JPH0425020B2

JPH0425020B2 -

Info

Publication number: JPH0425020B2
Application number: JP59198998A
Authority: JP
Inventors: Masahiro Hizuka; Kaneo Suzuki; Shigeo Yasugi; Junpei Enami
Original assignee: Nitta Gelatin Inc
Current assignee: Nitta Gelatin Inc
Priority date: 1984-09-22
Filing date: 1984-09-22
Publication date: 1992-04-28
Also published as: JPS6176161A

Description

【発明の詳細な説明】

〔技術分野〕この発明は、細胞培養や医用材料などに用いら
れるコラーゲンの滅菌法に関する。〔背景技術〕コラーゲンは、ホ乳類はじめ動物界に広く分布
しており、それから取り出されて各種用途に利用
されている。その用途には、たとえば、細胞培養
用基質、人工皮膚、止血剤などがあり、生体また
は細胞と直接接触するような使われ方が多い。こ
のため、コラーゲンの乾燥物（固体）、溶液を問
わず、無菌であるか、滅菌することが要求され
る。従来、コラーゲンの滅菌法として、コラーゲンの溶液を0.20〜0.45μｍのメンブ
ランフイルターで濾過滅菌する、乾燥状態のコラーゲンを放射線照射したり、
ガスを用いたりして滅菌する、の２方法が行われていた。ところが、の濾過滅菌法では、熱が加わらな
いという利点があるけれども、ウイルスの除去が
できないうえに、コラーゲン分子の会合体が細菌
などとともに除去されるため、濾過後のコラーゲ
ン濃度が減少し、ロスが生じるという欠点があつ
た。また、の放射線滅菌、ガス滅菌では、コラ
ーゲンの部分的な架橋反応が生じるため、コラー
ゲンを溶解するのが困難になるという欠点があつ
た。ガス滅菌では、さらに、ガスの残留という問
題も生じうる。〔発明の目的〕この発明は、以上のことに鑑みて、コラーゲン
の特性を損なわずにコラーゲンを完全に滅菌する
方法を提供することを目的とする。〔発明の開示〕この発明は、上記の目的を達成するために、コ
ラーゲンを滅菌するにあたり、コラーゲンを溶液
にした状態下で紫外線を照射することを特徴とす
るコラーゲンを滅菌法を要旨としている。以下、
この発明について詳しく説明する。コラーゲンの種類としては、コラーゲンタイプ
〜が知られており、この発明で用いるコラー
ゲンは、主にコラーゲンタイプである。その原
料としては、たとえば、牛皮、牛腱、豚皮、豚
腱、ラツトの尾腱などがあげられるが、これらに
限定されない。このような原料からコラーゲンを
取り出すには、公知の処理法によればよい。その
例をあげると、原料を洗浄、脱脂、脱灰、微細化
したのち、酸の溶液中に分散し（あるいは、分散
したのち、微細化し）、そのまま、酸可溶性コラ
ーゲンを抽出し、精製して回収したり、あるい
は、酸の溶液中に分散したあと、酸性で活性なプ
ロテアーゼを加えて可溶化したコラーゲンを抽出
し、精製して回収したりする方法があるが、これ
らに限定されない。精製したコラーゲンを塩酸な
どの溶液に溶解すれば、コラーゲンの溶液が得ら
れる。あるいは、原料を処理して、直接、精製し
たコラーゲン溶液を得てもよい。この発明において、コラーゲンを紫外線滅菌す
