JPH04158260A - 糖類の分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は、アルカリ溶液に耐久性のあるアミノ基を有す
る弱塩基性アニオン交換体の充填された液体クロマトグ
ラフィーカラムを用いた単糖、オリゴ糖の分離分析方法
に関する。

［従来の技術］ 糖類は単糖類として存在するばかりでなく、いくつかの
単糖が結合してできるオリゴ糖から数種類の単糖類が数
多く結合して高分子を形成するデンプンやセルロースの
ような多糖類まで広く自然界に存在する。

液体クロマトグラフィーは、糖の分離分析に適しており
、広く汎用されている。液体クロマトグラフィーによる
単糖やオリゴ糖の分離分析方法には、分子フルイ、逆相
分配、イオン交換、配位子交換その他のカラムを用いる
方法がある。

糖を分子フルイ機構で分離する方法は、充填剤の微細孔
径分布を利用して各種の糖類を分子サイズの差によって
分離する方法であるため、多糖類やオリゴ糖の分離分析
に広く用いられているものの、分離能力が劣り、分子量
の等しい単糖やオリゴ糖の相互分離にはまったく適さな
い。

オリゴ糖の分離分析方法に、オクタデシルのようなアル
キル基を化学結合させた逆相分配クロマトグラフィー用
カラムを用いる方法がある。この方法も分子量の等しい
単糖やオリゴ糖の相互分離に難点があり、適用できる試
料が著しく限定される。

分子量に差のない単糖やオリゴ糖の相互分離に適合する
分離分析方法として、スルホン酸基を有するポリスチレ
ンゲルの対イオンに金属イオンをイオン結合させたゲル
を充填剤にして、糖と金属イオンとの配位子交換を利用
する方法がある。しかしながら、この方法は、イオン結
合で充填剤に存在させている金属イオンが脱離し易く、
継続使用における経時変化の問題がある。

強塩基性アニオン交換樹脂の充填されたカラムを用いて
、ｐ）１１３以上の強アルカリ液を溶離液にして、糖の
水酸基を陰イオンに解離させアニオン交換作用で分離す
る方法もある。この方法は単糖やオリゴ糖の分離性能が
すぐれているものの、糖の分解、装置のアルカリ耐性、
溶離液中の塩類の析出問題等、多くの欠点がある。

単糖やオリゴ糖の分離方法として広く知られている他の
方法として、シリカゲルにアミノプロピル基あるいはポ
リアミンを化学結合させた充填剤を用い、溶離液として
水とアセトニトリルの混合液を用いる方法があげられる
。この方法は、一定組成の溶離液を用いるために操作が
簡便で、かつ分子量に差のない単糖、オリゴ糖の相互分
離にも高い分離能を有している。しかしながら、アミノ
基を有するシリカゲル充填剤は、水溶液やｐＨ耐性に大
きな欠点があり、分離性能、再現性、カラムの耐久性等
に解決すべき課題が残されていた。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明は、従来の分離分析方法の中にあって、操作が簡
便で高い分離性能も期待できるアミノ基を有する弱アニ
オン交換体を充填剤とする液体クロマトグラフィーカラ
ム（以下、アミノカラムと略称）を用い、単糖、オリゴ
糖を分離分析する改良された糖分析法を提供する。

本発明者らは、従来技術の再現性の欠如や早期カラム劣
化の問題を解消するとともに、アミノカラムを用いる糖
分析方法では提示されなかった還元糖のアノマーに起因
するピークの拡がりの問題を克服する分離分析方法を確
立し本発明をなすに至った。

