JPH0420285A

JPH0420285A - Ｓｏｄ誘導体

Info

Publication number: JPH0420285A
Application number: JP2124510A
Authority: JP
Inventors: Mitsuru Hashida; 充橋田; Hitoshi Sezaki; 瀬崎　仁
Original assignee: Toyo Jozo KK; Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Toyo Jozo KK; Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1990-05-15
Filing date: 1990-05-15
Publication date: 1992-01-23

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】【産業上の利用分野】

本発明は、新規なスーパーオキシドディスムクーゼ（以
下、ＳＯＤと略す）誘導体および肝炎予防治療剤に関す
る。

【従来の技術】

肝臓は、生体内最大の臓器で、糖質、蛋白質等を代謝し
、内因性、外因性物質の解毒・排泄、血液循環の調節等
種々の機能を行う生命の維持に必須の臓器である。しか
しながら、肝臓はウィルス、アルコールや薬物・毒物な
どの種々の障害性因子に曝され易く、これらの肝障害の
発生により炎症が生し、全身の倦怠感、食欲不振、黄痕
などの症状を惹起ゼしめる。従来これら肝炎に対し、肝抽出物、グルクチオンなどの
含硫化合物の製剤、蛋白合成促進剤などの使用が検討さ
れてきたが、充分でなかった。また、ＳＯＤ活性により、スーパーオキシドアニオンラ
ジカル（・０□−）を消失せしめ、肝炎を治療せしめよ
うとする検胴がなされている〔特開平１−２３８５３７
号公報〕。号公報−オキシドアニオンラジカルは、生体
における酸素毒性の中で最も毒性の高い分子種で、炎症
、未１１時酸素網膜症、放射線障害、ガンなどの疾病を
引き起こすと言われている。ＳＯＤ活性を有するポリペ
ブチｌは、次式に示す不均化反応により、スーパーオキ
シ１゛アニオンラジカルを消失させる。２（・０□−）＋２８’→０゜ｌＨ２Ｏ２この特開平１
−２３８５３７号公報においては、ＳＯＤをリポソーム
化することにより肝炎に有効な治療剤が得られることを
報告している。

【発明が解決しようきする課題】

しかしながら、レシチンなどのリン脂質からなるリポソ
ームは、熱や光に弱く分解されやすく、また、リポソー
ムの製逍、貯蔵および使用に当たっても劣化分解や性能
不足をきたし、さらにリポソームの安定貯蔵期間が短く
、冷蔵などの品質管理に手間がかかるという欠点を有し
ていた。また、合成界面活性剤より形成されるリポソー
ムは、安全性、皮膚刺激性および生分解性などの問題が
多く生体に係わる用途の使用には問題があった。例えば、極めて安定なリポソームを形成するステアリル
アミンを使用したりボッ−Ｊ、については、痙栄の報告
［Ｊ、Ｎｅｕｒｏｌ、Ｓｃｉ、　、　３１　、１７３　
（１９７７）　’Ｊがあり、また、フォスフブチノルセ
リン含有のリポソームが脳内ブドウ糖代謝を抑えるとい
う報告（Ｂｒ、Ｊ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、、６６、１６
７（１９７９）　）がある。したがって、さらなる肝炎の有効な治療剤が求められて
いた。

【課題を解決するための手段】

本発明者らは、」二記問題点を解決するために鋭意研究
した結果、ＳＯＤ活性ををするポリペプチドのアミノ基
に対し特殊な糖部分を有する基を導入した新規ＳＯＤ誘
導体が、充分なＳＯＤ活性を保持し、且つ肝臓に特異的
に集積する性質を有しており、実際に肝炎に有効である
ことを確認し本発明を完成するに至った。即ち、本発明
は式（Ｉ〕　：Ｉ１ＲＳ　　　（ＣＨｚ）ｎ　　　Ｃ（１）（式中、Ｒは１
−α−マンノース残基、又は１β−ガラクト−ス残基を
示し、ｎは１〜４の整数を示ず）で表される修飾基によ
り、ＳＯＤ活性を有するポリペプチドのアミノ基が修飾
されていることを′ｌ￥徴とするＳＯＤ誘導体および該
新規ＳＯＤ誘導体を行動成分とする肝炎治療剤である。本発明においてＳＯＤ活性を有するポリペプチドとは、
反応式；％式％を触媒する活性を有するポリペプチドであれば何ら限定
されるものではなく、天然由来の抽出、精製によって得
られたポリペプチドであってもよく、またこのような天
然由来のポリペプチドを化学的合成または遺伝子操作の
手段を利用して得られたポリペブチ１−′であってもよ
