JP3037942B2 - パラシロイド高血圧性因子の検出及び同定方法 - Google Patents
パラシロイド高血圧性因子の検出及び同定方法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はパラシロイド高血圧
性因子（ＰＨＦ）の検出及び同定方法に関する。本出願
は１９８９年３月２２日に出願されたアメリカ特許出願
第３２７,４５０号の一部継続出願であり、又１９９０
年１月３日に出願されたアメリカ特許出願第４６０,４
８２号の一部継続出願である。本発明は副甲状腺（para
thyroid, 甲状腺旁, 上皮小体)由来の予め未同定の循
環性因子に関する。この因子は細胞のカルシウム取り込
みのコントロールに係り、特に哺乳動物の高血圧症及び
その他の疾病に係る。循環性因子が単離され、循環性因
子の存在について患者をスクリーニングする方法が記載
されている。この因子は細胞内カルシウムエレベーシヨ
ンを含む病気の患者の査定及びその他カルシウムの関連
する病気の研究に有用である。この因子の存在は患者に
新規な治療を指示する。
性因子（ＰＨＦ）の検出及び同定方法に関する。本出願
は１９８９年３月２２日に出願されたアメリカ特許出願
第３２７,４５０号の一部継続出願であり、又１９９０
年１月３日に出願されたアメリカ特許出願第４６０,４
８２号の一部継続出願である。本発明は副甲状腺（para
thyroid, 甲状腺旁, 上皮小体)由来の予め未同定の循
環性因子に関する。この因子は細胞のカルシウム取り込
みのコントロールに係り、特に哺乳動物の高血圧症及び
その他の疾病に係る。循環性因子が単離され、循環性因
子の存在について患者をスクリーニングする方法が記載
されている。この因子は細胞内カルシウムエレベーシヨ
ンを含む病気の患者の査定及びその他カルシウムの関連
する病気の研究に有用である。この因子の存在は患者に
新規な治療を指示する。
【０００２】
【従来の技術】一般に高血圧症は心臓の収縮及び又は弛
緩に基づいて血圧が１４０／９０mmＨg以上の値に上昇
する症状と定義される。高血圧症に関連する疾病として
は動脈硬化症、高血圧性腎不全、発作、欝血性心不全、
心筋梗塞等がある。血圧低下の治療に有効なものとして
多くの方法が知られているが、本態性（essential）高
血圧症の病因は本質的には不明である。高血圧症の遺伝
的素因は一般に認められているが、多くの異なる薬物が
高血圧症の治療に有効であることが知られ、又、これら
の薬物が異なる薬理学的レスポンスを導く事実より、本
態性高血圧症の主因としては種々の病因があると考えら
れる。
緩に基づいて血圧が１４０／９０mmＨg以上の値に上昇
する症状と定義される。高血圧症に関連する疾病として
は動脈硬化症、高血圧性腎不全、発作、欝血性心不全、
心筋梗塞等がある。血圧低下の治療に有効なものとして
多くの方法が知られているが、本態性（essential）高
血圧症の病因は本質的には不明である。高血圧症の遺伝
的素因は一般に認められているが、多くの異なる薬物が
高血圧症の治療に有効であることが知られ、又、これら
の薬物が異なる薬理学的レスポンスを導く事実より、本
態性高血圧症の主因としては種々の病因があると考えら
れる。
【０００３】多くの研究により高血圧症の発生又は継続
には１又はそれ以上の循環性因子が存在すると考えられ
る。〔ライトら，高血圧自然発症ラツトの血液における
高血圧性物質；Ｌife Ｓci．１９８４；３４：１５２
１−１５２８； ダールら，高血圧症の体液性伝達：パ
ラビオーゼの徴候；Ｃirc．Ｒes．１９６９；２４／２
５（Ｓuppl．Ｉ）：２１−２３； グリーンバーグら，
高血圧自然発症ラツトの静脈肥大の原因としての循環性
因子の徴候； Ａm．Ｊ．Ｐhysiol．１９８１；２４
１：Ｈ４２１−Ｈ４３０；トビアンら，ソルト高血圧症
のダールＳラツトにおける循環性体液性昇圧物質；Ｃli
n．Ｓci．１９７９；５７：３４５ｓ−３４７ｓ； ジ
デツクら，プライマリー高血圧症の病因における体液性
因子；Ｋlin．Ｗochenschr．１９８５； ６３（Ｓupp
l．II）Ｄ：９４−９６； ヒラタら，高血圧性ダール
ソルト−センシテイブ ラツトの血清における高血圧
誘因因子； Ｈypertension １９８４；６：７０９−
７１６〕。例えばパラビオーゼ及びクロス−サーキユレ
イシヨンの実験において正常血圧の動物の血圧の上昇は
高血圧性動物の血液と接触（exposure）することにより
誘発される。高血圧自然発症ラツト（ＳＨＲ）から得ら
れた赤血球関与因子の皮下注射により正常血圧のウイス
ター−キヨウト（Ｗister−Ｋyoto，ＷＫＹ）ラツトに
おいて高血圧症が誘発されることが示され、又、正常血
圧のソルト−センシテイブ ダールラツトに、高血圧症
ソルト−センシテイブ ダール ラツトから得た血清を
注射することにより血圧の上昇が誘発される。
には１又はそれ以上の循環性因子が存在すると考えられ
る。〔ライトら，高血圧自然発症ラツトの血液における
高血圧性物質；Ｌife Ｓci．１９８４；３４：１５２
１−１５２８； ダールら，高血圧症の体液性伝達：パ
ラビオーゼの徴候；Ｃirc．Ｒes．１９６９；２４／２
５（Ｓuppl．Ｉ）：２１−２３； グリーンバーグら，
高血圧自然発症ラツトの静脈肥大の原因としての循環性
因子の徴候； Ａm．Ｊ．Ｐhysiol．１９８１；２４
１：Ｈ４２１−Ｈ４３０；トビアンら，ソルト高血圧症
