JPH04258293A - 組換えｄｎａ、それを含む形質転換体及びそれを用い たグルコースデヒドロゲナーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、バチルス・メガテリウ
ム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来
のグルコースデヒドロゲナーゼ（以下「ＧＤＨ」という
。）をコードするＤＮＡのアミノ酸配列で示される特定
の位置のアミノ酸を他のアミノ酸で置換することによっ
て得られる改良型ＤＮＡを大腸菌用ＤＮＡ導入ベクター
に組み込んだ大腸菌内で複製可能な改良型組換えＤＮＡ
、それを含む形質転換体及びそれを用いるＧＤＨの製造
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＧＤＨ〔ＥＣ　　１．１．１．４７〕は
、グルコース定量用酵素として臨床検査及び食品工業の
分野において重要な酵素として使用されている。従来、
ＧＤＨを生産する微生物としては、バチルス・メガテリ
ウム、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｃｅ
ｒｅｕｓ）等のバチルス属菌が知られている（特開昭５
３−１３７１９９号）。

【０００３】バチルス・メガテリウム由来のＧＤＨは分
子量約３０，０００の同一サブユニットからなる四量体
酵素として知られている。ＧＤＨはアルカリ側では可逆
的に解離して失活する性質を有している。しかし、イオ
ン強度が高いときは失活しないことが知られている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながらグルコー
ス測定用酵素としてＧＤＨを使用するためには、より安
定性に優れた性質を持つことが望まれ、更にイオン強度
が低い場合においてもｐＨによる影響を受けにくく、熱
に対しても安定性の優れたＧＤＨをより安価に製造する
ことが望まれていた。

【０００５】最近になってバチルス・メガテリウム由来
のＧＤＨ遺伝子を大腸菌に組み入れた組換え体を用いた
ＧＤＨの生産方法が開示された〔ヨーロピアン・ジャー
ナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．）１７４巻、４８５〜４９０、（１９８８）
〕。

【０００６】しかし、バチルス・メガテリウム由来のＧ
ＤＨ遺伝子は複数個存在することが示され、それらを用
いて形質転換体を得、ＧＤＨを生産しているが、使用し
ているベクターはＧＤＨの大量生産には向かないもので
あり、かつＧＤＨをより安定化するための改良は何らな
されていないのであった。

【０００７】本発明者らは、既にＧＤＨをより安価に製
造するため、バチルス・メガテリウム由来のＧＤＨ遺伝
子を高発現ベクターｐＫＫ２２３−３に組み入れて形質
転換体を得、該形質転換体を栄養培地で培養することに
よってＧＤＨを高生産することに成功し、さらに検討し
てバチルス・メガテリウム由来のＧＤＨをコードするＤ
ＮＡのアミノ酸配列で示される特定の位置のアミノ酸を
他のアミノ酸で置換して得られる改良型ＤＮＡを大腸菌
に組み入れた形質転換体を栄養培地で培養したところ、
培養物中に従来のＧＤＨより熱安定性に優れたＧＤＨを
大量に製造せしめることに成功している（特開平２−８
６７７９）。

【０００８】

【課題を解決するための手段・作用】本発明は前記発明
について更に検討を重ね、一組の特定のアミノ酸を他の
一組の特定のアミノ酸に置換することによって得られる
ＤＮＡを大腸菌に組み入れた形質転換体を栄養培地で培
養したところ、熱安定性に優れたＧＤＨを製造すること
ができること、更にどのｐＨにおいても四量体の形で存
在し、熱にも安定なＧＤＨを製造することができること
を見いだして本発明を完成した。

【０００９】バチルス・メガテリウム由来のＧＤＨ組換
えＤＮＡを調製するためには、まずＧＤＨをコードする
組換えＤＮＡを調製する必要がある。そのために使用す
る菌株としては、ＧＤＨ生産能を有するバチルス・メガ
テリウムであればいずれのものも使用できるが、好まし
くはバチルス・メガテリウムＩＡＭ１０３０及び土壌か
ら分離されたバチルス・メガテリウムＩＷＧ３を用いる
のがよい。

【００１０】このうち土壌から得られた菌株のバチルス
・メガテリウムＩＷＧ３は以下のようにして同定された
ものである。

【００１１】菌学的諸性質の試験は、ルース・イー・ゴ
ードン著，ザ・ジーナス・バチルス（Ｒｕｔｈ　　Ｅ．
Ｇｏｒｄｏｎ：Ｔｈｅ　　Ｇｅｎｕｓ　　Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ（１９７３）〕に準拠し、分類方法はバージェイス
・マニュアル・オブ・ディタミネイティブ・バクテリオ
ロジー （Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　　Ｍａｎｕａｌ　　ｏｆ　　Ｄｅ
ｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
）（第８版）及び前記のＴｈｅ　　Ｇｅｎｕｓ　　Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓによった。

