JPH04134098A - 副甲状腺由来高血圧因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は、これまで確認されていなかった副甲状腺由来
の循環因子に関する。この因子は、細胞へのカルシウム
の取り込みの調節に関与し、特に哺乳類における高血圧
及びいくつかの他の疾患に関係する。単離されたこの循
環因子並びに患者におけるこの循環因子の検出法を開示
する。この因子は、細胞内カルシウムの上昇に起因する
疾患に罹患した患者の検査、及びカルシウムが関与する
他の疾患の研究に有用である。

［従来の技術］ 高血圧症とは通常、収縮期及び／又は拡張期の動脈圧が
公称値である１４０／９０ｍｍＨｇより上昇した状態と
定義される。高血圧を伴う疾患には、粥状硬化、高血圧
性腎不全、脳卒中、欝血性心不全及び心筋梗塞が含まれ
る。動脈圧の降下に有効な多くの治療法が発見されてい
るにもかかわらず、本態性高血圧症の病因は本質的に不
明のままである。高血圧に対する遺伝的素因は一般に認
められているが、高血圧症の治療に有効であることが見
出された多くの薬剤、及びこれらの薬剤が異なる薬理学
的機序により作用していると見なされる事実から、本態
性高血圧にはいくつかの要因が存在するであろうことが
示唆される。

多くの研究は、１つまたはそれ以上の循環因子が高血圧
症の発症及び経過に関与しているであろうことを示して
いる（Ｗｒｉｇｈｔ　ｅｔ　ａｌ、、　　ｒＳＨＲ血液
中に見出された高血圧性物質Ｊ　、　ＬｉｆｅＳｃｉ、
　３４．１５２１−１５２８　（１９８４）；　Ｄａｈ
ｌ　ｅｔ　ａｌ。

「高血圧の液性伝達；パラバイオシスによる証明Ｊ　、
　Ｃ１ｒｃ、　Ｒｅｓηｊ吐（Ｓｕｐｐｌ、Ｉ）、　２
ｌ−２３（１９６９）；　Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　
ａｌ、、　　ｒ　Ｓ　ＨＲにおける静脈肥大の原因とな
る循環因子の証明Ｊ　、　ＡｍＪ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、
　２４１．　Ｈ４２ｌ−Ｈ４３０（１９８１）；　Ｔｏ
ｂｉａｎｅｔａｌ、、ｒ食塩誘発高血圧を伴うＤａｈｌ
　Ｓラットにおける循環液性昇圧物質Ｊ　、　Ｃ１１ｎ
、　Ｓｃｉ、　５７３４５ｓ−３４７ｓ　（１９７９）
；　Ｚｉｄｅｋ　ｅｔ　ａｌ、、　　ｒ原発性高血圧症
の病因における液性因子Ｊ　、　Ｋ１１ｎＷｏｃｈｅｎ
ｓｃｈｒ、　６３　（Ｓｕｐｐｌ　ＩＩ）、　Ｄ：　９
４−９６（１９８５）：　Ｈｉｒａｔａ　ｅｔ　ａｌ、
、　　ｒ高血圧の食塩感受性Ｄａｈｌラットの血清にお
ける高血圧誘導因子」。

Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ　６．７０９−７１６　（１
９８４））　、例えば、バラバイオシスや交叉潅流試験
では、正常血圧動物に高血圧動物の血液を交流させるこ
とにより血圧を上昇させることができた。高血圧自然発
症ラット（ＳＨＲ）から得られた赤血球関連因子を皮下
注射することにより、正常血圧のＷＫ　Ｙ　（Ｗｉｓｔ
ａｒ−Ｋｙｏｔｏ）ラットにおいて高血圧が誘発される
ことが観察されており、且つ高血圧の食塩感受性Ｄａｈ
ｌラットの血清を注射することにより、正常血圧の食塩
感受性Ｄａｈｌラットの血圧上昇を誘発することができ
る。

高血圧ラット及び高血圧患者のいずれにも存在し、細胞
内カルシウムを上昇させる循環因子が報告されている（
Ｂａｎｏｓ　ｅｔ　ａｌ、、　　ｒ本態性高血圧患者の
血小板におけるカルシウム取り込み増加に関連する２つ
の因子Ｊ　、　Ｃ１１ｎ、　ＥｘｐＨｙｐｅｒｔｅｎｓ
、　９．１５１５−１５３０　（１９８７）；　Ｚｉｄ
ｅｋ　ｅｔａｌ、、　　「高血圧患者血漿の透過性亢進
ヒト好中球内カルシウム移送に対する効果Ｊ　、　Ｃ１
１ｎＳｃｉ、　７４．５３−５６　（１９８８）；　Ｌ
ｉｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、　　ｒ本態性高血圧患者循
環因子の正常血小板細胞内遊離カルシウムに対する効果
Ｊ　、　Ｎ、　Ｅｎｇ、　Ｊ、　Ｍｅｄ３１６　５０９
−５１３　（１９８７）；　Ｂｒｕｓｃｈｉ　ｅｔ　ａ
ｌ、、　　ｒｓ１〇　− ＳＨＲにおけるＰ　Ｔ　Ｈレベルの上昇が報告されてお
り（ＭｃＣａｒｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｈｙｐｅｒｔ
ｅｎｓｉｏｎ　３（Ｓｕｐｐｌ、１）、　１１６２　（
１９８１））　、さらに、副甲状腺機能亢進患者がしば
しば高血圧を示し、多くの症例で副甲状腺切除によりそ
の症状が緩解されることが観察されている（Ｈｅｌｌｓ
ｔｒｏｍ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｂｒ１ｔ、　Ｊ、　Ｕｒｏｌ、　３０．▽１３　（１９
５８））　。副甲状腺切除による同様の結果は、ＳＨＲ
においても報告されている［５ｃｈｅｅｉｆｆｅｒ　ｅ
ｔ　ａｌ、、Ｊａｐ、’　Ｃ１ｒｃ、　Ｊ４５、▽１２
７２　（１９８１））。哺乳類及びその他のを椎動物に
おいては、外因性ＰＴＨが血圧降下をきたす［Ｐａｎｇ
　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎ、　Ｃｏｍｐ、　Ｅｎｄｏｃ
ｒｉｎｏｌ。