のダールＳラツトにおける循環性体液性昇圧物質；Ｃli
n．Ｓci．１９７９；５７：３４５ｓ−３４７ｓ； ジ
デツクら，プライマリー高血圧症の病因における体液性
因子；Ｋlin．Ｗochenschr．１９８５； ６３（Ｓupp
l．II）Ｄ：９４−９６； ヒラタら，高血圧性ダール
ソルト−センシテイブ ラツトの血清における高血圧
誘因因子； Ｈypertension １９８４；６：７０９−
７１６〕。例えばパラビオーゼ及びクロス−サーキユレ
イシヨンの実験において正常血圧の動物の血圧の上昇は
高血圧性動物の血液と接触（exposure）することにより
誘発される。高血圧自然発症ラツト（ＳＨＲ）から得ら
れた赤血球関与因子の皮下注射により正常血圧のウイス
ター−キヨウト（Ｗister−Ｋyoto，ＷＫＹ）ラツトに
おいて高血圧症が誘発されることが示され、又、正常血
圧のソルト−センシテイブ ダールラツトに、高血圧症
ソルト−センシテイブ ダール ラツトから得た血清を
注射することにより血圧の上昇が誘発される。
【０００４】又、細胞内カルシウムの上昇した高血圧症
ラツト及び高血圧症患者の両方における循環性因子につ
いて報告されている。〔バノスら, 本態性高血圧症患
者の血小板におけるカルシウム取り込みの増大に伴う２
つの因子；Ｃlin．Ｅxp．Ｈypertens．１９８７；９：
１５１５−１５３０； ジデツクら，透過性の人体好中
球におけるカルシウム輸送に際しての高血圧症患者から
のプラスマの効果；Ｃlin．Ｓci．１９８８；７４：５
３−５６； リンダーら, 正常血小板の細胞内遊離カ
ルシウムに関する本態性高血圧症患者における循環性因
子の効果；Ｎ．Ｅng．Ｊ．Ｍed．１９８７；３１６：５
０９−５１３；ブルシら，高血圧自然発症ラツト及び本
態性高血圧症患者の血小板における細胞質遊離カルシウ
ムの増加；Ｃlin．Ｓci．１９８５；６８：１７９−１
８４；ライトら，高血圧特性を有する高血圧自然発症ラ
ツト赤血球の抽出による大動脈組織カルシウム取り込み
の刺激；Ｃan．Ｊ．Ｐhysiol．Ｐharmacol．１９８６；
６４：１５１５−１５２０〕。血管のトーン（tone）は
細胞内カルシウムのレベルに影響されるので、実験的に
証明されていないが、血圧を上昇する因子及び細胞内カ
ルシウムを上昇する因子は関連があると考えるのが合理
的であるだろう。高血圧のいくつかの形態においてカル
シウム制御ホルモンの影響を示唆する多くの証拠が存在
する〔エル エム レスニツク, Ａm．Ｊ．Ｍed． ８
２（Ｓuppl．１Ｂ），１６（１９８７）〕。副甲状腺ホ
ルモン（ＰＴＨ）はカルシウム制御ホルモンの一種であ
る。本態性高血圧症患者の３０％以上は免疫反応性副甲
状腺ホルモン（ir−ＰＴＨ）のレベルが増大したサブグ
ループに分類される〔ララフら，Ｋidney Ｉnt． ３
４，（Ｓuppl．３５），Ｓ１６２（１９８８）〕。ＰＴ
Ｈレベルの増加はＳＨＲラツトにおいて報告がある〔マ
クキヤロンら，Ｈypertension ３ （Ｓuppl．１），
Ｉ１６２（１９８１）〕。ハイパーパラシロイド（副甲
状腺機能亢進症）患者はしばしば高血圧症を示し、その
病状は多くの場合、副甲状腺摘出術により軽減される
〔ヘルストロームら，Ｂrit．Ｊ．Ｕrol． ３０，１３
（１９５８）〕。
ラツト及び高血圧症患者の両方における循環性因子につ
いて報告されている。〔バノスら, 本態性高血圧症患
者の血小板におけるカルシウム取り込みの増大に伴う２
つの因子；Ｃlin．Ｅxp．Ｈypertens．１９８７；９：
１５１５−１５３０； ジデツクら，透過性の人体好中
球におけるカルシウム輸送に際しての高血圧症患者から
のプラスマの効果；Ｃlin．Ｓci．１９８８；７４：５
３−５６； リンダーら, 正常血小板の細胞内遊離カ
ルシウムに関する本態性高血圧症患者における循環性因
子の効果；Ｎ．Ｅng．Ｊ．Ｍed．１９８７；３１６：５
０９−５１３；ブルシら，高血圧自然発症ラツト及び本
態性高血圧症患者の血小板における細胞質遊離カルシウ
ムの増加；Ｃlin．Ｓci．１９８５；６８：１７９−１
８４；ライトら，高血圧特性を有する高血圧自然発症ラ
ツト赤血球の抽出による大動脈組織カルシウム取り込み
の刺激；Ｃan．Ｊ．Ｐhysiol．Ｐharmacol．１９８６；
６４：１５１５−１５２０〕。血管のトーン（tone）は
細胞内カルシウムのレベルに影響されるので、実験的に
証明されていないが、血圧を上昇する因子及び細胞内カ
ルシウムを上昇する因子は関連があると考えるのが合理
的であるだろう。高血圧のいくつかの形態においてカル
シウム制御ホルモンの影響を示唆する多くの証拠が存在
する〔エル エム レスニツク, Ａm．Ｊ．Ｍed． ８
２（Ｓuppl．１Ｂ），１６（１９８７）〕。副甲状腺ホ
ルモン（ＰＴＨ）はカルシウム制御ホルモンの一種であ
る。本態性高血圧症患者の３０％以上は免疫反応性副甲
状腺ホルモン（ir−ＰＴＨ）のレベルが増大したサブグ
ループに分類される〔ララフら，Ｋidney Ｉnt． ３
４，（Ｓuppl．３５），Ｓ１６２（１９８８）〕。ＰＴ
Ｈレベルの増加はＳＨＲラツトにおいて報告がある〔マ
クキヤロンら，Ｈypertension ３ （Ｓuppl．１），
Ｉ１６２（１９８１）〕。ハイパーパラシロイド（副甲
状腺機能亢進症）患者はしばしば高血圧症を示し、その
病状は多くの場合、副甲状腺摘出術により軽減される
〔ヘルストロームら，Ｂrit．Ｊ．Ｕrol． ３０，１３