く、さらに天然由来のポリペプチドを化学的合成または
遺伝子操作の手段を利用して本来のＳＯＤ活性を維持し
、且つ構成ペプチドの一部を変換せしめたムティン［ｍ
ｕＬａｉｎＨＧｌｏｓｓａｒｙ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ　ａｎｄ　Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ第４版、第３８
１頁（１９７Ｇ））ポリペプチドであってもよい。このようなＳＯＤ活性を有するポリペプチドとしては、
例えば酵母や、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ニワトす
、サルやヒトなどの高等動物の胎盤、肝臓や血液に広く
分布する銅、亜鉛の原子を含むポリペブチＦ　（Ｃｕ、
Ｚｎ−３ＯＤ　；ダイマーで分子量約３２０００）、原
核生物やミＩ〜コンドリアに分布するマンガンの原子を
含むポリペプチド（Ｍｎ−３ＯＤ；ダイマーで分子量約
４００００）、鉄の原子を含むポリペプチド（Ｆｅ−３
ＯＤ；ダイマーで分子量約４００００）などが天然由来
のポリペプチドとして挙げられ、特に好ましくはウシ肝
臓由来の天然ポリペプチド〔オルゴティン；米国命名審
議会（ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ａｄｏｐ
ｔｃｄ　Ｎａｍｅ　Ｃｏｕｎｃｉｌ）にて選定された一
般名〕や、ヒト由来の天然ポリペプチド　（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ１９　２３１０−２３１．６（１９８０
）、ＦＴｉＢＳ　ＬｅｔＬｅｒｓ、１２０．５３−５５
（１９８０）　）が挙げられる。ざらに、これらのＳＯ
Ｄ活性を有するポリペプチドは、例えばダイマーである
Ｃｕ、Ｚｎ　−３ＯＤの少なくとも１５３個のアミノ酸
からなるヒト由来のＳＯＤ活性を有するポリペプチドに
関し、ヒト肝臓組織からＲＮＡを回収し、さらにポリ　
（Ａ）　−１−ＲＮＡを回収後、遺伝子操作における常
法に従って、Ｃ−Ｉ）ＮＡを合成し、さらにこれを発現
ヘクターに組め換えた後、大腸菌や酵母などの微生物を
形質転換せしめ、この微生物を培養して目的とするダイ
マーであるＳＯＤ活性を有するポリペプチドを得てもよ
く、特開昭６０−１．３７２８６号公報、特開昭６１−
１１１６９０号公報、特開昭６１−１３９３９０号公報
、特開昭６２−１１５２７７号公報および特開昭６２−
１３０６８９号公報記載の遺伝子操作による方法を利用
できる。さらにこのような遺伝子操作によるヒｌ−Ｓ　
ＯＤ活性を有するポリペプチドに関して、本来のＳＯＤ
活性を維持して構成ペプチドの一部を特貢的に変換せし
めたムティンポリペプチドであってもよく、例えば、前
記の如くして得られた発現ヘクターに、部位特異的変異
法、即ら天然型ヒトＳＯＤ活性を有するポリペブチ１の
Ｉ）ＮＡを有する閉環構造のプラスミドヘクタ−にＢａ
ｍ１ｌ　ｌをエチシュウムブ［＋マイト存在下遮光状態
で作用さ−ヒで開環構造となし、次いでエキソヌクレア
ーゼ■を作用さ−け、変異−ｕしめたい部分のアミノ酸
をコートする塩基配列を含むＤＮＡの一木鎖合成りＮＡ
を用意し、両者をアニルさせ、ｄ　Ｎ　Ｔ　Ｐの存在下
でＤＮＡポリメラーゼおよび′■゛４　リガーゼを作用
させ、合成りＮＡをプラスミＩＳヘクターに結合せしめ
て目的とする遺伝子配列の特異的部位を変換せしめたヘ
クターが得られ（ｌｉｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍａｎ
ｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｃｓｓ
ｉｏｎ、２９１−３０３（１９８３）　；　アカデミツ
ク・プレス刊〕、これを遺伝子操作の常法乙こより微生
物に形質転換せしめてダイマーのポリペブチＦを発現−
ｕしめて得ればよい。このような遺伝子操作手段として
ば、例えば特開昭６２−１．３０６８４号公報が有効に
引用できるもので、ダイマーであるＣｕ、Ｚｎ−３ＯＤ
のアミノ酸１５３個からなるＮ末端アラニンを１位アミ
ノ酸配列とする天然ヒ１〜型ＳＯＤ活性を有するポリペ
プチドのムティンポリペプチドとして、６位および１１
１位のシスティン（Ｃｙｓ　）を何れか一方または両方
を他のアミノ酸に変換せしめるもので、特に１　］、　
１位のシスティンをセリン（Ｓｃｒ）、ヂロシン（Ｔｙ
ｒ　）　、アラニン（八ｌａ）、フェニルアラニン（Ｐ
ｉｋｅ　＞　、ｔ−リプトファン（Ｔｒｐ　）　、アル
