JPH04174360A - 抗原感作ビーズおよびその用途 - Google Patents

抗原感作ビーズおよびその用途

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JPH04174360A
JPH04174360A JP2274987A JP27498790A JPH04174360A JP H04174360 A JPH04174360 A JP H04174360A JP 2274987 A JP2274987 A JP 2274987A JP 27498790 A JP27498790 A JP 27498790A JP H04174360 A JPH04174360 A JP H04174360A
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antigen
beads
synthetic resin
sensitized
pertussis
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Eiji Yamamoto
英治 山本
Shigeru Mizuta
茂 水田
Takashi Kobayashi
孝 小林
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Takeda Chemical Industries Ltd
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、抗原感作ビーズおよびその用途に関する。さ
らに詳しくは、本発明は百日せき菌由来の抗原などの抗
原で感作した合成樹脂ビーズ、その製造法および抗Ｎ１
こ対する抗体の測定法に関する。
（従来の技術） 百日せきワクチンは百日せき菌を用いた全菌体ワクチン
が用いられていたが、１９７４年に接種事故が多々発生
し、百日せきワクチンの集団接種が一時中止されるに至
った。これを契機として百日せきワクチンに対する関心
が高まり、百日せき菌の研究、ワクチンの改良化が進み
、１９８１年には百日せき菌の感染防御有効成分の中で
主要と考えられる繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、百日
せき毒素（ＰＴ）を主成分とする沈降精製百日せきワク
チンが開発され、公に接種されるに至った。
したがって、ワクチンの効果判定の手段さらに百日せき
疾患の診断・予後管理としてＦＨＡ、ＰＴに対する抗体
を測定する事は極めて重要であり、要望も強くなってい
る。
従来、ＦＨＡならびにＰＴに対する抗体価の測定法とし
ては、マイクロプレートを用いる酵素免疫測定法［Ｅ　
Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ　（ｅｎｚｙｍｅ　−ｌｉｎｋｅｄｉｍ
ｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　　ａｓｓａｙ）法］が知られ
ているが［佐藤ら、セミナーズ・イン・インフェクシ２
ン・デイシーズ（Ｓｅｍｊｎａｒｓ　　ｉｎ　　Ｉｎｆ
ｅｃｔｉｏｎ　　Ｄｉｓｅａｓｅ）。
４．３８０（１９８２）］、検出感度、測定精度、再現
性、非特異反応や試薬の安定性などの面から問題があり
、さらに優れた抗体価測定方法・試薬の出現が望まれて
いた。
（発明が解決しようとする課題） 本発明は、抗原に対する抗体なかでも百日せき菌由来の
抗原に対する抗体（以下、百日せき抗体と略記すること
がある）の測定法において、測定精度、検出感度、再現
性を向上させるとともに非特異反応を減少させることを
目的とし、また安定性に優れた百日せき抗体などの抗体
測定用試薬を提供することを目的とする。
（課題を解決するための手段） 本発明者らは上記した技術的背景のもとに、特に百日せ
き抗体価を正確に、また臨床の場においても容易に測定