【００１２】Ａ．形態 （１）　　細胞の大きさは１．１〜１．６μ×３．０〜
５．０μで桿菌である。またグルコース栄養培地（ｇｌ
ｕｃｏｓｅｎｕｔｒｉｅｎｔ　　ａｇａｒ）で生育した
細胞をフクシンで染めると細胞内は粒状である。 （２）　　運動性はない。 （３）　　胞子を形成し、大きさは１．０〜１．３μ×
２．０〜２．５μで、卵形ないしは円柱形である。胞子
のうは膨らまない。中立ないしは準端立である。 （４）　　グラム染色性は陽性である。

【００１３】Ｂ・生理学的性質 （１）　　　　硝酸塩の還元：陰性 （２）　　　　脱窒反応　　　　：陰性（３）　　　　
ＶＰテスト　　：陰性。ブロスのｐＨは７日間の培養で
４．６〜５．０である。 （４）　　　　インドールの生成：陰性（５）　　　　
デンプンの加水分解：陰性（６）　　　　クエン酸塩の
利用：陽性（７）　　　　無機窒素源の利用：アンモニ
ウム塩と硝酸塩を共に利用する。 （８）　　　　色素の生成：チロシン培地で茶褐色の水
溶性色素を生成する。 （９）　　　　ウレアーゼ：弱陽性 （１０）　　カタラーゼ：陽性 （１１）　　酸素に対する態度：好気性（１２）　　糖
類からの酸及びガスの生成：アラビノース，キシロース
，グルコース，フラクトース，ガラクトース，マルトー
ス，シュクロース，ラクトース，トレハロース，マンニ
ット，イノシット，グリセリン，デンプンから酸を生成
するが、ガスは生成しない。マンノース，ソルビットか
らは酸もガスも生成しない。 （１３）　　７％　　ＮａＣｌ培地での生育：生育しな
い（１４）　　４５℃における生育：生育する（１５）
　　６５℃における生育：生育しない（１６）　　サブ
ロー・デキストローズ（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ　　ｄｅｘ
ｔｒｏｓｅ）培地における生育：生育する（１７）　　
フェニルアラニンのデアミネーション：陽性（１８）　
　ゼラチンの液化性：陽性 （１９）　　カゼインの分解性：陽性 （２０）　　チロシンの分解性：陽性 （２１）　　卵黄反応：陰性

【００１４】以上の諸性質をバージェイス・マニュアル
・オブ・ディタミネイティブ・バクテリオロジー（第８
版）の分類方法にしたがって検索すると、本菌株はグラ
ム陽性の好気性桿菌で胞子を形成するのでバチルス属に
分類される。

【００１５】種については、 （１）　　栄養細胞の大きさが１．０〜１．６μ×３．
０〜５．０μであり、グルコース培地で細胞内が粒状で
ある。 （２）　　胞子のうが膨らまないこと、胞子形成部位は
中央部ないしはやや末端よりである。 （３）　　グルコースから酸を生成すること、ＶＰテス
トが陰性である。 （４）　　嫌気条件下では生育しない。 （５）　　サブロー・デキストローズ（Ｓａｂｏｕｒａ
ｕｄ　　ｄｅｘｔｒｏｓｅ）培地で生育する。 （６）　　アラビノース、キシロース、マンニットから
酸を生成する。 （７）　　卵黄反応が陰性である。 こと等の性質からバチルス・メガテリウムと同定され、
本発明者らは、本菌株をバチルス・メガテリウムＩＷＧ
３と命名した。

【００１６】以下、実施例を記載しながら本発明を詳述
する。

【実施例】

【００１７】形質転換体Ａの調製 （１）　　ＧＤＨの精製 バチルス・メガテリウムＩＷＧ３を２ＸＴＹブロスに植
菌し、培養後集菌し、菌体破砕後、遠心分離して得られ
る上清液を脱塩濃縮後、凍結乾燥して得られたＧＤＨ粗
酵素粉末１０５μｇをグリセロール１０％含有イミダゾ
ール緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ６．５）１５ｍｌに溶解し
、ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０に吸着させた後、
食塩濃度勾配（０．１Ｍ−０．５Ｍ）により溶出させ、
活性画分を集め脱塩濃縮する。次にＴＳＫ−ゲルＤＥＡ
Ｅ−３−ＳＷを担体とする高速液体クロマトグラフィー
により分子量分画を行い、さらにＴＳＫ−ゲル　　Ｇ３
０００−ＳＷを担体とする高速液体クロマトグラフィー
により吸着溶離して電気泳動的に均一な活性画分（蛋白
質量として約５ｍｇ）を得た。