４１、▽１３５　（１９８０））にもかかわらず、いろ
いろな研究者は、ＰＴＨが本態性高血圧の進展に関与し
ていると提唱している。このＰＴＨの血管拡張作用もま
た、高カルシウム血症を招来する活性部位とは分子上独
立した特別な活性部位に関係しており（Ｐａｎｇ　ｅｔ
　ａｌ、、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇ、ｙ　１１２゜
２８４　（１９８３））　、ＰＴＨはさらにＬ−タイプ
のカルシウムチャンネル（Ｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、投
稿中〕を▽　１１▽− 通じてカルシウムが血管平滑筋に流入することを阻害す
る（Ｐａｎｇ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ、　
４２゜１３９５　（１９８８）］。従来、Ｐ　Ｔ　Ｈが
上昇すれば、血清中のイオン化カルシウムレベルが上昇
すると考えられてきたが、高Ｐ　Ｔ　Ｉ−ル▽ベルにあ
る高血圧患者が、血清中のイオン化カルシウムレベルの
低下を示すという事実により、このパラドックスは、更
に強調される（Ｒｅｓｎｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３０９．８８８
　（１９８３）：Ｈｖａｒｆｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　
Ａｃｔａ　Ｍｅｄ、　５ｃａｎｄ、　２１９．▽４６１
（１９８６））。

本発明がなされた時点においては、Ｐ　Ｔ　Ｈは副甲状
腺が産生ずる唯一のホルモンであると報告されており、
また本態性高血圧症に副甲状腺が関与することは明白で
あるが、血管系に及ぼすＰＴＨの作用に関して報告して
いるこれまでの文献からは、Ｐ　Ｔ　Ｈが本態性高血圧
の原因因子であるとは考えられない。

［発明が解決しようとする課題］ Ｓ　Ｈ▽Ｒ及び多くの本態性高血圧患者において、▽１
２− 副甲状腺に由来し、従来報告されていなかった循環因子
が存在することがここに示されている。

この因子は、細胞へのカルシウムの取り込みを調節する
ことを示しており、また食事によって摂取するカルシウ
ムレベルの上昇により抑制され得る。本発明者らはこの
因子を単離し、この因子に対する抗体を用いてこの因子
を検出する方法を開示する。この因子は約３，０００〜
４　、▽０００ダルトンの分子量を有する。バイオアッ
セイ・データより、人間及びラットにおけるこの因子は
実質的に類似していることが見出された。

この循環因子は、本態性高血圧症に罹患した人口のかな
りの割合に−すべでではないが一存在していると思われ
、特に低レニン性高血圧と関連している。高血圧患者が
この循環因子を有するか否かを調べることにより、この
循環因子の作用に拮抗する治療法を計画し、治療効果を
観察するために利用できる。

Ｓ　ｌ（▽Ｒの血液中における循環因子の存在は、我々
が報告した研究［ＡｌＴ１．　Ｊ、　Ｈｙｐｅｒｔｅｎ
ｓ、　２゜▽　１３▽− ▽１１ ２６−３１　（１９８９））により確認されている。こ
れらの研究において我々は、Ｓ　Ｈ▽Ｒからの血漿を正
常血圧ラット（ＷＫＹ及びＳ　Ｄ　（Ｓｐｒａｇｕｅ−
Ｄａｗｌｅｙ）ラット）の静脈内龜持続注入（ｉｎｆｕ
ｓｉｏｎ）あるいは単回注入（ｂｏｌｕｓ　１ｎｊｅｃ
ｔｉｏｎ）　した場合、血圧が上昇することを示した。

さらに随夙１印試験において、ラット尾動脈切片による
４５Ｃａ取り込みが、ＳＨＲの血漿濃度を緩衝溶液中で
増加させたとき、用量依存的に増大することを示した。

これらの実験結果は、血圧の」−昇及び細胞内へのカル
シウム取り込みの増加がともにこの系内に存在し、かつ
利用可能なＳ　ＨＲの血漿量に依存していることを明ら
かにしている。興味深いことに、両事例の作用の立ち上
がりは遅く、徐々に進行するが、ノルエピネフリン、ア
ンギオテンシン■及びパップレシンのような周知の内因
性昇圧物質は投与後はとんど直ちに又は極めて迅速に血
圧の上昇を起こすことが観察されている。本研究で観察
されたもう一つの結果は、Ｓ　Ｈ▽Ｒの血漿の持続注入
を中止▽１４− １〇− したり、正常血圧ラットから得た血漿に置き換えたりす
ると、血圧が極めて迅速に元の状態に低下したことであ
る。この血圧低下は、単なる循環液量の減少による影響
ではない。関連する実験では、正常血圧および高血圧を
有する被験者の血漿を透析し、正常血圧ＳＤクラット注
入すると、両検体ともに血圧を上昇させた。これらの血
漿はｉｎ　ｖｉｔｒｏでラット尾動脈におけるカルシウ
ムの取り込みも上昇させた。

循環因子の由来は、これまで知られていない。

しかし、ＰＴＨが高血圧ラットにおいて上昇するという
逸話的な報告により、副甲状腺が研究の標的となること
が示唆された。ＳＨＲの副甲状腺を切除すると、血圧の
低下が観られ、また副甲状腺を切除したＳＨＲからの血
漿は、正常血圧ラットの血圧上昇を引き起こさなかった
。

逆に、正常血圧ＳＤクラットＳＨＲからの副甲状腺を移
植すると、採取した血漿を他の正常血圧ラットに注入す
ることにより示されたように、血圧の上昇及び血漿中の
因子の出現が認められた［：Ｐａｎｇ　ａｎｄ　Ｌｅｗ
ａｎｃｚｕｋ、Ａｍｅｒ、　Ｊ、　Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ
２、　８９８　　（１９８９））　。

