JPH04232465A - 固相イムノアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、一般にイムノアッセイ
法に関する。さらに詳しくは、試料中の抗体の存在を検
出および確認するための改良半自動アッセイシステムに
関する。

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ヒト
免疫系は、種々の抗原に対する抗体を産生することによ
り感染に応答する。産生される抗体の数および各異なる
抗体の量は、感染因子および抗体応答を開始させた特定
の抗原に依存する。

【０００２】感染を測定するために現在市販されている
スクリーニング試験は、抗体の存在を検出するための酵
素イムノアッセイ（ＥＩＡｓ）に基づいている。一般に
、そのような試験では、感染因子の抗原を含む部分精製
溶解液をコーティングしたポリスチレンビーズやマイク
ロタイターウエルなどの固相支持体が利用される。該コ
ーティング固相支持体に試料を接触させ、試料中に存在
し該抗原に特異的な抗体を該固相支持体上に捕捉させ、
かくして抗原−抗体複合体を生成させる。この抗原−抗
体複合体を、シグナルを生成する検出可能な結合体で標
識した第二の抗体と接触させて、抗原−抗体−抗−抗体
複合体を生成させる。試料中の抗体の存在および量は、
該結合体複合体によって生成したシグナルを検出するこ
とにより決定される。しかしながら、上記部分精製溶解
液は、不純物および不釣合いな量の種々の抗原を含んで
いるかもしれず、また重要な抗原性ポリペプチドを欠失
しているかもしれない。これら欠点は、アッセイの感度
および特異性の両方に悪影響を与える。さらに、伝統的
な確認試験のために充分な量の部分精製溶解液を調製す
ることはしばしば困難であり、所望の抗原が欠失してい
ることは精製の問題を大きくする。

【０００３】これらスクリーニング試験はまた、非特異
的な反応性を有することが知られている［たとえば、メ
ネトーブ（Ｊ．Ｅ．Ｍｅｎｅｔｏｖｅ）ら、Ｌａｎｃｅ
ｔ：１２１３（１９８７年１１月２１日）；バーンズ（
Ｄ．Ｂａｒｎｅｓ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３８：８８４〜
８８５（１９８７）；パケット（Ａ．Ｐｕｃｋｅｔｔ）
ら、Ｌａｎｃｅｔ、７１４（１９８８年３月２６日）参
照］。大部分の非特異性は、感染因子の上記溶解液中に
存在する正常ヒト抗原との免疫反応性によるものである
。正常ヒト抗原（細胞タンパク質不純物）は、感染因子
を増殖させるのに使用した組織培養細胞または他の培地
に由来するものであり、部分精製溶解液の主要な構成成
分である。

【０００４】ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の主要な
表面抗原であるｇｐ１２０およびＨＩＶの経膜抗原であ
るｇｐ４１は、ウイルス精製の間に容易に失われる［ゲ
ルダーブラッド（Ｈ．Ｇｅｌｄｅｒｂｌｏｏｄ）ら、Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ１５６：１７１〜１７６（１９８７）］
。それゆえ、これらＨＩＶエンベロープ抗原は、ウイル
ス溶解液中に充分に表されない。

【０００５】従って、現在利用できる認可されたＨＩＶ
のスクリーニング試験で得られた反応性の結果を確証す
るために確認試験が必要となる。そのような確認試験を
行うためのプロトコールには、一般に、スクリーニング
試験を繰り返して反応性の試料を確認し、ついで、これ
ら繰り返し試験した反応性の試料についてウエスタンブ
ロッティング（ＷＢ）試験を行って反応性のスクリーニ
ング結果を確認することが含まれる。ＷＢ試験によって
も反応性である試料は、ＨＩＶ暴露に対して陽性である
とされる。

【０００６】典型的なウエスタンブロッティング試験は
、ゴードン（Ｇｏｒｄｏｎ）らの米国特許第４，４５２
，９０１号に記載されている。この試験では、還元条件
下、ウイルス溶解液の抗原をサイズに基づいてＳＤＳ−
ＰＡＧＥにより分離する。ついで、ゲル中の目に見えな
い抗原バンドを、そのままでニトロセルロースのシート
に電気泳動的に移動させる（トランスブロットさせる）
。ついで、このシートをバンドに直角にストリップにカ
ッティングする。これらストリップを個々の試料と反応
させ、反応性の抗体をスクリーニングアッセイと類似の
ＥＩＡｓにより検出する。得られた発色反応から、試料
が血清陽性である抗原を示す染色バンドのパターンが得
られる。それゆえ、ＷＢ試験は、個々の抗体と反応性の
ウイルス溶解液中の抗原を別々に可視化することができ
るので、スクリーニング試験に比べて有利である。加え
て、バンド間領域の非ウイルス性の反応性を同定し、無
視することができる。

【０００７】伝統的なスクリーニングアッセイに比べて
ウエスタンブロッティング試験が上記利点を有するにも
かかわらず、ＷＢ試験は欠点を有する［たとえば、バイ
バーフェルト（Ｇ．Ｂｉｂｅｒｆｅｌｄ）ら、Ｌａｎｃ
ｅｔ　ｉｉ：２８９〜２９０（１９８６）；バン・デ・
ポエル（Ｃ．Ｌ．Ｖａｎ　ｄｅ　Ｐｏｅｌ）ら、Ｌａｎ
ｃｅｔ　ｉｉ：７５２〜７５４（１９８６）；およびク
ルース（Ａ．Ｍ．Ｃｏｕｒｏｕｃｅ）ら、Ｌａｎｃｅｔ
　ｉｉ：９２１〜９２２（１９８６）参照］。ＷＢ試験
のような伝統的なイムノブロッティング法は、ウイルス
溶解液の抗原濃度が変化するので再現性を欠く。

【０００８】ＷＢ試験は、特にＨＩＶエンベロープ（Ｅ
ＮＶ）抗原に関して感度を欠くことが報告されている［
サー（Ａ．Ｓａａｈ）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．
２５９：１６０５〜１６１０（１９８７）］。本発明者
らは、このことが、一部はウイルスの成熟および精製の
間に主要な表面抗原ｇｐ１２０が優先的に失われること
、一部はｇｐ１２０が還元感受性であるという事実によ
るものであることを観察した。その抗原性は、還元ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥを利用するＷＢ試験において特に減少する
。さらに、血清学的に最も重要なＨＩＶ経膜ＥＮＶ抗原
ｇｐ４１［サムガドハラン（Ｍ．Ｇ．Ｓａｍｇａｄｈａ
ｒａｎ）ら、Ａｎｎ．Ｉｎｓｔ．Ｐａｓｔｅｕｒ／Ｖｉ
ｒｏｌ．１３８：１３３〜１３６（１９８７）］は、変
化する糖付加によりウエスタンブロット上に拡散バンド
を典型的に与える。このバンドは、ｐ２４抗原により生
成したバンドと比較すると極めて弱いものである。さら
に、このｇｐ４１反応性のバンドは、組換えｐ４１抗原
を利用したブロットと比較すると特に弱い。

【０００９】ウエスタンブロッティング試験はまた、多
くの非特異的反応性を与える。これら非特異的反応性は
、真の抗原バンドとしばしば重複するバンドを与える。 たとえば、ｐ２４のみの反応性、ｐ１７のみの反応性、
典型的でないｇｐ４１の反応性、またはｐ７０のみの反
応性は、おそらく偽りの反応性である。

