JPH04197200A - 核酸の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、相補性を有する核酸間でのハイブリッド形成
反応を利用した核酸の検出方法に関する。

〔従来の技術〕

一本鎖のＤＮＡやＲＮＡが互いに相補性を有している場
合、相補性を有する部分が結合して二本鎖となりハイブ
リッドを形成する。このハイブリダイゼーション反応を
利用した核酸の検出や定量のための方法としてサザン法
等の種々の方法があり、これらの方法は遺伝子のクロー
ニング、遺伝子組換え、所望の遺伝子のスクリーニング
、あるいは検体遺伝子を用いた疾病の診断等の各種遺伝
子工学的手法における基本的技術の一つとなっている。

核酸のハイブリダイゼーションを利用した分析方法とし
ては、ＤＮＡやＲＮＡからなるプローブにハイブリッド
の検出のための標識を施し、これを試料核酸と直接ハイ
ブリダイズさせ、形成されるハイブリットをプローブに
付与した標識を利用して検出する方法が一般的である。

この直接的ハイブリダイゼーション法としての代表例と
して試料核酸をフィルターに固定した状態で標識化プロ
ーブと反応させる方法を挙げることができる。

しかしながら、従来のフィルターを支持体とした核酸の
ハイブリッド形成反応を利用する分析は、試料中の核酸
の固定、プレハイブリダイゼーション、標識化プローブ
とのハイブリッド形成、洗浄、検出という一連の操作を
必要とし、分析結果を得るまでに時間がかかるので、例
えば臨床実験で日常的に用いるのには適さないという問
題を有する。

特に核酸の固定化における焼き付け、プレハイブリダイ
ゼーション、洗浄という操作は煩雑で、分析に要する時
間を長くする原因となっている。

［Ｌｉｎ　ｅｔ　ａｔ、：　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、５５゜５０９ページ（１９
８５）　］。

また、フィルター上でのハイブリッド形成は、固相の一
本鎖核酸と液相の標識化プローブ（−水飴）との反応が
溶液中で不均一な状態で実施されるため、ハイブリット
の形成速度が遅いという問題を有する。しかもハイブリ
ッド形成効率は極めて低く、通常、添加された標識化プ
ローブのうち計算上期待される値の数％がハイブリット
形成に利用されるにすぎない。

さらに、このフィルターを支持体として用いる核酸の分
析法は、感度や精度が低いという問題もある。

以上の点から最近では核酸の固定化を行なわずに試料核
酸とプローブとを溶液中で反応させるハイブリダイゼー
ション法の核酸検出方法への適用が注目されている。

このような非固定状態でのハイブリダイゼーション法を
利用する方法が、例えば英国特許出願公開第２１６９４
０３号明細書に開示されている。この方法においては、
同一液相中に共存する２つの異なるプローブが用いられ
、検出プローブには検出され得る標識が施されており、
捕捉プローブは形成されるハイブリッドの捕捉手段に対
して親和性を有する部分を有する。これらのハイブリダ
イゼーションを行った後、捕捉プローブ、標的核酸およ
び検出プローブにより形成されたハイブリッドは、捕捉
プローブと捕捉手段との親和性を利用することによって
ハイブリダイゼーション溶液から分離される。

［発明が解決しようとしている課題］ 遺伝子工学の発展にともない、ハイブリダイゼーション
を利用した核酸の分析法の利用頻度や応用範囲も拡大し
つつあり、より簡便な操作で高感度の分析が行なえる方
法に対する要請が高まっている。

しかしながら、従来の方法はこのような要請に十分対応
し得るものではなかった。

例えば、先に挙げた非固定状態での反応を利用するハイ
ブリダイゼーションを用いる方法は、試料をフィルター
等に固定する方法に比べて検出感度の点において大幅な
改善が期待できるが、なお以下のような問題点を有して
いる。

例えば、放射性同位元素を標識とした標識化プローブを
用いた方法では、ハイブリッドの検出感度が良い等の利
点を有する反面、放射性物質を扱うので、そのための高
価な試薬、特別な機器、装置等が必要であり、また操作
に危険性を伴なうという問題がある。