（１９５８）〕。
【０００５】ＳＨＲラツトにおいて同様の副甲状腺摘出
術の結果が報告されている〔シユレイフアーら，Ｊap．
Ｃirc．Ｊ． ４５，１２７２（１９８１）〕。人及び
他の脊椎動物においてＰＴＨの投与により血圧の低下が
起こるが、ＰＴＨは本態性高血圧症の発生に関与するこ
とが多くの研究者により示唆されている〔パングら，Ｇ
en．Ｃomp．Ｅndocrinol． ４１，１３５（１９８
０）〕。このＰＴＨの血管拡張作用は高カルシウム血症
効果を仲介する領域とは異なる分子の特定の領域に関係
する〔パングら，Ｅndocrinology，１１２， ２８４
（１９８３）〕。ＰＴＨはＬ−タイプのカルシウムチヤ
ンネル〔ワングら, 投稿中〕を通じて血管の平滑筋へ
のカルシウムエントリーを阻害することが示されている
〔パングら,Ｌife Ｓci., ４２，１３９５（１９８
８）〕。この逆説は高められたＰＴＨレベルの高血圧性
患者が血清の低イオン化カルシウムレベルを示すという
事実から更に補強される〔レスニツクら，Ｎew Ｅng
l．Ｊ．Ｍed.，３０９，８８８（１９８３）； フバル
フナーら，Ａcta Ｍed．Ｓcand.，２１９，４６１（１
９８６）〕。もしＰＴＨが先ず高められれば血清のイオ
ン化カルシウムレベルは向上すると考えられる。
術の結果が報告されている〔シユレイフアーら，Ｊap．
Ｃirc．Ｊ． ４５，１２７２（１９８１）〕。人及び
他の脊椎動物においてＰＴＨの投与により血圧の低下が
起こるが、ＰＴＨは本態性高血圧症の発生に関与するこ
とが多くの研究者により示唆されている〔パングら，Ｇ
en．Ｃomp．Ｅndocrinol． ４１，１３５（１９８
０）〕。このＰＴＨの血管拡張作用は高カルシウム血症
効果を仲介する領域とは異なる分子の特定の領域に関係
する〔パングら，Ｅndocrinology，１１２， ２８４
（１９８３）〕。ＰＴＨはＬ−タイプのカルシウムチヤ
ンネル〔ワングら, 投稿中〕を通じて血管の平滑筋へ
のカルシウムエントリーを阻害することが示されている
〔パングら,Ｌife Ｓci., ４２，１３９５（１９８
８）〕。この逆説は高められたＰＴＨレベルの高血圧性
患者が血清の低イオン化カルシウムレベルを示すという
事実から更に補強される〔レスニツクら，Ｎew Ｅng
l．Ｊ．Ｍed.，３０９，８８８（１９８３）； フバル
フナーら，Ａcta Ｍed．Ｓcand.，２１９，４６１（１
９８６）〕。もしＰＴＨが先ず高められれば血清のイオ
ン化カルシウムレベルは向上すると考えられる。
【０００６】本態性高血圧症と副甲状腺の関連は明らか
であるが、血管系に対するＰＴＨの作用は本態性高血圧
症におけるＰＴＨの役割と一致していないことを文献は
示している。本発明がなされたとき、ＰＴＨは副甲状腺
により産生される唯一の活性ホルモンと報告されてい
た。
であるが、血管系に対するＰＴＨの作用は本態性高血圧
症におけるＰＴＨの役割と一致していないことを文献は
示している。本発明がなされたとき、ＰＴＨは副甲状腺
により産生される唯一の活性ホルモンと報告されてい
た。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】副甲状腺に由来する従
来未報告の循環性因子の存在が本態性高血圧症のＳＨＲ
ラツト及び多くの人間において証明された。この因子は
細胞のカルシウム取り込みを制御し、食事中のカルシウ
ムレベルの増加により阻害される。この因子を単離し、
この因子に対する抗体を用いて該因子をスクリーンする
方法について記載する。この因子は約３０００〜４００
０の分子量を有する。バイオアツセイのデータから、人
間及びラツトにおいて因子は本質的に同様であることが
見出された。この循環因子は本態性高血圧症の患者のか
なりの割合−しかし全員ではない−で存在すると思わ
れ、特に低−レニン高血圧症に関連すると思われる。高
血圧症患者におけるこの循環性因子の同定は、その効果
に拮抗する治療法をデザインしモニターするのに用いら
れる。
来未報告の循環性因子の存在が本態性高血圧症のＳＨＲ
ラツト及び多くの人間において証明された。この因子は
細胞のカルシウム取り込みを制御し、食事中のカルシウ
ムレベルの増加により阻害される。この因子を単離し、
この因子に対する抗体を用いて該因子をスクリーンする
方法について記載する。この因子は約３０００〜４００
０の分子量を有する。バイオアツセイのデータから、人
間及びラツトにおいて因子は本質的に同様であることが
見出された。この循環因子は本態性高血圧症の患者のか
なりの割合−しかし全員ではない−で存在すると思わ
れ、特に低−レニン高血圧症に関連すると思われる。高
血圧症患者におけるこの循環性因子の同定は、その効果
に拮抗する治療法をデザインしモニターするのに用いら
れる。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、ａ）脊椎動物
（ヒトを除く）にパラシロイド高血圧性因子（ＰＨＦ）
を含有する溶液を注入することにより脊椎動物にポリク
ロナール抗体を生じさせ、ｂ）ＰＨＦに対する抗体を含
有する血清を集め、ｃ）イムノアツセイ法により血清サ
ンプルをスクリーニングすることを特徴とするパラシロ
イド高血圧性因子の検出方法に係る。
（ヒトを除く）にパラシロイド高血圧性因子（ＰＨＦ）
を含有する溶液を注入することにより脊椎動物にポリク
ロナール抗体を生じさせ、ｂ）ＰＨＦに対する抗体を含