【００１０】さらに、ＷＢ試験は、余分の反応性バンド
を与えるが、これは一部は部分開裂または非開裂のウイ
ルス前駆体タンパク質によるものであり、主要な抗原バ
ンドの間に現れる。これら余分の反応性はまた、ウイル
ス抗原の凝集または分解によるものでもある。たとえば
、ＨＩＶ　ｇｐ１２０バンドは、ｇｐ４１の３量体凝集
物によるものであるかもしれない［ゾラ−パズナー（Ｓ
．Ｚｏｌｌａ−Ｐａｚｎｅｒ）ら、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａ
ｎｄ　Ｊ．Ｍｅｄ．３２０：１８〜１９（１９８９）］
。ＨＩＶ　ｇｐ４１およびｇｐ２４の両方とも、電気泳
動中の還元条件にもかかわらず２量体、３量体および４
量体を生成することが知られている。本発明者らは、モ
ノクローナル抗体を用い、ＨＩＶ　ｇｐ１２０が他の２
つのバンド、ｇｐ８０およびｇｐ４５にも現れることを
観察した。これら２つのバンドは、それぞれｇｐ１２０
のＮ末端側の２／３およびＣ末端側の１／３を表してい
る。これらは、おそらくｇｐ１２０の特別の開裂の結果
得られるウイルス溶解液中の分解生成物であろう。

【００１１】ＷＢ試験に伴う他の問題としては、ｎｅｆ
、ＶＲＰ、ＶＰＶなどの制御タンパク質の存在による主
要でない反応性バンド；試験を行うのに要する時間（通
常、一夜のインキュベーション工程が含まれる）；試験
が手動の性格を有すること；視覚で読み取ることに基づ
く試験結果の主観性；および試験する試料当たり特定の
ウイルスを１株しか検出できないことなどが挙げられる
。それゆえ、ＷＢ確認試験は、感度が悪く（とりわけ、
重要なＨＩＶ　ＥＮＶマーカーに関して）、付加的な非
特異的および特異的なバンドが多数存在し、バンドの同
定を困難にし所要時間が長くなる技術的問題を有する。

【００１２】感染因子の溶解液をＷＢ試験に用いること
に伴う上記問題は、所望の抗原ポリペプチドを種々の異
種細胞系で発現させることにより一部は回避される。こ
れらの系では遺伝子組み換え技術を用い、目的の感染因
子の遺伝子を細胞中に挿入し、これらポリペプチドタン
パク質を多量に生成できるようにする。この方法からは
しばしば所望の抗原が充分な量で産生されるが、一般に
新たな不純物および分解抗原断片の存在を伴う。これら
方法により生成される抗原はまた凝集物をも形成するた
め、これら凝集物の形成を還元剤を用いることにより最
小に抑えるか、または複数のゲルを使用することにより
凝集および分解の両方の問題を回避する必要がある。

【００１３】単一のアッセイにおいて幾つかの抗原を使
用することが記載されている。リン（Ｌｉｎ）らのＪ．
Ｖｉｒｏｌ．５９：５２２〜５２４（１９８６）には、
同じウエスタンブロッティング試験においてエプスタイ
ン−バーウイルスおよび他の異なるヘルペスウイルス抗
原を同定することが可能な二重抗体プローブ法が記載さ
れている。

【００１４】単一のウエスタンブロッティング試験にお
いて複数の検出法を使用することも可能である。リー（
Ｌｅｅ）らのＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１０
６：２７〜３０（１９８８）には、プローブ抗体、酵素
結合発色抗体および酵素基質のセットを連続的に適用す
ることにより、単一のウエスタンブロッティング試験に
おいて２種またはそれ以上のインターフェロンを検出す
る方法が記載されている。同じ結果はまた、異なる酵素
結合発色抗体の混合物を用い２種以上のプローブ抗体を
同時に適用し、ついで異なる基質を適用することによっ
ても達成することができる。

【００１５】ゴードン（Ｇｏｒｄｏｎ）らのヨーロッパ
特許出願公開００６３８１０号公報（１９８２年３月１
１日公開）には、固相支持体上に抗原または抗体または
両方を結合させてなるイムノアッセイ装置およびキット
が記載されている。記載の固相支持体を用いることによ
り、１回の操作で多くの抗体−抗原反応を同時に行うこ
とが可能になる。ゴードンらは、ピペットまたはスポイ
トを用い、固相支持体表面に抗原溶液または抗体溶液を
１回でまたは連続的に適用することを記載している。好
ましい態様においては、少量の抗原溶液を添加するこに
より生成するマイクロドットとして抗原を適用する。し
かしながら、該公報は、タンパク質の複合混合物から精
製した抗原を使用したイムノアッセイについては記載し
ていない。

【００１６】レフコビッツ（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ）のＷ
Ｏ８７／０３９６５（１９８７年７月２日公開）には、
幾つかの同時アッセイを行うための試験ストリップが記
載されている。この試験ストリップは、抗体を浸漬した
ニトロセルロースをストリップにカッティングしたもの
であり、不活性な裏板に積載したものである。抗原ペプ
チドの溶液中に支持体シートを浸し、ついで該シートを
ストリップにカッティングすることは記載されているが
、抗原を固相支持体に電気泳動的に移すことは該公報に
は教示されていない。

【００１７】ウエスタンブロッティング試験またはウエ
スタンブロッティングに基づく試験の代わりに確認試験
として用いることのできるアッセイシステムを提供する
ことは有利である。そのようなアッセイシステムでは、
不純物、凝集物または分解断片を本質的に含まない、感
染因子の高度精製モノマー性抗原を利用する。それゆえ
、このアッセイシステムは、現在利用できるスクリーニ
ング試験および確認試験に比べて特異性が改善されてい
る。また、読み取りが主観的でなく半自動的であり、そ
れゆえＷＢ試験に比べて評価が容易であるアッセイシス
テムを提供することも有利である。そのようなアッセイ
システムの他の利点は、ウイルス感染（とりわけウイル
スが単離されていないＣ型肝炎の場合）に付随する血清
マーカーのパターンをよく理解するための研究手段とし
て該アッセイシステムを用いることができることである
。さらに、比較データを提供することによりＨＩＶ−１
とＨＩＶ−２とを互いに識別することができ、それゆえ
ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の両方を検出することがで
き、また一方のタイプを他方のタイプから識別すること
のできる試験を提供することも有利である。さらに、複
数の抗原または抗体のパネルを同時に検出することので
きるアッセイシステムを提供することも有利である。

【００１８】

【課題を解決するための手段】本発明は、試料中に存在
する少なくとも１種の抗体の存在または量を同時に検出
するためのイムノアッセイ法を提供するものであり、該
方法は、１種または２種以上の抗原を別々の試験部位と
して固定化した固相支持体に、抗原−抗体複合体を形成
するのに充分な時間および条件下で試料を接触させ、つ
いで該固相支持体上の該複合体の存在を検出することを
特徴とする。固相支持体はニトロセルロースであってよ
く、また別々の試験部位はイムノドットブロットであっ
てよい。固相支持体を試料と接触させる前に固相支持体
をブロッキング剤と接触させてもよい。抗原−抗体複合
体の検出は、正常試料のシグナルと相関した定量的に測
定可能なシグナルを生成して試料について抗体陽性また
は抗体陰性を示すことのできる結合体シグナル生成系に
、該複合体を接触させることにより行う。本発明の方法
により検出することのできる抗体としては、抗ヒト免疫
不全ウイルス（ＨＩＶ）−１抗体、抗ＨＩＶ−２抗体お
よび抗Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗体などが挙げられ
る。

