RU2752505C1 - Бесформальдегидный фиксатор биоматериала для гистологических и иммуногистохимических исследований - Google Patents
Бесформальдегидный фиксатор биоматериала для гистологических и иммуногистохимических исследований Download PDFInfo
- Publication number
- RU2752505C1 RU2752505C1 RU2020140827A RU2020140827A RU2752505C1 RU 2752505 C1 RU2752505 C1 RU 2752505C1 RU 2020140827 A RU2020140827 A RU 2020140827A RU 2020140827 A RU2020140827 A RU 2020140827A RU 2752505 C1 RU2752505 C1 RU 2752505C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- histological
- formaldehyde
- fixation
- oxaldehyde
- water
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/0231—Chemically defined matrices, e.g. alginate gels, for immobilising, holding or storing cells, tissue or organs for preservation purposes; Chemically altering or fixing cells, tissue or organs, e.g. by cross-linking, for preservation purposes
Abstract
Изобретение относится к медицине и касается бесформальдегидного фиксатора биоматериала для гистологических и иммуногистохимических исследований, включающего щавелевый альдегид и воду, содержащего тетраметилолгликолурил для повышения качества фиксации, этиловый, изопропиловый или метиловый спирт для повышения проницающей способности, калия дигидрофосфат в качестве модификатора рН, при следующем соотношении, мас.%: щавелевый альдегид - 8-10, тетраметилолгликолурил - 1-3, спирт - 10-60, калия дигидрофосфат - 0,1-0,3, вода до 100. Изобретение обеспечивает создание бесформальдегидного фиксатора, который обладает фиксирующими свойствами и сохраняет структуру тканей, что проявляется в сохранении гистоархитектоники органа, структуры клеток, их ядер и цитоплазмы, а также обеспечивает фиксацию кусочков тканей размером 5-7 мм на всю глубину. 1 пр., 6 ил.
Description
Изобретение относится к медицине и касается технологии фиксации биоматериала с использованием высокоэффективного и нетоксичного реагента.
Первым этапом подготовки биоматериала к проведению гистологического и иммуногистохимического исследования является фиксация. При этом наибольшее распространение в медицинской практике получил 10% раствор формалина [Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. М.: Мир, 1969; Grigorev I.P., Korzhevskii D.E. Current technologies for fixation of biological material for immunohistochemically analysis (review). Sovremennyetehnologiivmedicine 2018; 10(2): 156–165].
Недостатками формалина являются его летучесть, высокая токсичность и канцерогенность.
Вработе [Wicks LF, Suntzeff V. Glyoxal, a Non-Irritating Aldehyde Suggested as Substitute for Formalin in Histological Fixations. Science. 1943; 98(2539):204] было впервые предложено использовать 2% раствор щавелевого альдегида в качестве фиксатора тканей при гистологических исследованиях (окраска гематоксилин-эозином) взамен 10% раствора формалина. Вработе [Bussolati G, Annaratone L, Berrino E, Miglio U, Panero M, Cupo M, et al. (2017) Acid-free glyoxal as a substitute of formalin for structural and molecular preservation in tissue samples] былопредложеноиспользовать 2% растворщавелевогоальдегида, предварительноочищенныйоторганическихкислотспомощьюионообменныхсмолидоведённыйбуфернымрастворомдорН = 7,5. Бескислотный щавелевый альдегид был запатентован как фиксатор для гистологических препаратов (патент WO 2017/140596 Al, A01N 1/00, G01N 1/30, G01N 33/48, опубл. 24.08.2017 г.). Изобретение относится к композиции для фиксации гистологических препаратов, содержащей раствор щавелевого альдегида, из которого удалены кислоты, обычно присутствующие в коммерчески доступном щавелевом альдегиде.
Недостатком растворов щавелевого альдегида в качестве фиксатора является низкая скорость проникновения реагента на всю глубину ткани биоматериала и недостаточная фиксирующая способность.
