JPH04204238A - 鳥類の染色体標本及びその性別判定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野］ この発明は、鳥類の染色体標本及びその性別判定法に関
し、更に詳しくは、鳥類の正羽の下＃部イドグラスへ面
に展開して染色体分析を容易にした染色体標本と、その
染色体標本にＣ−バンド染色法を適用して性染色体を同
定し、雌雄判定結果を確実にした鳥類の染色体標本及び
その性別判定法に関するものである。 ［従来の技術〕 従来、鳥類の飼育、繁殖には雌雄判定が不可欠条件とさ
れているが、一般に行われている鳥類の外部形態から性
別を判定する方法として、■二次性徴（円冠、軒側、測
色等）による方法、■泣き声の違いを識別する方法、■
生殖行動の違いを見る方法、０体の大きさの違いを見る
方法などがあるが、■と■では、区別のできない種類が
大部分である。■と■は、種類によって異なり、画一的
な方法でない上、その種に精通した専門的な知識と経験
が必要である。特に■では、各種類において統計的に満
足できるデータがそろっていない。 などの理由で実用的な方法とは考え難い。また、鳥類の
ヒナは一般的に外部形態による性別判定は不可能である
。鶏において総排せつ腔部の突起物の状部で、ふ化直後
のヒナの性別を判定する方法が実用化されているが、他
の鳥類には応用されていない。その他、鳥類は鳥綱２８
目、１５５科存在する内、２目及び１１目の一部のみに
おいて、外観（二次性徴）で性別が判明するが、他のも
のは外観上雌雄の区別が困難である。 近年、遺伝物質である染色体を分析する方法が最も権威
ある性別判定手段として、人類をはじめ生物全般に適用
されてきた。以下、鳥類における染色体による性別判定
の原理とその根拠について説明する。 鳥類の染色体には、鳥類の雌雄を決定する性染色体があ
る。その性染色体は、塩基性色素で染まり易い棒状の色
体て、真正染色質から構成されたＺ染色体と、異質染色
質から構成されたＷ染色体とからなり、雄はＺＺ１雌は
ＺＷとして存在する。 このＺ染色体とＷ染色体は形態が異り化学的性質も異な
る。その化学的性質は、アルカリや熱処理によって破壊
される真正染色質と、破壊されない異質染色質とに分類
されている。 この化学的性質を用いて真正染色質を破壊し、破壊され
ない異質染色質をギムザ染色によって、Ｗ染色体のみを
同定する方法がＣ−バンド染色法といわれている［　Ｓ
ｕｇ＋ｎｅｒ、Ａ、Ｔ、　：ＥｘｐＬｌ、Ｃｅ１ｌ　Ｒ
ｅｓ、７５：３０４−３０６（１９７２）］。 鳥類のＺ染色体は真正染色質より構成され、Ｗ染色体は
全長にわたって異質染色質からなることが明らかにされ
［５ｔｅｆｏｓ、）［、ａｎｄ　Ａｒｒｉｇｈｉ、Ｆ、
Ｅ、：Ｅｚ−てきている。このことは鳥類の染色体標本
をＣ−バンド染色法で処理すれば、雌のＷ染色体を同定
できることを示している。 また、Ｗ染色体は蛋白分解酵素（例えばトリプシンなど
）にも、真正染色質部より強い抵抗性を示すことが明ら
かにされている［Ｗａｎｇ、Ｎ、ａｎｄ　５ｈｏ−［ｎ
ｅｒ、Ｒ，Ｎ、：　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｌａ：４７：６ｌ
−６９（Ｉｉ１７４）］　ｏ染色体標本をトリプシンな
どの蛋白分解酵素で処理した後、染色する方法を６−バ
ンド染色法と言う。 次に、鳥類において従来用いられてきた染色体による性
別判定技術は、染色体標本作成法と性染色体の同定法と
の二段階技術から成り立っている。 以下、その概要を説明する。 前者の染色体標本作成法としては、組織を培養した細胞