【００１９】本発明はまた、試料中に存在する少なくと
も１種の抗原の存在または量を同時に検出するためのイ
ムノアッセイ法を提供するものであり、該方法は、１種
または２種以上の抗体を別々の試験部位として固定化し
た固相支持体に、抗原−抗体複合体を形成するのに充分
な時間および条件下で試料を接触させ、ついで該固相支
持体上の該複合体の存在を検出することを特徴とする。 固相支持体はニトロセルロースであってよく、また別々
の試験部位はイムノドットブロットであってよい。固相
支持体を試料と接触させる前に固相支持体をブロッキン
グ剤と接触させてもよい。抗原−抗体複合体の検出は、
正常試料のシグナルと相関した定量的に測定可能なシグ
ナルを生成して試料について抗体陽性または抗体陰性を
示すことのできる結合体シグナル生成系に、該複合体を
接触させることにより行う。本発明の方法により検出す
ることのできる抗原としては、ヒト免疫不全ウイルス（
ＨＩＶ）−１、ＨＩＶ−２およびＣ型肝炎ウイルス（Ｈ
ＣＶ）などが挙げられる。

【００２０】以下、本発明をさらに詳しく説明する。本
発明のアッセイシステムは、公知のスクリーニング試験
およびＷＢ確認試験の問題を回避すべく設計した。本発
明は、感染の血清検出および確認に適したイムノブロッ
トシステムの新規な適用である。感染因子かまたは組換
えＤＮＡのいずれかに由来する高度に精製した診断学的
に重要な抗原を、固相支持体上に個別に固定化する。本
発明者らは、使用する精製抗原の量を増やすことにより
一層高い感度が得られることを発見した。固相支持体上
に固定化する抗原の量は、約０．０１０〜約５．０μｇ
の範囲であってよい。好ましくは、約０．０２０〜約２
．０μｇの範囲である。最も好ましくは、約０．０２０
〜約１．０μｇの範囲である。

【００２１】好ましい態様においては、ミラール（ｍｙ
ｌａｒ）などの不活性プラスチックで裏打ちしたニトロ
セルロースのシート上に、凹部で分離したドットの配列
に抗原を個別に固定化する。この配列は、米国特許出願
第２２７，２７２号明細書（参照のため本明細書に引用
する）において試験カードとして記載されている。これ
ら抗原をドット配列したニトロセルロースカードを個々
の反応カートリッジに入れ、ついで試料に存在する特異
的抗体を検出するのに充分な時間および条件下で試料と
ともに２２〜３７℃でインキュベートする。これら反応
カートリッジは、米国特許出願第２２７，５９０号（発
明の名称「生物学的試料分析装置のための反応カートリ
ッジおよび回転コンベア」；参照のため本明細書に引用
する）に記載されている。

【００２２】定量的に測定可能なシグナルを生成する結
合体シグナル生成系として最大の感度を得るために最適
化したビオチン−抗ビオチン（ＢＡＢ）増幅免疫検出系
を用い、固相支持体上に固定化した種々の抗原に特異的
な試料中に存在する抗体を同時に検出する。これら試験
カードを入れた反応カートリッジをアナライザー中で処
理することにより、インキュベーションおよび洗浄を半
自動化することができる。反射濃度（Ｄｒ）を測定する
ための反射率読み取り装置により発色反応の強度を自動
定量し、結果をデジタル方式でプリントする。試料から
得られたＤｒ値を正常陰性群から得られたＤｒ値と比較
することにより、結果を決定する。カートリッジ上のバ
ーコードは、陽性試料の同定を確認するために用いる。 これら試験カードを処理するのに使用するアナライザー
は、アボット・ラボラトリーズ（アボットパーク、ＩＬ
）から入手可能なアボットＭＡＴＲＩＸＴＭアナライザ
ーである。このアナライザーは、米国特許出願第２２７
，４０８号明細書（参照のため本明細書に引用する）の
発明の対象である。

【００２３】それゆえ、本発明のアッセイシステムが半
自動化され最適化されていることにより、実地の時間お
よびアッセイ時間が短縮される。ＷＢ試験で一夜のイン
キュベーションが必要とされるのとは異なり、本発明の
アッセイでは結果を得るためにわずかに４〜６時間が必
要であるにすぎない。また、本発明のアッセイは、反射
濃度に基づき固相支持体上の各抗原の反応性をデジタル
方式で自動的にプリントアウトすることができるため、
結果を決定する場合の主観性を排除することができる。

【００２４】手順コントロール、たとえばヤギ抗ヒトＩ
ｇＧを含有する手順コントロールが固相支持体上に含ま
れており、各試験を確認するための内部コントロールと
して働く。固相支持体上の陽性の反応は、試料が加えら
れたこと、および、その後のインキュベーション工程で
すべての試薬が正しく加えられ適切に機能していること
を示す。固相支持体上で起こる反応性の解釈のため、陽
性手順コントロールが推奨される。不活性物質（たとえ
ばカゼイン酸加水分解物）をコーティングした参照スポ
ットを固相支持体上に含めることも推奨される。

【００２５】固相支持体は、検出抗体が近付くことがで
きるのに充分な表面多孔性および抗原が結合するのに適
当な親和性を有する物質であればいかなるものであって
もよい。微孔性の構造が一般に好ましいが、水和状態で
ゲル構造を有する物質も使用することができる。有用な
固相支持体としては、下記のものが挙げられる。

【００２６】天然のポリマー性炭水化物およびその合成
的に修飾した架橋または置換誘導体、たとえば、アガー
、アガロース、架橋アルギン酸、置換または架橋グアー
ルガム、セルロースエステル（とりわけ硝酸エステルお
よびカルボン酸エステル）、混合セルロースエステル、
およびセルロースエーテルなど；

【００２７】窒素を含有する天然ポリマー、たとえばタ
ンパク質およびその誘導体（架橋または修飾ゼラチンを
含む）など；天然炭水化物ポリマー、たとえばラテック
スおよびゴムなど；適当な多孔質構造を有するように調
製できる合成ポリマー、たとえば、ビニルポリマー（ポ
リエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化
ビニル、ポリ酢酸ビニルおよびその部分的に加水分解さ
れた誘導体を含む）、ポリアクリレート、ポリアクリル
アミド、ポリメタクリレート、上記重縮合のコポリマー
およびターポリマー、たとえばポリエステル、ポリアミ
ドなど、および他のポリマー、たとえばポリウレタンお
よびポリエポキシドなど；

【００２８】多孔質無機物質、たとえばアルカリ土類金
属およびマグネシウムの硫酸塩および炭酸塩（硫酸バリ
ウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウムを含む）、アル
カリ金属、アルカリ土類金属、アルミニウムおよびマグ
ネシウムのケイ酸塩；および酸化アルミニウム、酸化ケ
イ素、アルミニウム水和物、ケイ素水和物、たとえば粘
土、アルミナ、タルク、カオリン、ゼオライト、シリカ
ゲル、またはガラス（これら物質は上記ポリマー性物質
の充填剤として用いることもできる）など；および上記
物質の混合物またはコポリマー、たとえば、すでに存在
する天然ポリマー上で合成ポリマーの重合を開始するこ
とにより得られるグラフトコポリマーなどが挙げられる
。