できる方法を確立し、市場性に耐え得る測定試薬をユー
ザーに供給すべく鋭意研究を重ねた結果、意外にも合成
樹脂ビーズをアルデヒド類処理後に百日ぜき菌由来の抗
原で感作したビーズが安定性に優れ、該ビーズを酵素免
疫測定法における同相として用いることにより、百日せ
き抗体価測定法における測定精度、検出感度、再現性が
向上するとともに非特異反応が減少することを見い出し
、さらに研究を進め、本発明を完成した。
すなわち、本発明は （１）アルデヒド類処理後に抗原で感作した合成樹脂ビ
ーズ、（２）合成樹脂ビーズを、アルデヒド類処理後に
抗原で感作することを特徴とする上記（１）項のビーズ
の製造法、および（３）液体試料中の抗原に対する抗体
を測定する酵素免疫測定法において、固相として上記（
１）項のビーズを用いることを特徴とする該抗体の測定
法である。
本発明で用いられる抗原としては、例えば百日せき菌、
破傷風菌、ジフテリア菌、ましんウィルス、風しんウィ
ルス、おｔこふくカゼウィルス、日本脳炎ウィルスなど
の病原微生物由来の抗原など、なかでもワクチンにおけ
る感染防御有効成分中の抗原などが挙げられ、百日せき
苗、破傷風菌、ジフテリア菌などの病原細菌由来の抗原
とりわけ百日せき菌由来の抗原（好ましくは、ＦＨＡま
たはＰＴ）が好ましい。
百日ぜき菌由来の抗原を感作抗原として用いる場合、用
いられる百日せき菌［ボルデテラ・パターシス（Ｂｏｒ
ｄｅｔｅｌｌａ　　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）］としては、
例えば百ａせ、ｔ　Ｉ相菌東浜株（ＩＦＯｔ４０７３）
。
百日ぜきＩ相菌山口株、百日せき■相菌１８−３２３株
などの百日せきＩ相菌などが挙げられ、百日ぜき菌由来
の抗原としては、例えば線維状赤血球凝集素（Ｆ　ＨＡ
　：　Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ　Ｈａｍａｇｇｌｕｔｉ
ｎｉｎ）。
百日せき毒素（Ｐ　Ｔ　：　Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ　　Ｔ
ｏｘｉｎ）、易熱性毒素、フィンブリエ（Ｆ　ｉｍｂｒ
　１ａｅ）、アデニル酸サイクラーゼ、内毒素（Ｅｎｄ
ｏｔｏｘｉｎ）　、凝集［（Ａｇｇｌｕｔｉｎｏｇｅｎ
）など［医学細菌学、１巻、６３頁、１９８６年（菜根
出版）］、６９Ｋ　　ＯＭＰ（６９Ｋ［ｌａＯｕｔｅｒ
Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）など［インフェク
ション・アンド０イミユニテイ（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　
　ａｎｄ　　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）。
５６．３１８９（１９８８）］が挙げられるが、なかで
も百日せき菌としては百日ぜき■相菌とりわけ百日せき
■相菌東浜株が、百日ぜき菌由来の抗原としてはＦＨＡ
またはＰＴが好都合に用いられる。
本発明における固相（感作固相）の支持相として用いら
れる合成樹脂ビーズとしては、直径が約０゜１μＩｌ＋
−１０ｍｍ好ましくは約２〜９ｍｍさらに好ましくは約
３〜８１である球状形態好ましくは球形の合成樹脂が挙
げられ、ビーズの表面は研磨により作製することによっ
てざらざらとした形態であるものが好ましい。また、上
記合成樹脂ビーズはその表面が合成樹脂で構成されてい
るものであればよく、その内部が例えば磁性体などで構
成されているものであってもよい。
合成樹脂としては、ポリエチレン、ポリアミド。
ポリスチレンなどの熱可塑性樹脂、尿素樹脂、メラミン
樹脂、フェノール樹脂などの熱硬化性樹脂などを用いて
もよいが、なかでもポリスチレン系樹脂とりわけポリス
チレンを主成分とする合成樹脂を用いるのが好ましい。
本発明の抗原感作ビーズは、上記した合成樹脂ビーズを