【００１８】（２）　　ＧＤＨのアミノ基末端アミノ酸
配列の決定 前記（１）により得た精製酵素蛋白質のアミノ基末端ア
ミノ酸配列をＡＢＩ〔アプライド・バイオシステム（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）〕社製ペプチド
シーケンサーＧａｓ　　Ｐｈａｓｅ　　４７０Ａにより
分析し、Ｎ末端より２９アミノ酸残基の配列（配列番号
：２）を決定した。尚、下線部はプローブ合成に用いら
れた配列を示す。

【００１９】（３）　　ＤＮＡプローブの合成前記アミ
ノ酸配列（配列番号：２）から下線で示した１ヶ所の配
列を選択し、これらのアミノ酸配列から推定される遺伝
子上の可能なＤＮＡ塩基配列のうち、枯草菌のコドン利
用頻度を参考にしてＤＮＡ塩基配列を推定し、３８ｍｅ
ｒの１種のＤＮＡプローブの塩基配列（配列番号：３）
を決定した。ＤＮＡの合成はＡＢＩ社製でシンセサイザ
ー（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）モデル３８１Ａを用いて
行った。

【００２０】（４）　　バチルス・メガテリウムからの
全ＤＮＡの抽出と切断 斉藤、三浦らの方法〔バイオキミカ・バイオフィジカ・
アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）
、７２巻、６１９頁（１９６３）］に従ってバチルス・
メガテリウムＩＷＧ３から全ＤＮＡを抽出精製した。こ
のＤＮＡ２４０μｇをとり、制限酵素ＥｃｏＲＩ、Ｂｇ
ｌＩＩそれぞれ１５０単位と３７℃、３時間反応させた
。反応液の全量を１％アガロースゲル電気泳動に供し、
３〜４Ｋｂの大きさに相当するＤＮＡを含む部分を切出
して、電気抽出法によりゲルからＤＮＡ断片を溶出させ
た。次いで溶出液を当量のフェノール及びフェノール・
クロロホルムで順次抽出し、得られた水層にエタノール
を添加してＤＮＡを沈澱させた後、ＴＥ緩衝液１００μ
ｌに溶かした。

【００２１】（５）　　ベクターへのＤＮＡ断片の挿入
ベクターとしてはｐＢＲ３２２を用いたが、ＤＮＡ断片
挿入のためには、ｐＢＲ３２２　　２０μｇをＥｃｏＲ
Ｉ−ＢａｍＨＩで完全分解して得られた直鎖状ベクター
ＤＮＡをＴＥ緩衝液２００μｌに溶解して使用した。上
記工程（４）で得られたＤＮＡ断片との結合は、工程（
４）で得られた溶液と直鎖状ベクターＤＮＡ溶液を１０
：１の割合に混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを１４℃で一
夜反応させることにより行った。

【００２２】（６）　　バチルス・メガテリウムのＤＮ
Ａライブラリーの作成 上記工程（５）で得られた組換えＤＮＡを形質転換によ
り宿主大腸菌エシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ　　ｃｏｌｉ）Ｃ６００に導入し、アンピシリン５
０μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス寒天培地上で生育してき
たコロニーを集めてバチルス・メガテリウムＩＷＧ３の
ＤＮＡライブラリーと称した。

【００２３】（７）　　ＤＮＡライブラリーからＧＤＨ
クローンの選択・分離 上記工程（３）で得られたＤＮＡプローブを各々イング
リア（Ｉｎｇｌｉａ）らの方法〔ヌクレイック・アシッ
ド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　ＡｃｉｄｓＲｅｓ．
）、９巻、１６２７〜１６４２頁（１９８２）〕に従っ
てＴ４ポリヌクレオチドキナーゼとγ−３２Ｐ−ＡＴＰ
を用いてラベルした。

【００２４】次に前記工程（６）で得られた大腸菌をア
ンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス寒天培地上
でコロニーとして生育させ、これをレプリカ法によって
、アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）ナイロンメンブラ
ンへ移し、リゾチーム溶菌し、アルカリでＤＮＡ変性さ
せ、塩酸による中和処理を行った後、前記プローブとハ
イブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーション
は６倍濃度のＳＳＣ（０．１５Ｍ　　ＮａＣｌ、０．０
１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、５倍濃度の
デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）液（０．０２％フィコ
ール，０．０２％ポリビニルピロリドン，０．０２％牛
血清アルブミン）、０．５％ＳＤＳ、牛胸腺ＤＮＡ２０
μｇ／ｍｌ（終濃度）及びラベルしたＤＮＡプローブ約
５×１０５ｃｐｍ／ｍｌを用いてプレハイブリダイゼー
ションを４５℃、３時間行った後、４５℃、一夜のハイ
ブリダイゼーションを行った。