［課題を解決するための手段］ 本発明に用いる充填剤は、一級アミノ基、二級アミノ基
またはおよび三級アミノ基、即ち、弱塩基性アニオン交
換基を有する充填剤からなる。本発明に好適な充填剤は
、例えばビニルアルコール・コポリマーに量比＝が０．
５〜２．　Ｏｍｅｑ／　ｇ導入されたゲルが用いられる
。更に詳しくは以下のものが好ましい。ビニルアルコー
ル単位と架橋性単量体単位を有し、コポリマー重量当た
りのビニルアルコール単位に由来する水酸基量が０．５
〜４、Ｏｍｅｑ／ｇｓ弱塩基性アニオン交換基量が０，
５〜２、Ｏｍｅｑ／ｇｓ保持し得る水の量が０．５〜４
．０ｇ／ｇの架橋共重合体であって、架橋性単量体単位
の割合（Ｘ）が０，４５≦Ｘ≦０，８の範囲にある事を
特徴とする、陰イオン交換体。

（但し　　　　　　ｎｂ Ｘ＝　　− ａ＋ｎｂ ここで、ａは架橋共重合体中の架橋性単量体単位を除く
単量体単位のモル分率、ｂは架橋性単量体単位のモル分
率、ｎは架橋性単量体１分子が有するエチレン性二重結
合の数を示す。） 即ちこれら充填剤は、各種緩衝液およびｐ）１８〜１３
のアルカリに対して耐性を示すので好ましい。その詳細
は製造方法も含めて、特開平２−２２７１４４に詳述さ
れている。

本発明に用いる充填剤の粒子径は、特に限定されるもの
ではないが、平均粒径として３〜５０μｍ１好ましくは
４〜２０μｍが望ましい。３μｍ以下では高速処理が難
しくなり、５０μｍを越えると分離性能が著しく低下し
、実用的でない。

本発明に用いるカラムの製作方法は、一般に知られた方
法で何等支障がなく、湿式スラリー法の定圧充填法で良
い。ゲルを充填する際の圧力は用いるゲルの粒子径によ
って異なるが、３０〜２ｏＯ）ｃｇ／ａｌで満足できる
カラムが得られる。

次に本発明で特に重要な要件となる充填剤におけるアミ
ノ基の形態と糖類の分離方法について詳細説明する。本
発明でいう糖類とは、単糖、オリゴ糖である。従来方法
においては、還元糖における例えばグルコースと呼ばれ
る単糖において、α型とβ型のアノマーが存在し、この
アノマーが液体クロマトグラフィー分析時に異なった溶
出特性を示す。分析条件によってはαとβのアノマーの
溶出位置が異なってくるため、極端な条件では２つのピ
ークに分離し、分離しない条件でもピークの幅が拡がり
ブロードになる。多くの単糖やオリゴ糖の分離分析では
、このアノマーの分離は共存する他の糖との分離に支障
をきたすため、分離しない条件におくことが肝要となる
。前記の配位子交換による分析法では８０℃の高温下で
分析することでこの問題に対処している。一方、従来の
アミノカラムを用いる分析方法では、充填剤に塩基性を
持つアミノ基が存在することもあって、これまで同種の
問題があまり取り上げられなかった。しかしながら、本
発明者らの検討の結果、アミノカラムにおける糖分析に
おいても糖アノマーの問題は、分離性能に大きく関与し
ていることが判明した。

本発明方法においては、アミノ基の遊離型量比を高くす
ることが高分離性能の重要要件であり、またアミノ基の
遊離型量比を一定にすることが、再現性の確保に不可欠
である。即ち糖類の分離分析に際して充填剤のアミノ基
の遊離型量比を０．６以上、好ましくは０．８以上、更
に好ましくは０．９以上にする必要がある。本発明でい
う遊離型量比は次式で定義する。

分析時の遊離型量比＝ 遊離型量比　＝ カラム内の総量比＝ カラム内の総量比＝は、カラムに０．ｌＮ−ＨＮＯ３水
溶液３０ｍ１を１時間かけて通液し、無水メタノール１
５ｍ１を３０分間通液して液置換した後、０、ｌＮ−Ｎ
ａＯＨ水溶液２０ｍ１を４０分間通液し、その溶離液を
採取し、同溶離液中のＮ　ａ　Ｎｏ、を定量して求める
。分析時の遊離型量比＝は、上記の無水メタノールによ
る液置換以降の同じ操作によって求める。