有する血清を集め、ｃ）イムノアツセイ法により血清サ
ンプルをスクリーニングすることを特徴とするパラシロ
イド高血圧性因子の検出方法に係る。
【０００９】また本発明は、ａ）脊椎動物（ヒトを除
く）にパラシロイド高血圧性因子を注入することにより
パラシロイド高血圧性因子に対する抗体を引き起こし、
ｂ）免疫された脊椎動物から抗体を分泌するＢ−リンパ
球を単離し、ｃ）上記抗体を分泌するプラスマ細胞をミ
エローマ細胞と融合してハイブリドーマを形成し、ｄ）
ＰＨＦ抗体を分泌するハイブリドーマを選別及びクロー
ニングし、ｅ）上記抗体を分泌するハイブリドーマを増
殖し、ｆ）上記ハイブリドーマからモノクロナール抗体
を単離し、ｇ）上記モノクロナール抗体を用いてイムノ
アツセイ法により哺乳動物の血液から得た血清サンプル
をスクリーニングすることを特徴とする患者の血清中の
パラシロイド高血圧性因子の同定方法に係る。
く）にパラシロイド高血圧性因子を注入することにより
パラシロイド高血圧性因子に対する抗体を引き起こし、
ｂ）免疫された脊椎動物から抗体を分泌するＢ−リンパ
球を単離し、ｃ）上記抗体を分泌するプラスマ細胞をミ
エローマ細胞と融合してハイブリドーマを形成し、ｄ）
ＰＨＦ抗体を分泌するハイブリドーマを選別及びクロー
ニングし、ｅ）上記抗体を分泌するハイブリドーマを増
殖し、ｆ）上記ハイブリドーマからモノクロナール抗体
を単離し、ｇ）上記モノクロナール抗体を用いてイムノ
アツセイ法により哺乳動物の血液から得た血清サンプル
をスクリーニングすることを特徴とする患者の血清中の
パラシロイド高血圧性因子の同定方法に係る。
【００１０】更に本発明は、シングルパツケージに、
ａ）固相に結合したパラシロイド高血圧性因子に対する
抗体、ｂ）酵素でラベルされた抗パラシロイド高血圧性
因子に対する第２の抗体、ｃ）上記第２の抗体上の酵素
ラベルのための基質及び ｄ）パラシロイド高血圧性因
子の標準溶液を含有することを特徴とする哺乳動物血液
中のパラシロイド高血圧性因子の同定キツトに係る。
ａ）固相に結合したパラシロイド高血圧性因子に対する
抗体、ｂ）酵素でラベルされた抗パラシロイド高血圧性
因子に対する第２の抗体、ｃ）上記第２の抗体上の酵素
ラベルのための基質及び ｄ）パラシロイド高血圧性因
子の標準溶液を含有することを特徴とする哺乳動物血液
中のパラシロイド高血圧性因子の同定キツトに係る。
【００１１】更に本発明は、シングルパツケージに、
ａ）パラシロイド高血圧性因子に対する抗体、ｂ）上記
抗体が付加する固相及びｃ）パラシロイド高血圧性因子
の標準溶液を含有することを特徴とする哺乳動物血液中
のパラシロイド高血圧性因子の同定キツトに係る。
ａ）パラシロイド高血圧性因子に対する抗体、ｂ）上記
抗体が付加する固相及びｃ）パラシロイド高血圧性因子
の標準溶液を含有することを特徴とする哺乳動物血液中
のパラシロイド高血圧性因子の同定キツトに係る。
【００１２】
【発明の実施の形態】ＳＨＲラツトの血液中に循環性因
子の存在することが本発明者らがＡm．Ｊ．Ｈyperten
s.，２，２６−３１，（１９８９）に発表した研究によ
り確認された。この研究において本発明者らはＳＨＲラ
ツトからのプラスマが持続注入又はボラス（bolus）注
射により正常血圧のラツトに注射されるとＷＫＹ及びＳ
Ｄラツトの血圧が上昇することを示した。更に本発明者
らはＳＨＲプラスマの濃度がバツフアーベース培地中で
増加するようにラツトのテイル動脈の切片からの45Ｃa
の取り込みが試験管的に投与量に依存して増加すること
を示した。この実験の結果より血圧の増加及び細胞内へ
のカルシウム取り込みの増加は共にシステム中に存在し
入手できるＳＨＲプラスマの量に依存することが明らか
である。奇妙なことに両イベンツの開始は遅く緩やかで
あるが、ノルエピネフリン（norepinephrine）、アンギ
オテンシンII（angiotensinII）及びバソプレシン（vas
opressin）のような公知の内因性昇圧物質は投与後殆ど
ただちに又は急速に血圧を上げることが観察された。こ
れらの研究のその他の結果としてＳＨＲプラスマの注入
が停止され正常血圧のラツトからのプラスマに置換され
たとき血圧は急速にベースラインに下降することが認め
られた。この血圧の下降は単なる容量効果を除外する。
関連した実験において、正常血圧及び高血圧症の被験者
から透析されたプラスマは正常血圧のＳＤラツトに注入
され高血圧症を引き起こすことが示された。これらの被
験者からのプラスマは試験管的にラツトテイル動脈にお
けるカルシウムの取り込みを増大した。
子の存在することが本発明者らがＡm．Ｊ．Ｈyperten
s.，２，２６−３１，（１９８９）に発表した研究によ
り確認された。この研究において本発明者らはＳＨＲラ
ツトからのプラスマが持続注入又はボラス（bolus）注
射により正常血圧のラツトに注射されるとＷＫＹ及びＳ
Ｄラツトの血圧が上昇することを示した。更に本発明者
らはＳＨＲプラスマの濃度がバツフアーベース培地中で
増加するようにラツトのテイル動脈の切片からの45Ｃa
の取り込みが試験管的に投与量に依存して増加すること
を示した。この実験の結果より血圧の増加及び細胞内へ
のカルシウム取り込みの増加は共にシステム中に存在し
入手できるＳＨＲプラスマの量に依存することが明らか
である。奇妙なことに両イベンツの開始は遅く緩やかで
あるが、ノルエピネフリン（norepinephrine）、アンギ
オテンシンII（angiotensinII）及びバソプレシン（vas
