JPH04210598A - レトロウイルスプロテアーゼの活性を測定する試薬および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

［０００１３発明の背景 本発明はレトロウイルスプロテアーゼ、たとえばヒト免
疫不全症ウィルス（ＨＩ　Ｖ）プロテアーゼの活性を測
定する試薬および方法に関する。さらに詳しくは、本発
明はＨＩＶプロテアーゼおよび他のレトロウィルスプロ
テアーゼに対する新規な蛍光原性基質および蛍光測光検
定法に関する。 ［０００２］わずか数年前までは珍しい疾患であった後
天性免疫不全症候群は、現在では重大な疾患になってい
る。その結果、ＡＩＤＳに打克つ薬剤およびワクチンの
開発のためにム厖マ大な努力が払われてきた。１９８３
年にはじめて同定されたＡＩＤＳウィルスはいくつかの
名前で呼ばれてきた。それは第三番目に知られたＴ−リ
ンパ球ウィルス（ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｉ　Ｉ）であり、免疫
系内で複製する能力を有し、したがってＴ４”　Ｔ−細
胞（またはＣＤ　４　＝細胞）の著しい破壊を招く　（
たとえば、Ｇａ１ｌｏら：　Ｓｃ　１ｅｎｃ　ｅ、２２
４：　５００〜５０３．１９８４およびＰｏｐｏｖｉｃ
ら：同誌：４９７〜５００．１．９８４参照）。このし
１ヘロウイルスは、リンパ腺症関連ウィルス（ＬＡＶ）
またはＡＩＤＳ関連ウィルス（ＡＲＶ）としても知られ
、つい最近、ヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩ　Ｖ）と呼
ばわるようになった。２種の異なるＡＩＤＳウィルス、
ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２が知られている。ＨＩＶ−１は
１９８３年にＭｏｎｔａｇｎｉｅｒと共同研究者によっ
てパリのＰａ５ｔｅｕｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅで始めて確
認されたウィルスであり（Ａｎｎ、Ｖｉｒｏｌ、Ｉｎ５
ｔ、Ｐａ５ｔｅｕｒ　　１３５Ｅ、１１９〜１３４．１
９８４）、一方ＨＩＶ−２はさらに最近、１９８６年に
Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒと共同研究者によって単離された
（Ｎａｔｕｒｅ、３２６：６６２．１９８７）。本明細
書において用いられるＨ　ＩＶの語は、一般的な意味で
これらのウィルスを指すものである。 ［０００３］最近検討されているＡＩＤＳの処置へ利用
できる可能性のある有用なアプローチとして、レトロウ
ィルスプロテアーゼの阻害剤である合成ペプチドの開発
がある。すなわち、ヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩ　Ｖ
）を含めてし１−ロウイルスは、宿主によるポリ蛋白質
の合成を指図することによってそれ自身の遺伝子内容を
発現することが知られている。この前駆体はついで蛋白
分解による処理を受け、主要なウィルス酵素と構造蛋白
質を与える。ウィルスによってコードされた酵素、レト
ロウィルスプロテアーゼはポリ蛋白質内に含有され、ポ
リ蛋白質の特異的切断による成熟ウィルス蛋白質の生成
の役目を担っている。 ［０００４］ＨＩＶプロテアーゼのようなし１〜ロウイ
ルスプロテアーゼの、本発明者らによって開発された様
々の新規なペプチドインヒビターはたとえばｐ　２４／
ｐ　１５のようなＨＩＶ切断部位に由来する約４〜８個
のアミノ酸残基の短いペプチドであり、こねらは内部Ｃ
Ｈ２ＮＨ結合アイソステイアを導入して修飾されている
。このようなペプチドの例は次の通りである。