【００２５】この後、５倍濃度のＳＳＣを用いて４５℃
で２回、つづいて５倍濃度のＳＳＣ（０．１％ＳＤＳを
含む）を用いて４５℃で２回、４倍濃度のＳＳＣで２回
ナイロンメンブランを洗浄した。この後ナイロンメンブ
ランを乾燥させ、オートラジオグラフィー（条件：−８
０℃、一夜）に供した。その結果、ハイブリダイゼーシ
ョン陽性のコロニーが３つ見出された。そこで陽性のコ
ロニーについて液体培養をした後、バーンボイム（Ｂｉ
ｒｎｂｏｉｍ）らの方法〔ヌクレイック・アシッド・リ
サーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ．）
、７巻、１５１３〜１５２３頁（１９７９）〕によりプ
ラスミドＤＮＡを調製した。

【００２６】得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ、ＳａｌＩで切断し、アガロースゲル電気泳動を
行った後、ラベルしたＤＮＡプローブとサザン（Ｓｏｎ
ｔｈｅｒｎ）ハイブリダイゼーション〔ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー　　（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ）、９８巻、５０３〜５１７頁（１９７５）〕を
行った。その結果、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ切断で生成す
る約３．６ＫｂのＤＮＡ断片にＤＮＡプローブが強くハ
イブリダイズすることが見出された。なお分離された３
株は同一のプラスミドを有することが示され、ＧＤＨク
ローンの候補としてこのプラスミドをｐＧＤＡ１と命名
した。

【００２７】（８）　　ＧＤＨクローンの同定とＤＮＡ
塩基配列の決定 プラスミドｐＧＤＡ１よりＥｃｏＲＩ、Ｓａｕ３ＡＩ切
断により生成する９３０ｂｐのＤＮＡ断片についてサン
ガー（Ｓａｎｇｅｒ）らの方法〔プロシーディングス・
オブ・ナショナル・アカデミー・サイエンス・ユーエス
エー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ
．Ａ．）、７４巻、５４６３〜５４６７頁（１９７７）
〕に従ってＤＮＡ塩基配列を決定した。

【００２８】その結果、上記工程（２）で得られたＧＤ
Ｈのアミノ基末端アミノ酸配列に完全に一致するアミノ
酸配列をコードする塩基配列が見出され、この断片がＧ
ＤＨ遺伝子の一部を含むことが明らかになった。プラス
ミドｐＧＤＡ１については、制限酵素切断の結果にもと
づいて図１に表される制限酵素地図を作成した。すでに
決定された塩基配列から遺伝子読取り方向の下流部位の
ＤＮＡ塩基配列を決定したところ、配列番号：４に示さ
れる２６１個のアミノ酸よりなる蛋白質をコードする塩
基配列が存在することが示された。

【００２９】以上の結果によりプラスミドｐＧＤＡ１中
のバチルス・メガテリウムＩＷＧ３由来のＤＮＡ断片中
にはＧＤＨの構造遺伝子が完全に含まれているものと推
定される。

【００３０】（９）　　ＧＤＨ遺伝子の発現クローニン
グされたＧＤＨ遺伝子を大腸菌で発現させるためにプラ
スミドｐＧＤＡ１中のバチルス・メガテリウムＩＷＧ３
由来のＤＮＡ断片から、以下に示す工程に従い遺伝子の
発現を試みた。

【００３１】プラスミドｐＧＤＡ１　　１０μｇをＥｃ
ｏＲＩ及びＰｖｕＩＩで切断し、１％アガロース電気泳
動に供し、約１．５Ｋｂの大きさの断片を回収した。得
られた断片１μｇにｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＴＴＰを終濃度各１ｍＭ、ＤＮＡポリメラーゼクレノウ
フラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ　　ｆｒａｇｍｅｎｔ）４
単位を加え、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５
）、７ｍＭ　　ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール
の反応液２０μｌ中で、３０℃、２０分間反応させた。 これにより両端が平滑末端にされたＤＮＡ断片を精製し
、その約０．５μｇにＰｓｔＩリンカーとＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ１０単位を加え、６６ｍＭトリス−塩酸緩衝液（
ｐＨ７．５）、５ｍＭ　　ＭｇＣｌ２、５ｍＭジチオス
レイトール、１ｍＭ　　ＡＴＰの反応液２０μｌ中で、
１４℃、一夜反応させた。反応後ＤＮＡ断片を精製し、
ＢａｎＩＩで切断後、この断片にマングビーンヌクレア
ーゼ（Ｍｕｎｇ　　ｂｅａｎ　　ｎｕｃｌｅａｓｅ）１
単位を加え、４０ｍＭ酢酸ナトリウム（ＰＨ４．５）、
１００ｍＭ　　ＮａＣｌ、２ｍＭ　　ＺｎＣｌ２、１０
％グリセロールの反応液５０μｌ中で、３０℃、３０分
間反応させた。この操作によりＢａｎＩＩの突出末端を
平滑末端にし、さらに上述したのと同様の方法でＥｃｏ
ＲＩリンカーを連結した。反応後ＤＮＡ断片を精製し、
ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで両端を切断し、ＥｃｏＲＩ−Ｐ
ｓｔＩ断片として回収した。