ギニン（八ｒｇ　）　、グリシン（Ｇｌｙ）、プロリン
（Ｐｒｏ　）　、スレオニン（Ｔｈｒ）、ヒスチジン（
ｌｌｉｓ　）　、アスパラギン（Ａｓｎ　）　、アスパ
ラギン酸（Ａｓｐ　）　、ロイシン（１、ｅｕ　）　、
バリン（νａ１）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン
酸（Ｇｌｕ　）　、リジン（Ｌｙｓ　）またはメチオニ
ン（Ｍｅｔ）の何れかに変換したＮ末端側が水素原子ま
たはアセチル化されたＳＯＤ活性を有するポリペプチド
が挙げられ、これらのムティンポリペプチドにおいて、
６位システィンがそのままのアミノ酸であるか、または
このシスティンをセリン、アラニン、スレオニンなどの
中性アミノ酸に変換せしめ、かつ１１１位システィンを
セリン、アラニン、スレオニンなどの中性アミノ酸に変
換せしめたＳＯＤ活性を有するポリペプチド′が好まし
い。前記式［１３で表される修飾基にお１Ｊ７ＪＲは、１−
α−マンノース残基、又は１−β−ガラクｌ−ス残基で
あるが、］−］α−マンノース残としては１−α−Ｄ−
マンノピラノース残基が好ましく、又１−β−ガラクト
ース残基としては１−βＤ−ガラクトピラノース残基が
好ましい。この修飾基を形成するためには、式■；Ｒ−３−（ＣＨ２）　　ｎ−Ｃ−ＯＭｅ（式中、Ｒおよ
びｎは１１ｊ記と同し意味を持つ）で表される化合物を
使用すればよく、例えば、式■の化合物の代表例として
は、■−デオキソー１α−〔（２−メトキシ−２−イミ
ノ−エチル）チオ〕　−Ｄ−マンノピラノース（１−ｄ
ｅｏｘｙ−］−α−［（２−＋ｎｃ　ｔｈｏｘｙ−２−
ｉ　ｍ１ｎｏ−ｅ　Ｌｈｙ　Ｉ）　ｔｈ　ｉｏｌ　−Ｄ
−＋ｎ＋１ｎｎｏｐｙｒａｎ。ｓｅ）およびＪ−デオキソ−１−β−（（２−メトキシ
−２−イミノ−エチル）チオ）−Ｄ−ガラクトピラノー
ス（１−ｄｅｏｘｙ−１−β−（（２−ｍｅＬｈｏｘｙ
−２−４ｍｉｎｏ−ｅｔｈｙｌ）　ｔｈｉｏｌ−Ｄ−ｇ
ａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｅ）が挙げられる。これら
の製造方法は、公知の方法またはその方法に準して調整
する（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｖｏｌ、１５Ｎｏ、
１８　、ｐｐ３９５６−３９６３　（１９７６）　）　
。即ち、以下の方法によればよい。マンノース又はガラクトースをｌＩＣｌ０ａ存在下で無
水酢酸を反応せしめて、水酸基をアセチル化し、ＨＢ　
ｒにて１位をブロム化した後、これにチオウレア（ｔｈ
ｉｏｕｒｅａ）を反応せしめた後、さらに、これにＣ１
４（ＣＨ２）　、、ＣＮを反応せしめ式■；ＲＳ　−−
（ＣＨｚ　）　ｎ　　ＣＮ　　　（ＴｆＪ〕（式中、Ｒ
”は、２．３．４．６位の水酸基がアセチル化された１
−α−マンノース残基、又は２３．４．６位の水酸基が
アセチル化された１β−ガラクＩ・−ス残基を示し、ｎ
は１〜４の整数を示す）で表される化合物を得る。この
弐■の化合物に、Ｎ　ａ　ＯＭ　ｅ　／　Ｍ　ｅ　ＯＨ
を反応せしめると、式■の化合物が得られる。このようにして得られた式■の化合物と、ＳＯＤ活性を
有するポリペプチドとを、水、緩衝液等の水性媒体中ア
ルカリ条件下にて反応せしめることにより、容易に本発
明の目的化合物が調製される。アルカリ条件としては、
ｐ　＋−＋約７．５〜約１０程度が例示される。反応に
際し、ＳＯＤ活性を有するポリペプチド１分子（ｈ−３
ＯＤ等においては、ダイマーである）に対し、式■の化
合物を過剰量添加すればよいが、該修飾基を多く入れる
場合には、通常、ＳＯＤ活性を有するポリペプチド二式
Ｈの化合物−１：４〜１：］００（モル比）程度を目安
に使用すればよく、特に好ましくは、］、　：　５０程
度が例示される。また、反応温度としては、通常室温に
て行えば良いが、必要に応じて冷却または加熱すればよ
く、通常は、０〜４０°Ｃ程度とすればよい。加熱する
場合には、ＳＯＤ活性を有するポリペプチドの熱安定性
を勘案して、失活しないように設定すればよい。反応時
間は、試薬の量的関係や反応条件によって相違するので
、薄層クロマトグラフィー（Ｔ　Ｌ　Ｃ）等により反応
程度を確認して適宜終了すればよく、通常は、室温にお
いて約３〜８時間程度が例示される。ＳＯＤ活性を有す
るポリペプチド：式Ｈの化合物−１：５０程度とし、反
応時のｐ　Ｈを約９，５、温度を室温、反応時間を３時
間として調製して得た本願化合物は、後記のＴＮＢＳ　
（２，４，６−１リニトロヘンゼン−１−スルホン酸）
法により検出した結果、ＳＯＤ活性を有するポリペプチ