より染色体標本を作成する間接法がある。 この方法は皮膚、羽根、血液等を無菌操作により一定期
間培養した細胞から染色体標本を作成する為、高価な組
織培養の設備を必要とし、性別判定までに長期間を要し
、かつ組織培養の専門的な技術を必要とする等の欠点が
あるが、非常に奇麗な理想的な染色体標本が得られる利
点がある。 染色体標本を作成する直接法としては、分裂の盛んな骨
髄細胞を用いた空気乾燥法、羽根部を用いた押しつぶし
法、および、羽根部を用いた空気乾燥法がある。先ず、
骨髄細胞空気乾燥法では、組織培養法に準する奇麗な染
色体標本が得られるが、鳥類の骨髄は採取が困難で、採
取にあたって個体に危険が伴う欠点がある。また、羽根
部を直接おしつぶす方法では奇麗な染色体標本が得られ
ないこと、及びカバーグラスをかけなければならないの
でバンド染色法を適用することができない。 さらに、羽根部を直接空気乾燥させる方法［Ｗａｄａ。 Ｗ、Ｙ、ａｎｄ　Ｙｏｓｉｄａ、Ｔ、Ｈ，：　Ｐｒｏｃ
、Ｊａｐａｎ　Ａｃａｄ、、５９，５ｅｒＢ　２１９−
２２２（１９８３）］では、可なり奇麗な染色体標本が
得られるが、昆虫に用いられていた従来法を羽根部に応
用していたので判定結果の再現性、安定性に問題がある
こと、及び性染色体同定法にＧ〜バンド染色法を用いて
いたのでＷ染色体の決定が不明瞭になる欠点があった。 後者の性染色体同定法としては、中期分裂抜板写真の染
色体から、雌は性染色体がＺ染色体とＷ染色体の異形対
からなることを根拠に性別を判定する抜型分析による方
法、及び、Ｇ−バンド染色法やＣ−バンド染色法により
Ｗ染色体の有無を確認する方法がある。しかしながら、
抜型分析による性染色体同定法は非常に時間がかかり、
かつ微／／＼ ｐ染色体の存在によって分析に高等な技術を必要とする
。また、Ｇ−バンド染色法によりＷ染色体の有無を確認
する方法は、Ｗ染色体が若干破壊される為、その識別が
不正確になるという問題点がある。才た、Ｃ−バンド染
色法によりＷ染色体の有無を確認する方法は、操作が比
較的簡単でＷ染色体を明確に識別でき、今のところ欠点
は見当たらない。 ［発明が解決しようとする課題］ この発明は、かかる問題点を解決するためになされたも
のであって、上記したＷａｃｌａ、　Ｍ　、　Ｙ　。 ａｎｄ　　Ｙ　ｏｓｉｄａ、　Ｔ　、　Ｈ、の、昆虫に
用いられる空気乾燥による染色体標本作成法を、鳥類の
羽根部に適用できるように改良した鳥類の染色体標本、
及び、その染色体標本にＣ−バンド染色法を適用して性
染色体を同定し、性別判定結果を確実にした鳥類の性別
判定法である。 この昆虫に用いられる空気乾燥による標本作成法での、
羽根部の結合重を溶解する手段は、■　エタノール　３
：氷酢酸　３・蒸留水　４　の割合の固定液で固定と同
時に結合重を溶解し、細胞を物理的に細分する。 ■　エタノール　１：氷酢酸　ｌの固定液で固定する、
手順をとった。 昆虫に用いた３：３：４の固定液では羽根部組織の結合
重が溶解されにくい為、この発明に係る鳥類の染色体標
本は、 ■　エタノール　３：氷酢酸　１の固定液で組織を先に
固定する。 ■　酢酸の組織溶解液を用いて、羽根部組織の結合重を
強く溶解する。 ■　この組織を物理的に細分した後、エタノール３：氷
酢酸　！の固定液で再固定する、手順に改善したもので
ある。 以上の改善策によって、鳥の種類や大小を問わず、個体
を安全に材料の採取が簡単で、高価な設備や場所を必要
としない低コストの染色体標本を得ることを目的とする
。 また、この発明の第２の発明は、上記目的で得られた染
色体標本に異質染色質部位が濃く染まるＣ−バンド染色
法を適用し、Ｗ染色体を同定することによって、短時間
