(1) 栄養細胞の大きさが1.0〜1.6μ×3.
0〜5.0μであり、グルコース培地で細胞内が粒状で
ある。 (2) 胞子のうが膨らまないこと、胞子形成部位は
中央部ないしはやや末端よりである。 (3) グルコースから酸を生成すること、VPテス
トが陰性である。 (4) 嫌気条件下では生育しない。 (5) サブロー・デキストローズ(Saboura
ud dextrose)培地で生育する。 (6) アラビノース、キシロース、マンニットから
酸を生成する。 (7) 卵黄反応が陰性である。 こと等の性質からバチルス・メガテリウムと同定され、
本発明者らは、本菌株をバチルス・メガテリウムIWG
3と命名した。
0〜5.0μであり、グルコース培地で細胞内が粒状で
ある。 (2) 胞子のうが膨らまないこと、胞子形成部位は
中央部ないしはやや末端よりである。 (3) グルコースから酸を生成すること、VPテス
トが陰性である。 (4) 嫌気条件下では生育しない。 (5) サブロー・デキストローズ(Saboura
ud dextrose)培地で生育する。 (6) アラビノース、キシロース、マンニットから
酸を生成する。 (7) 卵黄反応が陰性である。 こと等の性質からバチルス・メガテリウムと同定され、
本発明者らは、本菌株をバチルス・メガテリウムIWG
3と命名した。
【0016】以下、実施例を記載しながら本発明を詳述
する。
する。
【0017】形質転換体Aの調製
(1) GDHの精製
バチルス・メガテリウムIWG3を2XTYブロスに植
菌し、培養後集菌し、菌体破砕後、遠心分離して得られ
る上清液を脱塩濃縮後、凍結乾燥して得られたGDH粗
酵素粉末105μgをグリセロール10%含有イミダゾ
ール緩衝液(20mM、pH6.5)15mlに溶解し
、DEAE−セファデックスA−50に吸着させた後、
食塩濃度勾配(0.1M−0.5M)により溶出させ、
活性画分を集め脱塩濃縮する。次にTSK−ゲルDEA
E−3−SWを担体とする高速液体クロマトグラフィー
により分子量分画を行い、さらにTSK−ゲル G3
000−SWを担体とする高速液体クロマトグラフィー
により吸着溶離して電気泳動的に均一な活性画分(蛋白
質量として約5mg)を得た。
菌し、培養後集菌し、菌体破砕後、遠心分離して得られ
る上清液を脱塩濃縮後、凍結乾燥して得られたGDH粗
酵素粉末105μgをグリセロール10%含有イミダゾ
ール緩衝液(20mM、pH6.5)15mlに溶解し
、DEAE−セファデックスA−50に吸着させた後、
食塩濃度勾配(0.1M−0.5M)により溶出させ、
活性画分を集め脱塩濃縮する。次にTSK−ゲルDEA
E−3−SWを担体とする高速液体クロマトグラフィー
により分子量分画を行い、さらにTSK−ゲル G3
000−SWを担体とする高速液体クロマトグラフィー
により吸着溶離して電気泳動的に均一な活性画分(蛋白
質量として約5mg)を得た。
【0018】(2) GDHのアミノ基末端アミノ酸
配列の決定 前記(1)により得た精製酵素蛋白質のアミノ基末端ア
ミノ酸配列をABI〔アプライド・バイオシステム(A
pplied Biosystem)〕社製ペプチド
シーケンサーGas Phase 470Aにより
分析し、N末端より29アミノ酸残基の配列(配列番号
:2)を決定した。尚、下線部はプローブ合成に用いら
れた配列を示す。
配列の決定 前記(1)により得た精製酵素蛋白質のアミノ基末端ア
ミノ酸配列をABI〔アプライド・バイオシステム(A
pplied Biosystem)〕社製ペプチド
シーケンサーGas Phase 470Aにより
分析し、N末端より29アミノ酸残基の配列(配列番号
:2)を決定した。尚、下線部はプローブ合成に用いら
れた配列を示す。
【0019】(3) DNAプローブの合成前記アミ
ノ酸配列(配列番号:2)から下線で示した1ヶ所の配
列を選択し、これらのアミノ酸配列から推定される遺伝
子上の可能なDNA塩基配列のうち、枯草菌のコドン利
用頻度を参考にしてDNA塩基配列を推定し、38me
rの1種のDNAプローブの塩基配列(配列番号:3)
を決定した。DNAの合成はABI社製でシンセサイザ
ー(Synthesizer)モデル381Aを用いて
行った。
ノ酸配列(配列番号:2)から下線で示した1ヶ所の配
列を選択し、これらのアミノ酸配列から推定される遺伝
子上の可能なDNA塩基配列のうち、枯草菌のコドン利
用頻度を参考にしてDNA塩基配列を推定し、38me
rの1種のDNAプローブの塩基配列(配列番号:3)
を決定した。DNAの合成はABI社製でシンセサイザ
ー(Synthesizer)モデル381Aを用いて
行った。
【0020】(4) バチルス・メガテリウムからの
全DNAの抽出と切断 斉藤、三浦らの方法〔バイオキミカ・バイオフィジカ・
アクタ(Biochim.Biophys.Acta)
、72巻、619頁(1963)]に従ってバチルス・
メガテリウムIWG3から全DNAを抽出精製した。こ
のDNA240μgをとり、制限酵素EcoRI、Bg
lIIそれぞれ150単位と37℃、3時間反応させた
。反応液の全量を1%アガロースゲル電気泳動に供し、
3〜4Kbの大きさに相当するDNAを含む部分を切出
して、電気抽出法によりゲルからDNA断片を溶出させ
た。次いで溶出液を当量のフェノール及びフェノール・
クロロホルムで順次抽出し、得られた水層にエタノール
を添加してDNAを沈澱させた後、TE緩衝液100μ
lに溶かした。
全DNAの抽出と切断 斉藤、三浦らの方法〔バイオキミカ・バイオフィジカ・
アクタ(Biochim.Biophys.Acta)
