JPH04134266A - 総ビリルビンの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、総ビリルビンの測定方法に関し、さラニ詳し
くは、間接ビリルビンの反応性を高め、ジアゾ反応が迅
速に行われるようにした正確かつ効率的な総ビリルビン
の測定方法に関する。

〔従来の技術］ ビリルビンは、赤血球の老化によるヘモグロビンの分解
産物で、赤色胆汁色素の主成分であり、血清中にも少量
存在する代表的な生体内色素である。このビリルビンに
は間接型ビリルビンと直接型ビリルビンがあり、間接ビ
リルビンは非抱合型ビリルビン（遊離ビリルビン）で水
に極めて難溶性であるが、血液中でアルブミンと結合し
て水溶化され、一方、直接ビリルビンは抱合型ビリルビ
ンで、間接ビリルビンの側鎖のプロピオン基にグルクロ
ン酸が結合したグルクロナイド（モノグルクロナイドと
ジグルクロナイドの２種類がある）である。これらの間
接ビリルビンと直接ビリルビンとを合わせて総ビリルビ
ンと称している。

通常、血中のビリルビン濃度は１■／ｄ１以下であり、
主として間接ビリルビンであるが、赤血球の崩壊速度、
細網内皮系でのビリルビン形成能、肝臓における抱合能
、細胆管、胆道の透過速度などの異常により、血中に間
接ビリルビンあるいは直接ビリルビンが増加し、溶血性
、閉塞性、肝細胞性、先天性などの買置を引き起こす、
したがって、総ビリルビンの測定によって、肝機能障害
の程度や、Ｒｈ不適合による胎児の溶血性疾患の重症度
等を知ることができ、臨床検査において重要な測定項目
の１つとなっている。

従来より行われている血清ビリルビンの測定法の１つと
して１９１６年Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｂｅｒｇｈによって紹
介された反応促進剤の存在下でジアゾ反応を行い、生成
したアブビリルビン色素の吸光度を測定する方法がある
が、血清中に存在するビリルビンはごく少量であるため
この方法は有効であり、現代でも一般によく行われてい
る。そしてこの原理に基づいて、反応促進剤としてメタ
ノールを用いたＭａｌｌｏｙ−Ｅｖｅｌｙｎ法、カフェ
インと安息香酸塩を用いたＪｅｎｄｒａｓｓｉｋ−Ｇｒ
ｏｆ法、ダイフィリンを用いたＭｉｃｈａｅｌｓｓｏｎ
法等が紹介され、ジアゾ化試薬としてはスルファニル酸
と亜硝酸ナトリウムが用いられていた。

これらのビリルビン測定法は、試薬調製が繁雑であり、
血清蛋白による濁りが生しやすいため正確な値が得られ
ないという問題があった。

また、ジアゾ化試薬として用いられるスルファニル酸と
亜硝酸ナトリウムは極めて不安定であるため、使用時に
調製する必要があった。

そのため反応促進剤についても、ジアゾ化試薬について
も数々の工夫がなされてきたが、主なものにジアゾ化試
薬の改良の１つである、ジアゾ化合物とナフタレンスル
ホン酸塩、塩化亜鉛との複合塩、フッ化ホウ素酸塩など
、固体状態で分離された安定化ジアゾニウム塩が挙げら
れる。これは予め作成した安定化ジアゾニウム塩粉末を
緩衝液に溶解するだけで試薬調製ができ、生成したアゾ
ビリルビンの安定性もよく優れたものである。

しかしながら、安定化ジアゾニウム塩はｐＨが高くなる
と不安定になり、ｐＨが低くなるとビリルビンとの反応
性が悪くなるという欠点があった。

間接ビリルビンも直接ビリルビンも血清中ではアルブミ
ンと強固に結合しており、ｐＨ５以下で解離するが、間
接ビリルビンはアルブミンと結合して水溶化された状態
の方がジアゾ反応をおこしやすく、完全に解離してしま
う酸性条件下では反応性が著しく低下する。一方、直接
ビリルビンは低いＰＨＯ方が反応性が増し、ｐＨ２付近
が最も反応し易い、従って、間接ビリルビンと直接ビリ
ルビンのジアゾ反応における至適ｐＨが異なるため両者
を同し条件下で完全に反応させることは困難である。