これに対して、ビオチン−アビジン−抗アビジン抗体−
蛍光色素複合体の蛍光反応を利用する酵素による標識化
に代表される非放射性標識を施したプローブを用いる方
法では、安全かつ簡便な操作により標識化及び検出が行
なえ、用いる試薬も安価であるという利点を有するが、
検出感度が低くなり易いという欠点がある。

また、各種分析においては、標識化されるプローブとし
て１００塩基以上のヌクレオチド鎖長を有する核酸断片
が用いられる場合が多い。このような比較的長い核酸断
片は、その標識化が比較的容易であるという利点を有す
るが、合成機による合成が困難であり、その調達に生体
からの分離操作やクローニング等の煩雑な作業が必要と
なるという欠点がある。

これに対し、１００塩基未満の長さの核酸断片は、合成
機器によって容易に合成できるという利点がある。しか
しながら、標識化、特にニックトランスレーションや酵
素による標識化が容易でないという短所がある。

本発明の目的は非固定状態でのハイブリダイゼーション
反応を利用する方法の高感度性を生かし、かつより簡便
な操作での検出を可能とする核酸検出方法を提供するこ
とにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明の核酸の検出方法は、試料核酸とプローブ核酸と
を反応させ、得られた反応混合物中の被検出核酸・プロ
ーブ核酸ハイブリッドの形成の有無を検出する過程を含
む核酸の検出方法において、 ａ）被検出核酸の異なる部位とそれぞれ相補的な配列を
有する少なくとも２つ以上のプローブ核酸と、試料核酸
とを反応させる過程と、 ｂ）過程ａで得られた反応混合物中に形成されたハイブ
リッドのみに標識を施す過程と、Ｃ）過程をにおいて標
識化されたハイブリットを該標識を利用して検出する過
程と を含むことを特徴とする。

本発明の方法の過程ａに用いられる２つ以上のプローブ
核酸は、被検出核酸に特徴的な塩基配列内の複数の異な
る部位のそれぞれに相補的であり、その塩基配列は被検
出核酸の特徴部分に応じて選択される。プローブ配列の
態様としては、２つ以上のプローブ間で配列が同じもの
も異なるものも本件では対象とする。

なお、この被検出核酸の特徴部分自体の選定は例えば従
来の方法におけるプローブの選定と同様にして行なうこ
とができる。

本発明における被検出核酸とプローブとの関゛係を第１
図に模式的に示す。

図示した例は、被検出核酸１の特徴部分１ａ内の３つの
異なる部位のそれぞれに相補的な３つのプローブ核酸２
８〜２Ｃを用いる場合を示している。

プローブの種類数、各プローブ核酸の長さ及びそれらに
対応する被検出核酸上の各部位の配置は、後述するハイ
ブリッドへの標識過程すに用いる標識化のための方法や
各種のプローブを合成することの煩雑性等を考慮して決
定することができる。

例えば、ハイブリッドへの標識に、部分的に形成された
二本鎖の一方の一本鎖に添って他方の一本鎖を伸展させ
て２本鎖化する際に伸展する鋼内に標識を取り込ませる
方法を用いる場合には、より多くの標識を取り込ませる
ためのスペース（例えば第１図における２ａ−２ｂ及び
２ｂ−２ｃ間のスペース）がハイブリッドに形成される
ようにこれらの要件を選定すると良い。

各プローブ核酸の長さとしては、種々の長さが利用可能
であるが、上記の点に加えてミスマツチの発生を防止す
る点、から例えば１０〜１００塩基程度、望ましくは２
０〜４０塩基とすることができる。

また、ハイブリッド形成時における被検出核酸の特徴部
分１ａに占めるプローブ核酸２８〜２ｃの割合は、プロ
ーブ間のスペースが、４ｏ塩基から数に塩基程度、望ま
しくは１００塩基から５００塩基がよい。