本発明方法による糖類の分離方法は、予めｐＨ１２〜１
３のアルカリ水溶液、例えば、ＮａＯＨ水溶液を１時間
〜１夜通液してカラム内のアミノ基を遊離型化した後、
５０〜９０％アセトニトリル水溶液を溶離液にして試料
液を注入して行う。この方法では、分離分析を繰り返し
ている間に試料液あるいは溶離液中に共存する微量の酸
性物質が吸着し、徐々に遊離型量比が低下してくるため
、適当な間隔で上記の遊離型化操作を行う必要がある。

本発明方法による別の糖類の分離分析方法として、ｐＨ
９〜１１のアルカリ水溶液とアセトニトリルの５０〜９
０％混合液を溶離液にして行う方法がある。。

ここに用いるアルカリ試薬はＮａＯＨ，ＫＯＨ等でも良
いが、水酸化テトラプロピルアンモニウム、水酸化テト
ラブチルアンモニウム等の四級の水酸化アルキルアミン
を酢酸等の酸でｐＨ調整した緩衝液が好適である。他の
緩衝液として酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム等も適
合する。緩衝液を用いる場合、その濃度はアセトニトリ
ルを混合する前の水溶液の状態で１０〜１００ｍＭが好
ましい。１０ｍＭ以下では緩衝能が不十分になり、１０
０ｍＭ以上は濃度を上げる利点が見当たらない。アルカ
リ水溶液のｐＨが９以下では、アミノ基の遊離型量比低
下に伴うピークのブロード化が著しくなり、ｐＨ１１以
上では三糖類の溶出特性が著しく変化するため良好な分
離が得られ難くなる。本発明方法で糖類を分析すると、
常に一定組成のアルカリ液が溶離液として通液されてい
るため、アミノ基の遊離型量比が一定比率に保たれ、従
来の糖アノマー分離の問題を解消しピークの幅が極めて
シャープになり高分離性能を発揮すると同時に、従来技
術に無い高い再現性が確保される。

本発明方法によると従来技術のような高温分析は特に必
要とせず室温で良いが、４〜８０℃の広い温度範囲で実
施できることも勿論のことである。

本発明で一般的に適用する溶離液の流速は、空塔速度と
して０．１〜１０ｍ／時間が好ましい。

送液ポンプ、試料注入器、検出器等の用いる液体クロマ
トグラフは従来の装置で便箋支障がなく、検出方法も一
般に広く知られている示差屈折計、ボストラベル法によ
る紫外分光々変針等が適合できる。

［実施例コ 以下、実施例に従って、本発明を更に具体的に説明する
が、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定するも
のでないことはいうまでもない。

実施例１ 酢酸ビニル１００ｇ、　　）リアリルイソシアヌレー）
　１４５ｇ　（Ｘ＝０．６　）　、酢酸ｎブチル１７０
ｇ及び２．２アゾビスイソブチロニトリル７ｇよりなる
均一混合液と、少量のポリビニルアルコールおよびリン
酸ナトリウムを溶解した水１４００ｍ１とを還流冷却器
、窒素導入管及び攪拌器を備えた５１の三つロフラスコ
に入れ十分攪拌した。次いで、窒素気流下で攪拌しつつ
、６０℃で１６時間重合を行って粒状コポリマーを得た
。該コポリマーを濾過、洗浄し、アセトン抽出した後乾
燥した。ついで該コポリマーをカセイソーダ６０ｇを溶
解した水３１と共に、還流冷却器、窒素導入管及び攪拌
器を供えた５１の三つロフラスコに入れ、窒素気流下１
５℃で２０時間攪拌して該コポリマーのケン化反応を行
った後、濾過、水洗、更に乾燥した。ケン化によって得
られたビニルアルコール・コオリマーの水酸基密度は２
．５＋＋＋ｅｑ／　ｇであった。