、72巻、619頁(1963)]に従ってバチルス・
メガテリウムIWG3から全DNAを抽出精製した。こ
のDNA240μgをとり、制限酵素EcoRI、Bg
lIIそれぞれ150単位と37℃、3時間反応させた
。反応液の全量を1%アガロースゲル電気泳動に供し、
3〜4Kbの大きさに相当するDNAを含む部分を切出
して、電気抽出法によりゲルからDNA断片を溶出させ
た。次いで溶出液を当量のフェノール及びフェノール・
クロロホルムで順次抽出し、得られた水層にエタノール
を添加してDNAを沈澱させた後、TE緩衝液100μ
lに溶かした。
【0021】(5) ベクターへのDNA断片の挿入
ベクターとしてはpBR322を用いたが、DNA断片
挿入のためには、pBR322 20μgをEcoR
I−BamHIで完全分解して得られた直鎖状ベクター
DNAをTE緩衝液200μlに溶解して使用した。上
記工程(4)で得られたDNA断片との結合は、工程(
4)で得られた溶液と直鎖状ベクターDNA溶液を10
:1の割合に混合し、T4DNAリガーゼを14℃で一
夜反応させることにより行った。
ベクターとしてはpBR322を用いたが、DNA断片
挿入のためには、pBR322 20μgをEcoR
I−BamHIで完全分解して得られた直鎖状ベクター
DNAをTE緩衝液200μlに溶解して使用した。上
記工程(4)で得られたDNA断片との結合は、工程(
4)で得られた溶液と直鎖状ベクターDNA溶液を10
:1の割合に混合し、T4DNAリガーゼを14℃で一
夜反応させることにより行った。
【0022】(6) バチルス・メガテリウムのDN
Aライブラリーの作成 上記工程(5)で得られた組換えDNAを形質転換によ
り宿主大腸菌エシエリヒア・コリ(Escherich
ia coli)C600に導入し、アンピシリン5
0μg/mlを含むL−ブロス寒天培地上で生育してき
たコロニーを集めてバチルス・メガテリウムIWG3の
DNAライブラリーと称した。
Aライブラリーの作成 上記工程(5)で得られた組換えDNAを形質転換によ
り宿主大腸菌エシエリヒア・コリ(Escherich
ia coli)C600に導入し、アンピシリン5
0μg/mlを含むL−ブロス寒天培地上で生育してき
たコロニーを集めてバチルス・メガテリウムIWG3の
DNAライブラリーと称した。
【0023】(7) DNAライブラリーからGDH
クローンの選択・分離 上記工程(3)で得られたDNAプローブを各々イング
リア(Inglia)らの方法〔ヌクレイック・アシッ
ド・リサーチ(Nucleic AcidsRes.
)、9巻、1627〜1642頁(1982)〕に従っ
てT4ポリヌクレオチドキナーゼとγ−32P−ATP
を用いてラベルした。
クローンの選択・分離 上記工程(3)で得られたDNAプローブを各々イング
リア(Inglia)らの方法〔ヌクレイック・アシッ
ド・リサーチ(Nucleic AcidsRes.
)、9巻、1627〜1642頁(1982)〕に従っ
てT4ポリヌクレオチドキナーゼとγ−32P−ATP
を用いてラベルした。
【0024】次に前記工程(6)で得られた大腸菌をア
ンピシリン50μg/mlを含むL−ブロス寒天培地上
でコロニーとして生育させ、これをレプリカ法によって
、アマーシャム(Amersham)ナイロンメンブラ
ンへ移し、リゾチーム溶菌し、アルカリでDNA変性さ
せ、塩酸による中和処理を行った後、前記プローブとハ
イブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーション
は6倍濃度のSSC(0.15M NaCl、0.0
15Mクエン酸ナトリウム、pH7.0)、5倍濃度の
デンハルト(Denhardt)液(0.02%フィコ
ール,0.02%ポリビニルピロリドン,0.02%牛
血清アルブミン)、0.5%SDS、牛胸腺DNA20
μg/ml(終濃度)及びラベルしたDNAプローブ約
5×105cpm/mlを用いてプレハイブリダイゼー
ションを45℃、3時間行った後、45℃、一夜のハイ
ブリダイゼーションを行った。
ンピシリン50μg/mlを含むL−ブロス寒天培地上
でコロニーとして生育させ、これをレプリカ法によって
、アマーシャム(Amersham)ナイロンメンブラ
ンへ移し、リゾチーム溶菌し、アルカリでDNA変性さ
せ、塩酸による中和処理を行った後、前記プローブとハ
イブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーション
は6倍濃度のSSC(0.15M NaCl、0.0
15Mクエン酸ナトリウム、pH7.0)、5倍濃度の
デンハルト(Denhardt)液(0.02%フィコ
ール,0.02%ポリビニルピロリドン,0.02%牛
血清アルブミン)、0.5%SDS、牛胸腺DNA20
μg/ml(終濃度)及びラベルしたDNAプローブ約
5×105cpm/mlを用いてプレハイブリダイゼー
ションを45℃、3時間行った後、45℃、一夜のハイ
ブリダイゼーションを行った。
【0025】この後、5倍濃度のSSCを用いて45℃
で2回、つづいて5倍濃度のSSC(0.1%SDSを
含む)を用いて45℃で2回、4倍濃度のSSCで2回
ナイロンメンブランを洗浄した。この後ナイロンメンブ
ランを乾燥させ、オートラジオグラフィー(条件:−8
0℃、一夜)に供した。その結果、ハイブリダイゼーシ
ョン陽性のコロニーが3つ見出された。そこで陽性のコ
ロニーについて液体培養をした後、バーンボイム(Bi
rnboim)らの方法〔ヌクレイック・アシッド・リ
サーチ(Nucleic Acids Res.)