百日せき菌由来の抗原などの抗原で公知の方法［石川栄
治著、酵素免疫測定法（医学書院）、イムノエンザイマ
テインク・アッセイ・テクニクス（Ｉｍｍｕｎｏｅｎｚ
ｙｍａｔｉｃ　　Ａｓ５ａｙ　　Ｔｅｃｂｎｉｑｕｅｓ
）、　ｌ　６５頁、１９８０年（Ｍａｒｔｉｎｕｓ　　
Ｎｌｊｈｏｆｆ社）など］に従って感作することによっ
て作製することもできるが、抗原感作の前処理として合
成樹脂ビーズの洗浄を行うことによって不純蛋白質等を
除去することができ、百日せき抗体などの抗体測定にお
ける検出感度を向上させることができるので好都合であ
る。
洗浄処理としては、約０．１〜５％（ｖ／ｖ）好ましく
は約１〜２％（ｖ／ｖ）に非イオン性界面活性剤（例、
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例、ホ
リオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ホリオキ
シエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエ
チレンソルビタンモノラウレ−ト、ポリオキシエチレン
ソルビタンモノラウレートなど）、ポリオキシエチレン
ソルビトール脂肪酸エステル（例、ポリオキシエチレン
ソルビトールモノラウレートなど）、ポリオキシエチレ
ン脂肪酸エステル（例、ポリオキシエチレンステアレー
トなど）、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル
（例、ポリオキシエチレンラウリルアルコール、ポリオ
キシエチレンオレイルアルコールなど）、ポリオキシエ
チレンアルキルアリールエーテル（例、ポリオキシエチ
レンノニルフェノールなど）、ポリオキシエチレンヒマ
シ油誘導体（例、ＨＣＯ−５０，ＨＣＯ−６０などのポ
リオキシエチレン硬化ヒマシ油誘導体など）、ポリオキ
シエチレンラノリン誘導体、ポリオキシエチレンラノリ
ンアルコール誘導体、ブロックポリマー型非イオン性界
面活性剤（例、プルロニック、Ｌ−６２、Ｌ−６４，Ｆ
−６８など））など好ましくはポリオキシエチレンソル
ビタン脂肪酸エステルさらに好ましくはポリオキシエチ
レンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ　２０　）
を溶解した溶液を用いて、約１０〜５０℃好ましくは約
２０〜３０℃で約１〜１０時間好ましくは約２〜３時間
、約１−１゜回好ましくは約３〜５回洗浄する方法が挙
げられる。
また、抗原感作の前処理として合成樹脂ビーズをアルデ
ヒド類（例、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、ピ
ルビンアルデヒド、グルタールアルデヒド、グリオキサ
ール）好ましくはグルタールアルデヒドまたはアセトア
ルデヒドさらに好ましくはグルタールアルデヒドで処理
することによって、百日せき抗体などの抗体測定法にお
ける検出感度を向上させることができ、また百日せき抗
体などの抗体測定用試薬（百日ぜき菌由来の抗原などの
抗原で感作した合成樹脂ビーズ）の安定性を向上させる
ことができる。
アルデヒド類での処理としては、約０．１〜１２．５％
（ｖ／ｖ）好ましくは約０．８〜２．５％（ｖ／ｖ）の
アルデヒド類好ましくはグルタールアルデヒドの水溶液
を用いて、約ｌθ〜５０℃好ましくは約２０〜３０℃で
約１０９〜５時間好ましくは約１〜２時間合成檎脂ビー
ズを処理する方法が挙げられる。
抗原感作の前処理としては、上記洗浄処理とアルデヒド
類での処理とを組み合わせて行うことが好ましく、合成
樹脂ビーズを洗浄処理後、必要に応じて乾燥し、アルデ
ヒド類での処理を行うことが好ましい。また、合成樹脂
ビーズ（好ましくは上記前処理後の合成樹脂ビーズ）は
、抗原感作前に後述する抗原調整に用いる緩衝液と同一
の緩衝液で洗浄しておくのが好ましい。
抗原感作に用いる抗原として百日せき菌由来の抗原を用