【式４】 ％式％ ［０００５］すなわち、ＨＩＶプロテアーゼは、ＡＩＤ
Ｓ薬剤の研究における論理にかなった治療標的である。 ＨＩＶプロテアーゼインヒビターの可能性の検討を容易
にし、リード化合物を至適化するためには、インヒビタ
ーの動力学的特性づけに便利な、自動化と高い処理鳳が
可能なアッセイが望まれる。ＨＩＶプロテアーゼの特性
づけに用いられた初期のアッセイは生成物と基質の固定
された時間間隔でのＨＰＬＣ分離に基づくものであった
（たとえばＭｏ　Ｏｒ　ｅら：Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ
　　ｈｌ及ｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、１５９，４２０〜４２
５．１９８９；Ｄａｒｋｅら：同誌１５６，２９７〜３
０３．１９８８；５ｃｈｎｅｉｄｅｒ　　＆Ｋｅｎｔ：
Ｃｅｌｌ　　５４，３６３〜３６８．１９８８参照）、
ＨＰＬＣアッセイは直ちに、所望の治療性を有するｉ（
Ｉ　Ｖプロテアーゼインヒビターの開発の律速工程とな
った。インヒビターとＨＩＶプロテアーゼの相互作用の
定量的動力学的特性づけが可能な連続アッセイが好まし
い。色素原性または蛍光原性基質を開発する策略が、本
発明者らにより、既知ＨＩＶプロテアーゼ切断部位の短
いペプチド基質を特性づけた本発明者らの仕事に基づい
て提案された（Ｔｏｔｈら：Ｐｒｏｃ、Ｉｌｅｈ　　Ａ
ｍ、Ｐｅｔｉｄｅ　　Ｓｙｍ且。、Ｒｉｖｅｒ　　＆　
　Ｍａｒｓｈａ１１編、ＥＳＣＯＭ、Ｌｃ　１ｄｅｎ、
印刷中、１９９０）。加水分解酵素に対する蛍光原性基
質は、その高い感度により、生化学の分野で広く用いら
れてきた（たとえばＧｕｉｌｂａｕｌｔ：Ｅｎｚｙｍａ
ｔｉｃ　　Ｍｅｔｈｏｄｓｏｆ　　Ａｎａｌｙｓｉｓ、
ＰｅｒｇａｍｏｎＰｒｅｓｓ、１９７０．４３〜４７頁
参照）。 ［０００６］最近、Ｎａ５ｈｅｄら（Ｂｉｏｃｈｅｍ。 Ｂｉｏ　　ｈ　　ｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、１６３．
１０７９〜１０８５．１９８９およびＨｙｌａｎｄら：
Ａｂｓｔｒ、２ｎｄ　　Ｉｎｔ、Ｃｏｎｆ、Ｄｒｕ　　
ｓ　　Ｒ，ｅＳ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｎｄ　　Ｉ
ｎｆｅｃｔｉ。 ｕｓ　　Ｄｉｓｅａｓｅ、ＡＩＤＳ、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒ
ｋＡｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ｌ−２０，１９８０）は、Ｐ１
位置にｐ−Ｎ０２−Ｐｈｅを含有する切断色素原性基質
に基づく分光測光アッセイを報告した。これらの場合、
基質はオクタペプチド、ノナペプチドおよびデカペプチ
ドであった。連続的でばないが、高い処理量が達成でき
る放射測定法によるＩ−（Ｉ　Ｖプロテアーゼインヒビ
ターのスフノーユングアッセイ法がまた、Ｈｙｌａｎｄ
ら（前出）によって報告されている。 ［０００７］発明の詳細な説明 本発明によれば、し１−ロウイルスプロテアーゼ、たと
えばＨＩＶプロテアーゼの新規な蛍光原性基質、および
これらの基質を用いるその蛍光測定アッセイが提供され
る。 ［０００８］好ましい新規な基質は、ＨＩＶプロテアー
ゼのｐ２４／ｐ１５切断部に由来するヘキサペプチドＡ
ｃ−Ｔｈｒ−Ｉ　ｌｅ−Ｎｌｅ−Ｎｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｒ
ｇＮＨ２に基づいている。このヘキサペプチドはこの場
合、蛍光原性基たとえば２−アミノ安息香酸（Ａｂｚ）
を好ましくはアセチル基（Ａ　ｃ　）の代わりにドナー
として導入し、蛍光原性基のアクセプターたとえばｐ−
二１へロフェニルアラニン（ｐ−ＮＯ２−Ｐ　ｈ　ｅ）
を好ましくはＩ）１′位置にアクセプターとして導入し
て修飾し、新規な分子内消光蛍光原性基質、Ｘ−Ｔｈｅ
−Ｉ　１ｅ−ＮＩｅ−Ｐｈｅ　　（Ｙ）　−Ｇｌｎ−Ａ
ｒｇ−ＮＨ２（式中、Ｘは蛍光原性基であり、Ｙは蛍光
原性基のアクセプターである）を提供する。好ましい蛍
光原性基質はしたがって、！・〜ｂｚ−Ｔｈｅ−Ｉ　１
ｅ−Ｎｌｅ−Ｐｈｅ　　（ｐ−Ｎ０２　）　−Ｇ　ｌ　
ｎ−Ａｒ　ｇ−ＮＨ２である。便宜上、この新規な基質
を本明細書゛ではＡｂｚ−ＮＦ”　−６とも）呼ぶこと
にする。 ［０００９］新規な蛍光測光アッセイは、既知量の蛍光
原性基質を分光測光蛍光計の蛍光セルに取り、既知量の
レトロウィルスプロテアーゼと３７℃でインキュベート
し、経時的な蛍光の変化を測定し、蛍光強度の変化を生
成物の濃度変化と関連づけた標準曲線と比較することに
よってレトロウィルスプロテアーゼのモル速度を求める
ことからなるレトロウィルスプロテアーゼたとえばＨＩ
Ｖプロテアーゼの測定方法である。 ［００１０１北述の好ましい蛍光原性基質には、様々な
修飾が可能で、レトロウィルスプロテアーゼの蛍光測光
アッセイにおいて実質的に同様な有利な結果が得られる
ことは明らかである。すなわち、ＨＩＶプロテアーゼの
アッセイに際しては、Ｘは任意の蛍光原性基（アシドラ
セン、アミノベンゾイル、インドール、アミノエチルナ
フチル等）およびその修飾された基でＮ末端アミン官能
基に結合し、たとえばＡｂ　ｚ、ダンシル（５−ジメチ
ルアミノ−ナフタレン−１−スルホニル ４−グアニジノ安息香酸およびそれらの誘導体、たとえ
ばＮ−メチルＡｂｚ，４−クロロ−Ａｂｚ，５−クロロ
Ａｂｚ，６−クロロ−Ａｂｚ，３．５−ジブロモＡｂ２
；ニコチン酸の誘導体たとえば６−アミノ、２−アミノ
、２−クロロニコチン酸およびニフルム酸；４ーグアニ
ジノ安息香酸の誘導体；ダンシルの誘導体；その他の誘
導体である。 ［００１１］Ｙは、蛍光原性ドナーＸの蛍光エネルギー
を吸収し、ＸとＹが共有結合的に接近した近位に保持さ
れた場合、蛍光発光を減衰させる消光芳香族基を有する
任意のアミノ酸誘導体である。例としてはＴｒｐ，Ｔｙ
ｒ，Ｐｈｅ　　（ｐ−ＮＯ２　）、Ｐｈｅ　　（ｍ−Ｎ
Ｏ２　）およびそれらのハロゲン化誘導体がある。 ［０　０　１　２］蛍光ドナーとアクセプター基，Ｘお
よびＹの変化のほかに、基質配列中のアミノ酸も、考慮
される特定のレトロウィルスプロテアーゼに対する親和
性および動力学的特性を至適化するために変化させるこ
とができる。 ［００１３］ＨＩＶプロテアーゼの場合、位置３（Ｎｌ
ｅ）は、Ｌｅｕ，Ｖａｌ，Ｉ　ｌｅ，Ｐｈｅ．Ｔｙｒ，
Ｃｈａおよび他の疎水性残基によって置換できる。位置
２（Ｉｌｅ）は同様に他の疎水性残基に変えることがで
きる。位置］（Ｔｈｒ）はＳｅ　ｒ，Ｇｌｕ，Ａｒｇ，
ＬｙＳ等のような親木性残基で置換することができる。 位置５（Ｇｌｕ）は各種の疎水性および親水性残基によ
って置換できる。位置６（Ａｒｇ）は、親水性残基、Ｌ
ｙｓ，ＨＡｒｇ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ等で置換できる。 ［０　０　１　４］また、ドナーとアクセプターの基の
位置は、位置Ｘにアクセプターまたは消光基を、位置Ｙ
におけるアミノ酸にドナー基を導入することによって交
換することができる。たとえば、Ｘにｐ−ニトロ安息香
酸基を、ＹにＰ　ｈ　ｅ　　（ｍ−ＮＨ２）を使用する
ことができる。 ［００１５］アクセプター基Ｙは、切断生成物のＣ−末
端切片における他の位置に配置されてもよく、たとえは
位置５におけるＧｌｕまたは位置６におけるＡｒｇを置
換してもよい。この場合、位置４は疎水性残基たとえは
Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉ　ｌｅ、Ｐｈｅ、Ｃｈａ、Ｔｙｒお
よびＮｌｅで占拠されることになる。Ｃ−末端アミドは
また同様に、アクセプター基たとえばニトロベンジルア
ミンで置換することができる。これは、基質内のドナー
とアクセプターの間の距離の増大はバックグランド蛍光
を増加し、切断による差を小さくするのであまり望まし
くない。しかしながら、これは、与えられたレトロウィ
ルスプロテアーゼの特定の基質要求に適応するために必
要である。 ［００１６ｌ発明の詳細な説明 本発明を構成する主題については、本明細書の特許請求
の範囲に特定して指摘され、また明瞭に請求されている
が、本発明は、以下の本発明の好ましい態様の、図面を
参照した詳細な説明によって、よりよく理解できるもの
と考える。 ［００１７ｌ図１は、本発明の新規な基質の一例、　Ａ
ｂｚ−Ｔｈｒ　　Ｉｌｅ　　Ｎｌｅ　　Ｐｈｅ　（ｐ　
　ＮＯ２）Ｇｌｎ−Ａｒｇ−ＮＨ２（ＡＢＺ−ＮＦ”−
６）および生成物、Ａｂｚ−Ｔｈｒ−Ｉ　１ｅ−Ｎｌｅ
−ＯＨ（ＡＢＺ−ＴＩＮ−ＯＨ）の０．１ｍＭ溶液の蛍
光発光スペクトル（励起波長＝３３７ｎｍ）を示すグラ
フであり、ドナー（ＡＢＺ）とアクセプター［Ｐｈｅ（
ｐ−Ｎｏ２）〕発色団の近接による基質内での蛍光の消
光が明らかにされている。蛍光の大きさを発光波長に対
してプロットしである。 ［００１８１図２は、Ａｂｚ−Ｔｈｒ−Ｉ　１ｅ−Ｎｌ
ｅＰｈｅ（ｐ−Ｎｏ２）−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−ＮＨ２（Ａ
ＢＺ−ＮＦ”−６）（溶出時間＝４２．１分）ならびに
生成物Ａｂｚ−Ｔｈｒ−Ｉ　１ｅ−Ｎｌｅ−ＯＨ（溶出
時間＝３７．４分）およびＨＰｈｅ　（ｐ　　Ｎ０２）
　　ＧＩｎ−Ａｒｇ−ＮＨ２（溶出時間＝１７．７分）
のＨＰＬＣにおける溶出パターン像を示す。他のピーク
は緩衝液成分によるものである。ＵＶ吸収を時間に対し
てプロットしである。 ［００１９１図３は、蛍光発光が時間の関数として増加
することを示すグラフで、使用した条件下でのアッセイ
の直線部分を示している。初期のキネティックスは、至
適条件（励起＝３３７ｎｍ、発光＝４１０ｎｍ）で電磁
撹拌下２５℃においてＳＬＭ８０００Ｃ蛍光計でモニタ
ノングした。蛍光を時間に対してプロットしである。 ［００２０１本発明の好ましい新規な蛍光原性基質およ
びその類縁体は、たとえばＰ１′位置にＰｈｅ（ｐ−Ｎ
Ｏ２）のようなアクセプター残基ならびにたとえばＮ−
末端位置およびＣ−末端アミドに２−アミノ安息香酸（
Ａｂｚ）のような蛍光原性基の導入のために改良するほ
かは、既知の溶液および固相ペプチド合成法によって作
成することができる。好ましいペプチド合成法は、Ｔａ
ｍら（Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、１０５．６４４２
〜６４４５．１９８３）の操作により改良された慣用の
Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相法（Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅ
ｍ、　Ｓｏｃ、　８５．２１４９〜２１５４．１９６３
）に従うものである。 ［００２１１本発明の特定の好ましい態様をさらに詳細
に例示するため、実験室的製造操作を以下に例示するよ
うに実施した。本発明がこれらの特定の例によって限定
されるものではないことを理解すべきである。 ［００２２］但 材料および方法 ＨＩＶプロテアーゼ基質の固相合成 アセチルへキサペプチドアミドを、ｐ−メトキシベンズ
ヒドリルアミンポリマーを用いる慣用の固相ペプチド合
成によって製造した。各合成ごとに０．５ｇのポリマー
を使用した（０．５モル）。Ｂｏｃ−アミノ酸の導入に
は以下の合成プロトコールを使用した。 脱保護：５０％トリフルオロ酢酸／ＣＨ２Ｃｌ２５分お
よび２５分 ＣＨ２Ｃｌ２　　　２Ｘ１分 イソプロパツール　　　２×１分 ＣＨ２Ｃｌ２　　　２Ｘ１分 中和：１０％ジイソプロピルエチルアミン／ＣＨ２Ｃ１
２３分および５分 ＣＨ２Ｃｌ２　　　２Ｘ１分 ＤＭＦ　　　２Ｘ１分 カップリング：４当量のＢｏｃ−アミノ酸と４当量のジ
イソプロピルカルボジイミド、４当量のヒドロキシベシ
ゾトリアゾールの存在下、ＤＭＦ中２時間。ＤＭＦ中で
のカップリングはカイゼル反応が陽性であった場合には
反復した。完成したペプチドはＴａｍら（Ｊ、　Ａｍ、
　Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、１０５．６４４２〜６４４５．１
９８３）のＨＦ／アニゾール９：１処理によって切断し
た。 粗製ペプチドを２０％酢酸に溶解し、凍結乾燥した。こ
れらをＣ１８半製造用カラム上０．１％ＴＦＡとアセト
ニトリルの勾配を用いて逆相ＨＰＬＣで精製した。それ
らの構造は高分解マススペクトル、ＮＭＲおよびアミノ
酸分析で確認した。 ［００２３］　ＨＰＬＣアッセイ ＨＰＬＣＨＩＶプロテアーゼアッセイは、２個のｃｙＳ
残基（Ｃｙｓ６７、Ｃｙｓ９”　）が遊離スルフヒドリ
ル基による複雑化を消失させるためにアイソステリック
なα−アミノ酪酸で置換した合成ＨＩＶプロテアーゼ（
Ｓｅｈｎｅｉｄｅｒ　　＆　　Ｋｅｎｔ：Ｃｅ１ｌ、５
４．３６３〜３６８．１９８８）、または大腸菌で発現
されたクローン化物質を用いて実施した。試験したすべ
ての場合で、切断パターンおよび阻害結果は同一であっ
た。合成ＨＰＬＣ−精製プロ精製−ロチアーゼ５ｍｇ／
ｍ　１　）をアッセイ緩衝液（２０ｍＭ　　リン酸塩、
２０％グリセロール、０．１％ＣＨＡＰＳ、ｐＨ６，４
）に溶解した。０．１ｍＭの基質２０μｌをアッセイ緩
衝液２０μｌと混合し、保存ＨＩＶプロテアーゼ１０　
／１１を加え、ついで２５℃で所望の時間インキュベー
トした。 １０％ＴＥＡ５０μｌを加えて反応を停止させた。サン
プルをＣ＋５ＨＰＬＣカラムに適用し、０．０５％ＴＦ
Ａで５分間ついで０〜４０％アセトニトリル勾配で４０
分間展開した。阻害実験では、プロテアーゼ溶液１０μ
ｍを２５℃において、０．１ｍＭのインヒビター（ＤＭ
ＳＯに溶解し、アッセイ緩衝液で０．１ｍＭに希釈）２
０μｌとともに１０分間ブレインキュベートした。次に
、試験基質、アセチル−Ｔｈｒ−Ｉ　ｌｅ　−Ｍｅ　ｔ
　−Ｍｅ　ｔ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−ＮＦ２またはＡｂｚ−
ＮＦ傘６．２０μｌを加えて、切断の阻害を測定した。 上述のように反応を停止し、切断率をＨＰＬＣでモニタ
リングした。Ａｂｚ−Ｔｈｒ−Ｉ　Ｉｅ−Ｎｌｅ−Ｐｈ
ｅ　　（ｐＮＯ２）−Ｇ１　ｎ−Ａｒｇ−ＮＦ２の切断
パターンを確認するために、ＨＰＬＣで判断されるよう
に切断を完結させ、２種の生成物のピークをＨＰＬＣで
単離した。合成ＨＩＶプロテアーゼまたは大腸菌から発
現され精製された酵素、いずれとのインキュベーション
でも同じＨＰＬＣパターンが得られた（図２）。基質の
保持時間は４１．１分、一方Ａｂｚ−Ｔｈｒ−Ｉ　１ｅ
−Ｎｌｅでは３７．４分、Ｐｈｅ　（ｐ−ＮＯ２）−Ｇ
ｌｎ−Ａｒｇ−ＮＦ２では１７．７分であった。生成ペ
プチドの同一性はＦＡＢＭＳおよびアミノ酸分析で確認
された。 ［００２４］蛍光スペクトル 励起および発光スペクトルはＳＬＭ８０００分光計で測
定した。基質、Ａｂｚ−ＮＦ”　−６およびＮ−末端生
成物、Ａｂｚ−Ｔｈ　ｒ−Ｉ　１ｅ−Ｎｌｅ−ＯＨはい
ずれも吸収極大を３３７ｎｍに、広い発光極大を３９０
〜４４０ｎｍに示す。基質と生成物を同時濃度で比較す
ると、酵素による加水分解で励起は１０倍、発光は６倍
と劇的な増大を示す。初期力イネティクスは、至適条件
で（励起＝３３７ｎｍ、発光＝４１０　ｎｍ）　、電磁
撹拌器で撹拌しながら２５℃でモニタリングした。