、7巻、1513〜1523頁(1979)〕によりプ
ラスミドDNAを調製した。
で2回、つづいて5倍濃度のSSC(0.1%SDSを
含む)を用いて45℃で2回、4倍濃度のSSCで2回
ナイロンメンブランを洗浄した。この後ナイロンメンブ
ランを乾燥させ、オートラジオグラフィー(条件:−8
0℃、一夜)に供した。その結果、ハイブリダイゼーシ
ョン陽性のコロニーが3つ見出された。そこで陽性のコ
ロニーについて液体培養をした後、バーンボイム(Bi
rnboim)らの方法〔ヌクレイック・アシッド・リ
サーチ(Nucleic Acids Res.)
、7巻、1513〜1523頁(1979)〕によりプ
ラスミドDNAを調製した。
【0026】得られたプラスミドDNAを制限酵素Ec
oRI、SalIで切断し、アガロースゲル電気泳動を
行った後、ラベルしたDNAプローブとサザン(Son
thern)ハイブリダイゼーション〔ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー (J.Mol.B
iol)、98巻、503〜517頁(1975)〕を
行った。その結果、EcoRI、SalI切断で生成す
る約3.6KbのDNA断片にDNAプローブが強くハ
イブリダイズすることが見出された。なお分離された3
株は同一のプラスミドを有することが示され、GDHク
ローンの候補としてこのプラスミドをpGDA1と命名
した。
oRI、SalIで切断し、アガロースゲル電気泳動を
行った後、ラベルしたDNAプローブとサザン(Son
thern)ハイブリダイゼーション〔ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー (J.Mol.B
iol)、98巻、503〜517頁(1975)〕を
行った。その結果、EcoRI、SalI切断で生成す
る約3.6KbのDNA断片にDNAプローブが強くハ
イブリダイズすることが見出された。なお分離された3
株は同一のプラスミドを有することが示され、GDHク
ローンの候補としてこのプラスミドをpGDA1と命名
した。
【0027】(8) GDHクローンの同定とDNA
塩基配列の決定 プラスミドpGDA1よりEcoRI、Sau3AI切
断により生成する930bpのDNA断片についてサン
ガー(Sanger)らの方法〔プロシーディングス・
オブ・ナショナル・アカデミー・サイエンス・ユーエス
エー(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S
.A.)、74巻、5463〜5467頁(1977)
〕に従ってDNA塩基配列を決定した。
塩基配列の決定 プラスミドpGDA1よりEcoRI、Sau3AI切
断により生成する930bpのDNA断片についてサン
ガー(Sanger)らの方法〔プロシーディングス・
オブ・ナショナル・アカデミー・サイエンス・ユーエス
エー(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S
.A.)、74巻、5463〜5467頁(1977)
〕に従ってDNA塩基配列を決定した。
【0028】その結果、上記工程(2)で得られたGD
Hのアミノ基末端アミノ酸配列に完全に一致するアミノ
酸配列をコードする塩基配列が見出され、この断片がG
DH遺伝子の一部を含むことが明らかになった。プラス
ミドpGDA1については、制限酵素切断の結果にもと
づいて図1に表される制限酵素地図を作成した。すでに
決定された塩基配列から遺伝子読取り方向の下流部位の
DNA塩基配列を決定したところ、配列番号:4に示さ
れる261個のアミノ酸よりなる蛋白質をコードする塩
基配列が存在することが示された。
Hのアミノ基末端アミノ酸配列に完全に一致するアミノ
酸配列をコードする塩基配列が見出され、この断片がG
DH遺伝子の一部を含むことが明らかになった。プラス
ミドpGDA1については、制限酵素切断の結果にもと
づいて図1に表される制限酵素地図を作成した。すでに
決定された塩基配列から遺伝子読取り方向の下流部位の
DNA塩基配列を決定したところ、配列番号:4に示さ
れる261個のアミノ酸よりなる蛋白質をコードする塩
基配列が存在することが示された。
【0029】以上の結果によりプラスミドpGDA1中
のバチルス・メガテリウムIWG3由来のDNA断片中
にはGDHの構造遺伝子が完全に含まれているものと推
定される。
のバチルス・メガテリウムIWG3由来のDNA断片中
にはGDHの構造遺伝子が完全に含まれているものと推
定される。
【0030】(9) GDH遺伝子の発現クローニン
グされたGDH遺伝子を大腸菌で発現させるためにプラ
スミドpGDA1中のバチルス・メガテリウムIWG3
由来のDNA断片から、以下に示す工程に従い遺伝子の
発現を試みた。
グされたGDH遺伝子を大腸菌で発現させるためにプラ
スミドpGDA1中のバチルス・メガテリウムIWG3
由来のDNA断片から、以下に示す工程に従い遺伝子の
発現を試みた。
【0031】プラスミドpGDA1 10μgをEc
oRI及びPvuIIで切断し、1%アガロース電気泳
動に供し、約1.5Kbの大きさの断片を回収した。得
られた断片1μgにdATP、dGTP、dCTP、d
TTPを終濃度各1mM、DNAポリメラーゼクレノウ
フラグメント(Klenow fragment)4
単位を加え、10mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5
)、7mM MgCl2、1mMジチオスレイトール
の反応液20μl中で、30℃、20分間反応させた。 これにより両端が平滑末端にされたDNA断片を精製し
、その約0.5μgにPstIリンカーとT4DNAリ
ガーゼ10単位を加え、66mMトリス−塩酸緩衝液(
pH7.5)、5mM MgCl2、5mMジチオス
レイトール、1mM ATPの反応液20μl中で、
14℃、一夜反応させた。反応後DNA断片を精製し、
BanIIで切断後、この断片にマングビーンヌクレア
ーゼ(Mung bean nuclease)1
単位を加え、40mM酢酸ナトリウム(PH4.5)、
100mM NaCl、2mM ZnCl2、10