いる場合、例えば自体公知の方法［インフェクシ日ン・
アンド・イミユニティ、４１．３１３（１９８３）など
］で百日ぜきＩ相菌東浜株の培養上清から精製すること
によって得られる。得られた百日ぜき菌由来の抗原は、
通常的（Ｌ５〜５μｇ／−好ましくは約０．８〜１．５
μｇ／―となるように弱アルカリ性好ましくはｐＨ約９
〜１０の緩衝液に溶解した後、抗原感作処理に用いられ
る。
緩衝液としては、ｐＨ９，６程度の炭酸緩衝液が好まし
く、炭酸緩衝液の濃度としては、約０．００５〜０．０
５Ｍなかでも約０．０１２５〜０．０２５Ｍが好ましい
。上記のごとく緩衝液に百日ぜき菌由来の抗原を溶解し
た抗原溶液は、そのまま抗原感作処理に用いてもよいが
、通常百日せき菌に由来する抗原などの抗原感作処理前
に約ｌＯ〜４０℃好ましくは約２０〜３０℃で約１〜１
０時間好ましくは約４〜６時間さらに好ましくは約２〜
３時間静置して安定化処理を行うことによって、百日せ
き抗体などの抗体の測定法におけるバラツキが減少し、
測定精度を向上させることができる。
合成樹脂ビーズおよび百日ぜき菌由来の抗原などの抗原
は、それぞれ所望により上記した前処理を行った後、抗
原感作処理に用いられるが、例えば抗原溶液に合成樹脂
ビーズを加え、約４°Ｃで一夜放置することにより百日
ぜき菌由来の抗原などの抗原で感作した合成樹脂ビーズ
（抗原感作ビーズ）を作製することかでさる。
得られた抗原感作ビーズは、必要に応じ洗浄（例えば、
０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ　２０を含有するリン酸
緩衝液による洗浄）を行った後、百日せき抗体などの抗
体の測定に用いることができるが、測定時の非特異反応
を減少させる目的でブロッキング操作を行い、さらに必
要に応じ洗浄（例えば、０．１％（ｖ／ｖ）　Ｔｖｅｅ
ｎ　２Ｑを含有するリン酸緩衝液による洗浄）を行うこ
とが好ましい。
ブロッキング操作においては、動物の血清（例えば、ヤ
ギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ウサギ、モルモット、マウス
、ヒトなどの血清）好ましくはヤギまたはヒツジの血清
が用いられ、また用いられる緩衝液としては例えば０．
１％（ｖ／ｖ）Ｔｖｅｅｎ　−２０を含有するリン酸緩
衝液などが挙げられる。添加する血清濃度としては約１
〜２０％（ｖ／ｖ）なかでも約５〜ｌＯ％（ｖ／ｖ）が
好ましく、ブロッキング処理温度としては約２〜６０℃
なかでも約４５℃が、ブロッキング処理時間としては約
１〜３０時間なかでも約２〜２０時間が好ましい。また
、後述の液体試料として動物の血清または血漿が用いら
れる場合には、ブロッキング操作において該動物とは種
の異なる動物の血清が用いられる。
本発明の抗原感作ビーズは、液体試料（例えば、動物（
ヒト、マウス、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ウ
マ、ウシなど）の血清または血漿など）中の抗体（例え
ば、百日せき抗体）を測定する酵素免疫測定法において
、固相（感作固相）として用いられるが、例えば百日せ
き抗体の測定法では液体試料（約１０μＱのヒト血清な
ど）中の百日せき抗体と通常素標識化抗体を添加して得
られる・同相化酵素標識体の酵素活性を測定することに
より、百日せき抗体の抗体価を測定することができる。
抗原感作ビーズは、病原微生物（例、百日せき菌など）
に由来する一種の抗原で感作した合成樹脂ビーズを該抗
原に対する抗体（例、百日せき抗体など）の測定法に用
いてもよく、また病Ｗ微生物に由来する二種以上の抗Ｗ
（例えば、百日せさ菌に由来するＰＴとＦＨＡ）でそれ
ぞれ別個に感作した合成樹脂ビーズ（例えば、ＰＴで感
作しｊ；合成樹脂ビーズとＦＨＡで感作した合成樹脂ビ
ーズ）を同一容器内に入れて、同一液体試料中の二種以
上の抗体（例えば、抗ＰＴ抗体と抗ＦＨＡ抗体）を同時