前述の通り安定化ジアゾニウム塩はｐＨが高いと不安定
になるため、一般に総ビリルビン測定試薬はｐＨ１，５
〜２．０に調整されている。すなわち間接ビリルビンが
非常に反応しにくい状態である。

特開昭５９−２３−２５３号公報では特定のジアゾニウ
ム塩をビリルビンのカップリング成分として：試験溶液
を弱酸性ないし中性にして生じた着色の吸光度を測定す
る方法が提案されているが、ジアゾニウム塩の存在下で
ｐＨを上げているためやはり不安定になることは避けら
れず、また直接ビリルビンの至適ｐＨでないため直接ビ
リルビンが完全に反応しないという欠点があった。

また、前記ジアゾ反応による従来の測定法はすべて検体
に直接ジアゾ化試薬を加えるので、共存物質（ヘモグロ
ビン、乳び等）の影響を受けやすく、測定値が実際より
高くなるという欠点があった。そのため検体ブランクを
測定することは不可欠であり、検体ブランクとアゾビリ
ルビンの最低２回の測定操作と試薬を必要とした。殊に
自動分析機を使用した場合は、２チヤンネルを使って検
体ブランクを取るという面倒な操作を行わなければなら
なかった。

ビリルビンの測定については課題が多く、今日まで数々
の改良法や試薬が提案されているが、ジアゾ化試薬の安
定性、ｐＨの調整、操作の容易さ、価格面等のあらゆる
条件を考慮すれば、どれも満足のいくものではない。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は如上の事情に鑑みてなされたもので、まず反応
促進化試薬である第１試薬を検体に加え、検体ブランク
を測定した後、更にジアゾ化試薬を第２試薬として加え
、−度に検体ブランクとアゾビリルビンを測定すること
によって操作の簡便化と試薬の節約を図った。

しかしながら、２試薬系にしたためジアゾ反応が完全に
終わるまでにはかなりの時間を要し、特に自動分析機に
適用した場合は、ジアゾ反応時間が短縮されてしまうた
め、間接ビリルビンの反応が不完全なまま測光してしま
い、正確な測定値が得られなかった。

本発明者は更に上記問題を解消せんがために鋭意研究し
た結果、第１試薬のｐＨを中性付近に調整し、間接ビリ
ルビンが反応しやすい状態でジアゾ化試薬が入るように
すると、短時間で反応が終了することを見出し、本発明
に到達した。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、ビリルビンにジアゾ化試薬を作用させ、生成
したアブビリルビンの吸光度を測定するビリルビンの測
定方法において、ｐＨが６．０〜８．０である反応促進
化試薬を第１試薬とし、ジアゾ化試薬を第２試薬として
検体ブランクおよびアゾビリルビンの吸光度を一連に測
定することを特徴とする総ビリルビンの測定方法である
。

〔作用〕

本発明の総ビリルビンの測定方法は、第１試薬である反
応促進化試薬のｐＨを中性付近に調整しであるので、間
接ビリルビンがジアゾ反応を起こしやすい状態でジアゾ
化試薬が加わることになり、短時間で反応が終了する。

ジアゾ化試薬は強酸性であるため、中性付近である反応
促進化試薬と混合されても試験液は酸性であるので直接
ビリルビンも反応が可能であり、１つの検体につき一度
の操作で検体ブランクとアゾビリルビンの吸光度を測定
することができる。

〔実施例〕

次に本発明の詳細な説明する。

本発明の総ビリルビンの測定方法は、総ビリルビン測定
試薬を２つに分け、第１試薬のｐＨを中性付近に調整し
たことを特徴とする。

まず検体に第１試薬を加え、５分後、吸光度を測定する
（Ｅ、）。測定後、第２試薬を加え、更に５分反応後、
吸光度を測定する（Ｅ−ｚ）　。

また、標準としてビリルビン濃度既知の標準液を用いて
同様に測定する（　Ｅ＊ｗ＋＋　　Ｅｓｔｄｚ）　＊こ
のＥ　ｓ＋は検体ブランクに相当し、Ｅ、はアゾビリル
ビンの吸光度である。Ｅ□□は標準ブランクであり、Ｅ
　ｆｉｗ□は標準検体の吸光度である。そして次式によ
って総ビリルビン量が求められる。