ド当り約１６〜１８個程度の該修飾基を有していた。Ｓ
ＯＤ活性を有するポリペプチド１分子に対する式■の化
合物の添加量を少なくするか、反応ｐ　Ｈまたは反応温
度を低く設定するか、または反応時間を短くすることに
より、本願化合物１分子中の該修飾基の数は適宜増減で
きる。しかしながら、本願化合物の肝臓への集積は、本
願化合物１分子中の該修飾基の数と相関する傾向がみら
れ、通常本願化合物１分子中に少なくとも４個以上の該
修飾基が存在すれば好ましい。このようにして得た本願化合物は、全く新規物であり、
該新規物が、元のＳＯＤに比較して充分なＳＯＤ活性を
保持し、さらに、肝臓に選択的に集積し、ｉｎ　ｖｉｖ
ｏにおいても肝炎モデルに予防治療効果を認めたのは、
本願が初めてである。本願化合物約１００ｍｇ／ｋｇを
ｄｄｙマウスに対して静注投与しても、死亡例が認めら
れなかったことから、本願化合物の毒性は、極めて低く
、本願化合物は極めて有用性の高い新規物であることが
示された。本願化合物をヒトに投与する場合には、体重や年齢、症
状により適宜の量を投与すればよく、例えば、１日１〜
５回の０．０１〜２００ｍｇを投与するとよい。本願化
合物の投与方法は、適宜の投与法、例えば注射用製剤と
して製剤化すればよく、簡便には本願化合物の凍結乾燥
物を適宜、浸透圧調節剤、防腐剤、ｐ　Ｈ調節剤、Ｉ！
類（例えば、ショ糖等）の安定化剤等を添加した注射用
蒸留水に）８解調整すればよい。さらに本願化合物を坐
剤用油性基剤、例えばオリーブ油、ラッカセイ油、ゴマ
油、人豆浦、ナタネ油、ツバキ油、カカオ脂、肝脂、羊
毛脂、牛脂などの油脂類またはこれらの水素添加油、ア
セチル化物や、これらに界面活性剤を乳化した乳化物の
単独または二種以上の混合物、または水性基剤例えばグ
リセロゼラチン、プロピレングリコールなどの基剤の単
独または種以上の混合物に加えて１〜２ｇの坐剤製剤と
して調整してもよく、また、適宜の増粘剤、吸湿剤、吸
収促進剤等を添加使用して、経皮吸収製剤又は経鼻用製
剤となしてもよい。

【実施例】

次いで本発明の参考例、実施例を挙げて本発明を具体的
に説明するが、本発明は何らこれにより限定されるもの
ではない。参考例１１−デオキソ−１−α−シアノメチルヂチオーマンノピ
ラノース−２，３，４，６−チトラアセテーＩ・の製造（１）マンノース１８　ｇ　（０，１ｍｏｌｅ）を無水
酢酸６３　ｒｎ　１．に溶かし、室温以下で攪拌しなが
ら、０゜３ｍ６のｌＩｃｌ０．　　（７０％純度）と］
Ｑｍｆｆの無水酢酸からなる混合液を添加した。室温に
て約３時間反応後、該反応液を氷水中に投入し、ｐ　Ｈ
無調整で酢酸エチルにて抽出し、酢酸エチル相を食塩水
（約１０χＷ／Ｖ）にて３回洗浄した。酢酸エチル相を
無水芒硝にて脱水後、酢酸エチルを減圧下エバボレー１
・し、得られたシラツブ残渣に同量のトルエンを加えて
共沸する操作を２回繰り返した。次いで、残渣を酢酸エ
チルに溶解し、飽和重曹水で３回、さらに飽和食塩水に
て２回洗浄した後、酢酸エチル相を無水芒硝にて脱水後
、酢酸エチルを減圧下エバボレートして残渣を得た。予め酢酸エチルにて充填したフコ−ゲルＣ−２００カラ
ム（φ４Ｘ５０ｃｍ、ゲル量；６００ｍ１）に、その残
渣をチャージし酢酸エチルで溶出するカラムクロマＩ・
グラフィーを行った。該当するフラクションを集め、減
圧濃縮し残渣を得た。（２）上記（３）で得られた残渣６゜４８ｇを、３０％
のＨＢ　ｒを含む酢酸２５ｇに４０゛Ｃの水浴中で溶解
−ｕしめ、約３℃にて、−晩装置した。反応液を、減圧下アルカリＩ・ラップを通して、エハボ
レートシ残渣を得た。この残渣を酢酸エチルに溶解し、
飽和重曹水で３回、次いで飽和食塩水で２回洗浄し、酢
酸エチル相を無水芒硝にて脱水後、酢酸エチルを減圧上
濃縮し、得られ残渣を、予め酢酸エチルにて充填したフ
コ−ゲルＣ−２００カラム（ゲルｉｔ　；　２００　ｍ
β）にチャージし、酢酸エチルで溶出するカラムクロマ
トグラフィを行った。該当するフラクションを集め、減
圧濃縮し残渣を得た。（３）上記（２）で得られた残渣４．、　１　ｇ　（０
，０１ｍｏｌｅ）に、チオウレア（ナカライテスク社製
）８ｇ　（０，０１ｍｏｌｅ　）を４．２ｍｊ！のアセ
１〜ン（モレキュラーシーブス４Ａで脱水）中で、アル
ゴン気流下、１５分間還流し、その後アセトンを減圧上
留去した。（４）上記の（３）で得られた残渣５　ｇ　（０，０１
頂０１ｅ）とＣ７ＩＣＨｚＣＮ　（ナカライテスク社製
）３．７ｇ　（０，０４１ｍｏｌｅ）とを５０％アセト
ン水２０．６ｍ（ｌで溶解し、Ｋ２ＣＯ２１、６５ｇ　
（０，０１２ｍ。ｌｅ）とＮａＨ３Ｏ，，２，１７ｇを添加し、室温下約