【００２９】上記物質はすべて適当な形態、たとえばフ
ィルム、シートまたはプレートなどで用いることができ
、また、たとえば紙、ガラス、プラスチックフィルムま
たは織物などの適当な不活性担体上にコーティング、結
合または積載することもできる。ニトロセルロースの多
孔質構造は、本発明に関連して用いる広範囲の試薬に対
して優れた吸収および吸着特性を有するため、好ましい
支持体物質である。

【００３０】固相支持体は、約０．０１〜０．５ｍｍ、
好ましくは約０．１ｍｍの厚さのシートの形態であるの
が好ましい。孔径は広範囲で変わり得るが、好ましくは
約０．０２５〜１５ミクロン、特に好ましくは０．１５
〜１５ミクロンである。これら支持体の表面は化学的処
理により活性化することができ、これにより抗原または
免疫グロブリンを支持体上に共有結合することができる
。しかしながら、一般に、よく理解されていない疎水力
によって多孔質物質上に吸着されることにより、抗原ま
たは抗体の非可逆的な結合が得られる。ニトロセルロー
スに基づく好ましい支持体は、ミリポアＲの商品名でミ
リポア社（ベッドフォード、マサチューセッツ）から販
売されている。適当な支持体はまた、米国特許出願第２
２７，２７２号明細書に記載されている。

【００３１】分析しようとする抗原の数または抗原のエ
ピトープは支持体のサイズによってのみ制限されるが、
その変更および組成は無限である。サイズは類似してい
るが異なる採取源から単離した抗原は、異なるゲルから
固相支持体の異なる別々の領域（部位）に移すことがで
きるので、可能である。還元感受性または還元依存性の
抗原は、別々の調製ゲル中に溶解することにより都合よ
く取り扱うことができる。加えて、各抗原の量は、アッ
セイの選択性および感度を最適化するように制御し釣り
合いをとることができる。

【００３２】ある感染因子の所望の数の抗原、または幾
つかの感染因子の抗原の組み合わせ、またはある感染因
子の所望の数の免疫グロブリン、または幾つかの感染因
子の免疫グロブリンの組み合わせを単一の固相支持体上
に含ませ、単一の試験手順で分析することができる。本
発明の方法は、抗体の濃度をモニターしたり通常特有で
あるが病的状態では変わり得る抗原を検出したりするた
め、または病的状態でのみ認められる抗体または抗原を
検出または定量するために用いることができる。本発明
のアッセイはまた、複数の抗原または抗体、たとえばＨ
ＴＬＶ−１、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＭＶ、ＨＳＶ、ＨＰＶ
などの抗原または抗体、細菌の抗原または抗体、真菌お
よび他の微生物学的抗原および抗体のパネルを同時に検
出することが可能な組み合わせアッセイに使用するのに
容易に役立てることができる。そのような組み合わせは
、通常の実施者が決定することのできる好ましい組み合
わせである。血清、血漿、脳脊髄液、尿、リンパ液、母
乳、唾液、大便などの体液試料を本発明に従って分析す
ることができる。

【００３３】クラス特異的抗体、たとえばＩｇＧ、Ｉｇ
Ａ、ＩｇＥおよびＩｇＭ抗体なども、当業者に知られた
適当な第二抗体を選択することにより検出することがで
きることが考えられる。さらに、抗原の代わりに特定の
抗体を固相支持体上に固定化し、プローブ抗体を適当に
変えることにより、本発明のシステムを抗原を検出する
ように適合させることができることも考えられる。また
、検出可能なシグナルを生成するのに用いる標識の選択
もまた、通常の実施者が決定することができる。そのよ
うな標識として考えられるものは、酵素標識、蛍光標識
などの発光標識、化学発光標識などが挙げられる。検出
−読み取り系は、選択した標識に依存して変え得ること
も考えられる。

【００３４】一つの態様において、有意のマーカーを試
験し、ｇｐ１６０、ｐ５５などの前駆体およびｎｅｆ、
ＶＰＲおよびＶＰＶなどの制御タンパク質を排除するよ
うに、ＨＩＶのためのアッセイシステムを設計した。そ
れゆえ、本発明のアッセイシステムでは、ＨＩＶ−１の
マーカーであるｇｐ１２０、ｐ６６、ｐ４１、ｐ３１、
ｐ２４およびｐ１７、およびＨＩＶ−２のマーカーであ
るｐ４１を、感度または特異性を損なうことなく試験し
た。特定のＨＩＶ　ｇｐ１２０の場合には、最大の反応
性を保持するために抗原を還元しなかった。ＷＢ試験と
比較して、本発明のアッセイ法は、特にＨＩＶ−１　ｇ
ｐ１２０、ｐ４１、ｐ３１およびｐ６６に対する感度が
増大していた。ＷＢ試験ではしばしば不自然に偏った不
釣合いに強いｐ２４反応性が得られるのとは違い、本発
明のアッセイでは、強い反応性の血清からすべてのＨＩ
Ｖ抗原に対する完全な反応性パターンが得られるであろ
う。好ましい態様において、本発明のアッセイ法はまた
増幅ビオチン−抗ビオチン：アルカリホスファターゼシ
グナル生成系を用い、これにより従来の免疫ペルオキシ
ダーゼ法に比べて１０倍も感度を向上させることができ
る。

【００３５】ＨＩＶに関して伝統的なスクリーニング試
験およびＷＢ試験の特異性の問題は、ＨＩＶ−１　ｇｐ
１２０以外のＨＩＶ抗原について大腸菌で発現させた組
換え抗原を利用することにより低減することができた。 ｇｐ１２０は哺乳動物のＣＨＯ細胞で発現させ、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ分析により決定されるように＞９０％の均質
性まで精製した。細菌抗原は電気泳動的に純粋なモノマ
ー性抗原であり、本質的に不純物、凝集物または分解断
片を含んでいない。

【００３６】本発明のアッセイは、ＨＩＶ−１およびＨ
ＩＶ−２を互いに識別することのできる組換えＨＩＶ−
１　ｐ４１抗原およびＨＩＶ−２　ｐ４１抗原を使用す
ることにより、ＨＩＶ−１抗体およびＨＩＶ−２抗体の
同時検出および識別を可能にするものである。このｐ４
１抗原を選択したのは、この抗原が両タイプのＨＩＶ感
染の最も有力な血清マーカーであり、これら２つの抗体
型の間での交差反応性が最小であることに基づく。それ
ゆえ、この単一の試験によってＨＩＶ−１抗体およびＨ
ＩＶ−２抗体の両方を検出することができ、また、これ
ら２つのタイプを識別することもできる。

【００３７】つぎに、本発明を実施例に基づいてさらに
詳しく説明するが、本発明はこれらに限られるものでは
ない。 実施例１（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２試験カードの調
製）使用したＨＩＶ−１組換え抗原は、ｇｐ１２０、ｐ
６６、ｐ４１、ｐ３１、ｐ２４およびｐ１７であった。 使用したＨＩＶ−２抗原はｐ４１であった。ＨＩＶ−１
　ｐ４１およびｐ６６、およびＨＩＶ−２　ｐ４１以外
の抗原はすべて全長抗原であった。ＨＩＶ−１　ｐ４１
抗原は経膜領域中の３８アミノ酸の最小欠失を有し、Ｈ
ＩＶ−２　ｐ４１抗原は経膜タンパク質の免疫優勢な（
ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ）Ｎ末端側の１／３から
なっていた。哺乳動物ＣＨＯ細胞中で発現させたＨＩＶ
−１　ｇｐ１２０以外の組換え抗原はすべて大腸菌で発
現させた。