opressin）のような公知の内因性昇圧物質は投与後殆ど
ただちに又は急速に血圧を上げることが観察された。こ
れらの研究のその他の結果としてＳＨＲプラスマの注入
が停止され正常血圧のラツトからのプラスマに置換され
たとき血圧は急速にベースラインに下降することが認め
られた。この血圧の下降は単なる容量効果を除外する。
関連した実験において、正常血圧及び高血圧症の被験者
から透析されたプラスマは正常血圧のＳＤラツトに注入
され高血圧症を引き起こすことが示された。これらの被
験者からのプラスマは試験管的にラツトテイル動脈にお
けるカルシウムの取り込みを増大した。
【００１３】循環性因子の由来は知られていないけれど
も、ＰＴＨが高血圧性ラツトで高いという報告は副甲状
腺が研究の対象となることを示唆している。ＳＨＲラツ
トの副甲状腺摘出術により血圧が低下することが見出さ
れ、副甲状腺を摘出されたＳＨＲラツトからのプラスマ
は正常血圧ラツトの血圧の上昇を引き起こさなかつた。
逆にＳＨＲラツトからの副甲状腺を正常血圧のスプラー
グ−ダウレー（ＳＤ）ラツトへの移植により血圧が上昇
し、他の正常血圧のラツトへ単離されたプラスマを注入
することにより見られたようなプラスマ中にフアクター
の存在が認められた〔パング及びレバンチユク，Ａme
r．Ｊ．Ｈypertens.，２，８９８（１９８９）〕。これ
らの研究より本発明者らは、副甲状腺は循環性因子の起
源であり、この物質に対して“副甲状腺高血圧性フアク
ター”或いはＰＨＦと名付けることを提案した。
も、ＰＴＨが高血圧性ラツトで高いという報告は副甲状
腺が研究の対象となることを示唆している。ＳＨＲラツ
トの副甲状腺摘出術により血圧が低下することが見出さ
れ、副甲状腺を摘出されたＳＨＲラツトからのプラスマ
は正常血圧ラツトの血圧の上昇を引き起こさなかつた。
逆にＳＨＲラツトからの副甲状腺を正常血圧のスプラー
グ−ダウレー（ＳＤ）ラツトへの移植により血圧が上昇
し、他の正常血圧のラツトへ単離されたプラスマを注入
することにより見られたようなプラスマ中にフアクター
の存在が認められた〔パング及びレバンチユク，Ａme
r．Ｊ．Ｈypertens.，２，８９８（１９８９）〕。これ
らの研究より本発明者らは、副甲状腺は循環性因子の起
源であり、この物質に対して“副甲状腺高血圧性フアク
ター”或いはＰＨＦと名付けることを提案した。
【００１４】上記実験において潜在性の複雑なフアクタ
ーは輸注されたプラスマ中、高い濃度で存在するカルシ
ウム及び他の低分子量の昇圧物質でありうる。この可能
性を排除するために輸注された全てのプラスマを分子量
約１０００をカットオフ値とする膜を用いて一晩透析し
た。この操作によりカルシウム及び、４００〜５００の
分子量を持つと報告されているウアバイン様因子を含む
最も知られた内因性昇圧剤も除去される。更に、全ての
公知の内因性昇圧物質は急速に作用する。
ーは輸注されたプラスマ中、高い濃度で存在するカルシ
ウム及び他の低分子量の昇圧物質でありうる。この可能
性を排除するために輸注された全てのプラスマを分子量
約１０００をカットオフ値とする膜を用いて一晩透析し
た。この操作によりカルシウム及び、４００〜５００の
分子量を持つと報告されているウアバイン様因子を含む
最も知られた内因性昇圧剤も除去される。更に、全ての
公知の内因性昇圧物質は急速に作用する。
【００１５】プラスマからＰＨＦを単離し同定するため
にＳＨＲラツト、ＷＫＹラツト及びＳＤラツトが断頭及
び瀉血され、各ラツトのプラスマは集められヘパリンで
処理された後、遠心分離された。集められたプラスマは
先ず透析され（分子量カツトオフ １０００）、約５０
００の分子量の上限カツトオフを有する限外濾過システ
ムで濾過され、次いで濾液を凍結乾燥により濃縮した。
濃縮透析物はバイオ−ゲル Ｐ−６のようなモレキユラ
ーシーブに通した。pＨ７.０で０.０５Ｍ ＮＨ4ＯＡc
で溶出して画分を集めた。溶出液はフアーマシア（Ｐha
rmacia）Ｕ．Ｖ．検知器を用いて２８０nmで光度計測
し、正常血圧のラツトから得られたサンプルには存在し
ない画分がＳＨＲラツトのプラスマから同定された（図
１参照）。
にＳＨＲラツト、ＷＫＹラツト及びＳＤラツトが断頭及
び瀉血され、各ラツトのプラスマは集められヘパリンで
処理された後、遠心分離された。集められたプラスマは
先ず透析され（分子量カツトオフ １０００）、約５０
００の分子量の上限カツトオフを有する限外濾過システ
ムで濾過され、次いで濾液を凍結乾燥により濃縮した。
濃縮透析物はバイオ−ゲル Ｐ−６のようなモレキユラ
ーシーブに通した。pＨ７.０で０.０５Ｍ ＮＨ4ＯＡc
で溶出して画分を集めた。溶出液はフアーマシア（Ｐha
rmacia）Ｕ．Ｖ．検知器を用いて２８０nmで光度計測
し、正常血圧のラツトから得られたサンプルには存在し
ない画分がＳＨＲラツトのプラスマから同定された（図
１参照）。
【００１６】ＳＨＲラツトからの種々の画分を集め、凍
結乾燥により濃縮し正常血圧のラツトに注入した。ＳＨ
Ｒラツトのプラスマの特徴として３０〜４５分の遅れで
血圧の上昇が観察された。正常血圧ラツトのプラスマか
らの溶出物の画分は上記のような活性を示さなかつた。
ＳＨＲの不規則な画分における活性成分は液体クロマト
グラフイーカラム及びＨＰＬＣの両方を用いた分子エク
スクルージヨン及びクロマトグラフイーより約３５００
ダルトンの分子量を有すると評価された。更にこの活性