３０分間攪拌した。反応液に氷水３　Ｑ　ｍ　Ｏを添加して攪拌し、析出し
た沈殿を吸引濾過により集め、その沈殿を酢酸エチルと
飽和食塩水により分液し、酢酸エチル層を無水芒硝にて
脱水後、酢酸エチルを減圧上留去して残渣を得た。得ら
れた残渣を、予めＣｌｌ２Ｃρ２にて充填したフコ−ゲ
ルＣ−２００カラム（φ４Ｘ５０ｃｍ、ゲル量；　６０
０ｍｊりにチャンし、ＣＨｚ　Ｃ１ｚ　−Ｍ　ｅ　ＯＨ
＝　５０　：　１の展開溶媒にて溶出するカラムクロマ
トグラフィーを行った。ソリ力ゲルＴＩ−Ｃ（メルク社
製、Ａｒｔ；５５５４、　ＤＣ−八Ｉｕｆｏｌｉｅｎ　
Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ　６０　Ｆ２５４）にて、Ｒｆ値が
約０．５　（展開溶媒；酢酸エチル、フナスルランプ下
でスポットを確認）のフラクションを集め、減圧濃縮し
残渣を得た。さらに、この残渣を温メタノールに熔かし
、３℃に静置するごとにより再結晶化し１−デオキソ−
１−α−シアノメチルヂチオＤ−マンノピラノース−２
，３４６テトラアセテート（１−ｄｅｏｘｙ−１−α−
ｃｙａｎｏｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏ−Ｄ−ｍａｎｎｏｐｙ
ｒａｎｏｓｅ−２＋３＋Ｃ６−１ｅｔｒａａｃｅｔａｔ
ｅ　　）の結晶を得た。物性は、シリカゲルＴＬＣ（メ
ルク社製、Δｒｔ：５５５４、ＤＣ−八１ｕｆｏｌｉｅ
ｎ　Ｋｉｅｓｅ１ｇｅ＋　６０Ｆ２５４）でのＲｆ値は
約０．５　（展開溶媒；酢酸エチル）、ｍｐ；１３０−
１３］℃、〔α〕、２２゜７４．５　（ｃ＝０．２、ク
ロロホルム）であった。参考例２１−チオキソ−１−α−（２−シアノエチル）チオーＤ
−マンノピラノース−２，３，４６−チトラアセテー１
・、Ｉ−デオキソ−１α−（３−シアノプロピル）チオ
ーＤ−マンノピラノース−２，３，４，６−チトラアセ
テー１・、およびＩ−デオキソ−１−α−（４−シアノ
ブチル）チオーＤ−マンノビラノス−２，３，４，６−
デトラアセテー１−の製造参考例１（４）で用いたＣ　（ｌ　ＣＨ２ＣＮの代わり
に、各＃Ｃｆｆ　（ＣＨ２）Ｚ　ＣＮ、Ｃ１（ＣＨ２）
　３ＣＮ、およびＣ１（ＣＨ２）　４ＣＮ　（アルドリ
ッヂ社製）を用い、その他の操作は参考例１と同様に行
って、標題の化合物を得た。参考例３１−チオこ１−ソー１−β　シアノメチルチオガラクト
ピラノース− ラアセテ＝１・の製造参考例１（１）のマンノースの代わりに、ガラクトース
１８ｇを用いて、以下参考例１と同様に行って、１−デ
オキソ−１−β−シアノメチルチオガラクトピラノース
−２．３．４．６−チトラアセテー１□　＜１−ｄｅｏ
ｘｙ−１−β−ｃｙａｎｏｍｅｔｈｙｌ　ｔｂｉｏ−Ｄ
−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｃ−２＋３＋４＋６−
ｔｅｔｒａａｃｅｔａｔｅ　）の結晶を得た。物性は、
シリカゲルＴＬＣ（メルク社製、八ｒＬ：５５５４、　
ＤＣ−Ａｌｕｆｏｌｉｅｎ　　Ｘｉｅｓｅ１４ｅｌ　　
６０　　Ｐ２ｓ４）　　でのＲｆ値は約０．５　（展開
溶媒；酢酸エチル）、ｍｐ；９５−９７°Ｃ、（α）ｎ
”；−３０。０（ｃ＝５．０２、メタノール）であった
。参考例４１−デオキソ−１−β−　（２−シアノエチル）チオ−
ガラクトピラノース−２．３．４。６ーテＩ・ラアセテ−１・、■ーデオキソー１β−（３
−シアノプロピル）チオ−ガラクトピラノース−２．　
　３．　　４．、　　６−チトラアセテト、および１−
デオキソ−１−β−（４シアノブチル）チオーガラクト
ピラノース２、３．４．６ーテ１−ラアセテートの製造
参考例１（１）のマンノースの代わりに、ガラクトース
１８ｇを用い、参考例１（４）で用いたＣ　ｆｆ　Ｃ　
１１、ＣＮの代わりに、各々Ｃ７！（ＣＴＩ２）２ＯＮ
．、Ｃ（１　　（ＣＨ２）　３ＣＮＸＣｅ　　（ＣＨ２
）４　ＣＮ　（７７１。トリソチ社製）を用いて、その他は参考例１と同様に行
って、表題の化合物を得た。実施例１参考例１で得た１−デオキソ−１−α−シアツノチルチ
オ−Ｄ−マンノピラノース−２．３．４６−チトラアセ
テー１・６　０　０　ｍ　ｇに、０．０１ＭのｐＪ　ａ
　Ｏ　Ｍ　Ｑ　／メタノールを１４．８ｍ６添加し、室
温にて約２４時間反応せしめた後、メタツルを留去し、
】−デオキソ−１−α−〔（２メトキソ−２−イミノ−
エチル）チオ）−Ｄ−マンノピラノース　（　１．−＋
ｌｅｏｘｙ−］−　α−［（２−ｍｅｔｈｏｘｙ−２ｉ
ｍｉｎｏ−ｅｔｈｙｌ）　ｔｈｉｏｌ−Ｄ−ｍａｎｎｏ
ｐｙｒａｎｏｓｅ）を含む反応液を得た（１−デオキソ