【００２５】Ｕｖスペクトル 基質、Ａｂｚ−ＮＦ”−６およびＮ−末端生成物、Ａｂ
ｚ−Ｔｈｒ−Ｉ　１ｅ−Ｎｌｅ−ＯＨの吸収スペクトル
はＢｅｃｈｍａｎ　　ＤＵ−８分光光度計で記録した。 基質は極大を２３８　ｎｍおよび２５４ｎｍに示すが、
分裂生成物は極大を３１８ｎｍおよび２５２　ｎｍに示
す。 ［００２６］蛍光アツセイ ９６−ウェルＥＬＩＳＡプレート上の蛍光測定はＴｉｔ
ｅｒｔｅｋ　　Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ　　ＩＩ、Ｖｅｒ
ｓｉｏｎ３．１を用いて行った。３５５ｎｍの励起フィ
ルターおよび４３０ｎｍの発光フィルターを使用した。 ＨＩＶプロテアーゼの保存溶液（０，１ｍｇ／ｍ１）１
０μｌを５種の異なる濃度のＡｂｚ−ＮＦ”−６と、最
終容量１００μｍ、３７℃でインキュベートし、各ウェ
ルにつき５分毎に蛍光の増大をモニタリングした。１ｍ
ＭＡｂｚ−ＮＦ”　−６のＤＭＳＯ中保存溶液を使用し
た。蛍光強度の変化と生成物の濃度の変化の関係の標準
曲線を使用して、蛍光変化をモル速度に変換した。イン
ヒビターのＫｉ測測定ための濃度範囲を予め定めるため
には、予備アッセイをＨＰＬＣで行うのが便利なことが
わかった。アッセイ緩衝液（ｐＨ６，４）中　０．１ｍ
Ｍのインヒビター２０μｌとＨＩＶプロテアーゼ（０，
０５ｍｇ／ｍ１の保存溶液）１０Ｉｚｌとを２５℃で５
〜１０分間ブレインキュベートした。０．１ｍＭＡｂｚ
−ＮＦ”−６，２０μｌを加え、反応を１時間続けた。 １０％ＴＦＡ　　６０μｌを加えて反応を停止させ、切
断量をＨＰＬＣで測定した。インヒビターの不存在下に
は、完全な切断が起こる。残った基質の量により、評価
されたＫｉから蛍光アッセイのためのインヒビターの濃
度範囲の適当な選択が可能になる。 ［００２７１懸 発色団基質として可能性のある次の配列の６種のペプチ
ドを製造した。 Ｈ−＄＠ｒ−Ｐｈ＠−Ａｓｎ−Ｐｈｅ　（Ｐ−Ｎｏ２）
４ｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−’ｍべ凪■−＾ｒｇ−Ｌｙｓ
−Ｚｌｅ−Ｌｅｕ−１’ｈ＊（ｐ−Ｎｏ２　）−Ｔ、ｅ
ｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−４ＸＨ−コ「−一−ｋｍ−！’ｈ
ｅ（ｐ−）Ｅ）１　）−Ｅ’２：Ｏ−Ｅｌ＠−Ｂ＠ｒニ
ー１’１：ｏ−ｏＨＡｃ−Ｌａｕ−Ａｓｉｎ−Ｊｈ＠（
ｍ→メ言）−Ｐｒｏ−Ｘ１ｅ−５ｅＱニーｋＫＥｉｌム
ｃ−Ｔｈｒ−１１ｅ−ｐｈａ　（ｐ−Ｎｏ、　）−１ｉ
Ｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｑ−ＭＥ。 Ａｃ４ｂｒ−！１ａ−ＮｌｅＪｈ＊　（Ｐ−Ｎｏｔ　）
−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｎｉ！。 これら６種のペプチド中、最後のＰ１′位置にＰｈｅ（
ｐ−ＮＯ２）をもつもののみが、所望のＨＰＬＣアッセ
イ条件および１時間のインキュベーション時間で切断を
示した。Ｈｙｌａｎｄら（前出）は、上に製造したもの
とやや類似のただしカルボキシ末端のアミノ酸が保護さ
れている発色団オクタペプチド基質、Ａｃ−ＡｒｇＬｙ
ｓ−’Ｉ　Ｉｅ、Ｌｅｕ−Ｐｈｅ　（ｐ−ＮＯ２）−Ｌ
ｅｕ−Ａｓ　ｐ　−Ｇ　１　ｙ−ＮＦ２を報告している
。Ｎａ５ｈａｄら（前出）は２種の発色団ペプチド基質
で、分光測光法によるアッセイの基礎になるＡｃ−Ｌｙ
ｓ−Ａｌａ−３ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ　（ｐ−ＮＯ２）
−Ｐｒｏ−Ｖａ　１−Ｖａ　１−ＮＦ２およびＨ−Ｔｈ
　ｒ−Ｐｈｅ　−Ｇ　１ｎ−Ａｌａ−Ｐｈｅ　（ｐ−Ｎ
Ｏ２）　−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｒ　ｇ　−Ａ　ｌ　ａ−
ＯＨを報告している。しかしながら、これらの３種の場
合は、加水分解が発色団残基をＣ末端に残して起こるの
で、大きなスペクトル変化を生じる。 Ｎ末端における発色団残基の場合にみられる小さなスペ
クトル変化により、本明細書において定義される新規な
蛍光原性基質が開発され、新規な蛍光測定アッセイが得
られた。