また比率としては、スペースの長さはプローブ核酸の２
〜１０倍程度がよい。

なお、本発明の方法においては、例えば第１図における
２８〜２ｃから選択した２つの核酸が同一塩基配列を有
する場合のように、被検出核酸上の異なる部位に同一塩
基配列のプローブがハイブリダイズしても良い。

本発明の方法の一例における反応過程を模式的に第２図
（Ａ）〜（Ｅ）に示す。

まず過程ａにおいて、第２図（Ａ）に示すように、試料
核酸と３種のプローブ核酸２８〜２ｃを適当な媒体中で
これらを固定化せずに反応させる。

この反応は、常法に従って行なうことができる。

なお、ハイブリッド形成反応の条件は、用いられるプロ
ーブ核酸の有するヌクレオチド鎖長や塩基配列などによ
って異なるので、ハイブリダイゼーションにおける操作
条件は所望とする目的に応じて最適条件を適宜選択する
と良い。

このハイブリッド形成反応は、−船釣には、ホルムアミ
ド、適当な塩及びＤｅｎｈａｒｄｔ容液を含むハイブリ
ダイゼーション容液中で、温度をコントロールして行な
うことができる。

試料核酸中に被検出核酸１が存在する場合は、第２図（
Ｂ）に示すように、被検出核酸１と各プローブ核酸２８
〜２ｃとの部分的ハイブリダイゼーションによって部分
的に２本鎖化されたハイブリッド３が形成される。

次に、過程をにおいて、形成されたハイブリットに選択
的に標識が施される。

この標識化の方法としては、例えば第２図（Ｂ）に示す
ハイブリッド３の二本鎖部分を構成する鎖の一方をプラ
イマーとして利用し、その末端を伸展させて１本鎖部分
を２本化する際に、その新たに合成される伸展部分に標
識物質を取り込ませる方法等が利用できる。

この方法によれば、ハイブリッドを形成していない核酸
には、新たな二本鎖部分形成のためのプライマーとして
機能する部分及び伸展部分形成用の鋳型となる部分が存
在しないので、上記の標識物質を取り込む二本鎖化反応
が生じない。

従って、ハイブリッドを形成していない核酸とハイブリ
ッドとの混合物状態で、この標識化反応を行なっても、
ハイブリッドのみに選択的に標識を施すことができる。

この標識化には、プライマーを利用して新たな２本鎖部
分を合成するための種々の方法が利用できる。

例えば、プライマ一端部の伸展に必要な、ｄＡＴＰ、　
ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＴＴＰなどのヌクレオチド
と標識化すべきハイブリッドとをヌクレオチド鎖形成用
の酸素の存在下で反応させ、その際に用いるヌクレオチ
ドの１または２以上に標識化ヌクレオチドを用いて、新
たに形成されるヌクレオチド鎖に標識を取り込ませる方
法等を利用できる。

ヌクレオチド鎖形成用の酵素としては、大腸菌ＤＮＡポ
リメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ等の各種ＤＮＡボのリメラーゼ
や逆転写酵素などが利用できる。

この伸展反応は常法に従って行なうことができる。なお
、伸展反応用のヌクレオチド分子は全て標識化されてい
ても、所定の検出感度が得られる範囲内で標識化したも
の５としないもの４とを第２図（Ｃ）に示すように混合
して用いても良い。

標識としては、ハイブリダイゼーション法による各種検
出で利用されている標識を用いることができ、例えば各
種放射性同位元素、ビオチン、ジニトロフェニルヌクレ
オチド誘導体等の蛍光、発光または発色を誘発するため
の化合物や酵素等の非放射性標識等を用いることができ
る。

なお、同程度の標識量を用いた場合、一般に放射性標識
に比べて非放射性標識は低感度である場合が多いが、本
発明の方法においては、プローブの種類数、各プローブ
の長さ、ハイブリット形成時における各プローブの結合
位置を適宜選択することで、ハイブリッドへの標識取り
込み量を容易に増大させて、高感度検出が可能となる。