ついで該コポリマーをエピクロルヒドリン１３８０ｇ１
ジメチルスルホオキサイド３１、カセイソーダ０．１５
Ａ’と共に、還流冷却器、窒素導入管及び攪拌器を供え
た５１の三つロセパラブルフラスコに入れ窒素気流下３
０℃で２０時間攪拌してエポキシ基を該コポリマーに導
入した。

ついで該コポリマーをジメチルスルホオキサイド、水で
洗浄した。その後、該コポリマーを５０％ペンタエチレ
ンへキサミン水３ｋｇと共に、還流冷却器、窒素導入管
及び攪拌器を供えた５１の三つロセパラブルフラスコに
入れ、窒素気流下３０℃で２０時間攪拌して一級、二級
、三級のポリアミノ基を該コポリマーに導入した。該コ
ポリマーを洗浄、乾燥した後、分級して粒子径５μｍの
陰イオン交換体を得た。該陰イオン交換体のアミノ基の
量は１．３ｍｅｑ／　ｇ陰イオン交換体、水酸基の密度
は２．３ｍｅｑ／　ｇ陰イオン交換体、保水量は０．７
ｇ／ｇ陰イオン交換体であった。

４ｇの該陰イオン交換体を７５％アセトニトリル水溶液
に分散して、圧力２５０ｋｇ／ａｍ！で内径４．６ｍｍ
及び長さ２５０ｍｍのステンレスカラムに２時間、同分
散液で通液して、充填カラムを作成した。

それぞれのカラムの遊離 型量比は表１に示す通りであった。

得られた遊離型量比の異なるカラムを用いて下記条件で
フルクトース、グルコース、シュクロース及びマルトー
スの混合物を分析し、糖類の溶出容量及び理論段数を測
定し、表２ならびに図１に示した。表２ならびに図１に
示す通り、遊離型量比が０．９３以上のカラムで高い理
論段数が得られた。更に遊離型量比の変化が、糖類の溶
出容量に大きく影響することがわかった。

分析条件 移動相　　　　　　７５％アセトニトリル水流速　　　
　　　　１．　０ｍｌ／ｍｉｎカラム恒温槽温度　３０
°Ｃ 検出器　　　　　　屈折率計５Ｅ−５１（昭和電工■製
） （よζ下企白） 実施例２ 実施例１と同じ方法で２本の充填カラムを作製し、その
１本については１０ｍＭ水酸化テトラプロピルアンモニ
ウムを酢酸でｐＨＩｏに調整した水溶液とアセトニトリ
ルを２５／７５に混合した溶液を移動相としてフルクト
ース、グルコース、シュクロース及びマルトースの混合
物を、２００検体連続分析を行った。当カラムの遊離型
量比は０．９６であった。本実施結果の溶出容量と理論
段数を表３に示した。比較のために、７５％アセトニト
リル水で同様の連続分析を実施し、得られた結果を表３
に示した。表３に示すように、本発明方法を用いれば、
すぐれた再現性が長期にわたって得られた。

（風下全白） ［発明の効果］ 以上のように、本発明方法は、アミノ基の遊離型量比を
高い状態におくことによって、低温から常温分析で糖ア
ノマーの分離問題を飛躍的に改善し、高い分離性能を可
能にする。さらに溶離液にアルカリ性溶液を用いること
によって、アミノ基の遊離型量比を一定にした結果、試
料液や溶離液から持ち込まれる酸性物質による悪影響を
排除し、従来にない高い再現性を確保した。

【図面の簡単な説明】

図１は実施例１において得られたアミノ基の遊離型量比
と糖類の理論段数の関係を示したグラフである。Ａはシ
ュクロース、Ｂはフルクトース、Ｃはマルトース、Ｄは
グルコースである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一級アミノ基、二級アミノ基またはおよび三級アミ
   ノ基を有する充填剤の充填された液体クロマトグラフィ
   ーカラムで糖類を分析するにあたり、アミノ基の遊離型
   量比が０．６以上にある充填カラムを用いて、糖類を分
   析する方法。 但し、遊離型量比＝遊離型アミノ基量／アミノ基の総量