В работе [Y.N. Wang, Histomorphometric comparison after fixation with formaldehyde or glyoxal, Biotechnic & Histochemistry Volume 86, 2011 - Issue 5] сообщается, что качество микропрепаратов мягких тканей, полученных с применением коммерческого фиксатора на основе щавелевого альдегида не уступает препаратам, зафиксированным в 10% растворе формалина. В работе [K.N. Richter and et. Glyoxalasanalternativefixativetoformaldehydeinimmunostainingandsuper‐resolutionmicroscopy, EMBOJ. 2018 Jan 4; 37(1): 139–159] так же сообщается об успешном опыте применения препаратов на основе щавелевого альдегида. Однако, врядеработсообщается [R. Buesa, Histology without formalin?, Annals of Diagnostic Pathology, Volume 12, Issue 6, 2008, Pages 387-396, ISSN 1092-9134; Umlas J, Tulecke M. The effects of glyoxal fixation on the histological evaluation of breast specimens. Hum Pathol. 2004;35(9):1058–62; Bussolati G, Annaratone L, Berrino E, Miglio U, Panero M, Cupo M, et al. (2017) Acid-free glyoxal as a substitute of formalin for structural and molecular preservation in tissue samples], чтокачествофиксацииобразцоввкоммерческихфиксаторахнаосновещавелевогоальдегидахуже, чемв 10% раствореформалина.
Известен способ изготовления и хранения музейных анатомических влажных макропрепаратов (патент RU 2566648, A01N 1/02, опубл. 27.10.2015 г.), выбранный в качестве прототипа. Способ включает промывание препарата водой с дальнейшей фиксацией препарата путем полного погружения в емкость с раствором химического реагента, с последующей заменой реагента на свежий. При приготовлении макропрепарата фиксацию осуществляют путем его погружения в 10% водный раствор щавелевого альдегида по объему, который превышает объем макропрепарата не менее, чем в 10 раз. Замена реагента производится трижды на 7, 14, 21 сутки, каждый раз промывая макропрепарат после удаления реагента проточной водой, для музейных экспонатов, фиксация которых осуществлялась 10% раствором формалина, формалин сливают, а перезаливку на 14, 28 и 42 сутки проводят 10% водным раствором щавелевого альдегида.
Недостатком указанного прототипа является низкая скорость проникновения реагента на всю глубину ткани биоматериала, низкая эластичность препарата после использования реагента.
Технический результат заявленного изобретения заключается в создании бесформальдегидного фиксатора, который обладает фиксирующими свойствами и сохраняет структуру тканей, что проявляется в сохранении гистоархитектоники органа, структуры клеток, их ядер и цитоплазмы, а также обеспечивает фиксацию кусочков тканей размером 5-7 мм на всю глубину.
Поставленная задача решается тем, что бесформальдегидный фиксатор биоматериала для гистологических и иммуногистохимических исследований, включает щавелевый альдегид и воду, но в отличие от прототипа, дополнительно содержит тетраметилолгликолурил для повышения качества фиксации, этиловый, изопропиловый или метиловый спирт для повышения проницающей способности, калия дигидрофосфат в качестве модификатора рН, при следующем соотношении масс%:
- щавелевый альдегид - 8-10%
- тетраметилолгликолурил - 1-3%
- спирт - 10-60%
- калия дигидрофосфат - 0,1 - 0,3%
- вода до 100%.
Пример конкретного осуществления изобретения.
Оценивали эффективность 10% раствора щавелевого альдегида в качестве фиксатора для гистологических микропрепаратов, в сравнении с 10% нейтральным забуференным формалином. В качестве объектов фиксации использовались фрагменты органов, полученных при аутопсии, размером не более 2,5 см 2,5 см, толщиной не более 5-7 мм. Для исследования фиксирующих свойств были взяты образцы тканей следующих органов: головной мозг (нервная ткань), печень, почки, поджелудочная железа, селезенка, легкие, миокард. Объем фиксирующей жидкости превышал объем фиксируемой ткани минимум в 10 раз. Общая продолжительность фиксации материала составляла 24 часа при комнатной температуре. Для получения гистологических препаратов материал проводился по стандартной методике и заливался в парафин.
На фиг. 1 представлена фотография кусочков органов, после фиксации в 10% растворе щавелевого альдегида в течении 24 часов. Видно, что фиксация прошла не полностью - внутри кусочки остаются непрофиксированными из-за неглубокого проникновения фиксатора вглубь ткани.
На фиг. 2 представлены фотографии микропрепаратов кусочков легкого, зафиксированных в 10% растворе щавелевого альдегида и 10% нейтральном забуференном формалине. Видно, что по сравнению с формалином, 10% раствор щавелевого альдегида обладает худшим качеством фиксации. На фиг. 2 отчетливо видно, что оболочки эритроцитов, при использовании 10% раствора щавелевого альдегида полностью разрушены. Это обусловлено относительно низким нативным рН раствора (~ 3,5), и недостаточной фиксирующей способностью. Полученные микропрепараты непригодны для гистологической и иммуногистохимической диагностики.