［課題を解決するための手段］ これらの研究に基づき、我々はこの循環因子が副甲状腺
に由来していると結論し、この物質を“副甲状腺由来高
血圧因子”（ＰＨＦ）と命名した。

注入した血漿中にはカルシウム並びに他の低分子量の昇
圧物質が存在していることが上述した実験を複雑にして
いる。この可能性を除去するために、注入するすべての
血漿を分子量約ｔ、ｏｏｏ以下の物質を分離する膜を使
い、−晩透析した。本性はカルシウムを効果的に除去し
、分子量４００〜５００であると報告されているウワバ
イン様因子を含む最もよく知られた内因性昇圧物質をも
除去し得る。また仮にそのようなＲ圧物質が存在してい
ても、その昇圧作用は速やかに発現し、ＰＩＦの昇圧パ
ターンとは異なる。

血漿からＰＩＦを分画、同定するために、ＳＨＲ，ＷＫ
Ｙ及びＳＤクラット断頭、瀉血し、集められたおのおの
のタイプの血漿をヘパリン処理後に遠心分離した。集め
られた血漿をまず初めにセルロース膜を用いて透析しく
分子量１．０００で分画）、そして上限分子量的５，０
００で分画することができる限外濾過膜、例えばポリス
ルホン樹脂膜等を用いた限外濾過装置を通して濾過した
。ここで集められた濾液を凍結乾燥により濃縮した。濃
縮した濾液を親水性シリカゲルを用いたゲル濾過カラム
クロマトグラフィーにかけた。０．１％トリフルオロ酢
酸水溶液を溶出液として両分を集めた。溶出液をＰｈａ
ｒｍａｃｉａ社製ＵＶ検出器を用い２１４及び２８０ｎ
ｍの波長でモニターしながら、分子量マーカーを目安に
して、ＳＨＲ血漿サンプルより分子量が約３，０００〜
４．０００ダルトンと推定される両分を得た。（第１図
参照）。

上記操作で得たＳＨＲ血漿由来の両分を一つにまとめ、
凍結乾燥により濃縮し、生理食塩水に溶解して正常血圧
ＳＤクラット静脈注入した。

血圧の上昇は、ＳＨＲの透析済み血漿の場合に観られる
ような遅発性（注入後３０〜４５分）の特徴を示した。

正常血圧ラットの血漿サンプルの同−溶出部における両
分は、このような活性を示さなかった。

活性画分をさらに特徴づけるため、血漿サンプルを凍結
乾燥し、０．１％トリフルオロ酢酸とアセトニトリルの
混液による濃度勾配を利用し、多孔質オクチル結合シリ
カゲルを用いた逆相カラム高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）にて２８０ｎｍで再び溶出液をモニターし
ながら分画し、単一ピークのＰ　ＨＦ画分を得た。結果
を第７図に示す。

上述したＳＨＲ血漿サンプルの各分離工程での精製度は
、ＳＤクラット１２週耐重３００〜３５０ｇ）において
１０ＩＴ１０ｌＴ１の遅発性平均動脈圧上昇（Ｌｌユ人
後５０分の時点）を引き起こす投与サンプル量中の蛋白
質含量より確かめた。その結果を第３表に示す。

甲状腺組織を伴う副甲状腺をＳ　ＨＲから摘出し、ハン
クス液（Ｇｉｂｃｏ社製）で毎日液を交換しながら７日
間培養した。ＰＩＦの産生は培養液からカルシウムを減
らすことによって刺激できる。培養液を血漿サンプルの
処理と同様の方法で透析、限外濾過及びゲル濾過した後
、得られた活性画分を凍結乾燥し逆相カラムＨＰＬＣに
よって分画して、単一ピークのＰＨＦ画分を得た。第１
０図はその逆相カラムＨＰＬＣの溶出プロフィールを示
している。

ＳＨＲの血漿或いは甲状腺組織を伴う副甲状腺培養液よ
り得られたＰＩＦの等電点電気泳動は、ポリアクリルア
ミドゲルを用い、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製Ｍｉｎｉ−ｉｓｏ
ｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｆｏｃｕｓｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍを
使ってｐＨ３〜１０のｐＨ勾配で行った。結果は第１１
図に示すが、約ｐＨ６に共通のバンドが認められている
。

ＰＩＦ産生細胞からのＲＮＡは従来の技術によって抽出
できる（ｃ、ｆ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、　ｅｔ　ａ
ｌＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ　Ｍｅｔｈｏｄ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　　Ｎ
Ｙ、　（１９８２）　）　。ポリ（Ａ）　ＲＮ　Ａはオ
リゴ（ｄＴ）セルロースカラムのようなりロマトグラフ
ィーにより分画され、逆転写酵素でｃＤＮＡに変換し、
従来技術（ｅ、ｇ、、　Ｌａｎｄ　ｅｔ　ａ１９　Ｎｕ
ｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　２２５１　（１９８
１））で、二重螺旋にできる。ＤＮＡは利用可能な形質
転換ベクターに挿入され、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２のよ
うな適当なりローニング宿主に形質転換する為に使用で
きる。その宿主から得られたプラスミドのフラグメント
はｃＤＮＡライブラリーを製造する為に用いられ、ラベ
ルした合成プローブで一般的方法（ｃ、ｆ、　５ｏｕｔ
ｈｅｒｎ、　９８　Ｊ、　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ、　５０３
（１９７５））により選別される。よくハイブリダイズ
したフラグメントは発現ベクターを構築する為に用いる
ことができる。発現ベクターで形質転換した細胞はＰＨ
Ｆを多量に産生できる。

血漿、培養産生細胞や形質転換細胞のいずれかから精製
したＰＨＦを用いて、ＰＩＦに対するポリクローナル及
びモノクローナル抗体を作り、その抗体を用いてＰＩＦ
をアッセイできる。