%グリセロールの反応液50μl中で、30℃、30分
間反応させた。この操作によりBanIIの突出末端を
平滑末端にし、さらに上述したのと同様の方法でEco
RIリンカーを連結した。反応後DNA断片を精製し、
EcoRIとPstIで両端を切断し、EcoRI−P
stI断片として回収した。
oRI及びPvuIIで切断し、1%アガロース電気泳
動に供し、約1.5Kbの大きさの断片を回収した。得
られた断片1μgにdATP、dGTP、dCTP、d
TTPを終濃度各1mM、DNAポリメラーゼクレノウ
フラグメント(Klenow fragment)4
単位を加え、10mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5
)、7mM MgCl2、1mMジチオスレイトール
の反応液20μl中で、30℃、20分間反応させた。 これにより両端が平滑末端にされたDNA断片を精製し
、その約0.5μgにPstIリンカーとT4DNAリ
ガーゼ10単位を加え、66mMトリス−塩酸緩衝液(
pH7.5)、5mM MgCl2、5mMジチオス
レイトール、1mM ATPの反応液20μl中で、
14℃、一夜反応させた。反応後DNA断片を精製し、
BanIIで切断後、この断片にマングビーンヌクレア
ーゼ(Mung bean nuclease)1
単位を加え、40mM酢酸ナトリウム(PH4.5)、
100mM NaCl、2mM ZnCl2、10
%グリセロールの反応液50μl中で、30℃、30分
間反応させた。この操作によりBanIIの突出末端を
平滑末端にし、さらに上述したのと同様の方法でEco
RIリンカーを連結した。反応後DNA断片を精製し、
EcoRIとPstIで両端を切断し、EcoRI−P
stI断片として回収した。
【0032】本実施例に用いられる発現用ベクターpK
K223−3は、ブロシウス (Brosius.J
.)ら〔プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカ
デミー・サイエンス・ユーエスエー(Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.)、81巻、69
29〜6933頁(1984)〕により報告されたもの
であり、プロモーターとしてtacプロモーターを有し
ている。
K223−3は、ブロシウス (Brosius.J
.)ら〔プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカ
デミー・サイエンス・ユーエスエー(Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.)、81巻、69
29〜6933頁(1984)〕により報告されたもの
であり、プロモーターとしてtacプロモーターを有し
ている。
【0033】この発現ベクターpKK223−3を制限
酵素EcoRIとPstIで切断した後、回収したEc
oRI−PstI断片と混合し、T4DNAリガーゼで
結合反応を行わせた。その反応液を用いてエシエリヒア
・コリJM105を形質転換し、アンピシリン50μg
/ml、イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシ
ド(IPTG)を含むL−ブロス寒天培地上で生育して
くるコロニーを選択した。
酵素EcoRIとPstIで切断した後、回収したEc
oRI−PstI断片と混合し、T4DNAリガーゼで
結合反応を行わせた。その反応液を用いてエシエリヒア
・コリJM105を形質転換し、アンピシリン50μg
/ml、イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシ
ド(IPTG)を含むL−ブロス寒天培地上で生育して
くるコロニーを選択した。
【0034】得られたコロニーについてGDHの発現を
確認するために、色素共役法を用いたコロニーアッセイ
を行った。コロニーをろ紙上にレプリカし、50mMト
リス−塩酸(pH7.5)、10mM EDTA緩衝
液にリゾチームを1mg/mlの濃度に調整したリゾチ
ーム溶液をろ紙上のコロニーに加え、30℃、20分間
保温後、1%トリトン溶液を加え室温で5分間放置した
。 さらに熱処理用の緩衝液[50mMリン酸緩衝液(pH
6.5)、2M−NaCl、50mM−EDTA〕を加
え、60℃、20分間熱処理を行った。
確認するために、色素共役法を用いたコロニーアッセイ
を行った。コロニーをろ紙上にレプリカし、50mMト
リス−塩酸(pH7.5)、10mM EDTA緩衝
液にリゾチームを1mg/mlの濃度に調整したリゾチ
ーム溶液をろ紙上のコロニーに加え、30℃、20分間
保温後、1%トリトン溶液を加え室温で5分間放置した
。 さらに熱処理用の緩衝液[50mMリン酸緩衝液(pH
6.5)、2M−NaCl、50mM−EDTA〕を加
え、60℃、20分間熱処理を行った。
【0035】次に基質混合液〔20mMトリス−塩酸(
pH8.0)、1M−NaCl、100mMグルコース
、0.5mMフェナジンエトサルフェート(PES)、
0.5mM 3−(4′,5′−ジメチルチアゾール
−2−イール−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロ
マイド(MTT)、50μM−NAD〕を加え、37℃
、5分間暗所にて放置する。対照実験として上記基質混
合液中のグルコースを除いたものを用いた。反応の停止
は、10%酢酸溶液を加えることにより行った。コロニ
ーの選択は、コロニーが青紫色に変化したものを選んだ
。コロニーアッセイの結果、多数の陽性コロニーを得、
この中の1株からプラスミドDNAを抽出し、これをp
GDA2と命名し、制限酵素による切断で予想される構
造、図2を確認した。
pH8.0)、1M−NaCl、100mMグルコース
、0.5mMフェナジンエトサルフェート(PES)、
0.5mM 3−(4′,5′−ジメチルチアゾール
−2−イール−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロ
マイド(MTT)、50μM−NAD〕を加え、37℃