Для повышения качества фиксации, и увеличения проницающей способности был предложен состав, содержащий:
- щавелевый альдегид - 10%
- тетраметилолгликолурил - 2% в качества добавки, повышающей фиксирующие свойства и стабильность
- этанол - 50% для повышения проницающей способности
- калия дигидрофосфат до рН = 6,5
- вода до 100%.
На фиг. 3 представлены кусочки органов, фиксированные в разработанном составе в течении 24 часов. Визуально видно, что образцы профиксированы полностью на всю глубину.
На фиг. 4 и 5 приведено сравнение микропрепаратов, зафиксированных в течении 24 часов в предложенном составе и 10% нейтральным забуференном формалине, с различными окрасками.
Из фиг. 4 и 5 видно, что предложенный состав обладает фиксирующими свойствами и сохраняет структуру тканей, что проявляется в сохранении гистоархитектоники органа, структуры клеток, их ядер и цитоплазмы. Результаты гистохимического окрашивания исследуемых органов и тканей сопоставимы по восприятию тканями и клетками красителей сложных окрасок и не отличаются значимо от аналогичных тканевых образцов, фиксированных в растворе 10% нейтрального забуференного формалина.
На фиг. 6 представлены микрофотографии образцов тканей с иммуногистохимическим окрашиванием.
Результаты иммуногистохимического окрашивания показали, что разработанный фиксатор сохраняет антигенные (иментин, гладкомышечный актин, общий лейкоцитарный антиген) структуры в тканях, окрашивание не имеет существенных различий для предложенного состава и 10% раствора формалина.
Claims (2)
- Бесформальдегидный фиксатор биоматериала для гистологических и иммуногистохимических исследований, включающий щавелевый альдегид и воду, отличающийся тем, что дополнительно содержит тетраметилолгликолурил для повышения качества фиксации, этиловый, изопропиловый или метиловый спирт для повышения проницающей способности, калия дигидрофосфат в качестве модификатора рН при следующем соотношении, мас.%:
-
щавелевый альдегид 8-10 тетраметилолгликолурил 1-3 спирт 10-60 калия дигидрофосфат 0,1 - 0,3 вода до 100
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2020140827A RU2752505C1 (ru) | 2020-12-11 | 2020-12-11 | Бесформальдегидный фиксатор биоматериала для гистологических и иммуногистохимических исследований |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2020140827A RU2752505C1 (ru) | 2020-12-11 | 2020-12-11 | Бесформальдегидный фиксатор биоматериала для гистологических и иммуногистохимических исследований |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2752505C1 true RU2752505C1 (ru) | 2021-07-28 |
Family
ID=77226124
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2020140827A RU2752505C1 (ru) | 2020-12-11 | 2020-12-11 | Бесформальдегидный фиксатор биоматериала для гистологических и иммуногистохимических исследований |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2752505C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2803135C1 (ru) * | 2020-04-29 | 2023-09-07 | Биодайне Ко., Лтд | Студнеобразная композиция на спиртовой основе для фиксации клеток |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE69227900T2 (de) * | 1992-07-15 | 1999-05-12 | Univ Singapore | Verfahren zur Fixierung von biologischen Geweben |
KR20030016767A (ko) * | 2001-08-21 | 2003-03-03 | 삼성에스디아이 주식회사 | 생체물질 고정용 올리고머, 그 제조 방법 및 이를포함하는 생체물질 고정용 코팅 조성물 |
-
2020
- 2020-12-11 RU RU2020140827A patent/RU2752505C1/ru active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE69227900T2 (de) * | 1992-07-15 | 1999-05-12 | Univ Singapore | Verfahren zur Fixierung von biologischen Geweben |
KR20030016767A (ko) * | 2001-08-21 | 2003-03-03 | 삼성에스디아이 주식회사 | 생체물질 고정용 올리고머, 그 제조 방법 및 이를포함하는 생체물질 고정용 코팅 조성물 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
A. G. PONOMAREVA and others. PHYSICO-CHEMICAL PROPERTIES OF ALIPHATIC ALCOHOLS AND THEIR COMPLEX COMPOUNDS WITH SILICON TETRAFLUORIDE. Advances in chemistry and chemical technology. Volume XXI. 2007. No8 (76). * |