で性別が判定され、かつ高い再現性が得られる鳥類の染
色体による性別判定法を提供することを目的とする。 ［課題を解決するたぬの手段］ この発明に係る染色体標本は、低張液中で低張処理した
１羽の下ｗ部組縁をスライドグラス上において固定液で
固定し、当該下臍部組織の結合重を組織溶解液で溶解す
ると同時に物理的に細分しグラスた面に展開してなるし
のである。 また、この発明の第２の発明に係る鳥類の性別判定法は
、鳥類の染色体標本にＣ−バンド染色法を適用して性染
色体を同定し、同定した性染色体中のＷ染色体のａ無を
確認することにより雌雄を識別するものである。 「作用」 この発明においては、１羽の下ｒ部組縁の結合重を溶解
するために、先に固定処理し、次に組織溶解液で溶解処
理すると同時に物理的に組織を細分した後、再び固定処
理して組織の結合重を完全に溶解したあと、細胞質溶解
液を用いて細胞質を展開された染色体標本が得られる。 その染色体標本にＣ−バンド染色法の適用でＷ染色体が
同定され、濃く染色されたバンドが明瞭に検出され、雌
雄判定結果が確実となる。 ［実施例］ この発明の一実施例について、鳥類の染色体標本及びそ
の性別判定法を、手順に従って以下に箇条書きする。

【鳥類の染色体標本】

■　発育中の１羽（筆羽）の採取 ・　別軸根より別軸及び側弁が発育途上にある時期の羽
を採取する。 ・　成鳥においては、換羽期の発育中の羽、又は、人工
的に数羽後（小型種では約２週間、大型種では約３ｉ１
！Ｉ間経過した羽）の羽を採取する。 ・　雛においては、２〜３週令ぐらいの個体で、発育中
の１羽の見られるものから採取する。 ■　下一部の切断、材料の大きさの調整・　採取した羽
の下請部（別軸根の先端）より、２〜５ｖｖぐらいをハ
サミで切断し、小型ンヤーレ（直径的３．５ｃＩＭ、高
さ約１ｃｍ）に、あらかじめ、３〜５ｍｌの低張液（０
，５％　クエン酸ナトリウム水溶液　＜　Ｎａ５Ｃｓｌ
ｌｓＯ７”　２ＨｔＯ＞９．５１１１と、０．１％コル
ヒチン水溶液　＜ＣｔｔＨｚｓＮＯｌｌ〉の混合ＩＩ＆
）を入れておき、その中へ落とし込む。 ・　標本作成には２１１１Ｉ角以下の組織が適している
ので組織を低張液中で、解剖針を用い、長軸及び短軸に
沿って切断して大きさを整える。 ■　低張処理 ・　大きさを整えた下請部を低張液中で、３０分間室温
放置する。 ■　下請部の固定処理 ・　下ｒ部（組織）を解剖針を用いて低張液中より取り
出し、スライドグラスの中央部に移す。 ・　スライドグラスを斜めに保ち、組織をはじめスライ
ドグラス全面に、固定液（９９５％エタノール　＜　Ｃ
ｔＨｓＯｕ＞を　３に対し、氷酢酸＜　ＣＬＣＯＯＨ＞
　　を　１の混合液）を、パスツールピペットで充分滴
下する。スライドグラスより流れ落ちる固定液は、下に
口紙を置き吸い取る。 スライドグラスを水平に保ち、Ｍｉ織に固定液をパスツ
ールピペットで２〜３滴滴下し、そのまま室温で１０分
間放置する。その１０分間に固定液が乾燥してしまわな
い様に、時々固定液を滴下補充する。 ■　組織の細分化 スライドグラスを斜めにして、固定液を流し去った後、
固定の前処理と同法でスライドグラス全面に組織溶解液
をパスツールピペットで滴下し、固定液を組織溶解液で
置換する。 ・　スライドグラスを垂直にして、余分な組織溶解液を
流し去った後、スライドグラスを水平に戻し、組織溶解
液を組織に１滴滴下する。約１〜２分後、解剖針を用い
て素早く組織を細分化しながら広げる。 ■　再固定処理 ・　組織が広がり、組織溶解液が乾燥し始める時に、組
織に固定液を１〜２滴滴下する。 ・　スライドグラスの両側に向かって固定液が流れて行