【００３２】本実施例に用いられる発現用ベクターｐＫ
Ｋ２２３−３は、ブロシウス　　（Ｂｒｏｓｉｕｓ．Ｊ
．）ら〔プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカ
デミー・サイエンス・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）、８１巻、６９
２９〜６９３３頁（１９８４）〕により報告されたもの
であり、プロモーターとしてｔａｃプロモーターを有し
ている。

【００３３】この発現ベクターｐＫＫ２２３−３を制限
酵素ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで切断した後、回収したＥｃ
ｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで
結合反応を行わせた。その反応液を用いてエシエリヒア
・コリＪＭ１０５を形質転換し、アンピシリン５０μｇ
／ｍｌ、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド（ＩＰＴＧ）を含むＬ−ブロス寒天培地上で生育して
くるコロニーを選択した。

【００３４】得られたコロニーについてＧＤＨの発現を
確認するために、色素共役法を用いたコロニーアッセイ
を行った。コロニーをろ紙上にレプリカし、５０ｍＭト
リス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ緩衝
液にリゾチームを１ｍｇ／ｍｌの濃度に調整したリゾチ
ーム溶液をろ紙上のコロニーに加え、３０℃、２０分間
保温後、１％トリトン溶液を加え室温で５分間放置した
。 さらに熱処理用の緩衝液［５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
６．５）、２Ｍ−ＮａＣｌ、５０ｍＭ−ＥＤＴＡ〕を加
え、６０℃、２０分間熱処理を行った。

【００３５】次に基質混合液〔２０ｍＭトリス−塩酸（
ｐＨ８．０）、１Ｍ−ＮａＣｌ、１００ｍＭグルコース
、０．５ｍＭフェナジンエトサルフェート（ＰＥＳ）、
０．５ｍＭ　　３−（４′，５′−ジメチルチアゾール
−２−イール−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロ
マイド（ＭＴＴ）、５０μＭ−ＮＡＤ〕を加え、３７℃
、５分間暗所にて放置する。対照実験として上記基質混
合液中のグルコースを除いたものを用いた。反応の停止
は、１０％酢酸溶液を加えることにより行った。コロニ
ーの選択は、コロニーが青紫色に変化したものを選んだ
。コロニーアッセイの結果、多数の陽性コロニーを得、
この中の１株からプラスミドＤＮＡを抽出し、これをｐ
ＧＤＡ２と命名し、制限酵素による切断で予想される構
造、図２を確認した。

【００３６】なお、本プラスミドをエシエリヒア・コリ
ＪＭ１０５へ形質転換により導入してＧＤＨ高発現株エ
シエリヒア・コリＪＭ１０５／ｐＧＤＡ２を得た。本菌
株は工業技術院微生物工業技術研究所にＦＥＲＭ　　Ｂ
Ｐ−２５８４として寄託されている。 形質転換体Ｂの調製

【００３７】バチルス・メガテリウムＩＷＧ３にかえて
バチルス・メガテリウムＩＡＭ１０３０を用い、上記の
形質転換体■の調製の（１）〜（９）と同様に操作し、
高ＧＤＨ発現プラスミドＤＮＡを抽出し、ｐＧＤＡ３と
命名した。次いで本プラスミドを形質転換してＧＤＨ高
発現株エシエリヒア・コリＪＭ１０５／ｐＧＤＡ３を得
た。

【００３８】なお、バチルス・メガテリウムＩＡＭ１０
３０より得られたＧＤＨのアミノ酸配列（配列番号：５
）は、配列番号：４で示されたバチルス・メガテリウム
ＩＷＧ３由来ＧＤＨのＤＮＡアミノ酸配列と比較してそ
のＮ末端より２２位のセリンがアラニンに、４３位のア
スパラギン酸がグルタミン酸に、７９位のアラニンがセ
リンにそして９５位のロイシンがメチオニンにそれぞれ
置き換わったにすぎないことがわかった。

【００３９】即ちバチルス・メガテリウム由来ＧＤＨを
コードするＤＮＡのアミノ酸配列は（配列番号：１）に
要約される。バチルス・メガテリウムＩＷＧ３由来ＧＤ
ＨのＤＮＡのＮ末端より９６位、２５２位及び２５３位
のアミノ酸に対応する塩基配列の変換