−１−α〜シアツメデルチオーＤーマンノピラノース−
２．３．４．６テトラアセテートから１−デオキソ−Ｉ
−α〔（２−メトキシ−２−イミノ−エチル）チオ〕Ｉ
〕ーマンノピラノースの収率は約５０％であった）１−デオキソ−１−α−　〔（２−メトキシ−２イミノ
−エチル）チオ〕−Ｄ−マンノビラノスを含む反応液に
、Ｓｅｒ”’−ｈ−　Ｓ　Ｏ　Ｄ　（特開昭６２１３０
６８４号、以下、Ｓ−ｂ−　Ｓ　Ｏ　Ｄと略す）５００
ｍｇを含む０．０５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＩ−Ｉ９．５）
５ｍｐを添加して、室温にて約３時間反応せしめ、限外
ｉＩｆ過（アトハンテク社製、ＵＩＩＰ−４３、分画分
子量；２０，０００）　Ｌ、凍結乾燥して目的化合物の
粉末５　３　０ｍｇを得た。実施例２実施例１の１−デオキソ−１−αーソアノメチルチオー
Ｄーマンノピラノース−２．３．４、６テトラアセテー
Ｌ　６　０　０　ｍ　ｇを、参考例３で得た１−デオキ
ソ−］−β−ンアノメヂルチオ−ガラクトピラノース−
２，３，４，，６−チトラアセデー１・６０　（１ｍｇ
に代え、以下実施例１と同様にＬ７て、「１的化合物の
粉末５３９ｍｇを得た。実施例１および実施例２における本化合物の物性は以下
の通りであった。 ■＋−１１）　Ｌ　Ｃ使用機器；　Ｓｈｉｍａｄｚｕ　６Ａ　ｓｙｓｔｅｍカ
ラム；Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ　Ｄｉｏｌ−３００（品性製
作所製、７．９　ｎｕｎ　（直径）　Ｘ　５０　ｃｍ　
（長さ））移動相；　２００ｍＭ硫酸ナトリウム含有２
０ｍＭリン酸緩衝ｉ（ｐ＋−＋７．２）流速；　１．０ｍ６／分検出；Ｕ■ディテクターにより２８０ｎｍ第１表 ■分子量；１−記１１　Ｐ　Ｌ　Ｃにより、下記の標

【１１！品の
リテンションタイムから下記計算式を作成し、この４算
式により分子量を計算した（ダイマーとしての分子量と
考えられる）。その結果は、第２表に示す通りである。Ｖ、−Ｖ。Ｋａｖ（与えられた試料が拡散しうる固定相ゲル体積の
割合）ＶＯ（シトテキストラン　２０００の溶出量）　　＝　
　１０．７９８Ｖｔ　　（カラムの体積）　　−２４，
５０８Ｖ、（対象物の溶出量）ＭＷ（対象物の分子量）第２表ｒ　−””−− ■修飾基の数：出発物質である５−ｈ−Ｓ　ＯＤと、実施例１および２
の化合物の反応性のアミノ基の数を、Ｔ　Ｎ　Ｔ３Ｓ（
２＋４＋６−ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅ　１−ｓ
ｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　）法により測定した。ＴＮ
ＢＳ法は１．１．Ｂｉｏｃｌ＋ｅｍｉｓｔｒｙ４７．６
５４−６６０　（１９６０）の方法に準して行った。即ち、検体試料にＴＮＢＳを反応せしめ、３４０ｎｍの
吸光度を測定し、ＴＮＰ−リジンのモル吸光係数（ε−
］　、　　４　Ｘ　ｌ　Ｏ’　Ｍ−’ｃｍ−’）により
、ＴＮＢＳと反応し得るアミノ基の数を算出し、出発物
質である５−ｈ−Ｓ　ＯＤの算出されたアミノ基数から
実施例１または２の化合物の算出されたアミノ基数を差
し引いた数を、導入された修飾基の数とした。上記方法により、出発物質である５−ｈ−Ｓ　ＯＤのア
ミノ基数を測定すると、約２０となった。また、実施例
１の化合物に導入されていた修飾基の数は、１６．６個
であり、実施例２の化合物に導入されていた修飾基の数
は、１７．５個であった。該修飾基における糖部分の同定は、酢酸水銀（ｍｃｒｃ
ｏｒｉｃ　ａｃｅｔａｔｅ）による加水分解反応〔Δｎ
ａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　７］、
　３１８−３２ＨＩ９７６）　）を行えば、比較的マイ
ル１な条件下にて割合に定量的に分解できるので好まし
い。 ■ＳＯＤ活性；出発物質である５−ｈ−Ｓ　ＯＤと、実施例１および２
の化合物のそれぞれをプｌコテインとして同一・重量含
有する溶液のＳＯＤ活性を、ＳＯＤ活性測定法〔チトク
ローム法；　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２４４．６０
４９−６０５５　（１，９６９））　ニより、測定した
。５−ｈ−Ｓ　ＯＤ　ニおけるＳ　ＯＩ）活性を１００
として、実施例１および２の化合物のＳＯＤ活性を相対
的に表示した。く結果〉本願化合物のＳＯＤ活性は、第３表の通り、６５〜８０
％と大部分の活性が保持された。比較として、５−ｈ−
Ｓ　ＯＤにシアヌル酸法によりＰＩＥＧ（ポリエチレン