これに対して従来の方法では、長鎖プローブではミスマ
ツチハイブリッドが発生しやすく、また合成操作も煩雑
であるので、より短い鎖のプローブを標識化して用いる
場合が多いが、このような場合には標識取り込み部の量
が制限され、標識の取り込み量に限界があり、より多く
の標識量を取り込ませることによる高感度化は困難であ
る。

伸展反応により第２図（Ｄ）に示すような標識化ハイブ
リッド６が形成される。なお、標識化ハイブリッドの形
成において各プローブ２８〜２ｃの間は全て二本鎖化さ
れる必要はなく、十分な量の標識が取り込まれるならば
一本鎖部分が残存しても良い。

標識化のための過程すで得られた標識化ハイブリッドは
標識と分離され、該ハイブリッドに施した標識により検
出される（過程Ｃ）。この標識を利用した検出は、例え
ば、過程すで得られた反応液をエタノール沈殿処理にか
け、第２図（Ｅ）に示すような状態における上清中の標
識５を除去して沈殿物中のハイブリッド６と分離し、沈
殿物中の標識量を測定することにより行なうことができ
る。

［実施例］ 実施例１ プラスミドｐＵｃ１９に存在し、ｐＢＲ３２２に存在し
ない３つの領域を選択し、それぞれに相補的な以下の塩
基配列ａ　−ｃを有する３種のオリゴヌクレオチドをプ
ローブとしてＤＮＡ合成機（ＡＢ１社、３８１Ａ型）に
より合成した。

５°　　　　　　　　　　　　　　　　３゜ａ、　　Ｇ
ＧＴＡＡＴＴＣＡＡＡＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＡＡＴＧ
ＴＡＡＴＴＡ５゛３゛ ｂ、　　ＴＴＣＴＡＡＡＴＣＣＴＣＡＡＡＴＧＴＡＴＴ
ＡＴＣＴＡＴＴＧＡＣＧ５°　　　　　　　　　　　　
　　　　３゜ｃ、　　ＡＧＧＴＡＴＴＴＣＣＡＴＧＡＧ
ＣＧＴＴＴＴＴＣＣＴＧＴＴＧＣＡＡ各合成物の一部を
用い、７Ｍ尿素を含む１５％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動によりその純度を調べたところ、９０％以上の純
度を有していると判定されたので、この合成物は精製せ
ずに直接用いた。

一方、試料核酸として、プラスミドｐＢ　Ｒ３２２（試
料Ａ）及びプラスミドｐＵｃ１９（試料Ｂ）を用意し、
これらの試料を常法によってＥｃｏＲＩ（ＴＯＹＯＢＯ
製）で消化してから、得られた消化物を加熱処理して、
二本鎖ＤＮＡを１本鎖化し、各゛紙料から得られた２種
の一本鎖ＤＮＡを含む反ｉ生成物を個々に用いて以下の
操作を行なった。

上記の操作で得た１本鎖ＤＮＡ断片混合物のＬｏｎｇと
先に調製したプローブａ−ｃ合せてｌｎｇをエッペンド
ルフチューブに投入し、これに１０Ｘアニーリング溶液
〔１×アニリング溶液＝６０ｍＭ　ＭｇＣｂ、６０ｍＭ
　　β−メルカプトエタノール及び５００ｍＭ　ＮａＣ
１を含む１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）ＩＣＩ（ｐＨ８，０
））　７μβを加えてから全体量が７ｏＬＬｆ２となる
ように蒸留水を追加した。

得られた溶液を６５℃で１０分間加温した後、約１時間
かけて室温まで徐冷した。

次に、１　ｍＭ　ｄＡＴＰ　５　ｕ℃、１ｍＭｄＧＴＰ
５μｌ、１　ｍＭ　ｄＣＴＰ　５　μｎ、１ｍＭ　ｄＴ
ＴＰ　１　ｕ１２．０．４ｍＭビオチン化ｔｌＴＰ　８
μβ、ＩＯＸアニーリング溶液７μβ及び蒸留水４０μ
βを加えて混合した後、更にクレノー断片ｌＯ単位を加
え、３７℃で１時間反応させ、標識化を行なった。