に測定することもできる。
本発明における百日せき菌由来の抗原などの抗原で感作
した合成樹脂ビーズは安定で、百日ぜき菌由来の抗原な
どの抗原に対する抗体の測定法に用いる試薬として優れ
ており、該測定法に該ビーズを用いることによって該測
定法の測定精度、検出感度、再現性が向上するとともに
、非特異反応が減少するので、例えば百日せきなどの疾
患の診断・予後管理あるいは百日せきワクチンなどのワ
クチンの効果判定の目的で、百日せき抗体などの抗体を
測定する際に有利に用いられる。
以下に、参考例、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に
説明するが、これらは本発明の例示であって本発明を限
定するものでないことは言うまでもない。
なお、下記参考例、実施例で使用されている百日ぜき■
相菌東浜株の性状は、インクエクンヨン・アンド・イミ
ユニティ（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉ
ｔｙ）。
６．８９９（１９７２）などに記載されており、当該株
は国立予防衛生研究所において保管され、昭和５５年８
月１３日より財団法人発酵研究所に受託番号ＩＦＯ１４
０７３として寄託されている。
参考例１　　（ＦＴおよびＦＨＡの調製）百日せき由来
の抗原ＰＴおよびＦＨＡは、佐原らの方法［医学細菌学
、１巻、６２頁、１９８６年（菜種出版）、インフェク
ション・アンド・イミユニティ、１．３１３（１９８３
）など］に準じて調製し、培養液１０１２よりＰＴを３
　ｍｇ（９３ｄ）およびＦＨＡを７　ｍｇ（３６ｍ２）
得た。
すなわち、百日ぜきＩ相菌東浜株（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌ
ａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ　Ｔｏｈａｍａ　Ｐｈａｓｅ　Ｉ
　　５ｔｒａｉｎ　：　Ｉ　Ｆ○１４０７３）を改良ス
ティナーショルト液体培地に植付け、３５°Ｃ１５日培
養後に得られる培養上清を遠心分離（８０００ｒｐｍ、
　３０分）し、得られる培養上清をヒドロキンアパタイ
トカラム（ｐＨ８。
０）で素通りする両分（画分ｌ）と０．５Ｍ　　ＮａＣ
Ｑを含有する０、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で溶
出する画分（画分２）とに分離した。画分１を苛性ソー
ダと塩酸でｐＨ６，０に調整し、ヒドロキンアパタイト
カラム（ｐＨ６，０）にかけ、０．５Ｍ　　ＮａＣＱを
含有するＯ、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７−０）で溶出す
る両分をハプトグロビンカラムにかけ、３Ｍ　　ＫＳＣ
Ｎで溶出する画分を０．５Ｍ　　Ｎａ（１含有０　、１
　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解した５０％
グリセリンで透析して精製ＰＴを得た。−方、画分２を
ハプトグロビンカラムにかけ、素通りする両分をショ糖
密度勾配遠心（３０，０００ｒｐｍ、　１８時間、１〜
２６％（ｗ／ｖ）ショ糖濃度画分）して得られるＦＨＡ
画分を０．５Ｍ　　Ｎａ、（１２含有０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，０）に溶解した５０％グリセリンで透析
して精製ＦＨＡを得た。
実施例１−１ （ポリスチレンビーズの前処理） 直径６．３５ｍｍのポリスチレンビーズ（イムノケミカ
ル社製、岡山）１０００個にＴｗｅｅｎ　２０　（フナ
コシ薬品社）の１％（ｖ／ｖ）水溶液２００−を加えて
、室温で２時間処理（計５回）した後に精製水で洗浄。
乾燥した。更に、このポリスチレンビーズ１０００個に
対し最終濃度が２．５％（Ｖ／Ｖ）となるようにグルタ
ルアルデヒド溶液２００ｍ１を加え、室温で３時間処理