【００４０】部位特異的変換手法〔ゾーラーら（Ｍ．Ｚ
ｏｌｌｅｒ、Ｍ．Ｓｍｉｔｈ）、ヌクレイック・アシド
・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ
．）、１０巻、６４８７頁（１９８２）〕を用いてＧＤ
Ｈ遺伝子のＮ末端より９６位に対応する塩基配列ＧＡＡ
（グルタミン酸）をＧＴＡ（バリン）に変換した変異遺
伝子（以下、Ｅ９６Ｖ遺伝子という。）を調製した。 更にＮ末端より９６位に対応する塩基配列ＧＡＡ（グル
タミン酸）をＡＡＡ（リシン）に変換した変異遺伝子（
以下、Ｅ９６Ｋ遺伝子という。）を調製した。次いで２
５２位に対応する塩基配列ＣＡＧ（グルタミン）をＣＴ
Ｇ（ロイシン）に、２５３位に対応する塩基配列ＴＡＣ
（チロシン）をＧＡＡ（グルタミン酸）に変換して変異
遺伝子（以下、Ｑ２５２Ｌ−Ｙ２５３Ｅ遺伝子という。 ）を調製した。

【００４１】更にＥ９６Ｋ遺伝子を含む形質転換体及び
Ｑ２５２Ｌ−Ｙ２５３Ｅ遺伝子を含む形質転換体を用い
た読みとりわく中にただ１箇所存在する制限酵素部位を
用いた組換え法を用いて９６位、２５２位及び２５３位
を変換した変異型酵素遺伝子（以下、Ｅ９６Ｋ−Ｑ２５
２Ｌ−Ｙ２５３Ｅ遺伝子という。）を得た。

【００４２】変異二本鎖遺伝子断片の調製前記の各変異
処理ＤＮＡ（Ｅ９６Ｖ遺伝子、Ｑ２５２Ｌ−Ｙ２５３Ｅ
遺伝子及びＥ９６Ｋ−Ｑ２５２Ｌ−Ｙ２５３Ｅ遺伝子）
１０μｇに１０倍濃度の逆転写酵素用緩衝液〔７０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５），７０ｍＭ塩化マグネ
シウム，０．５Ｍ塩化ナトリウム，２０ｍＭジチオスレ
イトール〕１０μｌと２０ｐｍｏｌのプライマーを含む
溶液２μｌと蒸留水７４μｌを加えて８５℃，５分間，
４０℃，１５分間保温した後、１０ｍＭのｄＮＴＰ　　
１３μｌと逆転写酵素１μｌ（２０単位）を加えて３７
℃で反応を行った。１時間後フェノール抽出を行った後
エタノール沈澱を行い、沈澱物を溶解後、制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ，ＰｓｔＩで分解し、アガロースゲル電気泳動を
行い、ゲルより変異二本鎖遺伝子断片を常法に従い回収
した。

【００４３】耐熱化ＧＤＨ遺伝子保持株の選択前工程に
より得られた変異二本鎖遺伝子断片を発現ベクターｐＫ
Ｋ２２３のＥｃｏＲＩ，ＰｓｔＩ切断部位へ組み込み、
大腸菌エシエリヒア・コリＪＭ１０３を形質転換した。 シャーレ培地上に生育したコロニーについて、ろ紙を用
いるレプリカプリント法により酵素活性を調べた。ろ紙
上に強い発色が認められた菌株をマスタープレートから
鈎菌する。

【００４４】次に上記方法により選択された菌株を各々
２ＸＴＹ培地５ｍｌに接種して３７℃，１８時間振盪培
養を行なった。集菌洗浄後、菌体懸濁液を超音波処理し
、遠心分離を行って上清液を得た。

【００４５】変異酵素遺伝子の塩基配列決定と変異の同
定 変異酵素遺伝子保持株よりプラスミドＤＮＡを調製し、
常法に従って遺伝子断片の塩基配列の決定を行い、変異
点を明らかにし、酵素蛋白質のアミノ酸配列上の変化を
確認した。

【００４６】即ち、バチルス・メガテリウムＩＷＧ３由
来ＧＤＨ天然型ＤＮＡのアミノ酸配列のＮ末端より９６
位のグルタミン酸がバリンに変化した改良型組換えＤＮ
ＡであるｐＧＤＡ２Ｆ−３０、２５２位のグルタミンが
ロイシンに、２５３位のチロシンがグルタミン酸に変化
した改良型組換えＤＮＡであるｐＧＤＡ２Ｆ−４０、同
じくＮ末端より９６位のグルタミン酸がアラニンに、２
５２位のグルタミンがロイシンに、更に２５３位のチロ
シンがグルタミン酸に変化した改良型組換えＤＮＡであ
るｐＧＤＡ２Ｆ−５０の各改良型組換えＤＮＡが得られ
た。

【００４７】次いで各プラスミドでエシエリヒア・コリ
ＪＭ１０３を形質転換して得られた各形質転換体（エシ
エリヒア・コリＪＭ１０３／ｐＧＤＡ２Ｆ−３０、エシ
エリヒア・コリＪＭ１０３／ｐＧＤＡ２Ｆ−４０及びエ
シエリヒア・コリＪＭ１０３／ｐＧＤＡ２Ｆ−５０）に
ついて２ＸＴＹブロス培地で３７℃，１８時間培養し、
集菌後、菌体懸濁液を超音波処理し、遠心分離後、得ら
れた上澄液をＤＥＡＥ−セファロースカラムクロマトグ
ラフィーで電気泳動的に均一まで精製した。この酵素に
ついて以下の試験を行った。