反応終了後、エタノール３５０μβを加え、−７０℃で
１時間冷却した後、上清を吸引廃棄し、上清とともに未
反応のビオチン化ＵＴＰを除去し、沈殿物と分離した。

さらに７０％エタノールで洗浄を行った。

次に、沈殿物を乾燥させた後、ウシ血清アルブミン（Ｓ
ｉｇｍｅｒ社製）によって常法によりブロッキングを行
なってから、ストレブトアビジンーアルカリホススファ
ターゼ溶液（ＢＲＬ社製）を加え、３７℃で反応させた
。

３０分間経過したところで、液体を吸引廃棄し、更にＯ
，ＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ９，５）　−０，１
ＭＮａＣ１−５０ｍＭ　ＭｇＣｈ溶液（緩衝液Ａ）で洗
浄した後、ＢＣＩＰ溶液（ＢＲＬ社製）３０ＬＬｎ、Ｎ
ＢＴ溶液（ＢＲＬ社製）４４μβ及び緩衝液Ａｌ０ｍρ
の混合溶液の２００μβを加え、室温で３０分間の反応
を行なわせた。

その結果、ｐＵｃ１９からの試料は青紫の強い発色が観
察されたが、ｐＢＲ３２２からの試料では、このような
発色は観察されなかった。

実施例２ ファージベクターＭ］３ｍｐ１８ＲＦ　ＤＮＡの６つの
領域を選択し、それぞれに相補的な以下の塩基配列ａ゛
〜ｆ°を有する６種のオリゴヌクレオチドをプローブと
してＤＮＡ合成機（ＡＢＩ社、３８１Ａ型）により合成
した。

５°　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３゜５°
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３゜ｄ’　　
ＧＣＴＴＡＡＣＴＣＡＡＴＴＣＴＴＧＴＧＧＧＴＴＡＴ
ＣＴＣＴＣＴＧＡＴＡＴＴＡＧＣ５・　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　３゜ｆ゛ ＡＡＡＧＡＣＴＡＡＴＡＧＣＣＡＴＴＣＡＡＡＡＡＴＡ
ＴＴＧＴＣＴＧＴＧＣＣＡＣＧＴ各合成物の一部を用い
、７Ｍ尿素を含む１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動によりその純度を調べたところ、９０％以上の純度を
有していると一定されたので、この合成物は精製せずに
直接用いた。

一方、試料核酸として、プラスミドｐ　Ｂ　Ｒ３２２（
試料Ａ）及びＭ１３ｍｐ１８　ＲＦ　ＤＮＡ　（試料Ｂ
）を用意し、これらの試料を常法によってＥｃｏＲＩ　
　（ＴＯＹＯＢＯ製）で消化してから、得られた消化物
を加熱処理して、二本鎖ＤＮＡを１本鎖化し、各試料か
ら得られた２種の一本鎖ＤＮＡを含む反応生成物を個々
に用いて以下の操作を行なった。

上記の操作で得た１本鎖ＤＮＡ断片混合物のＬｏｎｇと
先に調製したプローブ核酸６種合せて１．０ｎｇをエツ
ベントルフチューブに投入し、これに１０Ｘアニーリン
グ溶液［ｌｘアニリング溶液：　６０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
．６０ｍＭ　　β−メルカプトエタノール及び５００ｍ
Ｍ　ＮａＣ１を含む１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐ
Ｈ８，０）　］　７μβを加えてから全体量が７０μΩ
となるように蒸留水を追加した。

得られた溶液を６５℃で１０分間加熱した後、約−時間
かけて室温まで徐冷した。

次に、１ｍＭｄＡＴＰ５μｆｆ、１ｍＭｄＧＴＰ５ｇＪ
２．１ｍＭｄＣＴＰ５μｊ２．１ｍＭ　ｄＴＴＰ　１　
ｕＪ２．０．４ｍＭビオチン化ＵＴＰ　８μρ、１０ｘ
アニーリング溶液７μβ、及び蒸留水４０μρを加えて
混合した後、更にクレノー断片１０単位を加え、３７℃
で１時間反応させ、標識化を行なった。