画分を特徴化するためにプラスマサンプルは凍結乾燥さ
れ０.１％トリフルオロ酢酸；アセトニトリル溶媒を用
いたブラウンリーＲＰ−Ｐ（Ｃ−８）逆相カラムＨＰＬ
Ｃで分留され再び２８０nmで溶出液をモニターした。結
果を図２（Ａ）及び（Ｂ）に示す。
結乾燥により濃縮し正常血圧のラツトに注入した。ＳＨ
Ｒラツトのプラスマの特徴として３０〜４５分の遅れで
血圧の上昇が観察された。正常血圧ラツトのプラスマか
らの溶出物の画分は上記のような活性を示さなかつた。
ＳＨＲの不規則な画分における活性成分は液体クロマト
グラフイーカラム及びＨＰＬＣの両方を用いた分子エク
スクルージヨン及びクロマトグラフイーより約３５００
ダルトンの分子量を有すると評価された。更にこの活性
画分を特徴化するためにプラスマサンプルは凍結乾燥さ
れ０.１％トリフルオロ酢酸；アセトニトリル溶媒を用
いたブラウンリーＲＰ−Ｐ（Ｃ−８）逆相カラムＨＰＬ
Ｃで分留され再び２８０nmで溶出液をモニターした。結
果を図２（Ａ）及び（Ｂ）に示す。
【００１７】ＳＨＲラツトから甲状腺を切除し、ハンク
の培地（ジブコ，Ｇibco）中で７日以下毎日培地を交換
しながら培養した。ＰＨＦの産生は培地からカルシウム
の減少により活性化される。プールされた培地は、プラ
スマサンプルの処理と同様の透析及び濾過を受けた後、
凍結乾燥及び逆相カラムを用いたＨＰＬＣにより分留さ
れた。図８（Ａ）にその分離を示す。図８（Ｂ）にＷＫ
Ｙラツトの甲状腺を用いた結果を示す。ＳＨＲ及びＳＤ
ラツトから得られた第１の細胞培地は上記のように生育
された。４時間経過後、培地のサンプルは除去され凍結
乾燥された。最少量の蒸留水に再懸濁した後、抽出物は
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１５〜１８％ アクリルアミド
／ビスアクリルアミド）上に滴下され約１時間展開した
（Ｂio−Ｒad Ｍini−プロテイン II）。クマシーブ
ルー又は好ましくは銀色に染色した後、ゲルをスキヤン
した。結果を図１０に示す。ＳＤラツト細胞培地或いは
ＳＨＲラツト細胞培地には認められなかつたユニークな
ピークが約１２時間よりも前にＳＨＲラツトの細胞培地
に認められた。そのピークの分子量は約３３００ダルト
ンと評価された。
の培地（ジブコ，Ｇibco）中で７日以下毎日培地を交換
しながら培養した。ＰＨＦの産生は培地からカルシウム
の減少により活性化される。プールされた培地は、プラ
スマサンプルの処理と同様の透析及び濾過を受けた後、
凍結乾燥及び逆相カラムを用いたＨＰＬＣにより分留さ
れた。図８（Ａ）にその分離を示す。図８（Ｂ）にＷＫ
Ｙラツトの甲状腺を用いた結果を示す。ＳＨＲ及びＳＤ
ラツトから得られた第１の細胞培地は上記のように生育
された。４時間経過後、培地のサンプルは除去され凍結
乾燥された。最少量の蒸留水に再懸濁した後、抽出物は
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１５〜１８％ アクリルアミド
／ビスアクリルアミド）上に滴下され約１時間展開した
（Ｂio−Ｒad Ｍini−プロテイン II）。クマシーブ
ルー又は好ましくは銀色に染色した後、ゲルをスキヤン
した。結果を図１０に示す。ＳＤラツト細胞培地或いは
ＳＨＲラツト細胞培地には認められなかつたユニークな
ピークが約１２時間よりも前にＳＨＲラツトの細胞培地
に認められた。そのピークの分子量は約３３００ダルト
ンと評価された。
【００１８】関連実験において甲状腺細胞を上記と同様
に培養した。８時間後細胞を培養から除き、５０mＭの
酢酸中でホモジナイズし、約５０００×gで遠心分離し
て細胞の砕片を除き、１０〜１８％のアクリルアミド／
ビスアクリルアミドゲルに通した。結果を図９に示す。
ＳＨＲ甲状腺培地又はプラスマからＰＨＦの等電点はＩ
ＥＦ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥの２つのゲルを用いて、Ｂio
−Ｒad mini−等電点電気泳動システムを使ってｐＨ３
〜１０の両性電解質の条件で測定した。結果を図１３に
示し、共通のスポツトが約ｐＨ６において表われた。
に培養した。８時間後細胞を培養から除き、５０mＭの
酢酸中でホモジナイズし、約５０００×gで遠心分離し
て細胞の砕片を除き、１０〜１８％のアクリルアミド／
ビスアクリルアミドゲルに通した。結果を図９に示す。
ＳＨＲ甲状腺培地又はプラスマからＰＨＦの等電点はＩ
ＥＦ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥの２つのゲルを用いて、Ｂio
−Ｒad mini−等電点電気泳動システムを使ってｐＨ３
〜１０の両性電解質の条件で測定した。結果を図１３に
示し、共通のスポツトが約ｐＨ６において表われた。
【００１９】通常の方法〔テイ マニアテイスら，Ｍol
ecular Ｃloning，Ａ Ｌaboratory Ｍethod，Ｃold
Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory，Ｃold Ｓpring Ｈ
arbor，Ｎ．Ｙ．（１９８２）〕を用いてＰＨＦ産生セ
ルからのトータルＲＮＡが抽出される。ポリ（Ａ）ＲＮ
Ａは例えばオリド−（ｄＴ）セルロースカラム等のクロ
マトグラフイーにより単離され、リバース トランスク
リプターゼを用いてｃＤＮＡに変換され、通常の方法