甲状腺組織を伴う副甲状腺の培養液から得た部分精製Ｐ
ＨＦをＶｉａｍｏｎｔｅｓ等の方法〔ＪＩｍｍｕｎｏｌ
、　Ｍｅｔｈ、　９４．１３−１７　（１９８６））に
よりアミノフェニルチオエーテル（ＡＰＴ）ディスクに
結合させ、そのディスクを雄性Ｂａ１ｂ／ｃマウスに埋
め込むことにより免疫した。免疫したマウスは、２週問
おきにフロイントの不完全アジュバントと抗原で免疫を
増強させ、抗原として血漿から単離したＰＨＦを用い、
ＥＬ　Ｉ　ＳＡにより抗体力価を測定した。測定し得る
量のポリクローナル抗体は１ケ月以内に産生じ、その後
抗体価は増加した。

モノクローナル抗体はポリクローナル抗体を産生ずるマ
ウスの牌臓から調製できる。

必要なハイブリドーマとモノクローナル抗体は、本分野
の熟練した技術者において周知である方法［：Ｌａｎｇ
ｏｎｅ　＆　Ｖｕｎａｋｉｓ、　”Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ
ｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”　１２１．１−９４７　（１
９８６））を用いて得られる。

各々の抗体は通常の精製方法例えばプロティンＡをリガ
ンドとしたアフィニティークロマトグラフィー等で処理
し、ＰＩＦの検出法やキット用に利用される。

ポリクローナル抗体及び／又はモノクローナル抗体を使
った検出法は、特に限定されず、ＲＩＡ、ＥＩＡ、ＥＬ
ＩＳＡ及び免疫沈降反応に基づくアッセイ系を含む。そ
のようなアッセイ系の特に望ましい具体例としては、精
巧な分析機器を持っていない医師の診療室又は診療所で
使えるような診断キットの形態があげられる。

このような方法は、体液中のホルモンや他の免疫反応物
質の検出に使われてきた。１つの例は、妊娠初期の検出
用の市販キットである。それゆえＰＩＦはこのような方
法を利用することにより、定性的あるいは定量的な検出
が可能である。

酵素免疫アッセイ用の代表的なテストキットは、ａ）固
相と結合したＰ　Ｉ　Ｆに対する抗体、ｂ）ＰＨＦに対
する酵素標識抗体、Ｃ）該抗体の標識酵素に対する基質
、及びｄ）ＰＩＦの標準溶液を含む。ＲＩＡ用の代表的
なテストキットは、ａ）ＰＩＦに対する抗体、ｂ）抗Ｐ
ＨＦに対する二次抗体、ｃ）ラジオアイソトープで標識
されたＰＨＦの標準溶液、ｄ）標識されてないＰＨＦの
標準溶液、及びｅ）沈殿用試薬を含む。免疫沈降アッセ
イ用の代表的なテストキットは、ａ）ＰＩＦに対す盃抗
体、ｂ）抗体の付着している固相、及びｃ）ＰＨＦの標
準溶液からなる。

ＰＨＦの存在は、食事により摂取するカルシウムがしば
しば血圧を低下させる効果があること、そしてカルシウ
ムチャンネルブロッカ−もまた同一の患者において効果
があるという文献における一見矛盾した報告の説明に寄
与する。

一般に血清中でカルシウムが長時間高い濃度を維持して
いると、細胞内カルシウムレベルが高くなり、高血圧症
を引き起こすことは予想されるであろう。ところが、現
時点でこの特別な理論に明確に関連するものではないに
しても、第３図に示すように、ＰＨＦはカルシウムチャ
ンネルを開くように作用し、食事から摂取するカルシウ
ムはＰＨＦの放出を抑制するのである。

確かにＳＨＲでは、高カルシウム食を与えたＳＨＲの血
漿中には存在しない血漿中ＰＨＦがカルシウム欠乏食を
与えたＳＨＲでは上昇していることを我々は示した（Ｌ
ｅｗａｎｃｚｕｋ　ａｎｄ　Ｐａｎｇ第４回第４高米圧
学会年会要旨集、　１９８９）。

この仮説は他の血管作用物質を用いた潅流実験で支持さ
れる。透析したＳＨＲの血漿とノルエピネフリン、アル
ギニンパップレシン、アンギオテンシン■等をＳＤクラ
ット投与すると平均動脈圧の上昇が増強され、最大限の
上昇がＳＨＲの血漿に反応する高血圧のピーク時に観察
される。

ＰＨＦは低レニンや食塩感受性高血圧に特徴的に存在し
、高レニンや食塩非感受性高血圧には存在しないと思わ
れる。

ＰＩＦが副甲状腺細胞に由来することは、ＳＨ，Ｒの副
甲状腺切除によって平均動脈圧が減少することにより確
認されている。加えてＳＨＲの副甲状腺には特徴的な細
胞が認められるが、ＳＤやＷＫＹラットでは認められな
い。異常な細胞の存在は、光学及び電子顕微鏡のいずれ
によっても確認できる。細胞は、アルデヒド　ツクシン
（ａｌｄｅｈｙｄｅ　ｆｕｃｈｓｉｎ）や鉄ヘマトキシ
リン（ｉｒｏｎ　ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）のいずれ
かを用いて細胞質を強烈に染色することにより密で不定
型な核を持つことがわかる。

ＰＩＦの検出法は、医師が本態性高血圧症の特定の原因
を識別するための診断を行い、適切な治療法を選択し、
経過観察することを可能にする。

本態性高血圧症の識別に加え、ＰＨＦの存在とＰＨＦの
アッセイは症状として高血圧を合併するか、又は必ずし
も合併しない他の疾患の研究や治療に応用可能である。

例えば、インシュリン非依存性糖尿病患者は、しばしば
高血圧であり、逆に高血圧症患者にはしばしば耐ブドウ
糖能の異常がみうけられる。いずれの症状においても、
細胞内遊離カルシウムの増加が観られた。ＰＨＦは肥満
性の高血圧症であり、かつインシュリン非依存性糖尿病
を有する０ｂ１０ｂマウスの血漿中で検出されている。