、5分間暗所にて放置する。対照実験として上記基質混
合液中のグルコースを除いたものを用いた。反応の停止
は、10%酢酸溶液を加えることにより行った。コロニ
ーの選択は、コロニーが青紫色に変化したものを選んだ
。コロニーアッセイの結果、多数の陽性コロニーを得、
この中の1株からプラスミドDNAを抽出し、これをp
GDA2と命名し、制限酵素による切断で予想される構
造、図2を確認した。
【0036】なお、本プラスミドをエシエリヒア・コリ
JM105へ形質転換により導入してGDH高発現株エ
シエリヒア・コリJM105/pGDA2を得た。本菌
株は工業技術院微生物工業技術研究所にFERM B
P−2584として寄託されている。 形質転換体Bの調製
JM105へ形質転換により導入してGDH高発現株エ
シエリヒア・コリJM105/pGDA2を得た。本菌
株は工業技術院微生物工業技術研究所にFERM B
P−2584として寄託されている。 形質転換体Bの調製
【0037】バチルス・メガテリウムIWG3にかえて
バチルス・メガテリウムIAM1030を用い、上記の
形質転換体■の調製の(1)〜(9)と同様に操作し、
高GDH発現プラスミドDNAを抽出し、pGDA3と
命名した。次いで本プラスミドを形質転換してGDH高
発現株エシエリヒア・コリJM105/pGDA3を得
た。
バチルス・メガテリウムIAM1030を用い、上記の
形質転換体■の調製の(1)〜(9)と同様に操作し、
高GDH発現プラスミドDNAを抽出し、pGDA3と
命名した。次いで本プラスミドを形質転換してGDH高
発現株エシエリヒア・コリJM105/pGDA3を得
た。
【0038】なお、バチルス・メガテリウムIAM10
30より得られたGDHのアミノ酸配列(配列番号:5
)は、配列番号:4で示されたバチルス・メガテリウム
IWG3由来GDHのDNAアミノ酸配列と比較してそ
のN末端より22位のセリンがアラニンに、43位のア
スパラギン酸がグルタミン酸に、79位のアラニンがセ
リンにそして95位のロイシンがメチオニンにそれぞれ
置き換わったにすぎないことがわかった。
30より得られたGDHのアミノ酸配列(配列番号:5
)は、配列番号:4で示されたバチルス・メガテリウム
IWG3由来GDHのDNAアミノ酸配列と比較してそ
のN末端より22位のセリンがアラニンに、43位のア
スパラギン酸がグルタミン酸に、79位のアラニンがセ
リンにそして95位のロイシンがメチオニンにそれぞれ
置き換わったにすぎないことがわかった。
【0039】即ちバチルス・メガテリウム由来GDHを
コードするDNAのアミノ酸配列は(配列番号:1)に
要約される。バチルス・メガテリウムIWG3由来GD
HのDNAのN末端より96位、252位及び253位
のアミノ酸に対応する塩基配列の変換
コードするDNAのアミノ酸配列は(配列番号:1)に
要約される。バチルス・メガテリウムIWG3由来GD
HのDNAのN末端より96位、252位及び253位
のアミノ酸に対応する塩基配列の変換
【0040】部位特異的変換手法〔ゾーラーら(M.Z
oller、M.Smith)、ヌクレイック・アシド
・リサーチ(Nucleic Acids Res
.)、10巻、6487頁(1982)〕を用いてGD
H遺伝子のN末端より96位に対応する塩基配列GAA
(グルタミン酸)をGTA(バリン)に変換した変異遺
伝子(以下、E96V遺伝子という。)を調製した。 更にN末端より96位に対応する塩基配列GAA(グル
タミン酸)をAAA(リシン)に変換した変異遺伝子(
以下、E96K遺伝子という。)を調製した。次いで2
52位に対応する塩基配列CAG(グルタミン)をCT
G(ロイシン)に、253位に対応する塩基配列TAC
(チロシン)をGAA(グルタミン酸)に変換して変異
遺伝子(以下、Q252L−Y253E遺伝子という。 )を調製した。
oller、M.Smith)、ヌクレイック・アシド
・リサーチ(Nucleic Acids Res
.)、10巻、6487頁(1982)〕を用いてGD
H遺伝子のN末端より96位に対応する塩基配列GAA
(グルタミン酸)をGTA(バリン)に変換した変異遺
伝子(以下、E96V遺伝子という。)を調製した。 更にN末端より96位に対応する塩基配列GAA(グル
タミン酸)をAAA(リシン)に変換した変異遺伝子(
以下、E96K遺伝子という。)を調製した。次いで2
52位に対応する塩基配列CAG(グルタミン)をCT
G(ロイシン)に、253位に対応する塩基配列TAC
(チロシン)をGAA(グルタミン酸)に変換して変異
遺伝子(以下、Q252L−Y253E遺伝子という。 )を調製した。
【0041】更にE96K遺伝子を含む形質転換体及び
Q252L−Y253E遺伝子を含む形質転換体を用い
た読みとりわく中にただ1箇所存在する制限酵素部位を
用いた組換え法を用いて96位、252位及び253位
を変換した変異型酵素遺伝子(以下、E96K−Q25
2L−Y253E遺伝子という。)を得た。
Q252L−Y253E遺伝子を含む形質転換体を用い
た読みとりわく中にただ1箇所存在する制限酵素部位を
用いた組換え法を用いて96位、252位及び253位
を変換した変異型酵素遺伝子(以下、E96K−Q25
2L−Y253E遺伝子という。)を得た。
【0042】変異二本鎖遺伝子断片の調製前記の各変異
処理DNA(E96V遺伝子、Q252L−Y253E
遺伝子及びE96K−Q252L−Y253E遺伝子)
10μgに10倍濃度の逆転写酵素用緩衝液〔70mM
トリス塩酸緩衝液(pH7.5),70mM塩化マグネ
シウム,0.5M塩化ナトリウム,20mMジチオスレ
イトール〕10μlと20pmolのプライマーを含む
溶液2μlと蒸留水74μlを加えて85℃,5分間,
40℃,15分間保温した後、10mMのdNTP
13μlと逆転写酵素1μl(20単位)を加えて37
℃で反応を行った。1時間後フェノール抽出を行った後
エタノール沈澱を行い、沈澱物を溶解後、制限酵素Ec
oRI,PstIで分解し、アガロースゲル電気泳動を
行い、ゲルより変異二本鎖遺伝子断片を常法に従い回収
した。
処理DNA(E96V遺伝子、Q252L−Y253E
遺伝子及びE96K−Q252L−Y253E遺伝子)