し、Ｍ／６０炭酸緩衝液（ｐＨ９，６）で洗浄した。
実施例１−２ （抗原の前処理） 参考例１で調製したＦＴ及びＦＨＡの炭酸緩衝液による
前処理操作については、ＦＴ及びＦＨＡ抗原をＭ／６０
炭酸緩衝液（ｐＨ９，６）でＰＴ−１゜５μｇ／ｉｍ、
　Ｆ　ＨＡ　−１，０Ｍｇ／＋ａ１２に鯛製し、室温で
３時間静置した。
実施例１−３ （ＰＴ結合固相の調製） 実施例１−１で前処理したポリスチレンビーズ１０００
個に対し、実施例１−２で調製処理したＰＴ抗原溶液１
６０ｄを添加し、撹拌後に真空条件下で２時間脱気し、
２〜８℃で１夜放置後Ｏ０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ　
２０を含有するリン酸緩衝液（ＰＢＳ）にて洗浄した。
実施例１−４ （ＦＨＡ結合固相の調製） 実施例１１で前処理したポリスチレンビーズ１０００個
に対し、実施例１−２で調製処理したＦＨＡ抗原溶液１
６０ｍＩ２を添加し、撹拌後に真空条件下で２時間脱気
し、２〜８℃でＩ夜放置後０゜１％Ｔｗｅｅｎ　２０／
　Ｐ　Ｂ　Ｓにて洗浄した。
実施例１−５ （ブロッキング） 実施例１−３及び１−４で得られた抗原感作固相各々１
０００個に対し、０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０　／ＰＢＳ
、１０％（ｖ／ｖ）ヒツジ血清２００−を添加し、ゆっ
くり振盪しながら４５℃の温湯で２時間処理し、０．１
％Ｔｗｅｅｎ　２０　／　Ｐ　Ｂ　Ｓで洗浄後、０．１
％Ｔｗｅｅｎ　２０／ＰＢＳ　−１０％ヒツジ血清中に
保存した。
実施例１−６ （抗原感作固相の試験） （方　法） 反応プレート（ＦＡＬＣＯＮ　　ＭＵＬＴＩＷＥＬＬ　
２４穴）の各人に緩衝液（０，１％Ｔｗｅｅｎ　２０／
ＰＢＳ　−１０％ヒツジ血清）１２００μＱを分配し、
ヒト血清検体及び標準液（２倍段階希釈液）をそれぞれ
ｌＯμＱ添加した。各人に実施例１−５で得られたＰＴ
結合ポール、ＦＨＡ結合ポールを１個ずつ添加し、恒温
槽で３７℃、６０分間第−叉応を行った。０゜１％Ｔｗ
ｅｅｎ　２０／　Ｐ　Ｂ　Ｓで洗浄（計３回）した後、
ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（１２００μｇ
）を加えて室温で３０分間第二次反応を行った。
反応終了後、０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０／ＰＢＳで洗浄
し、ビーズをそれぞれクリニコンチューブに移し替え、
基質液（０，２ｍｇ／１ｌ１２０　７　二二レンジアミ
ン、０．０２％　Ｈ２Ｏ２を含むクエン酸緩衝液ｐＨ４
，９）５００μａを加えて室温で３０分間反応した後、
ＩＮ　　Ｈ，Ｓｏ、を１５００μα加え反応を停止し、
４９２ｎｍの吸光度を測定した。
（結　果） （１）ポリスチレンビーズのグルタルアルデヒド（ＧＡ
）による前処理の効果 実施例１−１におけるＧＡの最終濃度をＯ〜２゜５％の
間で変化させ実施例１−１−ｉ５に記載の方法に従って
作製された抗原感作固相を実施例１−６に記載の方法で
測定したところ、はぼＧＡ濃度の上昇に従って測定感度
が向上し、はぼ一定となった（表１参照）。また、上記
と同様にＧＡの最終濃度を変化させて同様の方法で得ら
れた抗原感作固相を４５℃、５日間保存後、実施例１−
６に記載の方法で測定したところ、実施例１−５で得ら
れた抗原感作固相を作製直後に測定した結果とほぼ同様
な結果が得られ、４５℃、５日加速安定性試験から本発
明の抗原感作固相は安定性に優れていることが明らかで
ある。なお、抗原感作前にポリスチレンビーズをＧＡで
処理することによって、抗原感作固相の安定性がＧＡ未
処理の場合よりも向上することが判明した。
表１ 単位：吸光度（Ｘ１００Ｏ） 実施例２ ポリスチレンビーズの前処理について、２．５％（Ｖ／
Ｖ）のグルタールアルデヒドの代わりに２．５％（Ｖ／
Ｖ）のアセトアルデヒドを用いて処理し、以下実施例１