るにあたり、コラーゲンを溶液状態にしているこ
とが重要である。コラーゲンを溶液状態にするの
は、紫外線のエネルギーが小さく、物質への透過
力が小さいからであり、コラーゲンが固体状態で
は、死角（紫外線があたらない部分）が多く、滅
菌が不十分になるからである。ただし、コラーゲ
ンを溶液状態にしても、紫外線の透過率は100％
ではない。透過率が溶質の種類や濃度によつて変
化するため、一概には言えないが、紫外線透過方
向のコラーゲン溶液の厚みは、５mm以下とするの
が殺菌効果の点から好ましい。紫外線透過方向以
外の方向（たとえば紫外線透過方向に垂直な方向
など）の、コラーゲン溶液の広がりは、光源の形
態や滅菌処理に用いる装置の形態などによつて左
右される。たとえば、コラーゲン溶液を薄層にし
て紫外線照射することができるが、これに限定さ
れず適宜に設定すればよい。紫外線は、ガンマ線などの放射線に比べればエ
ネルギーが弱いため、照射したものに対して殺菌
以外の影響をほとんど及ぼさず、操作も簡単であ
る。また、ウイルスも殺菌でき、殺菌の選択性が
比較的少ないことも好都合である。そのため、こ
の発明で、コラーゲンの滅菌に用いることにし
た。紫外線の殺菌作用は、紫外線の全波長域
（1nｍ〜400nｍ）にわたつて有するが、特に強い
殺菌力を示すのは波長が260nｍ近辺のものであ
る。253.7nｍ（ナノメータ、10^-9ｍ）の波長を放
射する水銀ランプが殺菌灯として市販されてお
り、それを光源にすることができる。あるいは、
他の光源を用いてもよく、光源の種類は特に限定
されない。光源の数も、１つで十分な場合、２以
上必要な場合と様々あり、適宜に選択すればよ
い。コラーゲン溶液への紫外線照射も、一方向だ
けでなく、二方向あるいはそれ以上の方向から照
射してもよく、適宜に選択すればよい。ところで、各種微生物の中で、紫外線耐性の最
も強いとされているのがクロカビ
（Aspergillusniger）である。その滅菌には、
4400μW・min／cm²の紫外線照射量が必要とされ
ている。すなわち、コラーゲンを溶液にして紫外
線照射で滅菌するには、4400μW・min／cm²以上
の照射量とすることが好ましい。以上のように、コラーゲンの溶液にした状態下
で紫外線を照射してコラーゲンの滅菌を行えば、
コラーゲンが完全に滅菌され、その特性も損なわ
れない。このようにして滅菌されたコラーゲンは、溶液
状態のまま、あるいは、凍結乾燥法など種々の方
法で乾燥されて、各種の用途に利用される。この
コラーゲン乾燥物は、滅菌前のコラーゲンと同様
の溶解性をもち、再びコラーゲン溶液にすること
ができる。前記の用途を例示すれば、各種の生体
材料、人工皮膚、止血剤、医薬徐法剤、診断薬、
化粧品などがある。また、医用材料のコーテイン
グなど生体親和性を付与する目的で使われたりす
る。なお、コラーゲンの重要な用途の１つに、医学
分野、医薬品開発分野などで使われる細胞培養用
基質がある。動物細胞を培養する方法の一つとし
てコラーゲンゲル内培養と呼ばれる培養法があ
り、この場合に用いられる基質がそれである。こ
の基質は、コラーゲンをゲル化して用いるため、
コラーゲンゲルのゲル強度という特性が重要であ
る。すなわち、細胞が生体内に近い形態で成長増
殖し、分化機能などの本来細胞が持つている性質
を維持しながら細胞培養を行う目的で、コラーゲ
ンゲル内培養をするときに、コラーゲンゲルのゲ