【００２８】へキサペプチド基質、Ａｃ−Ｔｈｒ−ＩＩ
ｅ−Ｎｌｅ−Ｐｈｅ　（ｐ−ＮＯ２）−Ｇｌｎ−Ａｒｇ
−ＮＦ２の、Ｃ−末端生成物にアクセプター残基をもた
せる改良には、ドナー蛍光基をＮ−末端生成物に付加す
る必要がある。アセチル基を２−アミノ安息香酸（Ａｂ
２）で置換することにより、新規な蛍光原性ペプチド、
Ａｂｚ−Ｔｈｒ−Ｉ　１ｅ−Ｎｌｅ−Ｐｈｅ　　（ｐ−
Ｎ０２　）　−Ｇ　１　ｎ　−Ａ　ｒ　ｇ−ＮＦ２が得
られ、Ｃａｒｍｅｌ　　＆　　Ｙａｒｏｎ　（Ｅｕｒ、
Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、８７．２６５〜２７３．１９７８
）がアンギオテンシン変換酵素の基質に使用したのと同
じドナーとアクセプターの組合せを与えた。これらの著
者は、消光効果はドナーとアクセプター発色団の一近位
性に依存することを示していたので、Ｐ３の位置にＡｂ
ｚ基をもつ類縁体、ＡｂｚＩ　ｌ　ｅ　−Ｎ　１　ｅ−
Ｐｈｅ　（ｐ　−ＮＯ２）　−Ｇ　ｌ　ｎ　−Ａｒｇ−
ＮＦ２が本発明者らによって合成された。しかし、切断
効率は劇的に低下した。上記の本発明の新規なヘキサペ
プチド基質、Ａｂｚ　−ＮＦ”　−６は蛍光原の不完全
な消化により少量の蛍光バックグランドを示すが、加水
分解すると、図１に見られるように３９０〜４４０ｎｍ
の広い極大として蛍光の約６倍の増大が認められる。他
の各種の蛍光基が、合成ＨＩＶプロテアーゼとＭＶＴ−
１０１，類似構造のインヒビター、Ａｃ−Ｔｈｒ■１ｃ
ｍＮ１ｃ−ψ［ＣＨ２Ｎｍ　−Ｎ　ｌ　ｅ　−Ｇ　ｌ　
ｎＡｒｇ−ＮＦ２との複合体Ｘ線結晶構造にみられる（
Ｍｉｌｌｅｒら：５ｃｉｅｎｃｅ、２４６．１１４９〜
１１５２．１９８９）その表面位置と一致するＰ４位置
に導入可能である。 ［００２９］合成ＨＩＶプロテアーゼによるＡｂｚ−Ｎ
Ｆ“−６の切断の動力学の測定では、１５％未満の基質
が酵素によって切断される場合、２０分以上の反応時間
にわたって直線状のカイネテイックスをもつ典型的なミ
カエリス−メンテンの挙動を示した（図３）。反応の直
線相から計算した速度のラインライ−バー・パーク・プ
ロワ１〜はＫｍ＝１１０ｍＶを与えた。Ｖａｍｘは３．
４５ｍＭ／ｍｉ　ｌ、Ｋｃａｔ＝２．９ｓｅｃ　　’　
と計算された。Ｎａ５ｈｅｄら（Ｂｉｏｅｈｅｍ、Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、１６３．１０７９
〜１０８５、　１９８９）の発色団基質のＫｍは４５０
ｍＭ以上と評価された。Ａｂｚ　−ＮＦ”　−６の合成
ＨＩＶプロテアーゼについてのＫｃａｔ／Ｋｍ比は２６
，３６４Ｍ−ｌ５−１であるが、Ｎａ５ｈｅｄら（前出
）のノナペプチド発色団基質の比は、大腸菌で発現され
た精製ＨＩＶプロテアーゼを用いて２３．ＯＯＯＭ−Ｉ
　Ｓ−１と評価された。 ［００３０１本発明の新規な蛍光原性基質、Ａｂ　ｚ　
＝−ＮＦ”−６を用いることにより、インヒビターの親
和性の測定が可能な、ＨＩＶプロテアーゼインヒビター
候補物質のスクリーニング法が確立された。８個のウェ
ルにより、ジクソンプロットに基づ＜Ｋｉ値（１／ｖ　
　ｖｓ、インヒビター濃度）の計算に最低限十分な、２
種の基質濃度について各４種の異なるインヒビター濃度
の測定が可能になる。蛍光は２０分間２分間隔で測定し
た。すなわち２０分間に１２個のインヒビターの親和性
の測定が実行可能である。１個のＫｉの測定に約３０回
の別個のＨＰＬＣの実行を要し、その実行それぞれに約
１時間かかるＨＰＬＣ分析法とは対照的である。しかし
ながら、定常的ではそれぞれ二重に測定試行を行うこと
が好ましく、また標準インヒビターの測を包含させると
して、Ｋｉの測定可能数は１時間あたり１５となる。 ［００３１１本明細書では、アミノ酸は標準の３文字省
略記号によって、次のように示す。 略号　　　　　　アミノ酸 Ａｌａ　　　　　　アラニン Ｃｙｓ　　　　　　　システィン Ａｓｐ　　　　　　　アスパラギン酸 Ｇｌｕ　　　　　　　グルタミン酸 Ｐｈｅ　　　　　　　フェニルアラニンＧ１ｙ　　　　
　　グリシン Ｈｌｓ　　　　　　　ヒスチジン １１ｅ　　　　　　　イソロイシン Ｌｙｓ　　　　　　　リジン Ｌｅｕ　　　　　　　ロイシン Ｍｅｔ　　　　　　　メチオニン Ａｓｎ　　　　　　　アスパラギン Ｐｒｏ　　　　　　　　プロリン Ｇｌｎ　　　　　　　グルタミン Ａｒｇ　　　　　　　アルギニン Ｓｅｒ　　　　　　セリン Ｔｈｒ　　　　　　　スレオニン Ｖａｌ　　　　　　バリン Ｔｒｐ　　　　　　　）リブトファン Ｔｒ　　　　　　　チロシン ［００３２］本明細に用いた他の標準的な略号には、Ｎ
１ｅ＝ノルロイシン Ａｂｚ＝２−アミノ安息香酸 Ａ、ｃ＝ニアセチ ルｈａ＝シクロへキシルアラニン ＴＥＡ＝トリフルオロ酢酸 ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド ＣＨＡＰＳ＝３−　（３−グロロアミドプロビル）−ジ
メチルアンモニオ）−１−プロパンスルホン酸、および
ＦＡＢＭＳ＝蛍光抗体マススペクトル がある。 ［００３３］以上の開示を読めば、本技術分野の熟練者
には、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、
様々な他の例が明らかであろう。このような他の例はす
べて、本発明の特許請求の範囲に包含されるものである
。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の基質、ＡＢＺ　　ＮＦ傘−６
および生成物　ＡＢＺ−ＴＩＮ−ＯＨの蛍光発光スペク
トルを示すグラフである。

【図２】図２は、本発明の基質、ＡＢＺ−ＮＦゝ−６な
らびにその生成物２種のＨＰＬＣにおける溶出パターン
を示す図である。

【図３】図３は、本発明の方法における蛍光発光が時間
とともに増加することを示すグラフである。

【手続補正書】

【提出日】平成３年３月１４日

【手続補正１】

【補正対象項目名】明細書

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正内容】

【書類名】　　　明細書

【発明の名称】　レトロウィルスプロテアーゼの活性苓
測定する試薬および方法

【特許請求の範囲】

【請求項１】次の化学構造：　Ｘ−Ｔｈ　ｒ　−Ｉ　ｌ
　ｅ　−Ｎ　１ｅ−Ｐｈｅ　　（Ｙ）−Ｇｌｎ−Ａｒｇ
−ＮＨ２（式中、）は蛍光原性基であり、Ｙはその蛍光
原性基のアクセプターである）を有するレトロウィルス
プロテアーゼの蛍光原性基質。

【請求項２】次の化学構造：　ＡｂＺ−Ｔｈ　ｒ−Ｉ　
１　ｅ　−Ｎ　ｌ　ｅ−Ｐｈ　ｅ　　（Ｐ−ＮＯ２）　
−Ｇ　Ｉ　１ｌ−Ａｒ　ｇ−Ｎ）］２を有するレトロウ
ィルスプロテアーゼの蛍光原性基質。

【請求項３】既知量の蛍光原性基質：Ｘ−Ｔｈｒ−ＩＩ
ｅ−Ｎｌｅ−Ｐｈｅ　　（Ｙ）　−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｎ
Ｈ２（式中、Ｘは蛍光原性基であり、Ｙはその蛍光原性
基に対するアクセプターである）を分光測光蛍光計の蛍
光セルに取り、既知量のレトロウィルスプロテアーゼと
３７℃でインキュベートし、蛍光の経時的変化を測定し
、ついで蛍光強度の変化と生成物の濃度変化と関連づけ
る標準曲線に対して比較することによってレトロウィル
スプロテアーゼのモル速度を求めることからなるレトロ
ウイルスプロテアーゼ活性の蛍光測光による測定方法。

【請求項４】レトロウィルスプロテアーゼはＨＩＶプロ
テアーゼである「請求項３」記載の方法。

【請求項５】既知量の蛍光原性基質：ＡｂＺ−Ｔｈｒ　
−Ｉ　１ｅ−Ｎｌｅ−Ｐｈｅ　（Ｐ−ＮＯ２）　−ＧＩ
ｎ−Ａｒｇ−ＮＨ２を分光測光蛍光計の蛍光セルに取り
、既知量のレトロウィルスプロテアーゼと３７℃でイン
キュへ−１−シ、蛍光の経時的変化を測定し、ついで蛍
光強度の変化と生成物の濃度変化とを関連づける標準曲
線に対して比較することによってレトロウィルスプロテ
アーゼのモル速度を求めることからなるレトロウィルス
プロテアーゼ活性の蛍光測光による測定方法。