【００３８】ｇｐ１２０以外の組換え抗原はすべて、ま
ず部分精製した。ついで、これら部分精製したタンパク
質を６ｍｍ調製的ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で個々に分画
した。タンパク質バンドの視覚化は、ネレス（Ｌ．Ｐ．
Ｎｅｌｌｅｓ）らのＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７３：
５２２〜５３１（１９７６）の変法として冷ＫＣｌ法に
より行った。目的抗原を含有するバンドをゲルから切り
出した。ついで、これらバンド精製タンパク質を電気溶
出（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）により回収し、ミ
ラールまたは他のプラスチックのシート上に溶接したニ
トロセルロースのドット上に直接適用した。ｇｐ１２０
をクロマトグラフィー法により＞９０％まで精製し、ス
ポッティングに直接用いた。

【００３９】ドット当たりに適用した各抗原の量は、陽
性コントロール血清の所定の希釈に対する反応性に依存
して０．０１〜１．０μｇであった。複数のスポイト−
ポンプアプリケーターによりドットの列に適用した抗原
を、室温で少なくとも１２時間空気乾燥させた。ついで
、連続的に穏やかに撹拌しながら、これらシートをブロ
ッキング溶液に約１時間浸漬して、ニトロセルロース表
面の残りのブロッキング部位を飽和させた。ブロッキン
グ溶液には、２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）および５０
０ｍＭ　ＮａＣｌ中に１％ゼラチン、１％カゼイン酸加
水分解物、５％ツイーン２０を含有していたが、当業者
に知られた他のブロッキング溶液を用いることもできる
。かくして調製したシートを３７°Ｃで約３０分間乾燥
させた。

【００４０】個々の３０ドット列をシートからパンチで
くりぬき、プラスチック反応カートリッジの底に付着さ
せた。透明な自己接着ミラール蓋を反応カートリッジに
かぶせた。各蓋には、フィラー／アスピレータープロー
ブのピペッティングおよび導入ができるように６ｍｍの
穴が含まれていた。ついで、これら反応カートリッジを
まとめて、使用するときまで２〜８°Ｃで貯蔵した。

【００４１】実施例２（アッセイ法）実施例１に記載の
ようにして調製した反応カートリッジを、アボットＭＡ
ＴＲＩＸＴＭ装置（アボット・ラボラトリーズ、アボッ
トパーク、ＩＬから入手可能）中の円形傾斜回転台（ｔ
ｉｌｔ−ｓｐｉｎ　ｐｌａｔｆｏｒｍ）上に置いた。１
ｍｌの試料希釈液（１５ｍＭトリス、１５０ｍＭ　Ｎａ
Ｃｌ、０．１％ウサギ免疫グロブリン、０．５％脱脂粉
乳、０．５％Ｂｒｉｊ３５、０．０２５％ＣＫＳタンパ
ク質および１．０％ウシアルブミン、ｐＨ７．４〜７．
６、を含有）を各反応カートリッジに加えた。ついで、
試料（１０〜１００μｌ）をカートリッジに加え、カー
トリッジを３５°Ｃで絶えず回転しながら１時間インキ
ュベートした。ついで、インキュベートした試料を自動
フィラー／アスピレーターにより引き出し、害虫駆除剤
を入れた廃棄容器に捨てた。１ｍｌのトリス緩衝食塩洗
浄溶液（ＴＢＳ、１０ｍＭトリス、ｐＨ７．４および１
５０ｍＭ　ＮａＣｌを含有）をポンプでフィラー／アス
ピレーターを通して入れ、カートリッジを回転しながら
数分間インキュベートすることにより洗浄を行った。こ
の洗浄サイクルを４回繰り返した。

【００４２】ついで、緩衝液（１５ｍＭトリス、１５０
ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１％ＥＤＴＡ、０．５％Ｂｒｉｊ
３５、０．５％脱脂粉乳、０．０２％ヤギ免疫グロブリ
ンおよびアジ化ナトリウム（０．１％）、ｐＨ７．４〜
７．６、を含有）中に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ鎖
およびＬ鎖）：ビオチン結合体の抗体溶液（１ｍｌ）を
加えた。この混合物を入れたカートリッジを３５°Ｃで
約１時間インキュベートし、ついで、この混合物を除去
した。カートリッジを上記のようにして３回洗浄した。 ついで、緩衝液（０．１Ｍトリス、１５４ｍＭ　ＮａＣ
ｌ、０．０２％ＭｇＣｌ２、０．００１４％ＺｎＣｌ２
、１．０％正常ウサギ血清、５．０％にべ、０．１％ポ
リソルベート２０および０．１％アジ化ナトリウム、ｐ
Ｈ６．９〜７．１、を含有）中に希釈したウサギ抗ビオ
チン：アルカリホスファターゼ結合体からなる第二の抗
体溶液（１ｍｌ）を加えた。３５°Ｃで約１時間インキ
ュベートした後、カートリッジを再びサイホンで吸い上
げ、上記と同様にして３回洗浄した。

【００４３】ついで、５−ブロモ−４−クロロ−３−イ
ンドイルホスフェート（ＢＣＩＰ）からなるアルカリホ
スファターゼ基質溶液（１ｍｌ）を加えた。３５°Ｃで
回転しながら発色反応を約３０分間行った。カートリッ
ジを再び３回洗浄した。蓋をピンセットで除き、傾斜回
転インキュベーター中で１５〜３０分間乾燥させた。つ
いで、カードを順番に反射リーダーで調べ、正味の反射
濃度をプリントした。試料の正味の反射濃度値は、試料
から得られた値からバックグラウンドの値を差し引いて
計算した。

【００４４】実施例３（系列希釈陽性試料の感度）ＨＩ
Ｖ−１陽性試料を１：３２から１：４０９６まで２倍系
列希釈し、これら希釈液を上記実施例１および２に記載
したアボットＭＡＴＲＩＸＴＭシステムおよびバイオテ
ックＴＭＷＢアッセイシステム（デュポン、ウイルミン
トン、ＤＥより入手可能）で試験した。これら結果を図
１に示す。図１によれば、本発明のアッセイシステムは
、ＷＢ試験の終点力価を越えて７倍希釈までＨＩＶ−１
　ｐ４１抗原を検出した。同様に、本発明のアッセイシ
ステムにより検出可能なＨＩＶ−１　ｇｐ１２０、ｐ３
１、ｐ６６およびｐ２４抗体力価は、ＷＢ試験により得
られる対応比較力価に比べて１〜４倍希釈大きかった。 それゆえ、これらのデータは、本発明のアッセイシステ
ムがＷＢ試験に比べて一層高度に希釈した試料において
も抗体を検出することができることを示している。

【００４５】実施例４（血清変換（ｓｅｒｏｃｏｎｖｅ
ｒｓｉｏｎ）パネルの感度）ＨＩＶ−１血清陰性からＨ
ＩＶ−１血清陽性への血清変換期間中に採取した１０人
の個体からの系列採血からなる１０の血清変換パネルを
、本発明のアッセイシステムおよびバイオテックＴＭＷ
Ｂアッセイシステム（デュポン）により試験した。これ
らパネルは、１０人の個体からの合計４８の試料からな
っていた。これらパネルから得られるデータを表１〜表
３に示す。このデータは、本発明のアッセイシステムが
ＨＩＶ−１　ｐ２４以外のすべての抗体をＷＢ試験に比
べて早期に検出したことを示している。ｐ２４の場合は
、２つの試験の結果は同等であった。また、本発明のア
ッセイシステムは、幾つかの早期の採血試料とかなり強
い陽性の反応を示したのに対し、ＷＢ試験では同じ試料
に対して反応が認められなかったことにも注意すべきで
ある。このことは、ＨＩＶ−１　ｐ４１、ｐ６６および
ｐ３１抗原において特に顕著に示された。本発明のアッ
セイシステムは、ｐ４１抗原をＷＢ試験に比べて数週間
早く検出した。さらに、４８の試料のうち、本発明のア
ッセイシステムは３７／４８血清陽性を検出したのに対
し、ＷＢ試験では１８／４８血清陽性を検出したことも
注意すべきである。