ル強度が影響してくる。コラーゲンゲル内培養は、細胞をコラーゲン溶
液に分散させ、中和したのち、ゲル化させてゲル
中の細胞を分散、維持させて行うものである。こ
のとき、コラーゲンゲルのゲル強度が高く、ゲル
化速度も早くないと（一般に、高ゲル強度になる
コラーゲン溶液は、ゲル化速度も早い。）、細胞が
ゲルの底面に沈降してしまい、コラーゲンゲル中
での細胞培養ができない。また、培養を継続して
いる時に、コラーゲンゲル上の培養液を、たびた
び新しい培養液と換える必要があり、この培養液
の交換時に、コラーゲンゲルのゲル強度が低い
と、除去すべき培養液とともに、ゲルおよび細胞
が廃棄されてしまうおそれがある。さらに、ゲル
強度が低い場合、細胞が増殖していく段階で、コ
ラーゲンゲルが収縮してしまい、細胞の増殖、維
持ができなくなる。このように、細胞培養用基質に使われるコラー
ゲンは、紫外線滅菌で、ゲル強度が実用に耐えな
いほど低下するのは好ましくない。したがつて、
細胞培養用基質に使われるコラーゲンを滅菌する
には、滅菌後のコラーゲン溶液から調整されるコ
ラーゲンゲルのゲル強度が、初期の（滅菌前の）
コラーゲン溶液から調整されるコラーゲンゲルの
ゲル強度より極端に低下しない範囲に、紫外線の
照射量を調節することが好ましい。この発明にコラーゲンの滅菌法の効果を見るた
め、つぎに、実施例および比較例を示す。〔実施例〕 (A) コラーゲン溶液の調整 (A‐1) 酸可溶性ラツト尾腱コラーゲン溶液の調
整よく洗浄、脱脂、脱灰したラツト尾腱を塩
酸溶液（PH2.5）中で、24時間冷却下に撹拌
してコラーゲンを抽出した。この抽出液を遠
心分離して不溶部を除いた後、カ性ソーダ
（水酸化ナトリウム）溶液を加えてPH７に調
整し、一夜放置して生じた沈澱を遠心分離し
て集めた。これを塩酸溶液（PH3.0）に再溶
解し、再び同様に沈澱処理して精製を行つ
た。得られた沈澱を充分に水洗した後、PH３
の塩酸溶液に溶解し、濃度3.0mg／mlの精製
酸可溶性ラツト尾腱コラーゲン溶液を得た。 (A‐2) ペプシン可溶化牛皮コラーゲン溶液の調
整細断した牛皮をよく洗浄、脱脂、脱灰した
後、乾燥牛皮重量の４％量のペプシン（和光
純薬(株)製１：10000）を含む塩酸溶液に膨潤
し、ついで、ホモジナイズして原料牛皮を分
散させた。その後、さらに、15℃で48時間撹
拌を続け、酵素処理を行つた。この処理液を
グラスフイルターで濾過し、不溶部を除いた
後、カ性ソーダ溶液を加えてPH10にして６時
間放置しペプシンを失活させた。つぎに、PH
７に調整し、一夜放置して生じた沈澱を遠心
分離して集めた。得られた沈澱を水洗後、PH
３の塩酸溶液に溶解し、再びPH７にして得ら
れた沈澱を充分に水洗した後、PH３の塩酸溶
液に溶解し、濃度3.0mg／mlの精製ペプシン
可溶化牛皮コラーゲン溶液を得た。 (B) 紫外線照射滅菌処理内径９cmのシヤーレに上記各コラーゲン溶液
を厚みが約２mmになる様に入れ、15W紫外線ラ
ンプ（東芝(株)製殺菌ランプ GL15）を用い、
20cmの距離から紫外線照射を行つた。第１表に示すように紫外線照射量を変えて、
殺菌効果およびゲル強度に与える影響を調べ
た。紫外線照射量は、紫外線強度計UVR−254
（東京光学機械(株)製）を用いて測定した。このように紫外線滅菌した各コラーゲン溶液
を用いて、つぎのようにコラーゲンゲルを調整
し、ゲル強度を測定した。これらの各コラーゲン溶液それぞれ24mlに、