【請求項６】レトロウィルスプロテアーゼはＨＩＶプロ
テアーゼである「請求項５」記載の方法。

【発明の詳細な説明】

［０００１１発明の１　本発明はレトロウイルスプロテ
アーゼ、たとえばヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩＶ）プ
ロテアーゼの活性を測定する試薬および方法に関する。 さらに詳しくは、本発明はＨＩＶプロテアーゼおよび他
のし１−ロウイルスプロテアーゼに対する新規な蛍光原
性基質および蛍光測光検定法に関する。 ［０００２ｆｆわずか数年前までは珍しい疾患であった
後天性免疫不全症候群は、現在では重大な疾患になって
いる。その結果、ＡＩＤＳに打克つ薬剤およびワクチン
の開発のために肥大な努力が払オっれてきた。１９８３
年にはじめて固定されたＡＩＤＳウィルスはいくつかの
名前で呼ばれてきた。それは第三番目に知られたＴ−リ
ンパ球ウィルス（ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｉ　Ｉ）であり、免疫
系内で複製する能力を有し、したがってＴ４＋Ｔ−細胞
（またはＣＤ４＋細胞）の著しい破壊を招く　（たとえ
ば、Ｇａ１ｌｏら：５ｃｉｅｎｃｅ、２２４：５００〜
５０３．１９８４およびＰｏｐｏｖ　ｉｃら：同誌：４
９７〜５００．１９８４参照）。このレトロウィルスは
、リンパ腺症関連ウィルス（ＬＡＶ）またはＡＩＤＳ関
連ウィルス（ＡＲＶ）としても知られ、つい最近、ヒト
免疫不全症ウィルス（ＨＩ　Ｖ）と呼ばれるようになっ
た。２種の異なるＡＩＤＳウィルス、ＨＩＶ−１とＨＩ
Ｖ−２が知られている。ＨＩＶ−１は１９８３年にＭｏ
ｎｔａｇｎｉｅｒと共同研究者によってパリのＰａ５ｔ
ｅｕｒ　　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅで始めて確認されたウィ
ルスであり　（Ａｎｎ、Ｖｉｒｏ［、Ｉｎ５ｔ、Ｐａ５
ｔｅｕｒ　　１３５Ｅ、１１９〜１３４．１９８４）、
一方ＨＩＶ−２はさらに最近、１９８６年にＭＯｎｔａ
ｇｎｉｅｒと共同研究者によって単離された（Ｎａｔｕ
ｒｅ、３２６：６６２．１９８７）。本明細書において
用いられるＨＩＶの語は、一般的な意味でこれらのウィ
ルスを指すものである。 ［０００３］最近検討されているＡＩＤＳの処置へ利用
できる可能性のある有用なアプローチとして、レトロウ
ィルスプロテアーゼの阻害剤である合成ペプチドの開発
がある。すなわち、ヒ［〜免疫不全症ウィルス（ＨＩ　
Ｖ）を含めてレトロウィルスは、宿主によるポリ蛋白質
の合成を指図することによってそれ自身の遺伝子内容を
発現することが知られている。この前駆体はついで蛋白
分解による処理を受け、主要なウィルス酵素と構造蛋白
質を与える。ウィルスによってコードされた酵素、レト
ロウィルスプロテアーゼはポリ蛋白質内に含有され、ポ
リ蛋白質の特異的切断による成熟ウィルス蛋白質の生成
の役目を担っている。 ［０００４１ＨＩＶプロテアーゼのようなレトロウィル
スプロテアーゼの、本発明者らによって開発された様々
の新規なペプチドインヒビターはたとえばＰ　２４／Ｐ
　］５のようなＨＩＶ切断部位に由来する約４〜８個の
アミノ酸残基の短いペプチドであり、これらは内部ＣＨ
２ＮＨ結合アイソステイアを導入して修飾さねでいる。 このようなペプチドの例は次の通りである。