反応終了後、エタノール３５０μβを加え、−７０℃で
１時間冷却した。後、上清を吸引廃棄し、上清とともに
未反応のビチオン化ＵＴＰを除去し、沈殿物と分離した
。さらに７０％エタノールで洗浄を行なった。

次に、沈殿物を乾燥させた後、ウシ血清アルブミン（Ｓ
ｉｇｍｅｒ社製）によって常法によりブロッキングを行
なってから、ストレブトアビジンーアルカリホススファ
ターゼ溶液（ＢＲＬ社製）を加え、３７℃で反応させた
。

３０分間経過したところで、液体を吸引廃棄し、更に０
．１　Ｍ　Ｔｒｉｓ−）ＩＣＩ（ｐＨ９，５）　−０，
１Ｍ　ＮａＣｌ３０ｍＭ　ＭｇＣｌ２溶液（緩衝液Ａ）
で洗浄した後、ＢＣＩＰ溶液（ＢＲＬ社製）３０μβ、
ＮＢＴ溶液（ＢＲＬ社製）４４μｆｌ及び緩衝液Ａ１０
ｍｆ２の混合溶液の２００μβを加え、室温で３０分間
の反応を行なわせた。

その結果、Ｍ　１３ｍｐ　１８ＲＦ　ＤＮＡからの試料
は青紫のきわめて強い発色が観察されたが、ｐＢＲ３２
２からの試料ではこのような発色は観察されなかった。

実施例３ 先ず、試料核酸としてプラスミドベクターｐＵｃ１９を
用いて以下に示すプラスミドｐＵＳ−○を構築した。

ｐＵｃ１９をＳｃａ　Ｉ、５ｓｐＩで消化後、この約４
００ｂｐ　　ＤＮＡ断片をｐＵｃ１９のマルチクローニ
ングサイトＳｍａ　Ｉの位置に挿入した。このプラスミ
ドをＨｉ　ｎ　ｃ　ＩＩで消化し、このサイトに先と同
じＳｃａ　Ｉ、５ｓｐＩ断片を挿入した後、トランスフ
ォーメーションを行ないプラスミドＤＮＡを回収し、第
３図のように構築されているものをｐｕｓ−０とした。

上記のｌｉｇａｔｉｏｎ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏ
ｎ反応は、ＴＡＫＡＲＡのライゲーションキットに従っ
て行なった。

プローブとしてプラスミドｐＵＣ１９の２２００〜２２
４０までの領域を選び出し、以下に示す塩基配列を有す
るオリゴヌフレオチドブローブをＤＮＡ合成機（ＡＢＩ
社、３８ＬＡ型）により合成した。

各合成物の一部を用い、７Ｍ尿素を含む１５％ポリアク
リルアミドゲル電気泳動によりその純度を調べたところ
、９０％以上の純度を有していると判定されたので、こ
の合成は精製せずに直接用いた。

一方、試料核酸として、プラスミドｐＢＲ３２２（試料
Ａ）及びプラスミドｐＵＣＩ９（試料Ｂ）及び先のプラ
スミドｐｔＪｃ−０＜試料Ｃ）を用意し、これらの試料
を常法によってＥｃｏＲＩ　　（ＴＯＹＯＢＯ製）で消
火してから、得られた消化物を加熱処理して、二本鎖Ｄ
ＮＡを一本化し、各試料から得られた２種の一本鎖ＤＮ
Ａを含む反応生成物を個々に用いて以下の操作を行なっ
た。

上記の操作で得た１本鎖ＤＮＡ断片混合物の１０ｎｇと
先に調整したプローブ１．０ｎｇをエッペンドルフチュ
ーブに投入し、これに１０×アニーリング溶液［１ｘア
ニリング溶液：　６０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、６０ｍＭβ−
メルカプトエタノール及び５００ｍＭ　ＮａＣ１を含む
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，０）　］　
７　ｕ　ｆ２を加えてから全体量が７０μ℃となるよう
に蒸留水を追加した。