と同様の操作を行って抗原感作固相を調製し、試験を行
った。
実施例２−１ （ポリスチレンピースの前処理） 直径６．３５ｍｍのポリスチレンビーズ（イムノケミカ
ル社製、岡山）１０００個にＴｗｅｅｎ　２０　（７ナ
コシ薬品社）の１％（ｖ／ｖ）水溶液２００−を加えて
、室温で２時間処理（計５回）した後に精製水で洗浄。
乾燥した。更に、このポリスチレンビーズ１００Ｏａｔ
こ対し最終濃度が２．５％（ｖ／ｖ）となるようにアセ
トアルデヒド（ＡＡ）溶液２００ｍ１２を加え、室温で
３時間処理し、Ｍ／６０炭酸緩衝液（ｐＨ９。
６）で洗浄した。
実施例２−２ （抗原の前処理） 参考例１で調製したＦＨＡの炭酸緩衝液による前処理操
作については、ＦＨＡ抗原をＭ／６０炭酸緩衝液（ｐＨ
９，６）でＦＨＡ−１，０ｐｇ／ａｉｌに調製し、室温
で３時間静置した。
実施例２−３ （ＦＨＡ結合固相の調製） 実施例２−１で前処理したポリスチレンピーズ１０００
個に対し、実施例２−２で調製処理したＦＨＡ抗原溶液
１６０顧を添加し、撹拌後に真空条件下で２時間脱気し
、２〜８℃で１夜放置後０゜１％Ｔｖｅｅｎ　２０／Ｐ
ＢＳにて洗浄した。
実施例２−４ （ブロッキング） 実施例２−３で得られた抗原感作固相各々１０００個に
対し、０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０　／　Ｐ　Ｂ　Ｓ　、
　１０％（ｖ／ｖ）ヒツジ血清２００ｄを添加し、ゆっ
くり振盪しなから４５°Ｃの温湯で２時間処理し、０゜
１％Ｔｗｅｅｎ　２０／ＰＢＳで洗浄後、０．１％Ｔｗ
ｅｅｎ２０／ＰＢＳ−１０％ヒツジ血清中に保存した。
実施例２−５ （抗原感作固相の試験） （方　法） 反応プレーｈ（ＦＡＬＣＯＮ　　ＭＵＬＴＩＷＥＬＬ　
２４穴）の各人に緩衝液（０，１％Ｔｗｅｅｎ　２０／
ＰＢＳ−１０％ヒツジ血清）１２００μａを分配し、ヒ
ト血清検体及び標準液（２倍段階希釈液）をそれぞれ１
０μα添加した。各人に実施例２〜４で得られたＦＨＡ
結合ポールを１個ずつ添加し、恒温槽で３７°Ｃ１６０
分間第一反応を行った。０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０／Ｐ
ＢＳで洗浄（計３回）した後、ベルオキンダーゼ標識抗
ヒトＩｇＧ抗体（１２００μＱ）を加えて室温で３０分
間第二次反応を行った。反応終了後、０．１％Ｔｖｅｅ
ｎ　２０　／　Ｐ　Ｂ　Ｓで洗浄し、ビーズをそれぞれ
クリニコンチューブに移し替え、基質液（０，２ｍｇ／
ｍ　Ｏ−７エニレンジアミン、０．０２％　Ｈ，０２を
含むクエン酸緩衝液　ｐＨ４，９）５００μａを加えて
室温で３０分間反応した後、ＩＮ　　Ｈ２ＳＯ，を１５
００μα加え反応を停止し、４９２ｎｍの吸光度を測定
した。
（結　果） （１）ポリスチレンビーズのアセトアルデヒド（ＡＡ）
による前処理の効果 最終濃度が２．５％（ｖ／ｖ）となるようにＡＡを加え
、実施例２−１〜２−４に記載の方法に従って作製され
た抗原感作固相を実施例２−５に記載の方法で測定した
ところ、ＡＡ未処理の場合よりも測定感度が向上するこ
とが明らかさなった（表２参照）。
単位：吸光度（Ｘ　１０００） 実施例３ 感作抗原として、ＰＴまたはＦＨＡの代わりに表３に示
す各種抗原を用い、以下実施例１と同様の操作を行って
抗原感作固相を調製し、試験を行った。
結果は表３に示すとおりとなった。表３から明らかなよ
うに、表３に示す感作抗原のいずれを用いた場合でも、
本発明の抗原感作固相はＧＡ未処理の抗ＷＬ！ｆ１．作
固相よりも測定感度が優れていた。
なお、表３に示す各種感作抗原はいずれも以下に示す公
知の方法に従って調製した。すなわち、■破傷風トキソ
イド：Ｈ４７Ａ株の培養上溝液からＰｉｌｌｅｍｅｒら
の方法［Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、１７３．４２
７（１９４８）］に準じて調製した。