10μgに10倍濃度の逆転写酵素用緩衝液〔70mM
トリス塩酸緩衝液(pH7.5),70mM塩化マグネ
シウム,0.5M塩化ナトリウム,20mMジチオスレ
イトール〕10μlと20pmolのプライマーを含む
溶液2μlと蒸留水74μlを加えて85℃,5分間,
40℃,15分間保温した後、10mMのdNTP
13μlと逆転写酵素1μl(20単位)を加えて37
℃で反応を行った。1時間後フェノール抽出を行った後
エタノール沈澱を行い、沈澱物を溶解後、制限酵素Ec
oRI,PstIで分解し、アガロースゲル電気泳動を
行い、ゲルより変異二本鎖遺伝子断片を常法に従い回収
した。
【0043】耐熱化GDH遺伝子保持株の選択前工程に
より得られた変異二本鎖遺伝子断片を発現ベクターpK
K223のEcoRI,PstI切断部位へ組み込み、
大腸菌エシエリヒア・コリJM103を形質転換した。 シャーレ培地上に生育したコロニーについて、ろ紙を用
いるレプリカプリント法により酵素活性を調べた。ろ紙
上に強い発色が認められた菌株をマスタープレートから
鈎菌する。
より得られた変異二本鎖遺伝子断片を発現ベクターpK
K223のEcoRI,PstI切断部位へ組み込み、
大腸菌エシエリヒア・コリJM103を形質転換した。 シャーレ培地上に生育したコロニーについて、ろ紙を用
いるレプリカプリント法により酵素活性を調べた。ろ紙
上に強い発色が認められた菌株をマスタープレートから
鈎菌する。
【0044】次に上記方法により選択された菌株を各々
2XTY培地5mlに接種して37℃,18時間振盪培
養を行なった。集菌洗浄後、菌体懸濁液を超音波処理し
、遠心分離を行って上清液を得た。
2XTY培地5mlに接種して37℃,18時間振盪培
養を行なった。集菌洗浄後、菌体懸濁液を超音波処理し
、遠心分離を行って上清液を得た。
【0045】変異酵素遺伝子の塩基配列決定と変異の同
定 変異酵素遺伝子保持株よりプラスミドDNAを調製し、
常法に従って遺伝子断片の塩基配列の決定を行い、変異
点を明らかにし、酵素蛋白質のアミノ酸配列上の変化を
確認した。
定 変異酵素遺伝子保持株よりプラスミドDNAを調製し、
常法に従って遺伝子断片の塩基配列の決定を行い、変異
点を明らかにし、酵素蛋白質のアミノ酸配列上の変化を
確認した。
【0046】即ち、バチルス・メガテリウムIWG3由
来GDH天然型DNAのアミノ酸配列のN末端より96
位のグルタミン酸がバリンに変化した改良型組換えDN
AであるpGDA2F−30、252位のグルタミンが
ロイシンに、253位のチロシンがグルタミン酸に変化
した改良型組換えDNAであるpGDA2F−40、同
じくN末端より96位のグルタミン酸がアラニンに、2
52位のグルタミンがロイシンに、更に253位のチロ
シンがグルタミン酸に変化した改良型組換えDNAであ
るpGDA2F−50の各改良型組換えDNAが得られ
た。
来GDH天然型DNAのアミノ酸配列のN末端より96
位のグルタミン酸がバリンに変化した改良型組換えDN
AであるpGDA2F−30、252位のグルタミンが
ロイシンに、253位のチロシンがグルタミン酸に変化
した改良型組換えDNAであるpGDA2F−40、同
じくN末端より96位のグルタミン酸がアラニンに、2
52位のグルタミンがロイシンに、更に253位のチロ
シンがグルタミン酸に変化した改良型組換えDNAであ
るpGDA2F−50の各改良型組換えDNAが得られ
た。
【0047】次いで各プラスミドでエシエリヒア・コリ
JM103を形質転換して得られた各形質転換体(エシ
エリヒア・コリJM103/pGDA2F−30、エシ
エリヒア・コリJM103/pGDA2F−40及びエ
シエリヒア・コリJM103/pGDA2F−50)に
ついて2XTYブロス培地で37℃,18時間培養し、
集菌後、菌体懸濁液を超音波処理し、遠心分離後、得ら
れた上澄液をDEAE−セファロースカラムクロマトグ
ラフィーで電気泳動的に均一まで精製した。この酵素に
ついて以下の試験を行った。
JM103を形質転換して得られた各形質転換体(エシ
エリヒア・コリJM103/pGDA2F−30、エシ
エリヒア・コリJM103/pGDA2F−40及びエ
シエリヒア・コリJM103/pGDA2F−50)に
ついて2XTYブロス培地で37℃,18時間培養し、
集菌後、菌体懸濁液を超音波処理し、遠心分離後、得ら
れた上澄液をDEAE−セファロースカラムクロマトグ
ラフィーで電気泳動的に均一まで精製した。この酵素に
ついて以下の試験を行った。
【0048】エシエリヒア・コリJM103/pGDA
2F−50より得られたGDHを、各緩衝液中において
2MのNaClの存在下および非存在下の条件で、30
℃、20分間処理したときのpH安定性を検討した(p
H4〜6は75mM酢酸緩衛液、pH6〜7.5および
pH11〜12は75mMリン酸緩衝液、pH7.5〜
8.5は75mMトリスー塩酸緩衝液、PH8.5〜1
0.5は75mMグリシン−NaOH緩衝液を使用)。 その結果を、図4に示す。
2F−50より得られたGDHを、各緩衝液中において
2MのNaClの存在下および非存在下の条件で、30
℃、20分間処理したときのpH安定性を検討した(p
H4〜6は75mM酢酸緩衛液、pH6〜7.5および
pH11〜12は75mMリン酸緩衝液、pH7.5〜
8.5は75mMトリスー塩酸緩衝液、PH8.5〜1
0.5は75mMグリシン−NaOH緩衝液を使用)。 その結果を、図4に示す。
【0049】エシエリヒア・コリJM103/pGDA
2F−50より得られたGDHを、各温度においてNa
Cl非存在下の条件で、50mMリン酸緩衝液(pH6
.5)中で20分間処理したときの温度安定性を検討し
た。その結果を図5に示す。
2F−50より得られたGDHを、各温度においてNa
Cl非存在下の条件で、50mMリン酸緩衝液(pH6
.5)中で20分間処理したときの温度安定性を検討し
た。その結果を図5に示す。
【0050】エシエリヒア・コリJM103/pGDA
2F−40より得られたGDHを、各温度においてNa
Cl非存在下の条件で、50mMリン酸緩衝液(pH6
.5)中で20分間処理したときの温度安定性を検討し
た。その結果も図5に示す。
2F−40より得られたGDHを、各温度においてNa