【式４１　Ａｃ−Ｔｈｒ　−Ｉ　１ｅ−Ｎｌｅ−ｖ［Ｃ
Ｈ２ＮＩ−月　−Ｎ１ｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−ＮＩ−（２
［０００５］すなわち、ＨＩＶプロテアーゼは、ＡＩＤ
Ｓ薬剤の研究における論理にかなった治療標的である。 ＨＩＶプロテアーゼインヒビターの可能性の検討を容易
にし、リード化合物を至適化するためには、インヒビタ
ーの動力学的特性づけに便利な、自動化と高い処理量が
可能なアッセイが望まれる。ＨＩＶプロテアーゼの特性
づけに用いられた初期のアッセイは生成物と基質の固定
された時間間隔でのＨＰＬＣ分離に基づくものであった
（たとえばＭｏｏｒｅら：Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｎ　　
ｈｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、１５９，４２０〜４２５
．１９８９；Ｄａｒｋｅら：同誌１５６，２９７−３０
３．１９８８；５ｃｈｎｅｉｄｅｒ　　＆Ｋｅｎｔ：Ｃ
ｅ１ｆ　　５４，３６：３〜３６８．１９８８参照）。 ＨＰＬＣアッセイは直ちに、所望の治療性を有するＨＩ
Ｖプロテアーゼインヒビターの開発の律速工程となった
。インヒビターとＨＩＶプロテアーゼの相互作用の定量
的動力学的時けづけが可能な連続アッセイが好ましい。 色素原性または蛍光原性基質を開発する策略が、本発明
者らにより、既知ＨＩＶプロテアーゼ切断部位の短いペ
プチド基質を特性づけた本発明者らの仕事に基づいて提
案された（Ｔｏｔｈら：Ｐｒｏｃ、Ｉｌｅｈ　　Ａｍ、
Ｐｅｐｔｉｄｅ　　Ｓ　　ｍ　　、、Ｒｉｖｅｒ　　＆
　　Ｍａｒｓｈａｌ１編、ＥＳＣＯＭ、Ｌ、ｅｉｄｅｎ
、印刷中、１９９０）。加水分解酵素に対する蛍光原性
基質は、その高い感度により、生化学の分野で広く用い
られてきた（たとえばＧｕ　！　１ｂａｕ１　ｊ　：Ｅ
ｎｚｙｒｎａｔ　ｉＣＭｅ　ｊｈｏｄｓｏｆ　　Ａｎａ
ｌｙｓｉｓ、ＰｃｒｇａｍｏｎＰｒｅｓｓ、１９７０．
４３〜４７頁参照）。 ［０００６］最近、Ｎａ５ｈｅｄら（Ｂ　ｉ　ｏ　ｓ　
ｈｅｍ。 Ｂｉｏｐｈ　　ｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、１６３．１
９７９〜１０８５．］、Ｏ９９およびＨｙｌａｎｄら：
Ａｂ８ｔｒ、２ｎｄ、ｉｎｔ、Ｃｏｎｆ、Ｄｒｕ　　ｓ
　　Ｒｅｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　　１ｃａｎｄ　　Ｉｎ
ｆｅｃｔｉａｕＳ　　Ｄｉｓｅａｓｅ、ＡＩＤＳ、Ｎｅ
ｗ　　ＹｏｒｋＡｃａｄ、Ｓｃｉ、ｌ−２０，１９８０
）は、Ｐ１位置にＰ　−Ｎｏ２−Ｐｈｅを含有する切断
色素原性基質に基づく分光測光アッセイを報告した。こ
れらの場合、基質はオクタペプチド、ノナペプチドおよ
びデカペプチドであった。連続的ではないが、高い処理
量が達成できる放射測定法によるＨＩＶプロテアーゼイ
ンヒビターのスクリニングアッセイ法がまた、Ｈｙｌａ
ｎｄら（前出）によって報告されている。 ［０００７］発明の詳細な説明　本発明によれば、レト
ロウィルスプロテアーゼ、たとえばＨＩＶプロテアーゼ
の新規な蛍光原性基質、およびこれらの基質を用いるそ
の蛍光測定アッセイが提供される。 ［０００８］好ましい新規な基質は、ＨＩＶプロプアー
ゼのｐ２４／ｐ１５切断部に由来するヘキサペプチドＡ
ｃ、Ｔｈｒ−Ｉ　Ｉｅ−Ｎｌｅ−Ｎｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｒ
ｇＮＨ２に基づいている。このヘキサペプチドはこの場
合、蛍光原性基たとえば２−アミノ安息香酸（Ａｂｚ）
を好ましくはアセチル基（Ａ　ｃ　）の代わりにドナー
として導入し、蛍光原性基のアクセプターたとえばＰ−
二１〜口フェニルアラニン（ｐ　−ＮＯ２Ｐ　ｈ　ｅ）
を好ましくはＰド位置にアクセプターとして導入して修
飾し、新規な分子内消光蛍光原性基質、Ｘ−Ｔｈｅ　−
Ｉ　ｌ　ｅ　−Ｎｌｅ−Ｐｈｅ　　（Ｙ）　−ＧＩｎ−
Ａｒｇ−ＮＨ２（式中、Ｘは蛍光原性基であり、Ｙは蛍
光原性基のアクセプターである）を提供する。好ましい
蛍光原性基質はしたがって、Ａｂｚ−Ｔｈｅ−Ｉ　Ｒｅ
−Ｎ１ｅ−Ｐｈｅ　（ｐ　−ＮＯ？）　−Ｇ　Ｉ　ｎ−
Ａｒ　ｇ−ＮＨ２である。便宜上、この新規な基質を本
明細書ではＡｂｚ　−ＮＦ”　−６とも呼ぶことにする
。 ［０００９］新規な蛍光測光アッセイは、既知量の蛍光
原性基質を分光測光蛍光計の蛍光セルに取り、既知量の
レトロウィルスプロテアーゼと３７℃でインキュベ−１
・し、経時的な蛍光の変化を測定し、蛍光強度の変化を
生成物の濃度変化と関連づけた標準曲線と比較すること
によってレトロウィルスプロテアーゼのモル速度を求め
ることからなるレトロウイルスプロテアーゼたとえばＨ
Ｉ■プロテアーゼの測定方法である。 ［００１０１上述の好ましい蛍光原性基質には、様々な
修飾が可能で、し１−ロウイルスプロテアーゼの蛍光測
光アッセイにおいて実質的に同様な有利な結果が得られ
ることは明らかである。すなわち、ＨＩＶプロテアーゼ
のアッセイに際しては、Ｘは任意の蛍光原性基（アシド
ラセン、アミノベン゛ゾイル、インドール、アミノエチ
ルナフチル等）およびその修飾された基でＮ末端アミノ
官能基に結合し、たとえばＡｂｚ、ダンシル（５−ジメ
チルアミノ−ナフタレン−１−スルホニル）、ニコチン
酸、４−グアニジノ安息香酸およびそれらの誘導体、た
とえばＮ−メチルＡｂｚ、４−クロロ−Ａｂｚ、５−ク
ロロＡｂｚ、６−クロロ−Ａｂｚ、３．５−ジブロモＡ
ｂ２；ニコチン酸の誘導体たとえば６−アミノ、２−ア
ミノ、２−クロロニコチン酸およびニフルム酸；４−グ
アニジノ安息香酸の誘導体；ダンシルの誘導体；その他
の誘導体である。 ［００１］、］Ｙは、蛍光原性ドナーＸの蛍光エネルギ
ーを吸収し、ＸとＹが共有結合的に接近した近位に保持
された場合、蛍光発光を減衰させる消光芳香族基を有す
る任意のアミノ酸誘導体である。例としてはＴｒｐ、Ｔ
ｙｒ、　　Ｐｈｅ　　（Ｐ−ＮＯ２）　、　　Ｐｈｅ　
（ｒｎ−ＮＯ２）およびそれらのハロゲン化誘導体があ
る。 ［００１２３蛍光ドナーとアクセプター基、ＸおよびＹ
の変化のほかに、基質配列中のアミノ酸も、考慮される
特定のレトロ「フィルスプロテアーゼに対する親和性お
よび動力学的特性を至適化するために変化させることが
できる。 ［００１３ｆｆＨＩＶプロテアーゼの場合、位置３（Ｎ
ｌｅ）は、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉ　ｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ
、Ｃｈａおよび他の疎水性残基によって置換できる。位
置２（Ｉｌｅ）は同様に他の疎水性残基に変えることが
できる。位置１（Ｔｈｒ）はＳｅ　ｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ
、ＬｙＳ等のような親水性残基で置換することができる
。位置５（Ｇｌｕ）は各種の疎水性および親水性残基に
よって置換できる。位置６（Ａｒｇ）は、親水性残基、
Ｌｙｓ、ＨＡｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ等で置換できる。 ［００１４］また、ドナーとアクセプターの基の位置は
、位置Ｘにアクセプターまたは消光基を、位置Ｙにおけ
るアミノ酸にドナー基を導入することによって交換する
ことができる。たとえば、Ｘにｐ−ニトロ安息香酸基を
、ＹにＰ　ｈ　ｅ　　（ｍ　　＝ＮＨ２）を使用するこ
とができる。 ［００１５］アクセプター基Ｙは、切断生成物のＣ−末
端切片における他の位置に配置されてもよく、たとえば
位置５におけるＧｌｕまたは位置６におけるＡｒｇを置
換してもよい。この場合、位置４は疎水性残基たとえば
Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉ　ｌｅ、Ｐｈｅ、Ｃｈａ、Ｔｙｒお
よびＮｌｅで占拠されることになる。Ｃ−末端アミドは
また同様に、アクセプター基たとえばニトロベンジルア
ミンで置換することができる。これは、基質内のドナー
とアクセプターの間の距離の増大はバックグランド蛍光
を増加し、切断による差を小さくするのであまり望まし
くない。しかしながら、これは、与えられたレトロウィ
ルスプロテアーゼの特定の基質要求に適応するために必
要である。 ［００１６ｌ発明の詳細な説明　本発明を構成する主題
については、本明細書の特許請求の範囲に特定して指摘
され、また明瞭に請求されているが、本発明は、以下の
本発明の好ましい態様の、図面を参照した詳細な説明に
よって、よりよく理解できるものと考える。 ［００１７ｌ図１は、本発明の新規な基質の一例、Ａｂ
ｚ−Ｔｈｒ−Ｉ　１　ｅ−Ｎｌｅ−Ｐｈｅ　（ｐ　−Ｎ
Ｏ２）　−Ｇ　ｌ　ｎ−Ａｒ　ｇ−ＮＨ２（ＡＢＺ−Ｎ
Ｆ”−６）および生成物、Ａｂｚ−Ｔｈｒ−Ｉ　１ｅ−
Ｎｌｅ−ＯＨ（ＡＢＺ−ＴＩＮ−ＯＨ）の０．１ｍＭ溶
液の蛍光発光スペクトル（励起波長＝３３７ｎｍ）を示
すグラフであり、ドナー（ＡＢＺ）とアクセプター［Ｐ
ｈｅ（ｐ−ＮＯ２）１発色団の近接による基質内での蛍
光の消光が明らかにされている。蛍光の大きさを発光波
長に対してプロットしである。 ［００１８１図２は、Ａｂｚ−Ｔｈｒ−Ｉ　１ｅ−Ｎｌ
ｅ−Ｐｈｅ　　（ｐ　　Ｎ０２）　　　Ｇｌｎ−Ａｒｇ
−ＮＨ２（ＡＢＺ−ＮＦ”　−６）　　（溶出時間＝４
２．１分）ならびに生成物Ａｂｚ−Ｔｈｒ−Ｉ　１ｅ−
Ｎｌｅ−ＯＨ（溶出時間＝３７．４分）およびＨ−Ｐｈ
ｅ（ｐ−ＮＯ２）　　ＧＩｎ　　Ａｒｇ−ＮＨ２（溶出
時間＝１７．７分）のＨＰＬＣにおける溶出パターン像
を示す。他のピークは緩衝液成分によるものである。Ｕ
Ｖ吸収を時間に対してプロットしである。 ［００１９ｌ図３は、蛍光発光が時間の関数として増加
することを示すグラフで、使用した条件下でのアッセイ
の直線部分を示している。初期のキネティックスは、至
適条件（励起＝３３７ｎｍ、発光＝４１０ｎｍ）で電磁
攪拌下２５℃においてＳＬＭ８０００Ｃ蛍光計でモニタ
リングした。蛍光を時間に対してプロットしである。 ［００２０１本発明の好ましい新規な蛍光原性基質およ
びその類縁体は、たとえばＰド位置にＰｈｅ（ｐ−Ｎ０
２）のようなアクセプター残基ならびにたとえばＮ末端
位置およびＣ−末端アミドに２−アミノ安息香酸（Ａｂ
ｚ）のような蛍光原性基の導入のために改良するほかは
、既知の溶液および固相ペプチド合成法によって作成す
ることができる。好ましいペプチド合成法は、Ｔａｍら
（Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、１０５．６４４２〜６
４４５．１９８３）の操作により改良された慣用のＭｅ
ｒｒｉｆｉｅｌｄの固相法（、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ
、　Ｓｏｃ・８５．２１４９〜２１５４．１９６３）に
従うものである。 ［００２１１本発明の特定の好ましい態様をさらに詳細
に例示するため、実験室的製造操作を以下に例示するよ
うに実施した。本発明がこれらの特定の例によって限定
されるものではないことを理解すべきである。 ［００２２ｌ例　材料および方法　ＨＩＶプロテアーゼ
基質の固相合成　アセチルへキサペプチドアミドを、ｐ
−メトキシベンズヒドリルアミシポリマーを用いる慣用
の固相ペプチド合成によって製造した。各合成ごとに０
．５ｇのポリマーを使用した（０．５モル）。Ｂｏｃア
ミノ酸の導入には以下の合成プロトコールを使用した。 脱保護：５０％トリフルオロ酢酸／ＣＨ２Ｃｌ２５分お
よび２５分Ｃ８２Ｃ１２２Ｘ１分イソプロパツール　２
×１分ＣＨ２Ｃｌ２　　２Ｘ１分中和：１０％ジイソプ
ロピルエチルアミン／ＣＨ２ＣＩ２３分および５分ＣＨ
２Ｃｌ２２Ｘ１分ＤＭＦ　　　２Ｘ１分カップリング：
４当量のＢｏｃ−アミノ酸と４当量のジイソプロピルカ
ルボジイミド、４当量のヒドロキシベンゾトリアゾール
の存在下、ＤＭＦ中２時間。ＤＭＦ中でのカップリング
はカイゼル反応が陽性であった場合には反復した。完成
したペプチドはＴａｍら（Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、Ｓ
ａｃ、１０５，６４４２〜６４４５．１９８３）のＨＦ
／アニソール９：１処理によって切断した。粗製ペプチ
ドを２０％酢酸に溶解し、凍結乾燥した。これらをＣｐ
ｓ半製造用カラム上０．　　］％ＴＦＡとアセトニトリ
ルの勾配を用いて逆相ＨＰＬＣで精製した。それらの構
造は高分解マススペクトル、ＮＭＲおよびアミノ酸分析
で確認した。 ［００２３］　ＨＰＬＣアッセイ　ＨＰＬＣＨＩＶプロ
テアーゼアッセイは、２個のＣｙｓ残基（Ｃｙｓ６７゜
Ｃｙｓ９５）が遊離スルフヒドリル基による複雑化を消
失させるためにアイソステリックなα−アミノ酪酸で置
換した合成ＨＩＶプロテアーゼ（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ＆
　　Ｋｅｎｔ：Ｃｅ１ｌ、５４，３６３〜３６８．１９
８８）、または大腸菌で発現されたクローン化物質を用
いて実施した。試験したすべての場合で、切断パターン
および阻害結果は同一であった。合成ＨＰＬＣ−精製プ
ロ精製−ロチアーゼ５ｍｇ／ｍｌ）をアッセイ緩衝液（
２０ｍＭリン酸塩、２０％グリセロール、０．１％ＣＨ
ＡＰＳ、ＰＨ６−４）に溶解した。０．１ｍＭの基質２
０　ｌｔｌをアッセイ緩衝液２０μｍと混合し、保存Ｈ
ＩＶプロテアーゼ１０μｌを加え、ついで２５℃で所望
の時間インキュベートした。１０％ＴＥＡ５０μｌを加
えて反応を停止させた。サンプルをＣ１ｓ　ＨＰＬＣカ
ラムに適用し、０．０５％ＴＦＡで５分間ついで０〜４
０％アセトニトリル勾配で４０分間展開した。阻害実験
では、プロテアーゼ溶液１０μ■を２５℃において、０
゜１ｍＭのインヒビター（ＤＭＳＯに溶解し、アッセイ
緩衝液で０．１ｍＭに希釈）２０μｌとともに１０分間
ブレインキュベートした。次に、試験基質、アセチル−
Ｔｈｒ−Ｉ　Ｉｅ−Ｍｅ　ｔ　−Ｍｅ　ｔ−Ｇｌｎ−Ａ
ｒｇ−ＮＨ；シまたはＡｂ　ｚ−Ｎ　Ｆ傘−６，２０μ
ｍを加えて、切断の阻害を測定した。上述のように反応
を停止し、切断率をＨＰＬＣでモニタリングした。Ａｂ
ｚ−Ｔｈｒ−Ｉ　１ｅ−Ｎｌｅ−Ｐｈｅ　（ｐ−ＮＯ２
）　−Ｇｌｎ−ＡｒｇＮＨ２の切断パターンを確認する
ために、ＨＰＣＬ、で判断されるように切断を完結させ
、２種の生成物のピークをＨＰＬＣで単離した。合成Ｈ
ＩＶプロテアーゼまたは大腸菌から発現され精製された
酵素、いずれとのインキュベーションでも同じＨＰＬＣ
パターンが得られた（図２）。基質の保持時間は４１．
１分、一方Ａｂｚ〜Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｎｌｅでは３７．
４分、Ｐｈｅ　（ｐ−Ｎ。 ２）　−Ｇ　１　ｎ−Ａｒ　ｇ−ＮＨ２では１７．７分
であった。生成ペプチドの同一性はＦＡＢＭＳおよびア
ミノ酸分析で確認された。 ［００２４］蛍光スペクトル　励起および発光スペクト
ルはＳＬＭ８０００分光計で測定した。基質、Ａｂｚ−
ＮＦ中−６およびＮ−末端生成物、Ａｂｚ−Ｔｈｒ−Ｉ
ｌｅ−Ｎｌｅ−ＯＨはいずれも吸収極大を３３７　ｎｍ
に、広い発光極大を３９０〜４４０　ｎｍに示す。基質
と生成物を同時濃度で比較すると、酵素による加水分解
で励起は１０倍、発光は６倍と劇的な増大を示す。初期
力イネティクスは、至適条件で（励起＝３３７ｎｍ、発
光＝４１０ｎｍ）、電磁攪拌器で攪拌しながら２５℃で
モニタリングした。 ［００２５］ＵＶスペクトル　基質、Ａｂｚ　−ＮＦ”
６およびＮ−末端生成物、Ａｂｚ−Ｔｈｒ　−Ｉ　ｌｅ
　−ＮＩｅ−ＯＨの吸収スペクトルはＢｅｃｈｍａｎ　
　ＤＵ８分光光度計で記録した。基質は極大を２３８　
ｎｍおよび２５４ｎｍに示すが、分裂生成物は極大を３
１８ｎｍおよび２５２　ｎｍに示す。 ［００２６］蛍光アツセイ　９６−ウェルＥＬＩＳＡプ
レート上の蛍光測定はＴｉｔｅｒｔｅｋ　　Ｆｌｕｏｒ
。 ５ｋａｎＩ　Ｉ、Ｖｅｒｓ　１ｏｎ３．１を用いて行っ
た。 ３５５　ｎｍの励起フィルターおよび４３０　ｎｍの発
光フィルターを使用した。ＨＩＶプロテアーゼの保存溶
液（０，１ｍｇ／ｍ１）ＬＯｕ、■を５種の異なる濃度
のＡｂｚ−ＮＦ”−６と、最終容量１００μｍ、３７℃
でインキュベーション、各ウェルにつき５分毎に蛍光の
増大をモニタリングした。１ｍＭＡｂｚ−ＮＦ”　−６
のＤＭＳＯ中保存溶液を使用した。蛍光強度の変化と生
成物の濃度の変化の関係の標準曲線を使用して、蛍光変
化をモル速度に変換した。インヒビターのＫｉ測測定た
めの濃度範囲を予め定めるためには、予備アッセイをＨ
ＰＬＣで行うのが便利なことがわかった。アッセイ緩衝
液（ｐＨ６，４）中０．１ｍＭのインヒビター２０μｍ
とＨＩＶプロテアーゼ（０，０５ｍｇ／ｍｌの保存溶液
）１０ｕｌとを２５℃で５〜１０分間ブレインキュベー
トした。 ０．１ｍＭ　　Ａｂｚ　−ＮＦ”−６，２０μｌを加え
、反応を１時間続けた。１０％ＴＦＡ６０μｌを加えて
反応を停止させ、切断量をＨＰＬＣで測定した。インヒ
ビターの不存在下には、完全な切断が起こる。残った基
質の量により、評価されたＫｉから蛍光アッセイのため
のインヒビターの濃度範囲の適当な選択が可能になる。 ［００２７］給米　発色団基質として可能性のある次の
配列の６種のペプチドを製造した。Ｈ−８ｅｒ−Ｐｈｅ
Ａｓｎ−Ｐｈｅ　　（ｐ−ＮＯ２）−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−
Ｖａｌ−Ｔｈｒ−ＯＨＨ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉ　１ｅ−
Ｌｅｕ−Ｐｈｅ　　（Ｐ　−ＮＯ２）−Ｌｅｕ−Ａｓｐ
−Ｇｌｙ−ＯＨＨ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ　
　（Ｐ−Ｎ０２）−Ｐｒｏ　−Ｉ　１ｅ−３ｅｔ−Ｐｒ
ｏ−ＯＨＡｃ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ　（ｍ−ＮＯ２
）　−Ｐｒｏ−Ｉ　１ｅ−３ｅｒ−ＮＨ２Ａｃ−Ｔｈｒ
−１１ｅ、Ｐｈｅ（Ｐ−ＮＯ２）−Ｎｌｅ−Ｇｌｎ−Ａ
ｒｇ−ＮＨ２Ａｃ−Ｔｈｒ−Ｉ　１ｅ−Ｎｌｅ−Ｐｈｅ
　　（ｐ−ＮＯ２）−Ｇ１　ｎ−Ａｒｇ　　ＮＨ２゜こ
れら６種のペプチド中、最後のＰド位置にＰ　ｈ　ｅ　
（Ｐ−ＮＯ２）をもつもののみが、所望のＨＰ　Ｌ　Ｃ
アッセイ条件および１時間のインキュベーション時間で
切断を示した。Ｈｙｌ　ａｎｄら（前出）は、上に製造
したものとやや類似のただしカルボキシ末端のアミノ酸
か保護されている発色団オクタペプチド基質、Ａｅ−Ａ
ｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉ　ｌｅ、Ｌｅｕ−Ｐｈｅ　（ｐ−ＮＯ
２）　−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−ＮＨ２を報告してい
る。Ｎａ５ｈａｄら（前出）は２種の発色団ペプチド基
質で、分光測光法によるアッセイの基礎になるＡｃ−Ｌ
ｙｓ−Ａｌａ−３ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ　（Ｐ−ＮＯ２
）　−Ｐ　ｒ　ｏ−Ｖａ　１−Ｖａ　１−ＮＨ２および
Ｈ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｐｈｅ　　（ｐ
−Ｎ。 ２　）　−Ｐ　ｒ　ｏ−Ｌ　ｅ　ｕ−Ａｒ　ｇ−Ａ　１
　ａ　−ＯＨを報告している。しかしながら、これらの
３種の場合は、加水分解が発色団残基をＣ末端に残して
起こるので、大きなスペクトル変化を生じる。Ｎ末端に
おける発色団残基の場合にみられる小さなスペクトル変
化により、本明細書において定義される新規な蛍光原性
基質が開発され、新規な蛍光測定アッセイが得られた。 【００２８】へキサペプチド基質、Ａ、ｃ−Ｔｈ　ｒ−
Ｉ　１ｅ　　Ｎｌｅ　　Ｐｈｅ　　（Ｉ）　　Ｎ０２）
　　　Ｇｌｎ　　ＡｒｇＮＨ２の、Ｃ−末端生成物にア
クセプター残基をもたせる改良には、ドナー蛍光基をＮ
−末端生成物に付加する必要がある。アセチル基を２−
アミノ安息香酸（Ａｂｚ）で置換することにより、新規
な蛍光原性ペプチド、Ａｂｚ−Ｔｈｒ　−Ｉ　１ｅ−Ｎ
ｌｅ−Ｐｈｅ　　（ｐ−ＮＯ２）　　Ｇｌｎ　　Ａｒｇ
　ＮＨ２が得られ、Ｃａｒｍｅｌ　　＆　　Ｍａｒｏｎ
　（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、８７．２６５〜２７
３．１９７８）がアンギオテンシン変換酵素の基質に使
用したのと同じドナーとアクセプターの組合せを与えた
。これらの著者は、消光効果はドナーとアクセプター・
発色団の近位性に依存することを示していたので、Ｐ３
の位置にＡｂｚ基をもつ類縁体、Ａｂｚ−Ｉ　１ｅ−Ｎ
ｌｅ−Ｐｈｅ　（ｐ、ＮＯ２）　−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｎ
Ｈ２が本発明者らによって合成された。しかし、切断効
率は劇的に低下した。上記の本発明の新規なヘキサペプ
チド基質、Ａｂｚ　　ＮＦ”、６は蛍光原の不完全な消
化により少量の蛍光バックグランドを示すか、加水分解
すると、図１に見られるように３９０〜４４０ｎｍの広
い極大として蛍光の約６倍の増大が認められる。他の各
種の蛍光基が、合成ＨＩＶプロテアーゼとＭＶＴ−１０
１、類似構造のインヒビター、Ａｃ−Ｔｈｒ−Ｉ　１ｅ
−Ｎｌｅ−ｖ［ＣＨ２ＮＨＩ　−Ｎｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｒ
ｇ−ＮＨ２との複合体Ｘ線結晶構造にみられる（Ｍｆｉ
ｌｅｒら：５ｃｉｅｎｃｅ、２４６．１１４９〜１１５
２．１９８９）その表面位置と一致するＰ４位置に導入
可能である。 ［００２９］合成ＨＩＶプロテアーゼによるＡｂｚ−Ｎ
Ｆ”−６の切断の動力学の測定では、１５％未満の基質
が酵素によって切断される場合、２０分以上の反応時間
にわたって直線状のカイネテイツクスをもつ典型的なミ
カエリス−メンテンの挙動を示した（図３）。反応の直
線相から計算した速度のラインライ−バー・パーク・プ
ロットはＫｍ＝１１０ｍＶを与えた。Ｖａｍｘは３．４
５ｍＭ／ｍｉ　ｌ、Ｋｃ　ａ　ｔ＝２．９３ｅｃ−’　
と計算された。Ｎａ５ｈｅｄら（Ｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ−Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、１６３．１０７９
〜１０８５．１９８９）の発色団基質のＫｍは４５０ｍ
Ｍ以上と評価された。Ａｂｚ＝ＮＦ”　−６の合成ＨＩ
ＶプロテアーゼについてのＫｃａｔ／Ｋｍ比は２６．３
６４Ｍ−ｌ５−１であるが、Ｎａ５ｈｅｄら（前出）の
ノナペプチド発色団基質の比は、大腸菌で発現された精
製ＨＩＶプロテアーゼを用いて２３．ＯＯＯＭ−Ｉ　Ｓ
−１と評価された。 ［００３０１本発明の新規な蛍光原性基質、Ａｂｚ−Ｎ
Ｆｌ−６を用いることにより、インヒビターの親和性の
測定が可能な、ＨＩＶプロテアーゼインヒビター候補物
質のスクリーニング法が確立された。８個のウェルによ
り、ジクソンプロットに基づ＜Ｋｉ値（１／ｖ　　ｖｓ
。 インヒビター濃度）の計算に最低限十分な、２種の基質
濃度について各４種の異なるインヒビター濃度の測定が
可能になる。蛍光は２０分間２分間隔で測定した。すな
わち２０分間に１２個のインヒビターの親和性の測定が
実行可能である。】−個のＫｉの測定に約３０回の別個
のＨＰＬＣの実行を要し、その実行それぞれに約１時間
かかるＨＰＬ、Ｃ分析法とは対照的である。しかしなが
ら、定常的ではそれぞれ二重に測定試行を行うことが好
ましく、また標準インヒビターの測を包含させるとして
、Ｋｉの測定可能数は１時間あたり１５となる。