得られた溶液を６５℃で１０分間加熱した後、約−時間
かけて室温まで徐冷した。

次に、１ｍＭｄＡＴＰ５ｕｊ２．１ｍＭｄＧＴＰ５μｆ
ｆ、１ｍＭｄＣＴＰ５ｇｆｆ、１ｍＭ　ｄＴＴＰ　１　
μｌ、０．４ｍＭビオチン化１１ＴＰ　８μρ、１０×
アニ一リング溶液７μ℃、及び蒸留水４０μＣを加えて
混合した後、更にクレノー断片１０単位を加え、３７℃
で１時間反応させ、標識化を行なった。

反応終了後、エタノール３５０μ℃を加久、−７０℃で
１時間冷却した後、上清を吸引廃棄し、上清とともに未
反応のビチオン化ＵＴＰを除去し、沈殿物と分離した。

さらに７０％エタノールで洗浄を行なった。

次に、沈殿物を乾燥させた後、ウシ血清アルブミン（Ｓ
ｉｇｍｅｒ社製）によって常法によりブロッキングを行
なってから、ストレブトアビジンーアルカリホススファ
ターゼ溶液（ＢＲＬ社製）を加え、３７℃で反応させた
。

３０分間経過したところで、液体を吸引廃棄し、更に０
．１　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ９，５）−０，１Ｍ
　ＮａＮａＣｌ５Ｄ　ＭｇＣｈ溶液（緩衝液Ａ）で洗浄
した後、ＢＣＩＰ溶液（ＢＲＬ社製）３０μρ、ＮＢＴ
溶液（ＢＲＬ社製）４４ｕｆｆ及び緩衝液Ａ１０ｍｆｆ
の混合溶液の２００μ℃を加夫、室温で３０分間の反応
を行なわせた。

その結果、ｐｕｓ−０からの試料はｐｕｃ　１９からの
試料よりきわめて強い青紫色の発色が得られ、ｐＢＲ３
２２からの試料からはこうした発色は観察されなかった
。

［発明の効果］ 本発明においては、標識化したプローブを用いないので
、プローブに標識化のための要件が要求されない。その
結果、入手が容易であり、かつ高感度な検出が期待でき
るヌクレオチド鎖長の短いものをプローブとして利用で
き、簡便な操作で感度の良い検出が行な久る。

また、本発明においては、形成されるハイブリッドに標
識が施されるので、非放射性標識を用いた場合でも効率
良い標識化が可能となり、標識化及び検出操作がより安
全で簡便なものとなる。

更に、各プローブが被検出核酸に結合する位置及び各プ
ローブの長さを選択することで、形成されるハイブリッ
トにおいてより多くの標識取り込み部を確保でき、標識
の取り込み量を増大させて検出感度を高めることができ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明における被検出核酸とプローブ核酸の関
係の一例を示す模式図、第２図（Ａ）〜（Ｅ）は本発明
の方法の一例の主要過程を示す模式図、第３図は実施例
３を説明するための図である。 １：被検出核酸 ２８〜２ｃニブローブ ３、ハイブリット ４：ヌクレオチド ５、標識化ヌクレオチド ６・標識化ハイブリット 特許出願人　　キャノン株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、試料核酸とプローブ核酸とを反応させ、得られた反
   応混合物中の被検出核酸・プローブ核酸ハイブリッドの
   形成の有無を検出する過程を含む核酸の検出方法におい
   て、 ａ）被検出核酸の異なる部位とそれぞれ相補的な塩基配
   列を有する少なくとも２つ以上のプローブ核酸と試料核
   酸とを反応させる過程と、 ｂ）過程ａで得られた反応混合物中に形成されたハイブ
   リッドのみに標識を施す過程と、ｃ）過程をにおいて標
   識化されたハイブリッドを該標識を利用して検出する過
   程と を含むことを特徴とする核酸の検出方法。 ２、上記２つ以上のプローブ核酸は、それぞれ塩基配列
   が異なっている請求項１記載の核酸の検出方法。 ３、上記２つ以上のプローブ核酸は、塩基配列が同じで
   ある請求項１記載の核酸の検出方法。