Cl非存在下の条件で、50mMリン酸緩衝液(pH6
.5)中で20分間処理したときの温度安定性を検討し
た。その結果も図5に示す。
【0051】図3、図4および図5より明らかのように
、GDHをコードするアミノ酸配列で示される特定のア
ミノ酸、即ちN末端より96位のグルタミン酸がアラニ
ンに、252位のグルタミンがロイシンに更に253位
のチロシンがグルタミン酸に置換することによって、イ
オン強度が低い場合において、どのpHにおいても活性
を保持し、さらに天然型と比較して熱にも安定なGDH
が生産されることがわかる。
、GDHをコードするアミノ酸配列で示される特定のア
ミノ酸、即ちN末端より96位のグルタミン酸がアラニ
ンに、252位のグルタミンがロイシンに更に253位
のチロシンがグルタミン酸に置換することによって、イ
オン強度が低い場合において、どのpHにおいても活性
を保持し、さらに天然型と比較して熱にも安定なGDH
が生産されることがわかる。
【0052】図5より明らかなように96位のグルタミ
ン酸がバリンに置換することによって、天然型と比較し
てGDHの耐熱性が向上することがわかる。
ン酸がバリンに置換することによって、天然型と比較し
てGDHの耐熱性が向上することがわかる。
【0053】更に、252位のグルタミンがロイシンに
、253位のチロシンがグルタミン酸に置換することに
よって、天然型と比較してGDHの耐熱性が向上するこ
とがわかる。
、253位のチロシンがグルタミン酸に置換することに
よって、天然型と比較してGDHの耐熱性が向上するこ
とがわかる。
【0054】形質転換体エシエリヒア・コリをアンピシ
リン50μg/mlを含む2XTYブロス100mlに
植菌し、37℃で13時間振盪培養後、IPTG(終濃
度0.1mM)を添加して2時間後に遠心分離により集
菌し、2MのNaClを含む50mMリン酸塩緩衝液(
pH6.5)で洗浄後、10mlの同緩衝液に懸濁し、
超音波破砕機により破砕後、遠心分離して上清液を得た
。一方、対照としてバチルス・メガテリウムIWG3を
2XTYブロス100mlに植菌し、37℃,24時間
振盪培養した。次に上記と同様に集菌し、洗浄後、超音
波破砕処理した後、遠心分離し、その上清を酵素液とし
た。
リン50μg/mlを含む2XTYブロス100mlに
植菌し、37℃で13時間振盪培養後、IPTG(終濃
度0.1mM)を添加して2時間後に遠心分離により集
菌し、2MのNaClを含む50mMリン酸塩緩衝液(
pH6.5)で洗浄後、10mlの同緩衝液に懸濁し、
超音波破砕機により破砕後、遠心分離して上清液を得た
。一方、対照としてバチルス・メガテリウムIWG3を
2XTYブロス100mlに植菌し、37℃,24時間
振盪培養した。次に上記と同様に集菌し、洗浄後、超音
波破砕処理した後、遠心分離し、その上清を酵素液とし
た。
【0055】GDHの酵素活性は以下の方法にしたがっ
て測定した。D−グルコース 0.1M、NAD
20mMを含む75mMトリス塩酸緩衝液に酵素液を加
えて光度計セル内にて30℃で反応させ、340nmに
おける吸光度の増大を測定する。反応の1分間に1μm
oleのNADHを生成する酵素活性を1単位と定め、
比活性は酵素液中の蛋白質1mg当りの単位数として示
した。
て測定した。D−グルコース 0.1M、NAD
20mMを含む75mMトリス塩酸緩衝液に酵素液を加
えて光度計セル内にて30℃で反応させ、340nmに
おける吸光度の増大を測定する。反応の1分間に1μm
oleのNADHを生成する酵素活性を1単位と定め、
比活性は酵素液中の蛋白質1mg当りの単位数として示
した。
【0056】その結果、エシエリヒア・コリJM103
/pGDA2F−50より得られたGDHの比活性(p
H6.5)は2MのNaCl存在下では12.7u/m
gを示し、非存在下では9.20u/mgを示した。つ
まリ、エシエリヒア・コリJM103/pGDA2F−
50より生産されたGDHはイオン強度に関係なく四量
体で存在して活性を示すものと考えられる。
/pGDA2F−50より得られたGDHの比活性(p
H6.5)は2MのNaCl存在下では12.7u/m
gを示し、非存在下では9.20u/mgを示した。つ
まリ、エシエリヒア・コリJM103/pGDA2F−
50より生産されたGDHはイオン強度に関係なく四量
体で存在して活性を示すものと考えられる。
【0057】エシエリヒア・コリJM103/pGDA
2F−40より得られたGDHの比活性は2MのNaC
l存在下では7.67u/mgを示し、非存在下では0
.96u/mgを示した。つまりエシエリヒア・コリJ
M103/pGDA2F−40より生産されたGDHは
イオン強度の低い状態では解離して活性を示さないもの
と考えられる。
2F−40より得られたGDHの比活性は2MのNaC
l存在下では7.67u/mgを示し、非存在下では0
.96u/mgを示した。つまりエシエリヒア・コリJ
M103/pGDA2F−40より生産されたGDHは
イオン強度の低い状態では解離して活性を示さないもの
と考えられる。
【0058】バチルス・メガテリウムIWG3より得ら
れたGDHの比活性(pH6.5)は2MのNaCl存
在下及び非存在下のいずれにおいても510u/mgを
示した。しかし、pH9.0における非活性は2MのN
aCl存在下では475u/mgを示したが、非存在下
では活性を示さなかった。つまリバチルス・メガテリウ
ムIWG3より生産されたGDHはイオン強度の低い状
態では解離して活性を示さないものと考えられる。
れたGDHの比活性(pH6.5)は2MのNaCl存
在下及び非存在下のいずれにおいても510u/mgを
示した。しかし、pH9.0における非活性は2MのN
aCl存在下では475u/mgを示したが、非存在下
では活性を示さなかった。つまリバチルス・メガテリウ
ムIWG3より生産されたGDHはイオン強度の低い状
態では解離して活性を示さないものと考えられる。
【0059】バチルス・メガテリウムIWG3に代えて
、バチルス・メガテリウムIAM1030を用いて同様
にして形質転換体を得、GDHを生産したところ、上記
と同様の結果となった。
、バチルス・メガテリウムIAM1030を用いて同様