これらのマウス由来のＰＨＦは、ＳＨＲ由来のＰ　ＨＦ
と同じ画分中に血清より単離されている。ＰＨＦの検出
は、インシュリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の診断
に有用であり、かつＮＩＤＤＭにおけるＰ　ＨＦの役割
に対する新たな研究領域を開くものである。

ある種の癌は、細胞内遊離カルシウムの増加を特徴とし
ている［：０ｋａｚａｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、ＣａｎｃＲ
ｅｓ、　４６　（１２Ｐｔ　１）、　６０５９−６０６
３　（１９８６）Ｌｉｐｔｏｎ　ａｎｄ　Ｍｏｒｒｉｓ
、　Ｃａｎｃ、　ＣｈｅｍｏｔｈｅｒＰｈａｒｍａｃｏ
ｌ、　１８　（１）、　１７−２０　（１９８６）；　
Ｃｈｉｅｎ　ａｎｄＷａｒｒｅｎ、　Ｃａｎｃ、　Ｒｅ
ｓ、４６　（１１）　　５７０６−５７１４（１９８６
）；　Ｓｈｉｒａｋａｗａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃａｎｅ、
　Ｒｅｓ、　４６　（２）６５８−６６１　（１９８６
）；及びＭｅｙｅｒ、　Ｊ、　Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ、　
５（ｓｕｐｐｌ　４）、　Ｓ３−８４　（１９８７））
　、又、副甲状腺の活性化がある種の癌と関連している
（Ｐａｌｍｅｒｅｔ　ａｌ、、　Ａｍ、　Ｊ、　Ｅｐｉ
ｄｅｍｉｏｌ、　１２７　（５）、　１０３１１０４０
　（１９８８）；及びＦｅ１ｇ　ａｎｄ　Ｇｏｔｔｅｓ
ｍａｎＣａｎｃｅｒ　６０　（３）、　４２９−４３２
（１９８７））　、　Ｐ　ＨＦは副甲状腺に由来してお
り、また予備検討の結果ではＰＩＦが癌の細胞内カルシ
ウムを増加させることを示しているので、ＰＨＦはこれ
ら及び他の種類の癌に関係しているかもしれない。Ｐ　
ＨＦのスクリーニングは、検出法や治療法の開発に価値
があると同様に、これら癌の病因を理解する上で価値が
ある。

［実　施　例］ 以下の実施例は、本発明を明らかにするものであるが、
発明はそれに限定されるものではない。本発明から逸脱
しない範囲での種々の変更・修正は当業者にとって自明
なことである。

実施例１ （ＳＨＲにおけるＰＨＦ存在の証明） ＳＨＲ（１６週齢、３００〜３５０ｇ）　、ＷＫＹ　（
１２週齢、３００〜３５０ｇ）及び５Ｄ（１２週齢、３
００〜３５０ｇ）の各系雄性ラットを断頭層殺し、瀉血
して、各系ラットから集めた血液をヘパリン処理（１０
０ＩＵ／ｍｌ）　Ｌ、４℃で３０分間３，０００ｘ　ｇ
で遠心分離した。得られた血漿を分子量１，０００ダル
トンで分離する膜〔セルロース（Ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒ
　６ｄｉａｌｙｓｉｓ　ｔｕｂｉｎｇ）］を用いて蒸留
水にて透析した。

雄性ＳＤラット（１２週齢、３００〜３５０ｇ）をベン
トパルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ、　ｉ　ｐ
）で麻酔し、カテーテルを試料の注入用として頚静脈に
、また血圧測定用として頚動脈に挿入した。

血漿は３　ｍｌ／　ｋｇ／　ｈｒの速度で持続注入（ｉ
ｎｆｕｓｉｏｎ）するか又は２．５ｍｌ／ｋｇを単回注
入（ｂｏｌｕｓ　１ｎｊｅｃｔｉｏｎ）することにより
行った。

第４図は、ＳＤクラットのＳＨＲ，ＷＫＹ及びＳＤクラ
ット漿の持続注入に対する平均動脈圧変化の推移を示し
ている。１０５分後、Ｓ　ＨＲ血漿の持続注入を終了し
、ＳＤ血漿に置き換えた結果、３０分以内に血圧はＳＤ
クラット正常レベルに戻った。

ＳＤクラットおけるＳＨＲ，ＷＫＹ及びＳＤ血漿の単回
注入の効果を第５図に示す。

実施例２ −２８　＝ （細胞内カルシウム取込みの調節） ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける細胞内への４５　Ｃａの取り
込みは、Ｐａｎｇ等の文献（Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ、　４２
　１９３５（１９８８））に記載された方法に従い、Ｓ
Ｄ及びＷＫＹラットの尾動脈を使って低親和性ランタン
抵抗性プール法を用いて測定した。ラット尾動脈切片を
酸素飽和　（９５％０２．５％ＣＯ２の通気）にしたク
レブス緩衝液で２時間平衡化させた後、０１μＣ１４δ
Ｃａ存在下、実施例１で準備した各系ラットの血漿３０
％を含むクレブス緩衝液中で尾動脈切片を培養した。前
もって決定した培養時間で培養後、Ｃａ”＋を含まず、
Ｌａ３＋を含む冷溶液中で組織を洗浄し、水分を除去し
、重量を量り、消化した。４６Ｃａの取り込みはシンチ
レーションカウンターで測定した。その結果を第６図に
示すが、４６Ｃａの取り込みは血圧の上昇とともに増大
している。

実施例３ （血漿由来ＰＨＦの分離） ＳＨＲ（１２週齢、２５０〜３００ｇ）　、ＷＫＹ　（
１２週齢、３００〜３５０ｇ）及び５Ｄ（１２週齢、３
００〜３５０ｇ）の各系雄性ラットを断頭層殺・瀉血し
、各系ラットから集めた血液をそれぞれヘパリン処理（
１００ＩＵ／ｍｌ）　Ｌ、、４℃で３０分間３，０ＯＯ
Ｘ　ｇで遠心分離した。得られた血漿を分子量ｉ、ｏｏ
。