【００４６】実施例５（１７０ランダムドナーのスクリ
ーニング）１７０ランダムドナー試料の反応性を、実施
例１および２の方法に従って得たＤｒ測定値により定量
した。１７０のドナーのすべてが血清陰性であった。こ
れら結果を図２〜図９に示す。図２〜図９において、各
抗原について低いＤｒ値は密な集団を形成し、これは問
題としている抗原の平均バックグラウンド値と考えられ
た。しかしながら、幾つかの試料では僅かに上昇した値
が得られ、これは可視レベルを下回っていた、すなわち
Ｄｒ＜０．０３であった。

【００４７】実施例６（９１の既知陰性ＷＢ未確定試料
の試験）本発明のアッセイシステムとＷＢ試験との特異
性を比較するため、ＷＢ試験（デュポン）により「未確
定」と決定された９１の試料を再試験し、本発明のアッ
セイシステムとＷＢ試験とを比較した。このデータを表
４に示す。６つのＨＩＶ−１陽性試料がパネルに含まれ
ており、両方のアッセイにおいて陽性と試験された。残
りの９１の試料のうち、本発明のアッセイシステムは７
１を陰性試料と同定し、２０を「未確定」とした。これ
とは対照的に、ＷＢ試験では９１の試料が未確定と再試
験された。さらに、本発明のアッセイシステムにより未
確定とされた２０の試料は、主としてＨＩＶ　ｐ３１の
みの反応性、ｐ２４のみの反応性、ｐ１７のみの反応性
およびｇｐ１２０のみの反応性を示す非典型的な反応性
パターンを示すことが決定された。

【００４８】これら未確定試料はＨＩＶに感染している
かもしれないが、そのような非典型的な反応性は、目的
のＨＩＶ抗原かまたは固相の調製に用いたゼラチンやカ
ゼイン酸加水分解物などのブロッキング剤のいずれかと
特異的な交差反応を起こしたためによる可能性が高い。 これら２０の試料の感染状態を確定するため、引き続き
採血を試験する必要があった。一般に、反対の臨床証拠
、ウイルス学的証拠、またはポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）による証拠がない限り、またはその後６カ月以内
に血清変換が観察されない限り、そのような非典型的ま
たは未確定試料は偽陽性であると考えられる。

【００４９】実施例７（８１のＥＩＡ偽陽性試料の試験
）ＨＩＶ−１のスクリーニングＥＩＡにより繰り返し陽
性と試験されたがＷＢ試験で試験しても確認できなかっ
た８１の試料について、実施例１および２に記載の方法
に従い、本発明のアッセイシステムで試験した。これら
８１の試料のうち、本発明のアッセイシステムによれば
７０の試料が陰性であり、３つの試料が陽性であり、８
つの試料が未確定であった。これら未確定の試料は、Ｈ
ＩＶ−１ｐ３１のみの反応性（４つの試料）、ｐ２４の
みの反応性（１つの試料）、ｇｐ１２０のみの反応性（
１つの試料）という非典型的な反応性パターンを示し、
また一般に強い染色を示した（２つの試料）。

【００５０】実施例８（ＨＩＶ−１抗体およびＨＩＶ−
２抗体の検出）ＨＩＶ−１に対する抗体およびＨＩＶ−
２に対する抗体を識別するため、実施例１の記載に従っ
て調製したＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２　ｐ４１抗原を
用いて試験を行った。この試験は、ＷＢ試験では観察さ
れた該２つのウイルス株のエンベロープ経膜抗原間の交
差反応性が比較的低かった。本発明者らは、同種ＨＩＶ
ｐ４１抗原に対する所定のＨＩＶ陽性血清の反応性が、
異種抗原に対する該所定のＨＩＶ陽性血清の反応性に比
べて通常約１００倍強いことを観察した。それゆえ、ｐ
４１反応性の比は、感染ウイルスのタイプの指標となり
得ると思われる。３４のＨＩＶ−１陽性血清は、試験し
たＨＩＶ−１抗原、とりわけＨＩＶ−１ｐ４１に対して
強い陽性の反応性を示した。これらの試験血清は、ＨＩ
Ｖ−２のｐ４１抗原とは１％未満のシグナルしか示さな
かった。

【００５１】５つの既知のＨＩＶ−２陽性血清は、ＨＩ
Ｖ−２　ｐ４１とは強い反応性を示したが、ＨＩＶ−１
　ｐ４１とは１％未満のシグナルしか示さなかった。幾
つかのＨＩＶ−２血清は、ＨＩＶ−１　ｐ３１、ｐ６６
、ｐ２４およびｐ１７抗原と弱い交差反応性を示すこと
が観察された。しかしながら、この発見は、これら２つ
のウイルスタイプのｇａｇ遺伝子産物とｐｏｌ遺伝子産
物の間の配列の相同性および抗原性交差反応性が報告さ
れていることと一致するものである。

【００５２】実施例９（血清試料中の特異的ＨＩＶ−１
抗体およびＨＩＶ−２抗体の検出）ＨＩＶ−１陽性血清
とＨＩＶ−２陽性血清を混合した混合実験を行った。各
血清は、単独ではそのｐ４１抗原と反応した。混合試料
は両方のｐ４１抗原と反応することが示された。それゆ
え、本発明のアッセイシステムは、１つの試料中でＨＩ
Ｖ−１抗体およびＨＩＶ−２抗体の両方を検出すること
ができた。

【００５３】実施例１０（ＨＩＶ−１陽性血清およびＨ
ＩＶ−２陽性血清のコードパネルの評価）本発明のアッ
セイシステムがＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の種々の単
一および二重反応性間での検出および識別する能力を評
価するため、米国および西アフリカの個体から得た陽性
血清および陰性血清の両方を含む６０の試験血清のコー
ドパネルを本発明のアッセイシステムにより分析した。 ２３のＨＩＶ陰性、９のＨＩＶ−１陽性、１２のＨＩＶ
−２陽性および１６のＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２反応
性の血清が検出された。これら結果を、ウエスタンブロ
ッティング法、ラジオイムノ沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）
、特異的モノクローナル抗体および種々のビーズＥＩＡ
ｓを含む一群の試験により確認した。

【００５４】実施例１１（可能な二重感染の証拠）二重
のｐ４１反応性を示した西アフリカ人の血清は、競合試
験によりＨＩＶ−１特異的抗体およびＨＩＶ−２特異的
抗体の両方を含んでいることがわかった。この競合は、
血清試料の初期インキュベーション液にウイルス溶解液
を加えることにより行った。ＨＩＶ−１ウイルス溶解液
の存在下ではＨＩＶ−１　ｐ４１の反応性はなくなった
が、ＨＩＶ−２　ｐ４１シグナルは影響を受けなかった
。同様に、ＨＩＶ−２ウイルス溶解液はＨＩＶ−２　ｐ
４１シグナルのみを特異的に競合排除した。両方のシグ
ナルを競合排除するには上記２つのウイルス溶解液を組
み合わせる必要があった。