ここで言う第１試薬とは緩衝液を含む反応促進化試薬で
あり、第２試薬とは安定化ジアゾニウム塩を含むジアゾ
化試薬である。安定化ジアゾニウム塩は従来から用いら
れているものが使用可能であり、例えば、２，４−ジク
ロロフエニルジアゾニウム［２−クロロ−４−ニトロフ
エニルジアゾニウム塩、ｐ−スルホベンゼンジアゾニウ
ム−１−５−ナフタレンジスルホン酸等が一般に使用さ
れている。

安定化ジアゾニウム塩は凍結乾燥品で粉末状であり、溶
解液で溶解してジアゾ化試薬とする。

第１試薬に関しては、間接ビリルビンの反応性を高める
ためｐＨを６〜８に調整したものを用いる。緩衝液はリ
ン酸緩衝液が好ましい。

比較例１〜４ 試薬の調製 玉上抜１ ジメチルスルホキシド　　　　　３００−スルファニル
酸　　　　　　　　０．１７３ｇ塩酸　　　　　　　　
　　　　　１０．４ｍ精製水　　　　　　　　　　　　
６９０　ｍ１１跋ｌ ｐ−スルホベンゼンジアゾニウム−１−５−ナフタレン
ジスルホン酸　　　　　　　　１．２８８ｇジメチルス
ルホキシド　　　　　３００ｄスルフアニル酸　　　　
　　　　０．１７３ｇ塩酸　　　　　　　　　　　　１
０．４２ｔｉ！塩化ナトリウム　　　　　　　　　２．
６ｇ精製水　　　　　　　　　　　　６９０ｍ検体０．
０８ｄに第１試薬２．５　ｄを混合し、３７°Ｃで５分
加温後、分光光度計（日立Ｕ−３２１０型）で吸光度を
測定した（Ｅ、、）。更に第２試薬１．５　ｄを混合し
、３７°Ｃで５分間反応後、波長５６０ｎｗで吸光度を
測定したｌ：、ｚ）　、検体は、オメガＥＢ（日本テク
ニコン社製）、ブレチビル（ベーリンガー社製）、ＥＸ
Ａビリルビン（三光純薬社製）、ビリルビンコントロー
ル（ディト社製）の４種の市販管理血清を使用した。

次に標準液０．０８ｄに第１試薬２．５　ｄを混合し、
同様に吸光度を測定（Ｅ、、、、）した後、第２試薬１
．５　ｍを加えて同条件下で吸光度を測定した（Ｅ、４
□）。標準液としては直接ビリルビンの凍結乾燥品を水
に溶解したもの（濃度９．６ａ＋ｇ／ｄ１）を用いた。

以上を前記計算式に当てはめて総ビリルビン量を求めた
。

比較例５〜８（従来の測定方法） 試薬の調製（総ビリルビン測定用） ｐ−スルホベンゼンジアゾニウム−１−５−ナフタレン
ジスルホン酸　　　　　　　　０．４８３ｇ塩化ナトリ
ウム　　　　　　　　　　１ｇ塩酸　　　　　　　　　
　　　　１０．４Ｊｄジメチルスルホキシド　　　　　
３０ＯＮ１スルフアニル酸　　　　　　　　０．１７３
ｇ精製水　　　　　　　　　　　　６９Ｍ！検体０．０
８１１に調製した試薬４．０　ｄを加え、３７°Ｃで１
０分反応後、分光光度計（日立ｔｌ−３２１０型）にて
波長５６０ｎｍで吸光度を測定した（Ｅ、□）。

標準液についても同様に測定を行なった（Ｅ　＠ｔａ２
−Ｅ□４□）。

試薬の調製（検体ブランク測定用） ジメチルスルホキシド　　　　　３００Ｉ１１スルフア
ニル酸　　　　　　　　０．１７３ｇ塩酸　　　　　　
　　　　　　　１０．４ｄ精製水　　　　　　　　　　
　　６９０ｄ検体０．０８ｄに上記試薬４．Ｏｉを加え
、同様に吸光度を測定した（Ｅ、、）。