ダルトンで分離する膜〔セルロース （Ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒ　６　ｄｉａｌｙｓｉｓ　ｔｕ
ｂｉｎｇ）：ｌを用いて、蒸留水に対して４℃で２４時
間透析した。透析は４００ｍ１の血漿に対して４１の蒸
留水を用い、８時間ごとに蒸留水を交換して行った。

次に、得られた透析内液を上限分子ｉ　５，０００ダル
トンで分離する膜〔ポリスルホン樹脂限外濾過膜（Ａｍ
ｉｃｏｎ社製ＹＭ５）〕を用いて５０ｐｓｉ　Ｎ２の条
件下で限外濾過し、濾液を凍結乾燥した。

凍結乾燥した濾液を０１％トリフルオロ酢酸水溶液に溶
解して、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー〔担体ニゲ
ル濾適用親水性シリカゲル（東ソー製ＴＳＫ　２０００
　ＳＷ）、カラム内径×長さニア、５Ｘ３００ｍｍ　、
溶出液；０１％トリフルオロ酢酸水溶液、流速：　０．
３ｍｌ／分、検出：２１４及び２８０ｎｍ、　（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ社製Ｕ、Ｖ光度計）〕にかけて分子量３，
０００〜４，０００ダルトンの両分（第１図の斜線部）
を分画した。カラムの計測に用いた分子量マーカーは、
還元しカルボキシメチル化したβブンガロトキシンのＢ
鎖（ＲＣＭＢ：分子量７０００ダルトン）、ｂＰＴＨ［
１〜３４〕（分子量４１００ダルトン）、１３個のアミ
ノ酸を有する合成ペプチド（Ｃ８１３８：分子量１６２
９ダルトン）、及びＡＣＴＨ［：１〜１０〕（分子量１
３００ダルトン）である。

ＳＨＲから得られたこの両分を凍結乾燥により濃縮し、
ＵＶ吸収より求めた蛋白質含量が１〜５μｇとなるサン
プルを６ｍｌの生理食塩水に溶解して調製し、そのうち
１ｍｌを実施例１に記載したごとくカテーテルを挿入し
たＳＤクラット単回注入した。その発現時間及び程度に
おいて、ＳＨＲ血漿に匹敵する血圧の上昇が観察された
。結果を第２図に示す。

実施例４ （ＨＰ　Ｌ　Ｃによる血漿由来ＰＨＦの精製）実施例３
で得た活性画分（凍結乾燥済）を蒸留水に溶かして、逆
相カラムＨＰＬＣ（担体多孔質オクチル結合シリカゲル
（粒度７μ、孔径３００Ａ　、　Ｂｒｏｗｎｌｅｅ社製
Ｐｉｅｒｃｅ　ＡｑｕａｐｏｒｅＲＰ−３００（Ｃ８）
）、カラム内径×長さ：　　４．６Ｘ２２０ｍｍ。

溶出液：　　（Ａ）　０．１％トリフルオロ酢酸水溶液
とアセトニトリルの混液（８０：２０）　；　（Ｂ）　
０．１％トリフルオロ酢酸水溶液とアセトニトリルの混
液（２０：８０）、勾配（溶出液Ａ、　Ｈの混合比）、
Ｏ〜３０分θ％Ｂ１３０〜４５分θ〜２０％Ｂ、４５〜
１６５分２０〜２５％Ｂ、　１６５〜１７５分２５〜１
００％Ｂ１流速：　０．５ｍｌ／分、検出：　２８０ｎ
ｍ）にかけて、第７図のチャートのリテンションタイム
約５８分にピークを示すＰＨＦ画分を分画し、ＵＶ吸収
より求めた蛋白質含量が５０〜２００ｎｇとなるサンプ
ル量を用いて、実施例３と同様に単回注入の方法でＳＤ
クラット血圧上昇を確かめた。その結果を第８図に示す
。

実施例５ （組織培養液由来Ｐ　Ｉ−Ｉ　Ｆの分離）−３１＝ ５ＨＲ（１２週齢、２５０〜３００ｇ）及びＷＫＹラッ
ト（１２週齢、３００〜３５０ｇ）から甲状腺組織を伴
う副甲状腺を摘出し、ハンクス液を培養液として毎日新
しいものに交換して７日間培養した。

培養濾液をまとめ、実施例３と同様にして蒸留水に対し
て透析し、限外濾過後、更にゲル濾過して分子量が３，
０００〜４　、０００ダルトン画分（第９図の斜線部）
を分画した。

ＳＨＲ組織培養液から得た両分は、実施例３のＳＨＲ血
漿から得た両分と同様の血圧」１昇がＳＤクラット用い
た生物活性試験でみられた。

実施例６ （ＨＰ　Ｌ　Ｃによる組織培養液由来ＰＨＦの精製）実
施例５で得られたＳＨＲ組織培養液の活性画分を実施例
４と同様にして逆相カラムＨＰＬＣにかけて、第１０図
のチャートのリテンションタイム約５８分の時点にピー
クを示すＰ　ＨＦ画分を分画した。分画したピークのリ
テンションタイムはＳＨＲ血漿由来のＰＨＦ画分の場合
（第７図）と同じであり、また単回注入によるＳＤクラ
ット血圧上昇に対する活性も同様であった。

その結果を第８図に示す。

実施例７ （等電点電気泳動） カラム画分の分析的等電点電気泳動は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ
社製Ｍｏｄｅｌ　１１１　Ｍｉｎｔ−ＩＥＦ　ｃｅｌｌ
を用いて行われる。使用した方法は〔１等電点電気泳動
理論、方法論と応用Ｊ　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｂｉｏｍｅ
ｄｉｃａｌＰｒｅｓｓ、　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ　（１９
８３））においてＲｉｇｈｅｔｔｉによって述べられた
方法である。それは、カルフォルニア州すッチモンドの
Ｂｉｏ−Ｒａｄ研究所のＢｉｏ−Ｒａｄ　Ｍｏｄｅｌ　
１１１　Ｍｉｎｉ−ＩＥＦ　Ｃｅ１ｌＩｎｓｔｒｕｃｔ
ｉｏｎ　Ｍａｎｕａｌによって修正されたものである。