■ジフテリアトキソイド：ＰＷ−Ｎｏ、８、トロント株
の培養上清液から米国らの方法［タンパク毒素、上巻、
　１５２−１５４頁、　１９７２年（講談社月に準じて
調製した。
■風疹（Ｒｕｂｅｌｌａ）ウィルス：ＴＯ−３３６株の
ＰＲＫ細胞培養液から蔗糖密度勾配遠心法［ウィルス実
験学、総論、国立予防衛生研究所学友金錫、丸善社１に
より調製した。
■おたふく風（Ｍｕ＋ｎｐｕｓ）ウィルス：Ｅｎｄｅｒ
ｓ株の卿化鶏卵膜液から杉浦らの方法［臨床とウィルス
、じ文０．８ｌ−８６（１９８４）］により調製した。
■６９Ｋ　　ＯＭＰ：百日ぜきＩ相菌東浜株の培養液か
らＢｒｅｎａｎらの方法［１１ｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ
、＋５６゜３１８９−３１９５（１９ｇｇ）］により調
製した。
■Ｆｉｍｂｒｉａｅ　：百日ぜきＩ相菌東浜株の培養液
からＩｒｏｎｓらの方法［Ｄｅｖｅｌｏｐ、　Ｂｉｏｌ
、　５ｔａｎｄａｒｄ、　６１゜１５３−１６３（１９
８５）］により調製した。
表３ ■風疹ウィルス抗体価測定 ■百日せきＦ　ｉｍｂｒ　ｉａｅ抗体価測定単位：吸光
度（Ｘ　１０００） 実施例４ ポリスチレンビーズの前処理について、２．５％（Ｖ／
Ｖ）のアセトアルデヒドの代わりに表４に示す各種アル
デヒド類［最終濃度＝０．５〜１２゜５％（ｖ／ｖ）　
］を用いて処理し、以下実施例２と同様の操作を行って
抗原感作固相を調製し、試験を行った。
結果は表４に示すとおりとなった。表４から、各種アル
デヒド類で前処理した抗原感作同相の測定感度は、アル
デヒド類未旭理の場合よりも優れていることが明らかで
ある。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 （１）アルデヒド類処理後に抗原で感作した合成樹脂ビ
    ーズ。 （２）アルデヒド類がグルタールアルデヒドである請求
    項１記載のビーズ。 （３）アルデヒド類処理が約０．８〜２．５％（ｖ／ｖ
    ）のグルタールアルデヒド水溶液を用いて約２０〜３０
    ℃で約１〜２時間処理することを特徴とするグルタール
    アルデヒド処理である請求項１記載のビーズ。 （４）抗原が感染防御有効成分中の抗原である請求項１
    記載のビーズ。 （５）抗原が病原微生物由来の抗原である請求項１記載
    のビーズ。 （６）病原微生物が百日せき菌、破傷風菌、ジフテリア
    菌、ましんウィルス、風しんウィルス、おたふくカゼウ
    イルスまたは日本脳炎ウィルスである請求項５記載のビ
    ーズ。 （７）抗原が百日せき菌由来の抗原である請求項１記載
    のビーズ。 （８）百日せき菌由来の抗原が線維状赤血球凝集素また
    は百日せき毒素である請求項１記載のビーズ。 （９）合成樹脂ビーズが直径約２〜９ｍｍの球状形態の
    合成樹脂ビーズである請求項１記載のビーズ。 （１０）合成樹脂ビーズが直径約３〜８ｍｍの球形の合
    成樹脂ビーズである請求項１記載のビーズ。 （１１）合成樹脂ビーズが表面を研磨することによって
    作製された合成樹脂ビーズである請求項１記載のビーズ
    。 （１２）合成樹脂がポリスチレン系樹脂である請求項１
    記載のビーズ。 （１３）合成樹脂がポリスチレンを主成分とする合成樹
    脂である請求項１記載のビーズ。（１４）合成樹脂ビー
    ズを、アルデヒド類処理後に抗原で感作することを特徴
    とする請求項１記載のビーズの製造法。 （１５）液体試料中の抗原に対する抗体を測定する酵素
    免疫測定法において、固相として請求項１記載のビーズ
    を用いることを特徴とする該抗体の測定法。
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JP1-266003 1989-10-12
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