【００３１】本明細書では、アミノ酸は標準の３文字省
略記号によって、次のように示す。 略号　　　　アミノ酸 Ａｌａ　　　　　アラニン Ｃ）ｒｓ　　　　　システィン Ａｓｐ　　　　　アスパラギン酸 Ｇｌｕ　　　　　グルタミン酸 Ｐｈｅ　　　　　フェニルアラニン Ｇｌｙ　　　　グリシン Ｈｉｓ　　　　　ヒスチジン ｌｉｅ　　　　　イソロイシン Ｌｙｓ　　　　　リジン Ｌｅｕ　　　　　ロイシン Ｍｅｔ　　　　　メチオニン Ａｓｎ　　　　　アスパラギン Ｐｒｏ　　　　　　プロリン Ｇｌｎ　　　　　グルタミン Ａｒｇ　　　　　アルギニン Ｓｅｒ　　　　セリン Ｔｈｒ　　　　　スレオニン Ｖａｌ　　　　バリン Ｔｒｐ　　　　　トリプトファン Ｔｙｒ　　　　　チロシン ［００３２１本明細に用いた他の標準的な略号には、Ｎ
１ｅ＝ノルロイシンＡｂｚ＝２−アミノ安息香酸Ａｃ＝
アセチルＣｈａ＝シクロへキシルアラニンＴＥＡ＝トリ
フルオロ酢酸ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミドＤＭＳＯ＝
ジメチルスルホキシドＣＨＡＰＳ＝３−［３−クロロア
ミドプロピル）−ジメチルアンモニオ〕−１−プロパン
スルホン酸、およびＦＡＢＭＳ＝蛍光抗体マススペクト
ルがある。 ［００３３１以上の開示を読めば、本技術分野の熟繍者
には、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、
様々な他の例が明らかであろう。このような他の例はす
べて、本発明の特許請求の範囲に包含されるものである
。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１、は、本発明の基質、ＡＢＺ−ＮＦ”　−
６および生成物ＡＢＺ−ＴＩＮ−ＯＨの蛍光発光スベク
１−ルを示すグラフである。