検体、標準液については実施例１〜４と同じものを使用
した。

以上を計算式に当てはめて総ビリルビン量を求めた。結
果を第１表に示す。

（以下余白） 第　　１　　表 （単位：■／ｄ１） 第１表かられかるように、比較例５〜８に比べて比較例
１〜４の数値が極めて低くなっている。

これは反応時間が短縮されたため、ジアゾ反応が不完全
な状態で測光していると考えられる。

そこで間接ビリルビンの反応性を高めることが必要とさ
れるが、用いた試薬がいずれも強酸性であるため間接ビ
リルビンの至適ｐＨでないことに着眼し、ｐＨによる影
響を調べるため第１試薬のｐＨをいろいろと変えて測定
することを試みた。

実施例１〜４ 試薬の調製 玉１区１ ジメチルスルホキシド　　　　　２７０ｄスルフアニル
酸　　　　　　　０．１５６ｇ＊緩衝液　　　　　　　
　　　　　１００ｄ精製水　　　　　　　　　　　　６
３０戚ＩＮの塩酸またはＩＮの水酸化ナトリウムで各々
のＰＨに調整する。

＊緩衝液は各ｐＨに適したものを下記のとおり使用した
。

ｐ　Ｈ４０，５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４）ｐ　Ｈ６０，０
５Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ６）ｐＨ７ｔｔ ｐ　Ｈ８０，５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８）ｐＨ１０ｓ １１跋１ ｐ−スルホベンゼンジアゾニウム−１−５−ナフタレン
ジスルホン酸　　　　　　　　１．２８８ｇジメチルス
ルホキシド　　　　　３００ｄスルファニル酸　　　　
　　　　０．１７３ｇ塩酸　　　　　　　　　　　　１
０．４２ｄ塩化ナトリウム　　　　　　　　　２．６ｇ
精製水　　　　　　　　　　　　６９０ｄ第１試薬のｐ
Ｈを４．６，７，８．１０に調整し、各々の試薬で比較
例１〜４と同様に４種の検体について測定を行ない、総
ビリルビン量を求めた。

結果を第２表に示す。

（以下余白） 第２表から、第１試薬のＰＨを６〜８に調整したものは
、５分の反応時間でも比較例５〜８、すなわち従来の測
定方法とほぼ等しい値が得られることがわかった。そし
て、ｐＨ４、ｐＨ１０のものは、５分間の反応時間では
反応が終了していないため数値が低くなることが明らか
になった。

このことより第１試薬のＰＨを６〜８、特にＰＨ７に調
整して測定するのが好ましく、自動分析機で測定する際
には本発明は一層効果的である。

次に、乳び（混濁）が測定値に及ぼす影響について次の
ような実験を行い、本発明の測定方法と従来の測定方法
とで比較した。

実施例５ ２倍濃度の血清に、添加液（混濁液）を１＝１の比で混
合したものを原液とする。そして、同血清に、精製水を
１：１の比で混合したものを稀釈液とする。更に原液と
稀釈液を０：５（乳び濃度０％）、１１（乳び濃度０．
４％）、２：３（乳び濃度０．８％）、３：２（乳び濃
度１．２％）、４：１（乳び濃度１．６％）、５：Ｏ（
乳び濃度２．０％）の比で混合し、６つのサンプルを調
製する。

血清は、市販管理血清モニトロールＩｒＸ（間隙試薬社
製、１０ｄ溶解用）を２倍濃度にするため５ｉの精製水
で溶解したものを用いた。添加液には、インドラリボス
（ミドリ十字社製、４％濃度）を使用した。

調製した６つのサンプルを実施例１〜４と同様に測定を
行なった。このときの第１試薬のｐＨは７とした。

比較例９ 実施例５と同じサンプルで比較例５〜８と同様に測定を
行なった。

添加液（乳び）の影響を受けていなければ、６つのサン
プルは、はぼ同じ値となる。添加液の影響を受けていれ
ば、原液の濃度（乳び濃度）が高くなるほど測定値も高
（なることになる。

結果を第３表に示す。

第 表 また、共存物質の影響を受けないので確実に、正確な測
定値が得られる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ビリルビンにジアゾ化試薬を作用させ、生成した
   アゾビリルビンの吸光度を測定するビリルビンの測定方
   法において、ｐＨが６．０〜８．０である反応促進化試
   薬を第１試薬とし、ジアゾ化試薬を第２試薬として検体
   ブランクおよびアゾビリルビンの吸光度を一連に測定す
   ることを特徴とする総ビリルビンの測定方法。