〔例えばランドら，９ Ｎucl．Ａcids Ｒes.，２２５
１（１９８１）〕により二重鎖とされる。ＤＮＡは市販
の変換ベクターに挿入され、Ｅ．coli Ｋ１２．のよう
な適当なクローニングホストを変換するのに用いられ
る。このホストから得られたダイジエスト（digested）
されたプラスミドは、ｃＤＮＡライブラリーを得るため
に用いられ標準的な方法〔サザーン、９８ Ｊ．Ｍol
Ｂiol．５０３（１９７５）〕に従い製造されたラベル
されたゾンデによりスクリーンされる。高度に交雑され
たフラグメントはエクスプレツシヨン（expression）ベ
クターを構成するのに用いられる。エクスプレツシヨン
ベクターにより変換されたセルＰＨＦの高産生源として
用いられる。プラスマ、培養された細胞又は変換された
細胞からの精製されたＰＨＦを用いて、ポリクロナール
及びモノクロナール抗体はＰＨＦに対して引き起こさ
れ、ＰＨＦのアツセイに用いられる。
ecular Ｃloning，Ａ Ｌaboratory Ｍethod，Ｃold
Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory，Ｃold Ｓpring Ｈ
arbor，Ｎ．Ｙ．（１９８２）〕を用いてＰＨＦ産生セ
ルからのトータルＲＮＡが抽出される。ポリ（Ａ）ＲＮ
Ａは例えばオリド−（ｄＴ）セルロースカラム等のクロ
マトグラフイーにより単離され、リバース トランスク
リプターゼを用いてｃＤＮＡに変換され、通常の方法
〔例えばランドら，９ Ｎucl．Ａcids Ｒes.，２２５
１（１９８１）〕により二重鎖とされる。ＤＮＡは市販
の変換ベクターに挿入され、Ｅ．coli Ｋ１２．のよう
な適当なクローニングホストを変換するのに用いられ
る。このホストから得られたダイジエスト（digested）
されたプラスミドは、ｃＤＮＡライブラリーを得るため
に用いられ標準的な方法〔サザーン、９８ Ｊ．Ｍol
Ｂiol．５０３（１９７５）〕に従い製造されたラベル
されたゾンデによりスクリーンされる。高度に交雑され
たフラグメントはエクスプレツシヨン（expression）ベ
クターを構成するのに用いられる。エクスプレツシヨン
ベクターにより変換されたセルＰＨＦの高産生源として
用いられる。プラスマ、培養された細胞又は変換された
細胞からの精製されたＰＨＦを用いて、ポリクロナール
及びモノクロナール抗体はＰＨＦに対して引き起こさ
れ、ＰＨＦのアツセイに用いられる。
【００２０】雄性のＢalb／Ｃマウスをアミノフエノー
ルチオールエーテルデイスクの移植により免疫化し、該
デイスクには甲状腺培地から得られた部分的に精製され
たＰＨＦをビアモンテスら，Ｊ．Ｉmmunol．Ｍeth，９
４，１３−１７（１９８６）の処方により添付しておい
た。マウスは２週間の間隔でフロイント不完全アジユバ
ント中、抗原でブーストされ、抗体の力価は酵素リンク
イムノソーベントアツセイ（ＥＬＩＳＡ）により検定さ
れ、該検定には抗原としてプラスマから単離されたＰＨ
Ｆが用いられた。ポリクロナール抗体の検出し得る量が
１箇月以内に観察されその後力価は増大した。モノクロ
ナール抗体はポリクロナール抗体産生マウスの脾臓から
得られる。必要なハイブリドーマ及びＭＣＡはランゴン
及びバンブナキス，“Ｍethodsin Ｅnzymology”，１
２１，１−９４７（１９８６）の方法又はこの分野の実
務者に公知の変法により得られる。
ルチオールエーテルデイスクの移植により免疫化し、該
デイスクには甲状腺培地から得られた部分的に精製され
たＰＨＦをビアモンテスら，Ｊ．Ｉmmunol．Ｍeth，９
４，１３−１７（１９８６）の処方により添付しておい
た。マウスは２週間の間隔でフロイント不完全アジユバ
ント中、抗原でブーストされ、抗体の力価は酵素リンク
イムノソーベントアツセイ（ＥＬＩＳＡ）により検定さ
れ、該検定には抗原としてプラスマから単離されたＰＨ
Ｆが用いられた。ポリクロナール抗体の検出し得る量が
１箇月以内に観察されその後力価は増大した。モノクロ
ナール抗体はポリクロナール抗体産生マウスの脾臓から
得られる。必要なハイブリドーマ及びＭＣＡはランゴン
及びバンブナキス，“Ｍethodsin Ｅnzymology”，１
２１，１−９４７（１９８６）の方法又はこの分野の実
務者に公知の変法により得られる。
【００２１】ポリクロナール及び又はモノクロナール抗
体を用いた検出方法は特に限定されず、例えばラジオイ
ムノアツセイ、酵素イムノアツセイ、酵素リンクイムノ
ソーベントアツセイ、免疫沈降の形成に基づくアツセイ
システム等が含まれる。このようなアツセイシステムの
うち特に好適なものは、医院又は診療所において高度の
分析機器を用いないで行われる診断キツトである。この
ような方法は体液中のホルモン又は免疫活性な物質の検
出に用いられているものである。一つの例は早期妊娠検
出のキツトである。従つてＰＨＦは上記方法によつて定
性的又は定量的に検出される。
体を用いた検出方法は特に限定されず、例えばラジオイ
ムノアツセイ、酵素イムノアツセイ、酵素リンクイムノ
ソーベントアツセイ、免疫沈降の形成に基づくアツセイ
システム等が含まれる。このようなアツセイシステムの
うち特に好適なものは、医院又は診療所において高度の
分析機器を用いないで行われる診断キツトである。この
ような方法は体液中のホルモン又は免疫活性な物質の検
出に用いられているものである。一つの例は早期妊娠検
出のキツトである。従つてＰＨＦは上記方法によつて定