両性電解質（ｐＨ３〜１０）を含むポリアクリルアミド
ゲルの平板はゲル支持フィルム上に調製する。実施例４
及び６で得られたＰ　Ｉ−Ｉ　Ｆ画分をそれぞれ標準物
質〔α−キモトリプシン（ｐＨ８，８）、クジラ−ミオ
グロビン（ｐＨ８，０５）、ウマ−ミオグロビン（ｐＨ
７，０）、ヒト炭酸脱水酵素（ｐＨ６、５）　、ウシ炭
酸脱水酵素（ｐＨ６，０）、β−ラクトグロブリン（ｐ
Ｈ５，１）、フィコシアニン（ｐＨ４，６５））ととも
にゲル上に付し、それからそのゲルを直接黒鉛電極上に
置いた。蛋白のバンドは、６０〜９０分経過後集束して
くる。蛋白バンドをクーマシーブルー及びクロセインス
カーレットで染色する。その結果を第１１図に示す。血
漿、培養液の両方とも約ｐＨ６のバンドが発現している
。

実施例８ （ポリクローナル抗体の産生） 雄性Ｂａ１ｂ／Ｃマウス（６〜１０週齢）耐重分精製し
たＰＩＦ　（純度２０〜３０％）で免疫した。ＰＩＦの
量は２１０　ｎｍの吸収に基づいて測定した。ＰＨＦ約
１０μｇを含むペプタイドは、Ｖｉａｍｏｎｔｅｓらの
方法（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、　９４．１
３−１７（１９８６））により、アミノフェニルチオエ
ーテル（ＡＰＴ）で誘導したディスクにジアゾ結合させ
た。２回蒸留した水で調製した１０ｍｇ／ｍｌの硝酸ナ
トリウム溶液０　、３ｍｌずつに１．２Ｎ塩酸１０ｍ１
を加えて得た硝酸ナトリウム／塩酸溶液０３ｍ１を６ｍ
ｍのＡＰＴディスクの上部に添加し、ディスクを容器に
載せ、４℃で３０分間振動させた。ディスクは冷蒸留水
、０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４）で洗浄し、
乾燥した。ＡＰＴディスクをフロイントの完全アジュバ
ントに浸し、腹腔内に移植した。２週間後、抗ＰＨＦ抗
体の力価をＥＬＩＳＡにより測定し、上述のように調製
したディスクをフロイントの不完全アジュバントに浸し
てマウスに再移植した。力価は１週間後ＥＬ　Ｉ　ＳＡ
により測定した。マウスは２週問おきに接種し試料は次
に示すＥＬＩＳＡ法によってアッセイした。

プレートはＰ　ＨＦ　５００ｎｇ／ｍｌを含むトリス緩
衝液（ｐＨ９，０）で１ウエル当たり１００μｌを用い
てコートし、−晩保存し、リン酸塩緩衝生理食塩液（Ｐ
　Ｂ　Ｓ　）−Ｔｗｅｅｎ　２０で洗浄し、その後ＰＢ
Ｓで３回洗浄した。プレートに更に０，２％のゼラチン
を含むＰＢＳを加えて、３７°Ｃで３０分間インキュベ
ートし、Ｐ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎ　２０で３回洗浄し
た。

上述の免疫したマウスより得た血清を１％のゼラチンを
含むＰ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎ　２０を用い１３０１：
６０　１：１２０．　１：２４０．　１・４８０．　１
：９６０．　１：１９２０１：３８４０の割合で希釈し
、１ウエル当たり１００μｍを加え、プレートは室温で
１時間インキュベートした後、３回Ｐ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗ
ｅｅｎ　２０で洗浄した。１％のゼラチンを含むＰ　Ｂ
　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎ　２０に溶解したヤギ由来抗マウス
抗体結合西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（１：１００
０）　（Ｔａｇｏ社製、　Ｃａｔに静脈内単回注入した
。

コントロールとして生理食塩水０１ｍ１で希釈した未処
置マウスの血清１０μｍをＳＨＲに注入した。

免疫したマウスの血清は正常血圧う・ソトのレベルまで
遅発性の血圧降下を呈した。

その結果を第１４図に示す。

第１表 第２表 マウス＃１ マウス＃２ ＊　　ＰＨＦ　５０ｎｇ／ｗｅｌｌ ＊＊　ＰＨＦ　　５ｎｇ／ｗｅｌｌ ＊　　ＰＨＦ　５０ｎｇ／ｗｅｌｌ ＊＊　ＰＨＦ　　５ｎｇ／ｗｅｌｌ 第３表 ＳＨＲ血漿サンプルの精製度