冷却下で、1.4M食塩を含む0.1M−リン酸緩衝
液（PH7.4）３mlおよびカ性ソーダ溶液３mlを
加え、よく混合して最終PHを7.4に調整した後、
37℃で１時間加熱してゲルを形成させた。得られたゲルをレオメーター（URM−
2002D：不動工業社製）で、0.5インチプラン
ジヤー用い、挿入深度10mm、挿入速度20mm／
minの条件でゲル強度を測定した。結果を第１
表に示した。また、上記のように紫外線滅菌した各コラー
ゲン溶液を用いて、つぎに示す一般細菌試験法
により細菌試験を行つた。上記の各コラーゲン溶液１mlをそれぞれ滅菌
したシヤーレに入れ、滅菌済カ性ソーダ溶液で
PH５〜７に中和し、標準寒天倍地溶液（標準寒
天倍地：栄研化学(株)の寒天23.8ｇを１の純水
に溶解し、121℃、20分間オートクレーブして
得る）約20mlを加えてよく混合した後、37℃で
48時間培養して殺菌発生の有（＋）、無（−）
を判定した。結果を第１表に示した。比較例１実施例の（Ａ−１）と同じ、濃度3.0mg／mlの
精製酸可溶性ラツト尾腱コラーゲン溶液用い、こ
のコラーゲン溶液を0.45μｍのメンブランフイル
ターで濾過滅菌を行つた。濾過後、濃度が1.2
mg／mlに低下していた。また、実施例（Ａ−２）と同じ、濃度3.0mg／
mlの精製ペプシン可溶化牛皮コラーゲン溶液を用
い、このコラーゲン溶液を0.45μｍのメンブラン
フイルターで濾過滅菌を行つた。濾過後、濃度が
2.4mg／mlに低下していた。比較例２実施例の（Ａ−１）と同じ、濃度3.0mg／mlの
精製酸可溶性ラツト尾腱コラーゲン溶液をメデイ
ム瓶に入れ密栓し、コバルト60によるガンマ
（γ）線を照射した。第２表に示すように吸収線
量を変えて、殺菌効果およびゲル強度に与える影
響を調べた。比較例２の各コラーゲン溶液を用い、実施例と
同様にしてコラーゲンゲルを調整し、ゲル強度を
測定した。結果を第２表に示した。比較例１の滅
菌処理では、処理後にコラーゲン溶液の濃度が低
下しており、当然ゲル強度も低下するので、ゲル
強度の比較対象にしなかつた。比較例１および２の滅菌済コラーゲン溶液をそ
れぞれ用いて、実施例の場合と同様の一般細菌試
験法により細菌試験を行つた。結果を第２表に示
した。なお、ブランクとして、上記実施例および比較
例で用いた各コラーゲン溶液を滅菌処理せずにそ
のままゲル化させ、上記のようにゲル強度を判定
し、細菌試験を行つた。結果は、第１表に併せて
示した。

【表】

〔発明の効果〕

この発明のコラーゲンの滅菌法は、コラーゲン
を溶液にした状態で紫外線を照射することにより
コラーゲンの滅菌を行うようにしているので、コ
ラーゲンが完全に滅菌され、濾過法によるような
ロス（損失）を生じず、コラーゲンの特性が損な
われない。すなわち、コラーゲンの難溶化が起こ
らず、ゲル強度の低下が実用上問題ない範囲に抑
えられる。この発明のコラーゲンの滅菌法によ
り、滅菌処理されたコラーゲンは、溶液、乾燥物
を問わず上記した各種の用途の優れた材料にな
る。

Claims

【特許請求の範囲】１コラーゲンを滅菌するにあたり、コラーゲン
を溶液にした状態下で紫外線を照射することを特
徴とするコラーゲンの滅菌法。２紫外線の照射は、滅菌後のコラーゲンの溶液
から調整されるコラーゲンゲルのゲル強度が初期
のコラーゲンの溶液から調整されるコラーゲンゲ
ルのゲル強度の80％以上に保たれるような照射量
で行われる特許請求の範囲第１項記載のコラーゲ
ンの滅菌法。