グリコール）を結合した化合物は、２０〜３０％程度の
活性保持であった。第３表実施例３Ｓ−ｈ−Ｓ　ＯＤ、実施例１の化合物、および実施例２
の化合物を下記の通り放射ラベルして、それぞれの化合
物につき２段階の投与量を、マウス（ｄｄｙ）の尾静脈
に注射した（Ｓ−ｂ−Ｓ　ＯＤについては、Ｏ，Ｉｍｇ
／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの２投与群、実施例１の化
合物、および実施例２の化合物については、０．１．ｍ
ｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇを２投与群をそれぞれ設け
た）。なお、いずれの化合物も比放射能５．６ｍＣ１／
ｍｇ　（プロティン重量当り）とした。投与後一定時間（Ｓ−ｈ−Ｓ　ＯＤにおいては、１０分
．１時間、２時間３０分、５時間、８時間および２４時
間、実施例１および実施例２の化合物においては、１分
、３分、１０分、３０分、１時間、および２時間）後に
、１群３匹を層殺し、血液、腎臓、ＩＩＩ！！臓、腸（
ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ　）　、肝臓、肺臓、心臓、筋肉、
糞尿等の臓器を摘出し、各臓器中の放射活性から、５−
ｈ−Ｓ　ＯＤ、実施例１の化合物、および実施例２の化
合物の各臓器中の分布量を測定した。〈各化合物の放射ラベル化方法〉 ■Ｉｌｌ　ｌ　ｎラベル化５−ｈ−Ｓ　ＯＤＩｎｔ、Ｊ
、八ｐｐｌ　、Ｒａ５ｉａｔ、１ｓｏｔ、、３３，３２
７−３３２（１９８２）および５ｃｉｅｎｃｅ　２２０
．６］３−６１５．（１９８３）に記載の方法に準して
行った。即ち、１０ｍｇ／ｍβの濃度の５−ｈ−Ｓ　Ｏ
Ｄ’を８液　（０、１ＭＩＩＥＰＲ３ｂｕｆｆｅｒ：ｐ
ｌ＋７．０＞１ｍｐに２倍モルのジエチレントリアミン
ペンタ酢酸無水物（Ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉ
ｎｅｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ　ａｎｈｙｄｒ
ｉｄｅ、同位化学社製、以下ＤＴＰＡ無水物と略す）を
含むＤＭＳＯ１０１７ρの溶液を添加し、約３０分間攪
拌した。その反応溶液を、Ｏ，１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６
，０）で調製したセファデックス（、−２５（商品名；
ファルマシア社製）カラム（２０ｇ、２Ｘ４０ｃｍ）に
掛けＯ，１Ｍ酢酸緩衝液（ｐｉ４６．０）で溶出した。ｔＪＶディテクターにより２８０ｎｍの吸光度を示すピ
ークを集め、限外濾過（アトパンチク社製、ＵＨＩ”−
４３、分画分子量、　２０，０００）にて１〜２ｍｌに
濃縮した。次いで、この濃縮物８０μｇに、１Ｍ酢酸ナトリウム（
ナカライテスク社製）４０μρとｎＣρ−ａ４０ｔｔｅ
の溶液を添加して、約３０分間放置し、０．１Ｍ＃酸緩
衝液（ｐＨ６，０）で調製したセファデックスＧ−２５
カラム（２０ｇ、２Ｘ４０Ｃｍ）に掛けＯ，１Ｍ酢酸緩
衝液（ｐＨ６，０）で溶出した。２８０ｎｍの吸光度を
示すビークを集め、上記と同一の限外濾過にて濃縮し、
生理食塩液に置換し、■Ｉ　ｌ　ｎラベル化５−ｈ−ｓ
ＯＤを得た〔比放射能１６．　８ｍＣｉ　７ｍｇ　（プ
ロティン重量当り）〕。 ■実施例１の化合物のＩｌｌ　）ｎラヘル化上記■にお
ける５−ｈ−Ｓ　ＯＤ溶液の代わりに実施例１の化合物
の溶液を用い、２倍モルのＤＴｒ’Ａ無水物を含むＤＭ
ＳＯ１０μｌの溶液の代わりに５〜１０倍モル（７）Ｄ
ＴＰＡ無水物を含むＤＭＳＯ１０μｆｆの溶液を用い、
以下■の方法と同様にして実施例１の化合物のｌｌｌＩ
ｎラヘル化物を得た〔比放射能；５．６ｍＣ１／ｍｇ　
　（プローｊ−イン重量当り）〕。 ■実施例２の化合物のｌＩＩ　Ｉｎラヘル化上記■にお
ける５−ｈ−Ｓ　ＯＩ）溶液の代わりに実施例２の化合
物の溶液を用い、２倍モルのＤＴＰＡ無水物を含むＤＭ
ＳＯＩＯμｅの溶液の代わりに５〜１０倍モルのＤＴＰ
八無へ物を含むＤＭＳＯＩＯμｐの溶液を用い、以下■
の方法と同様にして実施例２の化合物のＩＩＩ　ｌ　ｎ
ラベル化物を得た〔比放射能；　５．６ｍＣ１／ｍｇ　
　（プロティン重量当り）〕。〈結果〉本願化合物である実施例１および実施例２のラヘル化物
は、第１図および第２図に示される通り、肝臓に投与量
の約７０〜８０％が集積していた。実施例１の化合物で
は、腎臓、肺臓、腸等のその他の臓器に殆ど分布してい
なかった。また、実施例２の化合物では、腸に若干の分