にして形質転換体を得、GDHを生産したところ、上記
と同様の結果となった。
【0060】
【発明の効果】本発明は、バチルス・メガテリウム由来
のGDHをコードするDNAのアミノ酸配列で示される
特定位置のアミノ酸を、他のアミノ酸で置き換えて得ら
れる改良型DNAをを提供し、更にGDH高発現用ベク
ターに組み込んだ大腸菌内で複製可能な改良型組換えD
NAを含む形質転換体を培養することによって、イオン
強度に影響されずどのpHにおいても四量体の形で存在
し、さらに熱にも安定なGDHを安価に大量に供給する
ことを可能としたものである。
のGDHをコードするDNAのアミノ酸配列で示される
特定位置のアミノ酸を、他のアミノ酸で置き換えて得ら
れる改良型DNAをを提供し、更にGDH高発現用ベク
ターに組み込んだ大腸菌内で複製可能な改良型組換えD
NAを含む形質転換体を培養することによって、イオン
強度に影響されずどのpHにおいても四量体の形で存在
し、さらに熱にも安定なGDHを安価に大量に供給する
ことを可能としたものである。
【0061】
【0062】
【0064】
【0065】
【図1】プラスミドpGDA1の制限酵素地図を示すも
のである。
のである。
【図2】プラスミドpGDA2の制限酵素地図を示すも
のである。
のである。
【図3】改良型組換えDNAであるpGDA2F−40
を組み込んだ形質転換体を培養することによって生産さ
れるGDHのpH安定性を示すものである。図中におい
て、−−は2MのNaCl存在下での結果を示し、−●
−はNaClの非存在下での結果を示す。
を組み込んだ形質転換体を培養することによって生産さ
れるGDHのpH安定性を示すものである。図中におい
て、−−は2MのNaCl存在下での結果を示し、−●
−はNaClの非存在下での結果を示す。
【図4】改良型組換えDNAであるpGDA2F−50
を組み込んだ形質転換体を培養することによって生産さ
れるGDHのpH安定性を示すものである。図中におい
て、−−は2M NaClの存在下での結果を示し、
−●−はNaClの非存在下での結果を示す。
を組み込んだ形質転換体を培養することによって生産さ
れるGDHのpH安定性を示すものである。図中におい
て、−−は2M NaClの存在下での結果を示し、
−●−はNaClの非存在下での結果を示す。
【図5】改良型組換えDNAであるpGDA2F−30
,pGDA2F−40及びpGDA2F−50を組み込
んだ形質転換体を培養することによって生産されるGD
Hの温度安定性を示すものである。図中において、−■
−はバチルス・メガテリウムIWG3より得られたGD
Hを示し、−□−はpGDA2F−30の場合を示し、
−●−はpGDA2F−40の場合を示し−−はpGD
A2F−50の場合を示す。
,pGDA2F−40及びpGDA2F−50を組み込
んだ形質転換体を培養することによって生産されるGD
Hの温度安定性を示すものである。図中において、−■
−はバチルス・メガテリウムIWG3より得られたGD
Hを示し、−□−はpGDA2F−30の場合を示し、
−●−はpGDA2F−40の場合を示し−−はpGD
A2F−50の場合を示す。
Claims (5)
- 【請求項1】 配列表の配列番号:1で示されるバチ
ルス・メガテリウム由来のグルコースデヒドロゲナーゼ
をコードするDNAのN末端から96位のグルタミン酸
をバリンに置換し、大腸菌導入ベクターに組み込んだ大
腸菌内で複製可能な組換えDNA。 - 【請求項2】 配列表の配列番号:1で示されるバチ
ルス・メガテリウム由来のグルコースデヒドロゲナーゼ
をコードするDNAのN末端から252位のグルタミン
をロイシンに、253位のチロシンをグルタミン酸に置
換し、大腸菌導入ベクターに組み込んだ大腸菌内で複製
可能な組換えDNA。 - 【請求項3】 配列表の配列番号:1で示されるバチ
ルス・メガテリウム由来のグルコースデヒドロゲナーゼ
をコードするDNAのN末端から96位のグルタミン酸
をリシンに、252位のグルタミンをロイシンに、25
3位のチロシンをグルタミン酸に置換し、大腸菌導入ベ
クターに組み込んだ大腸菌内で複製可能な組換えDNA
。 - 【請求項4】 請求項1、請求項2又は請求項3の組
換えDNAを導入したエシエリヒア・コリ。 - 【請求項5】 請求項4の形質転換体を栄養培地で培
養し、グルコースデヒドロゲナーゼを培養物中に産生せ
しめ、該培養物中よりグルコースデヒドロゲナーゼを採
取することを特徴とするグルコースデヒドロゲナーゼの
製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10692791A JP3220471B2 (ja) | 1991-02-13 | 1991-02-13 | 組換えdna、それを含む形質転換体及びそれを用い たグルコースデヒドロゲナーゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10692791A JP3220471B2 (ja) | 1991-02-13 | 1991-02-13 | 組換えdna、それを含む形質転換体及びそれを用い たグルコースデヒドロゲナーゼの製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH04258293A true JPH04258293A (ja) | 1992-09-14 |
JP3220471B2 JP3220471B2 (ja) | 2001-10-22 |
Family
ID=14446047
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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JP10692791A Expired - Fee Related JP3220471B2 (ja) | 1991-02-13 | 1991-02-13 | 組換えdna、それを含む形質転換体及びそれを用い たグルコースデヒドロゲナーゼの製造法 |
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