JOON-YONG CHUNG et al. Histomorphological and Molecular Assessments of the Fixation Times Comparing Formalin and Ethanol-Based Fixatives. J Histochem Cytochem. 2018 Feb;66(2):121-135.doi: 10.1369/0022155417741467. Epub 2017 Nov 10. * |
Kolychev N.M. and others. GLIOXAL - DISINFECTANT OF WIDE RANGE OF ANTIMICROBIAL ACTION. Scientific journal KubSAU, No 87 (03), 2013 UDC 619: 614.48: 615.777.9. * |
O.K. Zenin and other Method of preservation of biological material. Bulletin of the Penza State University. - 2016. - No 1 (13). - S. 22-26. * |
ЗЕНИН О.К. и др. Способ сохранения биологического материала. Вестник Пензенского государственного университета. - 2016. - No 1 (13). - C. 22-26. КОЛЫЧЕВ Н.М. и др. ГЛИОКСАЛЬ - ДЕЗИНФЕКТАНТ ШИРОКОГО СПЕКТРА АНТИМИКРОБНОГО ДЕЙСТВИЯ. Научный журнал КубГАУ, No 87 (03), 2013 г. УДК 619:614.48:615.777.9. ПОНОМАРЕВА А.Г. и др. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА АЛИФАТИЧЕСКИХ СПИРТОВ И ИХ КОМПЛЕКСНЫХ СОЕДИНЕНИЙ С ТЕТРАФТОРИДОМ КРЕМНИЯ. Успехи в химии и химической технологии. Том XXI. 2007. No8 (76). JOON-YONG CHUNG et al. Histomorphological and Molecular Assessments of the Fixation Times Comparing Formalin and Ethanol-Based Fixatives. J Histochem Cytochem. 2018 Feb;66(2):121-135.doi: 10.1369/0022155417741467. Epub 2017 Nov 10. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2803135C1 (ru) * | 2020-04-29 | 2023-09-07 | Биодайне Ко., Лтд | Студнеобразная композиция на спиртовой основе для фиксации клеток |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Hayat | Fixation for electron microscopy | |
White | The dense bodies of human platelets: inherent electron opacity of the serotonin storage particles | |
Baker | The Histochemical Recognition, of Lipine | |
Bahr et al. | Volume changes of tissues in physiological fluids during fixation in osmium tetroxide or formaldehyde and during subsequent treatment | |
Pease | Histological techniques for electron microscopy | |
Maunsbach et al. | Biomedical electron microscopy: Illustrated methods and interpretations | |
Carleton | Histological Techniques: for normal and pathological tissues and the identification of parasites | |
US5811099A (en) | Method and composition for preserving antigens and process for utilizing cytological material produced by same | |
Heym et al. | Techniques in neuroanatomical research | |
JPH076893B2 (ja) | 組織固定液および動物組織の保存方法 | |
Arnold et al. | Embedding and sectioning undecalcified bone, and its application to radioautography | |
CA2119554C (en) | Method and compositions with aldehyde stabilizing solution | |
DE69333586T2 (de) | Verfahren und zusammensetzung zur konservierung von antigenen und verfahren zur verwendung von durch selbiges verfahren hergestellten zytologischem material | |
Nayler et al. | Influence of hyperthyroidism on the uptake and binding of calcium by cardiac microsomal fractions and on mitochondrial structure | |
Churg et al. | Silver impregnation for electron microscopy | |
McMillan et al. | Preservation of erythrocyte ghost ultrastructure achieved by various fixatives | |
Al-Saraj | Use of saturated sodium chloride solution as a tissue fixative | |
Naftalin et al. | The character of the tectorial membrane | |
RU2752505C1 (ru) | Бесформальдегидный фиксатор биоматериала для гистологических и иммуногистохимических исследований | |
Hance | The fixation of mammalian chromosomes | |
Franklin | A quick method of demonstrating nematodes of the genus Aphelenchoides in leaves | |
JP2008239487A (ja) | 難浸透性組織迅速固定液 | |
McNelly et al. | Glomerular basement membrane width and proteinuria in the aging hamster kidney | |
Barbier et al. | The lung of the marmoset (Callithrix jacchus): ultrastructure and morphometric data | |
Helander | Formaldehyde binding in brain and kidney: a kinetic study of fixation |