布が認められたが、その他の腎臓、肺臓等の臓器に分布
は見られなかった。実施例１および実施例２のラベル化
物の肝臓への集積の傾向は、Ｏ，１ｍｇ／ｋｇおよび］
Ｏｍｇ／ｋｇの投与群の各々において大きな変動は見ら
れなかった。これに対し、５−ｈ−Ｓ　ＯＤは第３図に示される通り
、血液から直ちに腎臓を経て体外に排泄され、肝臓を始
めとするその他の臓器には殆ど存在しなかった。実施例４Ｓ−ｈ−Ｓ　ＯＤと実施例１および実施例２にて調製さ
れた化合物をアセトアミノフェン（Ａｃｅｔｏａｍｉｎ
。ｐｈｅｎ）を用いて誘発した実験肝炎モデルに投与した
。　〈実験方法〉スプラグ・トウリー（Ｓｐｒｇｕｅ−Ｄｏｗｌｏｙ　）
系ラット（雄）に、予め１８時間前に３−メヂル・コラ
ントレン（３−ｍｅｔｈｙｌ　ｃｈｏｌａｎｔｈｒｅｎ
）　２５　ｍ　ｇ　／　ｋｇを腹腔的投与して、１群５
〜８匹となるように無作為に５群に分けた。１群は、対照として無処理とした。 ■群には、アセＩ・アミノフェンを７５０ｍｇ／ｋｇを
注射用蒸留水に溶解して腹腔的投与した。 ■群乙こは、アセトアミノフェンを７５０ｍｇ／ｋｇお
よび実施例１の化合物１６ｍｇ／ｋ　ｇを注射用蒸留水
に溶解して腹腔的投与し、さらに１２時間後に再度実施
例１の化合物を同量腹腔内投与した。 ■群には、アセＩ・アミノフェンを７５０ｍｇ／ｋｇお
よび実施例２の化合物１６ｍｇ／ｋｇを注射用蒸留水に
溶解して腹腔的投与し、ざらに１２時間後に再度実施例
２の化合物を同量腹腔内投与した。 ■群には、アセトアミノフェンを７５０ｍｇ／ｋｇおよ
び５−ｈ−ｓｏ＋）１６ｍｇ／ｋ　ｇを注射用蒸留水に
溶解して腹腔的投与し、さらに１２時間後に百度５−ｈ
−Ｓ　ＯＤを同量腹腔内投与した。全群とも、アセトアミノフェン投与２４時間後にエーテ
ル麻酔下にて腹大動脈より採血し、致死せしめ剖検を行
った。肝臓については重量の測定および肉眼的観察を行
った。また分離採取した血清については、肝障害の指標
となるＧ　ＯＴ　（Ｃ４ｃａｌＲＣＫ社製、メルクオー
トＧＯＴ）　、ＧＰＴ　（Ｃｉｃａ−ＭＥＲＣＫ社製、
メルクオートＧＰＴ）およびラフチー１〜デヒドロゲナ
ーゼ（Ｌ　Ｄ　ＩＩ　；　Ｃｉｃａ−ＭＥＩンＣＫ社製
、メルクオートＬ　Ｄ　Ｉｔ　）　　（Ｊ、ＣＩ　ｉｎ
、Ｃｈｅｍ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１０．１８２（１９
７２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　［ｉｎｚｙｍａｔｉｃ
　Ａｎａｌｙｓｉｓ、３ｒｄ　ｅｄ、　ｅｄｉｔｅｄ　
ｂｙ　Ｉｌ、Ｌｌ、ｌｌｅｒｇｍｅｙｅｒ、Ｗｅｉｎｈ
ｅｉｍＶｅｌａｇ　Ｃｈｅｍｉｅ（１９８３）　］の各
酵素活性の生化学検査を行った。〈結果〉結果は、第４表に示される通り、実施例１の化合物およ
び実施例２の化合物を投与することにより、肝障害が抑
制されたのに対し、５−ｈ−Ｓ　ＯＤを投与しても何ら
の抑制も見られなかった。（以下、余白）第４表【発明の効果】本発明によれば、ＳＯＤ活性を十分に保持し、特異的に
肝臓に集積する性質を有する肝炎予防・治療剤として有
効で安全性の高い新規なＳＯＤ誘導体を提供できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例Ｉの化合物の各臓器中の経時的分布を
示す。第２図は、実施例２の化合物の各臓器中の経時的
分布を示す。第３図は、５−ｈ−ｓ　。Ｉ）の各臓器中の経時的分布を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）式〔 I 〕： ▲数式、化学式、表等があります▼〔 I 〕（式中、Ｒは１−α−マンノース残基、又は１−β−ガ
ラクトース残基を示し、ｎは１〜４の整数を示す）で表
される修飾基により、スーパーオキシドディスムターゼ
（ＳＯＤ）活性を有するポリペプチドのアミノ基が修飾
されていることを特徴とするＳＯＤ誘導体。
（２）ＳＯＤ活性を有するポリペプチド１分子に対して
、該修飾基が少なくとも４つ以上存在することを特徴と
する請求項（１）記載のＳＯＤ誘導体。
（３）式〔 I 〕： ▲数式、化学式、表等があります▼〔 I 〕（式中、Ｒは１−α−マンノース残基、又は１−β−ガ
ラクトース残基を示し、ｎは１〜４の整数を示す）で表
される修飾基により、ＳＯＤ活性を有するポリペプチド
のアミノ基が修飾されているＳＯＤ誘導体を有効成分と
する肝炎予防治療剤。
（４）ＳＯＤ活性を有するポリペプチド１分子に対して
、該修飾基が少なくとも４つ以上存在することを特徴と
する請求項（３）記載の肝炎予防治療剤。