【００４８】エシエリヒア・コリＪＭ１０３／ｐＧＤＡ
２Ｆ−５０より得られたＧＤＨを、各緩衝液中において
２ＭのＮａＣｌの存在下および非存在下の条件で、３０
℃、２０分間処理したときのｐＨ安定性を検討した（ｐ
Ｈ４〜６は７５ｍＭ酢酸緩衛液、ｐＨ６〜７．５および
ｐＨ１１〜１２は７５ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．５〜
８．５は７５ｍＭトリスー塩酸緩衝液、ＰＨ８．５〜１
０．５は７５ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液を使用）。 その結果を、図４に示す。

【００４９】エシエリヒア・コリＪＭ１０３／ｐＧＤＡ
２Ｆ−５０より得られたＧＤＨを、各温度においてＮａ
Ｃｌ非存在下の条件で、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６
．５）中で２０分間処理したときの温度安定性を検討し
た。その結果を図５に示す。

【００５０】エシエリヒア・コリＪＭ１０３／ｐＧＤＡ
２Ｆ−４０より得られたＧＤＨを、各温度においてＮａ
Ｃｌ非存在下の条件で、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６
．５）中で２０分間処理したときの温度安定性を検討し
た。その結果も図５に示す。

【００５１】図３、図４および図５より明らかのように
、ＧＤＨをコードするアミノ酸配列で示される特定のア
ミノ酸、即ちＮ末端より９６位のグルタミン酸がアラニ
ンに、２５２位のグルタミンがロイシンに更に２５３位
のチロシンがグルタミン酸に置換することによって、イ
オン強度が低い場合において、どのｐＨにおいても活性
を保持し、さらに天然型と比較して熱にも安定なＧＤＨ
が生産されることがわかる。

【００５２】図５より明らかなように９６位のグルタミ
ン酸がバリンに置換することによって、天然型と比較し
てＧＤＨの耐熱性が向上することがわかる。

【００５３】更に、２５２位のグルタミンがロイシンに
、２５３位のチロシンがグルタミン酸に置換することに
よって、天然型と比較してＧＤＨの耐熱性が向上するこ
とがわかる。

【００５４】形質転換体エシエリヒア・コリをアンピシ
リン５０μｇ／ｍｌを含む２ＸＴＹブロス１００ｍｌに
植菌し、３７℃で１３時間振盪培養後、ＩＰＴＧ（終濃
度０．１ｍＭ）を添加して２時間後に遠心分離により集
菌し、２ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸塩緩衝液（
ｐＨ６．５）で洗浄後、１０ｍｌの同緩衝液に懸濁し、
超音波破砕機により破砕後、遠心分離して上清液を得た
。一方、対照としてバチルス・メガテリウムＩＷＧ３を
２ＸＴＹブロス１００ｍｌに植菌し、３７℃，２４時間
振盪培養した。次に上記と同様に集菌し、洗浄後、超音
波破砕処理した後、遠心分離し、その上清を酵素液とし
た。

【００５５】ＧＤＨの酵素活性は以下の方法にしたがっ
て測定した。Ｄ−グルコース　　０．１Ｍ、ＮＡＤ　　
２０ｍＭを含む７５ｍＭトリス塩酸緩衝液に酵素液を加
えて光度計セル内にて３０℃で反応させ、３４０ｎｍに
おける吸光度の増大を測定する。反応の１分間に１μｍ
ｏｌｅのＮＡＤＨを生成する酵素活性を１単位と定め、
比活性は酵素液中の蛋白質１ｍｇ当りの単位数として示
した。

【００５６】その結果、エシエリヒア・コリＪＭ１０３
／ｐＧＤＡ２Ｆ−５０より得られたＧＤＨの比活性（ｐ
Ｈ６．５）は２ＭのＮａＣｌ存在下では１２．７ｕ／ｍ
ｇを示し、非存在下では９．２０ｕ／ｍｇを示した。つ
まリ、エシエリヒア・コリＪＭ１０３／ｐＧＤＡ２Ｆ−
５０より生産されたＧＤＨはイオン強度に関係なく四量
体で存在して活性を示すものと考えられる。

【００５７】エシエリヒア・コリＪＭ１０３／ｐＧＤＡ
２Ｆ−４０より得られたＧＤＨの比活性は２ＭのＮａＣ
ｌ存在下では７．６７ｕ／ｍｇを示し、非存在下では０
．９６ｕ／ｍｇを示した。つまりエシエリヒア・コリＪ
Ｍ１０３／ｐＧＤＡ２Ｆ−４０より生産されたＧＤＨは
イオン強度の低い状態では解離して活性を示さないもの
と考えられる。