【００５５】実施例１２（ＨＣＶ試験カードの調製）Ｈ
ＣＶ試験カードは、酵母で発現したｃ１００−３キメラ
ポリペプチド［クオ（Ｋｕｏ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４
４：３６２〜３６４（１９８９）］、および大腸菌で発
現した組換えＨＣＶポリペプチド［ｐＨＣＶ−２３（ｃ
１００断片、Ｎ末端側の最初の１０７アミノ酸を欠失）
、ｐＨＣＶ−２９（３３Ｃ）、ｐＨＣＶ−３４およびｐ
ＨＣＶ−３５（推定コア）、およびｐＨＣＶ−４５（Ｎ
Ｓ４／ＮＳ５連結）を含む］からなっていた。ラムダｐ
Ｌ発現系で発現されたｐＨＣＶ−３５以外のタンパク質
はすべて、ＣＭＰ−ＫＤＯシンセターゼ（ＣＫＳ）融合
タンパク質として発現された。加えて、各パネルには、
ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ鎖およびＬ鎖）およびヒトＩｇＧ
からなる２つのコントロール、およびバックグラウンド
シグナルを検出するための参照スポット（アッセイを確
実にするのに有用であった）が含まれていた。

【００５６】組換えポリペプチドの調製は、ニトロセル
ロース固相上にスポッティングするため個々の場合に最
適化した。好ましい緩衝液、ｐＨ条件、およびスポッテ
ィング濃度を表５にまとめて示した。しかしながら、異
なるｐＨ値、界面活性剤組成および塩濃度でもポリペプ
チドをニトロセルロースに首尾よく適用できることがわ
かった。スポッティング後、固相を３７°Ｃで一夜乾燥
し、ついでトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ；２０ｍＭトリス
緩衝液、０．５Ｍ　ＮａＣｌ、０．１％ＮａＮ３、ｐＨ
７．４〜７．６、を含有）で２回濯いだ。ついで、固相
支持体を、ＴＢＳ中にブタゼラチン（１％）、カゼイン
酸加水分解物（１％）、およびツイーン２０（５％）を
含有する溶液で３５°Ｃにて３０分間オーバーコーティ
ングした。固相支持体をさらにＴＢＳで２回濯ぎ、つい
で試験細胞カートリッジ中に並べる前に３７°Ｃで乾燥
させた。

【００５７】実施例１３（ＨＣＶアッセイ法）試料（２
０μｌ）を、試料希釈液（２ｍｌ）［ウシ血清アルブミ
ン（１％ｗ／ｖ）、脱脂粉乳（０．５％ｗ／ｖ）、酵母
エキス（０．０３％ｗ／ｖ）からなる］、および２０ｍ
Ｍトリス緩衝食塩水（ｐＨ７．４〜７．６）［Ｂｒｉｊ
−３５Ｒ（１．５％ｖ／ｖ）、ＥＤＴＡ（０．１％ｗ／
ｖ）およびＮａＮ３（０．１％）を含有］中にＣＫＳタ
ンパク質（５％ｖ／ｖ）を含有する大腸菌溶解液と混合
した。この希釈試料（１ｍｌ）を実施例１２の記載に従
って調製した試験細胞に移した。試験細胞を試料ととも
に３５°Ｃにて１時間インキュベートした。 このインキュベーションの後に、ビオチン−結合ヤギ抗
ヒトＩｇＧ（Ｈ鎖およびＬ鎖）特異的抗体［キルケガー
ル−ペリー・ラボラトリーズ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ−
Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ガイセルス
バーグ、ＭＤ］、アルカリホスファターゼ結合ウサギ抗
ビオチン抗体、および５−ブロモ−４−クロロ−３−イ
ンドリルホスフェートとともに２０分間および３５分間
、順番にインキュベートして反応部位に発色生成物（検
出可能なシグナル）を生成させた。

【００５８】実施例１４（血清変換検出）実施例１２お
よび１３の方法に従い、ＨＣＶ暴露から０、１５、４０
、８０および９５日後のＣ１００、ＣＫＳ−ＢＣＤ、Ｃ
ＫＳ−３３、ＣＫＳ−コア、ＣＫＳ−Ｅおよびラムダｐ
Ｌコアの検出可能な反応性について、０２１９０−Ｄと
称する血清変換パネルを試験した。図１０に示すように
、１１日目に各コアタンパク質のシグナルは０日目のシ
グナルに比べて１５〜１８倍増加した。４０日目に組換
えタンパク質３３Ｃおよびコアは強反応性であったのに
対し、Ｃ１００構築物およびＮＳ４／ＮＳ５連結タンパ
ク質は反応性がカットオフ値と同じかまたはそれより低
かった。

【００５９】実施例１５（希釈パネルの検出）実施例１
２の試験カードを用い、実施例１３の方法に従って４０
の正常ドナーをアッセイした。ついで、各組換えタンパ
ク質について平均反射濃度値を測定した。カットオフ値
は、陰性平均に６標準偏差を加えたものとして計算した
。２つの試料の希釈パネルも試験した。１つの試料（Ａ
００６４２）は、回復期の非Ａ非Ｂ型肝炎患者からの試
料を陰性ヒト血漿中に１：１００〜１：１２８００に希
釈したものであった。他方の試料（４２３）は、ＨＣＶ
（ｃ１００）スクリーニングアッセイにおいて陽性と試
験された支払い（ｐａｉｄ）血漿ドナーからの試料を陰
性ヒト血漿中に１：４０〜１：２５６０に希釈したもの
であった。すべてのＨＣＶ組換えタンパク質について試
料／カットオフ（Ｓ／ＣＯ）値を決定した。１．０より
大きいかまたは１．０に等しいＳ／ＣＯ値を有する試料
は反応性とした。限界希釈は、１．０より大きいかまた
は１．０に等しいＳ／ＣＯ値を示す最低希釈として定義
した。

【００６０】表６からわかるように、各試料はすべての
ＨＣＶ組換えタンパク質について陽性と試験された。試
料Ａ００６４２の反応性は３３ｃ抗原に対するものが最
大であり、残りの抗原に対してはｃ１００、ｃ１００断
片、ＮＳ４／ＮＳ５連結タンパク質の順番で減少するこ
とがデータおよび図１１により示された。試料４２３は
、３３ｃおよびコア領域を発現する組換えタンパク質と
最も強く反応し、ｃ１００断片、ＮＳ４／ＮＳ５連結タ
ンパク質およびｃ１００とは反応性の程度が低かった。

【００６１】

【表１】

【表２】

【表３】

【表４】 　　　　　　表４（ウエスタンブロッティングによるＨ
ＩＶ−１未確定試料）試験した全試料数＝９７ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　陽性　　　　　　　　陰性　　　　　　
　　　　未確定ウエスタンブロッティング　　　　　　
　　６　　　　　　　　　　０　　　　　　　　　　　
　９１本発明のアッセイシステム　　　　　　　　６　
　　　　　　　　　７１　　　　　　　　　　２０