【図２】図２は、本発明の基質、ＡＢＺ−ＮＦ“−６な
らびにその生成物２種のＨＰＬＣにおける溶出パターン
を示す図である。

【図３】図３は、本発明の方法における蛍光発光が時間
とともに増加することを示すグラフである。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次の化学構造： Ｘ−Ｔｈｒ−ｒｌｅ−Ｎｌｅ−Ｐｈｅ（Ｙ）−Ｇｌｎ−
   ＡｒＧ−ＮＨ＿２ （式中、Ｘは蛍光原性基であり、Ｙはその蛍光原性基の
   アクセプターである）を有するレトロウイルスプロテア
   ーゼの蛍光原性基質。
2. 【請求項２】次の化学構造： Ａｂｚ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ｐｈｅ（ｐ−ＮＯ＿
   ２）−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−ＮＨ＿２を有するレトロウイル
   スプロテアーゼの蛍光原性基質
3. 【請求項３】既知量の蛍光原性基質： ｘ−ＴＨｒ−ｒｌｅ−Ｎｌｅ−Ｐｈｅ（Ｙ）−Ｇｌｎ−
   Ａｒｇ−ＮＨ＿２（式中、Ｘは蛍光原性基であり、Ｙは
   その蛍光原基に対するアクセプターである）を分光測光
   蛍光計の蛍光セルに取り、既知量のレトロウイルスプロ
   テアーゼと３７℃でインキュベートし、蛍光の経時的変
   化を測定し、ついで蛍光強度の変化と生成物の濃度変化
   と関連づける標準曲線に対して比較することによってレ
   トロウイルスプロテアーゼのモル速度を求めることから
   なるレトロウイルスプロテアーゼ活性の蛍光測光による
   測定方法
4. 【請求項４】レトロウイルスプロテアーゼはＨＩＶプロ
   テアーゼである「請求項３」記載の方法
5. 【請求項５】既知量の蛍光原性基質：Ａｂｚ−Ｔｈｒ−
   Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ｐｈｅ（ｐ−ＮＯ＿２）−Ｇｌｎ−Ａ
   ｒｇ−ＮＨ＿２を分光測光蛍光計の蛍光セルに取り、既
   知量のレトロウイルスプロテアーゼと３７℃でインキュ
   ベートし、蛍光の経時的変化を測定し、ついで蛍光強度
   の変化と生成物の濃度変化とを関連づける標準曲線に対
   して比較することによってレトロウイルスプロテアーゼ
   のモル速度を求めることからなるレトロウイルスプロテ
   アーゼ活性の蛍光測光による測定方法
6. 【請求項６】レトロウイルスプロテアーゼはＨＩＶプロ
   テアーゼである「請求項５」記載の方法