【００５８】バチルス・メガテリウムＩＷＧ３より得ら
れたＧＤＨの比活性（ｐＨ６．５）は２ＭのＮａＣｌ存
在下及び非存在下のいずれにおいても５１０ｕ／ｍｇを
示した。しかし、ｐＨ９．０における非活性は２ＭのＮ
ａＣｌ存在下では４７５ｕ／ｍｇを示したが、非存在下
では活性を示さなかった。つまリバチルス・メガテリウ
ムＩＷＧ３より生産されたＧＤＨはイオン強度の低い状
態では解離して活性を示さないものと考えられる。

【００５９】バチルス・メガテリウムＩＷＧ３に代えて
、バチルス・メガテリウムＩＡＭ１０３０を用いて同様
にして形質転換体を得、ＧＤＨを生産したところ、上記
と同様の結果となった。

【００６０】

【発明の効果】本発明は、バチルス・メガテリウム由来
のＧＤＨをコードするＤＮＡのアミノ酸配列で示される
特定位置のアミノ酸を、他のアミノ酸で置き換えて得ら
れる改良型ＤＮＡをを提供し、更にＧＤＨ高発現用ベク
ターに組み込んだ大腸菌内で複製可能な改良型組換えＤ
ＮＡを含む形質転換体を培養することによって、イオン
強度に影響されずどのｐＨにおいても四量体の形で存在
し、さらに熱にも安定なＧＤＨを安価に大量に供給する
ことを可能としたものである。

【配列表】

【００６１】

【００６２】

【００６４】

【００６５】

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＧＤＡ１の制限酵素地図を示すも
のである。

【図２】プラスミドｐＧＤＡ２の制限酵素地図を示すも
のである。

【図３】改良型組換えＤＮＡであるｐＧＤＡ２Ｆ−４０
を組み込んだ形質転換体を培養することによって生産さ
れるＧＤＨのｐＨ安定性を示すものである。図中におい
て、−−は２ＭのＮａＣｌ存在下での結果を示し、−●
−はＮａＣｌの非存在下での結果を示す。

【図４】改良型組換えＤＮＡであるｐＧＤＡ２Ｆ−５０
を組み込んだ形質転換体を培養することによって生産さ
れるＧＤＨのｐＨ安定性を示すものである。図中におい
て、−−は２Ｍ　　ＮａＣｌの存在下での結果を示し、
−●−はＮａＣｌの非存在下での結果を示す。

【図５】改良型組換えＤＮＡであるｐＧＤＡ２Ｆ−３０
，ｐＧＤＡ２Ｆ−４０及びｐＧＤＡ２Ｆ−５０を組み込
んだ形質転換体を培養することによって生産されるＧＤ
Ｈの温度安定性を示すものである。図中において、−■
−はバチルス・メガテリウムＩＷＧ３より得られたＧＤ
Ｈを示し、−□−はｐＧＤＡ２Ｆ−３０の場合を示し、
−●−はｐＧＤＡ２Ｆ−４０の場合を示し−−はｐＧＤ
Ａ２Ｆ−５０の場合を示す。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　配列表の配列番号：１で示されるバチ
   ルス・メガテリウム由来のグルコースデヒドロゲナーゼ
   をコードするＤＮＡのＮ末端から９６位のグルタミン酸
   をバリンに置換し、大腸菌導入ベクターに組み込んだ大
   腸菌内で複製可能な組換えＤＮＡ。
2. 【請求項２】　　配列表の配列番号：１で示されるバチ
   ルス・メガテリウム由来のグルコースデヒドロゲナーゼ
   をコードするＤＮＡのＮ末端から２５２位のグルタミン
   をロイシンに、２５３位のチロシンをグルタミン酸に置
   換し、大腸菌導入ベクターに組み込んだ大腸菌内で複製
   可能な組換えＤＮＡ。
3. 【請求項３】　　配列表の配列番号：１で示されるバチ
   ルス・メガテリウム由来のグルコースデヒドロゲナーゼ
   をコードするＤＮＡのＮ末端から９６位のグルタミン酸
   をリシンに、２５２位のグルタミンをロイシンに、２５
   ３位のチロシンをグルタミン酸に置換し、大腸菌導入ベ
   クターに組み込んだ大腸菌内で複製可能な組換えＤＮＡ
   。
4. 【請求項４】　　請求項１、請求項２又は請求項３の組
   換えＤＮＡを導入したエシエリヒア・コリ。
5. 【請求項５】　　請求項４の形質転換体を栄養培地で培
   養し、グルコースデヒドロゲナーゼを培養物中に産生せ
   しめ、該培養物中よりグルコースデヒドロゲナーゼを採
   取することを特徴とするグルコースデヒドロゲナーゼの
   製造法。