【図面の簡単な説明】 第１図は実施例３におけるＳ　ＨＲ血漿サンプルのゲル
濾過カラムクロマトグラフィーによる＊３００〜３５０
ｇのＳＤクラット単回注入した５０分後の遅発性血圧上
昇が１０ｍｍＨｇと定義する。 ＊＊　Ｂ　ＣＡ（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ　ａｃｉ
ｄ）法で測定第６図はＳＨＲ，ＳＤ、ＷＫＹラットから
得た血漿を含むクレブス緩衝液で培養したラットの尾動
脈部分における４５Ｃａの取り込みを示したグラフであ
る。 第７図は実施例３で得たＳＨＲ血漿画分を実施例４の逆
相カラムＨＰＬＣにかけた時の溶出プロフィールを示し
たグラフである。 第８図は実施例４及び実施例６の逆相カラムＨＰＬＣで
単離したＳＨＲの血漿由来および甲状腺組織を伴う副甲
状腺組織培養液由来の各ＰＨＦ画分をＳＤクラット単回
注入した時の平均動脈圧変化の推移を示したグラフであ
る。 第９図はＳＨＲの甲状腺組織を伴う副甲状腺組織培養液
サンプルのゲル濾過カラムクロマトグラフィーによる溶
出プロフィールを示したグラフである。 第１０図は実施例５で得たＳＨＲの甲状腺組織を伴う副
甲状腺組織培養液画分を実施例６の逆相カラムＨＰＬＣ
にかけた時の溶出プロフィールを示したグラフである。 第１１図はＳＨＲの血漿由来Ｐ　Ｉ　Ｆと培養液由来Ｐ
ＨＦの等電点電気泳動の結果を示した図である。 第１２図と第１３図は第１表、第２表のデータのグラフ
である。 第１４図はＰＨＦで免疫したマウス血清をＳ　ＨＲに単
回注入した時の平均動脈圧の推移を示したグラフである
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）（ａ）分子量が３，０００〜４，０００ダルトンで
   あり、 （ｂ）オクチル結合シリカゲルカラムＨＰＬＣ条件下で
   単一ピークを示し、 （ｃ）ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動で単一バ
   ンドを示し、 （ｄ）正常血圧哺乳動物に静脈投与することで遅発性の
   血圧上昇を示し、 そして、 （ｅ）以下の工程： I ）高血圧哺乳動物より血漿を採取するか又は同動物
   の副甲状腺を採取して培養した際の培養液を集め、 II）蒸留水での透析により１，０００ダルトン以下の分
   子量を有する成分を除去し、 III）限外濾過により５，０００ダルトン以下の分子量
   を有する血漿成分を分取して、凍結乾燥によって濃縮し
   、 IV）ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにて活性画分を
   分離して、凍結乾燥によって濃縮し、 Ｖ）更に、逆相カラムＨＰＬＣにて、 活性画分を単一ピークで得るからなる方法により得るこ
   とを特徴とする副甲状腺由来高血圧因子。 ２）以下の工程： I ）高血圧哺乳動物より血漿を採取するか又は同動物
   の副甲状腺を採取して培養した際の培養液を集め、 II）蒸留水での透析により１，０００ダルトン以下の分
   子量を有する成分を除去し、 III）限外濾過により５，０００ダルトン以下の分子量
   を有する血漿成分を分取して、 凍結乾燥によって濃縮し、 IV）ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにて活性画分を
   分離して、凍結乾燥によって濃縮し、 Ｖ）更に、逆相カラムＨＰＬＣにて活性画分を単一ピー
   クで得る からなる方法を特徴とする、 （ａ）分子量が３，０００〜４，０００ダルトンであり
   、 （ｂ）オクチル結合シリカゲルカラムＨＰＬＣ条件下で
   単一ピークを示し、 （ｃ）ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動で単一バ
   ンドを示し、 （ｄ）正常血圧哺乳動物に静脈投与することで遅発性の
   血圧上昇を示す、 実質的に純粋な副甲状腺由来高血圧因子の製造方法。 ３）以下の工程からなる請求項１で特定される副甲状腺
   由来高血圧因子の存在検出方法 ａ）哺乳動物の副甲状腺由来高血圧因子を用いて脊椎動
   物を免疫して、脊椎動物中に ポリクローナル抗体を生成し、 ｂ）副甲状腺由来高血圧因子に対して生成した該抗体を
   含む血清を採取し、 ｃ）得られた該抗体を用いて哺乳動物の血清サンプルを
   イムノアッセイ法によりスク リーニングする。 ４）イムノアッセイ法がＥＩＡ（ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋ
   ｅｄｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）である請求項３記載の方
   法。 ５）イムノアッセイ法がＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅｌｉ
   ｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）であ
   る請求項３記載の方法。 ６）イムノアッセイ法が免疫沈降法である請求項求３記
   載の方法。 ７）以下の工程からなる請求項１で特定される副甲状腺
   由来高血圧因子の同定方法 ａ）脊椎動物を副甲状腺由来高血圧因子にて免疫するこ
   とによって、副甲状腺由来高 血圧因子の抗体を生成し、 ｂ）免疫脊椎動物より抗体産生Ｂリンパ球を採取し、 ｃ）ハイブリドーマを形成するために該抗体産生血漿細
   胞と骨髄腫細胞を融合し、 ｄ）副甲状腺由来高血圧因子抗体を産生する該ハイブリ
   ドーマを選択し、クローニングし、 ｅ）該抗体産生ハイブリドーマを増殖させ、 ｆ）該ハイブリドーマよりモノクローナル抗体を分離し
   、 ｇ）該モノクローナル抗体を用いたイムノアッセイ法で
   哺乳動物の血清サンプルをスクリーニングする。 ８）イムノアッセイ法がＥＩＡである請求項７記載の方
   法。 ９）イムノアッセイ法がＥＬＩＳＡである請求項７記載
   の方法。 １０）イムノアッセイ法が免疫沈降法である請求項７記
   載の方法。 １１）請求項１で特定される副甲状腺由来高血圧因子の
   存在に関して、哺乳動物の血清をテストすることからな
   る哺乳動物の本態性高血圧症原因同定法。 １２）単一容器中で、以下のものからなる請求項１で特
   定される哺乳動物の副甲状腺由来高血圧因子検出キット ａ）固相と結合した副甲状腺由来高血圧因子に対する抗
   体 ｂ）副甲状腺由来高血圧因子に対する酵素標識抗体 ｃ）該抗体の標識酵素に対する基質 ｄ）副甲状腺由来高血圧因子の標準溶液。 １３）単一容器中で、以下のものからなる請求項１で特
   定される哺乳動物の副甲状腺由来高血圧因子検出キット ａ）副甲状腺由来高血圧因子に対する抗体 ｂ）該抗体に結合する固相 ｃ）副甲状腺由来高血圧因子の標準溶液。