くので、両側から口紙を用いて固定液を吸い取る。 ■　細胞質の溶解 ・　固定液がスライドグラス上で乾燥し始めてから観察
を続け、乾燥し終わる直前に、広げた組織全体に細胞質
溶解液（１００％水酢酸）を１〜２滴滴下する。 ■　乾燥 ・　スライドグラスを水平に保ち室温で乾燥させる。−
夜室温で乾燥させるのが最もよい。

【鳥類の性別判定法】

■　普通染色 ・　４％ギムザ液［Ｇｉｅｎｓａ染色液の原液２　ｍｌ
に対し、ｐＨ６，８Ｓ′６ｒｅｎｓｅｎ第　２リン酸ナ
トリウム＜　ＮａｔＨＰＯ＊　−１２１ＥＯ＞−第　ｌ
リン酸カリウム＜　Ｋ）Ｉ、ＰＯ２＞　　緩衝液　（Ｍ
／１５　リン酸二ナトリウムと、Ｍ／１５リン酸−カリ
ウムの等量混合液）を　４８１１混合した染色液］で室
温ＩＯ分間染色（る。 ［相］　顕微鏡観察と写真撮影 ・　カバーグラスをかけないで、細胞を観察し、比較的
良く染色体が広がった分裂中期の抜板を１０００倍で１
０個写真に撮り、その位置を記録する。 ■　脱オイル・脱染色 ・　次のシリーズを通してスライドグラスの脱オイルと
脱染色をする。 キノ１２５分間→キンレン１０分間−キン１フ５分間−
９９．５％エタノール１０分間→７０％エタノール３０
秒間→流水で洗う一５０％酢酸３０秒間−流水で洗う一
乾燥。 ＠　Ｃ−バンド染色処理 ａ、スライドグラスを　８．８％（Ｖ／Ｖ）塩酸＜ＨＣ
Ｉ＞　　中で室温４０分間処理する。 ｂ、スライドグラスを流水で洗う。 Ｃ，スライドグラスを５５℃　５％（Ｗ／Ｖ　）水酸化
バリウム水溶液　＜　Ｂ　ａ　（ＯＨ）ｚ・８Ｈ１０〉
　中で２分間処理する。 ｄ、スライドグラスを流水で洗う。 ８、スライドグラスを５５℃　２ＸＳＳＣ液（０３Ｍ塩
化ナトリウム　＜１ｌＩａｃＩ＞　　と、０．０３　Ｍ
クエン酸ナトリウムの水溶液）中で５分間液２１に対し
てｐＨ６，８Ｓ’６ｒｅｎｓｅｎ緩衝液４８１１の混合
液）で４０分間染色する。 ｇ　検鏡 普通染色で観察、写真撮影した中期抜板を検鏡して写真
撮影する。 ［株］　結果の判定 Ａ　雌の場合 ・　観察したＩＯ核抜板てに、染色体の全長にわたり、
Ｃ−バンド染色法で染まる染色体（Ｗ染色体で、種によ
って大きさが異なる）か存在することを確認する。この
時、染色体同志の重なり部分が濃く染まることがあるの
で、普通染色法による観察結果（前記［相］項参照）を
参考にしながら、結論を下す。 Ｂ　雄の場合 ・　観察した１０核板総てに、染色体の全長にわたり、
Ｃ−バンド染色で染まる染色体が存在しないことを確認
する。 ［発明の効果］ この発明は以上説明したとおり、鳥類の正割の下ｒ部組
縁を先に固定処理し、次に組織溶解液を用いて組織を溶
解処理すると同時に物理的に細分面に広がった染色体標
本に、Ｃ−バンド染色法を適用することによって、Ｗ染
色体の存在が正確に識別できる鳥類の性別判定法か得ら
れる効果がある。 特許出呻大　　和　１）政　保

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、低張液中で低張処理した正羽の下臍部組織をスライ
   ドグラス上において固定液で固定し、当該下臍部組織の
   結合織を組織溶解液で溶解すると同時に物理的に細分し
   た後、固定液で再び固定し、細胞質溶解液で前記下臍部
   組織全体の細胞質を溶解して染色体を前記スライドグラ
   ス面に展開してなることを特徴とする鳥類の染色体標本
   。 ２、請求項１記載の鳥類の染色体標本にＣ−バンド染色
   法を適用して性染色体を同定し、同定した性染色体中の
   Ｗ染色体の有無を確認することにより雌雄を識別するこ
   とを特徴とする鳥類の性別判定法。