【０
０６２】

【表５】 　　　　　　表５（ＨＩＶ−１ポリペプチドスポッティ
ング条件）プラスミド／タンパク質　　ｎｇ／スポット
　　スポッティング緩衝液ｃ１００　　　　　　　　　
　　　　　　　１００〜１５０　　　　２０ｍＭトリス
−ＨＣｌ、０．９％ＮａＣｌ、０．０１５％ＳＤＳ、　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　ｐＨ８．３ｐＨＣＶ−２３／ＣＫ
Ｓ−ＢＣＤ　　　　　　　　１００〜１５０　　　　２
０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．９％ＮａＣｌ、０．０１５
％ＳＤＳ、　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　ｐＨ８．３ｐＨＣＶ
−２９／ＣＫＳ−３３ｃ　　　　　　　　１００〜１５
０　　　　５０ｍＭリン酸Ｎａ、０．０１％トリトンＸ
１００、　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　ｐＨ６．５ｐＨＣＶ−
３５／コア　　　　　　　　　　　１００〜１５０　　
　　５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．００２５％ツイーン
２０、　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　ｐＨ８．５ｐＨＣＶ−３
４／ＣＫＳ−コア　　　　　　　　７５〜１００　　　
　５０ｍＭリン酸Ｎａ、０．００２５％ツイーン２０、
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　ｐＨ１２．０ｐＨＣＶ−４５／
ＣＫＳ−Ｅ　　　　　　　　　　１００〜１５０　　　
　５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．０１５％ＳＤＳ、ｐＨ
８．５

【００６３】

【表６】 　　　　　　表６ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　反射濃
度値　　　　　　　　　　　　　　　　限界希釈　　抗
原　　　　　　　　　　　　　　陰性平均　　　　カッ
トオフ　　　　Ａ００６４２　　　　４２３ｃ１００−
３　　　　　　　　０．０２３　　　　０．１２９　　
　　　　１６００　　　　　　　　４０ｃ１００断片　
　　　　　　　０．０１１　　　　０．０５０　　　　
　　３２００　　　　　　３２０ｃ３３ｃ　　　　　　
　　　　　　０．００５　　　　０．０３１　　　　１
２８００　　　　２５６０コア　　　　　　　　　　　
　　　　　０．０２７　　　　０．１６６　　　　　　
　　４００　　　　　　３２０　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　０．０３８　　　　０．１８０　　
　　　　　　４００　　　　１２８０ＮＳ４／ＮＳ５連
結　　　０．０１７　　　　０．０７９　　　　　　　
　８００　　　　　　３２０

【図面の簡単な説明】

【図１】　　正常ヒト血清で系列希釈したＨＩＶ−１抗
体陽性血清を本発明および従来のウエスタンブロッティ
ング試験の両方で滴定した比較結果を示す棒グラフ。

【図２】　　ＨＩＶ−１抗原ｇｐ１２０について正味の
反射濃度（Ｄｒ）に対して頻度をプロットしたランダム
ドナー分布グラフ（Ｎ＝１７０）。

【図３】　　ＨＩＶ−１抗原ｐ６６について正味の反射
濃度（Ｄｒ）に対して頻度をプロットしたランダムドナ
ー分布グラフ（Ｎ＝１７０）。

【図４】　　ＨＩＶ−１抗原ｐ４１について正味の反射
濃度（Ｄｒ）に対して頻度をプロットしたランダムドナ
ー分布グラフ（Ｎ＝１７０）。

【図５】　　ＨＩＶ−１抗原ｐ３１について正味の反射
濃度（Ｄｒ）に対して頻度をプロットしたランダムドナ
ー分布グラフ（Ｎ＝１７０）。

【図６】　　ＨＩＶ−１抗原ｐ２４について正味の反射
濃度（Ｄｒ）に対して頻度をプロットしたランダムドナ
ー分布グラフ（Ｎ＝１７０）。

【図７】　　ＨＩＶ−１抗原ｐ１７について正味の反射
濃度（Ｄｒ）に対して頻度をプロットしたランダムドナ
ー分布グラフ（Ｎ＝１７０）。

【図８】　　ＨＩＶ−２抗原ｐ４１について正味の反射
濃度（Ｄｒ）に対して頻度をプロットしたランダムドナ
ー分布グラフ（Ｎ＝１７０）。

【図９】　　手順（ｐｒｏｃｅｄｕｒａｌ）（抗ヒト）
値について正味の反射濃度（Ｄｒ）に対して頻度をプロ
ットしたランダムドナー分布グラフ（Ｎ＝１７０）。

【図１０】　　本発明のアッセイシステムを用いて試料
０１２９０−Ｄの血清変換パネルを調べた結果を時間（
日）に対して正味の反射濃度をプロットして示すグラフ
。

【図１１】　　本発明のアッセイシステムを用いて試料
Ａ００６４２について種々希釈における種々ＨＣＶタン
パク質に対する反応性を調べた結果をＳ／ＣＯ値として
示すグラフ。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　試料中に存在する少なくとも１種の抗
   体の存在または量を同時に検出するためのイムノアッセ
   イ法であって、 （ａ）別々の試験部位として１種または２種以上の抗原
   を固定化した固相支持体に、抗原−抗体複合体を形成す
   るのに充分な時間および条件で試料を接触させ、（ｂ）
   該複合体を、正常陰性試料のシグナルに相関する定量的
   に測定可能なシグナルを生成して試料について抗体陽性
   または抗体陰性を示し得る検出可能なシグナルまたは増
   幅系に結合させた抗体からなる結合シグナル生成系と接
   触させ、ついで （ｃ）生成したシグナルを測定することにより固相支持
   体上に存在する抗原−抗体複合体の存在を検出すること
   を特徴とする方法。
2. 【請求項２】　　固相支持体がニトロセルロースであり
   、別々の試験部位がイムノドットブロットである請求項
   １種に記載の方法。
3. 【請求項３】　　検出する抗体が、抗ＨＩＶ−１抗体、
   抗ＨＩＶ−２抗体および抗ＨＣＶ抗体よりなる群から選
   ばれたものである、請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】　　固相支持体を試料と接触させる前に固
   相支持体をブロッキング試薬と接触させる、請求項１に
   記載の方法。
5. 【請求項５】　　標識が、酵素、発光標識および化学発
   光標識よりなる群から選ばれたものである、請求項１に
   記載の方法。
6. 【請求項６】　　試料中に存在する少なくとも１種の抗
   原の存在または量を同時に検出するためのイムノアッセ
   イ法であって、 （ａ）別々の試験部位として１種または２種以上の抗体
   を固定化した固相支持体に、抗原−抗体複合体を形成す
   るのに充分な時間および条件で試料を接触させ、（ｂ）
   該複合体を、正常陰性試料のシグナルに相関する定量的
   に測定可能なシグナルを生成して試料について抗体陽性
   または抗体陰性を示し得る検出可能なシグナルまたは増
   幅系に結合させた抗体からなる結合シグナル生成系と接
   触させ、ついで （ｃ）固相支持体上に存在する抗原−抗体複合体の存在
   を検出することを特徴とする方法。
7. 【請求項７】　　固相支持体がニトロセルロースであり
   、別々の試験部位がイムノドットブロットである請求項
   ６に記載の方法。
8. 【請求項８】　　検出する抗体が、抗ＨＩＶ−１抗体、
   抗ＨＩＶ−２抗体および抗ＨＣＶ抗体よりなる群から選
   ばれたものである、請求項６に記載の方法。
9. 【請求項９】　　固相支持体を試料と接触させる前に固
   相支持体をブロッキング試薬と接触させる、請求項６に
   記載の方法。
10. 【請求項１０】　　標識が、酵素、発光標識および化学
    発光標識よりなる群から選ばれたものである、請求項６
    に記載の方法。