性的又は定量的に検出される。
【００２２】酵素イムノアツセイの代表的なテストキツ
トは ａ）好ましくは固相に結合した副甲状腺高血圧性
因子に対する抗体、ｂ）酵素でラベルされた第２の抗
体、ｃ）上記第２の抗体上の酵素ラベルのための基質及
び ｄ）副甲状腺高血圧性因子の標準溶液を含む。ＲＩ
Ａの代表的なテストキツトは ａ）副甲状腺高血圧性因
子に対する抗体、ｂ）抗副甲状腺高血圧性因子に対する
第２の抗体、ｃ）ラジオラベルされた副甲状腺高血圧性
因子の標準溶液、ｄ）非ラベル副甲状腺高血圧性因子の
標準溶液及び ｅ）沈降剤を含む。免疫沈降アツセイの
代表的なテストキツトは ａ）副甲状腺高血圧性因子に
対する抗体、ｂ）上記抗体が付加している固相及び
ｃ）副甲状腺高血圧性因子の標準溶液を含む。
トは ａ）好ましくは固相に結合した副甲状腺高血圧性
因子に対する抗体、ｂ）酵素でラベルされた第２の抗
体、ｃ）上記第２の抗体上の酵素ラベルのための基質及
び ｄ）副甲状腺高血圧性因子の標準溶液を含む。ＲＩ
Ａの代表的なテストキツトは ａ）副甲状腺高血圧性因
子に対する抗体、ｂ）抗副甲状腺高血圧性因子に対する
第２の抗体、ｃ）ラジオラベルされた副甲状腺高血圧性
因子の標準溶液、ｄ）非ラベル副甲状腺高血圧性因子の
標準溶液及び ｅ）沈降剤を含む。免疫沈降アツセイの
代表的なテストキツトは ａ）副甲状腺高血圧性因子に
対する抗体、ｂ）上記抗体が付加している固相及び
ｃ）副甲状腺高血圧性因子の標準溶液を含む。
【００２３】ＰＨＦの同定は、ダイエタリーカルシウム
が血圧の低下にしばしば有効であり、カルシウムチヤン
ネルブロツカーが同じ患者に有効であるという文献中の
一見、変則的な報告に説明を与える。高い血清カルシウ
ムイオンは高い細胞内カルシウムレベル及び高い血圧を
もたらすと考えられる。現在、特別な理論にとらわれな
いが、ＰＨＦは図２に示すようにカルシウムチヤンネル
を開くように機能するように見えるが、ダイエタリーカ
ルシウムの高レベルはＰＨＦの遊離を阻害する。確かに
ＳＨＲラツトにおいてはカルシウム欠乏ダイエツトは高
カルシウムダイエツト（レバンツユク及びパング，Ａbs
tract，４th Ａnnual Ｍeeting ofthe Ａmerican
Ｓociety of Ｈypertension，１９８９）を与えられ
たＳＨＲラツトのプラスマには見られないプラスマＰＨ
Ｆの増大をもたらすことを示した。
が血圧の低下にしばしば有効であり、カルシウムチヤン
ネルブロツカーが同じ患者に有効であるという文献中の
一見、変則的な報告に説明を与える。高い血清カルシウ
ムイオンは高い細胞内カルシウムレベル及び高い血圧を
もたらすと考えられる。現在、特別な理論にとらわれな
いが、ＰＨＦは図２に示すようにカルシウムチヤンネル
を開くように機能するように見えるが、ダイエタリーカ
ルシウムの高レベルはＰＨＦの遊離を阻害する。確かに
ＳＨＲラツトにおいてはカルシウム欠乏ダイエツトは高
カルシウムダイエツト（レバンツユク及びパング，Ａbs
tract，４th Ａnnual Ｍeeting ofthe Ａmerican
Ｓociety of Ｈypertension，１９８９）を与えられ
たＳＨＲラツトのプラスマには見られないプラスマＰＨ
Ｆの増大をもたらすことを示した。
【００２４】この仮説は他の血管作動性物質を用いた灌
流実験によつてサポートされる。ＳＤラツトが透析され
たＳＨＲプラスマ及び、ノルエピネフリン、アルギニン
バソプレシン（ＡＶＯ）又はアンギオテンシンII（Ａ−
II）を注入された場合、平均動脈血圧（ＭＡＰ）は増大
し、最大増加はＳＨＲプラスマに対するピーク高血圧性
レスポンスにおいて見られた。
流実験によつてサポートされる。ＳＤラツトが透析され
たＳＨＲプラスマ及び、ノルエピネフリン、アルギニン
バソプレシン（ＡＶＯ）又はアンギオテンシンII（Ａ−
II）を注入された場合、平均動脈血圧（ＭＡＰ）は増大
し、最大増加はＳＨＲプラスマに対するピーク高血圧性
レスポンスにおいて見られた。
【００２５】ＰＨＦの存在は低レニン及び高血圧症のソ
ルト−センシテイブフオームの特徴と考えられ、高レニ
ン又はソルト−インセンシテイブフオームではないと考
えられる。副甲状腺におけるＰＨＦの細胞起源はＳＨＲ
ラツトの副甲状腺摘出術によりＭＡＰが低下することに
よつて確認された。更にＳＨＲの副甲状腺においてユニ
ークな細胞が認められたが、ＳＤ又はＷＫＹラツトでは
認められなかつた。この新規な細胞は光学及び電子顕微
鏡の両方により観察される。この細胞はアルデヒドフク
シン又は鉄ヘマトキシリンを用いた細胞質の高度染色に
よつて高濃度で不規則な形状をした核を有している。
ルト−センシテイブフオームの特徴と考えられ、高レニ
ン又はソルト−インセンシテイブフオームではないと考
えられる。副甲状腺におけるＰＨＦの細胞起源はＳＨＲ
ラツトの副甲状腺摘出術によりＭＡＰが低下することに
よつて確認された。更にＳＨＲの副甲状腺においてユニ
ークな細胞が認められたが、ＳＤ又はＷＫＹラツトでは
認められなかつた。この新規な細胞は光学及び電子顕微
鏡の両方により観察される。この細胞はアルデヒドフク
シン又は鉄ヘマトキシリンを用いた細胞質の高度染色に
よつて高濃度で不規則な形状をした核を有している。
【００２６】ＰＨＦ検出法を用いることにより医者は本
態性高血圧症の原因を同定し、その適切な治療法を選択
し、モニターする診断テストを行うことができる。レニ
ンと同様ＰＨＦ（ｓ）の産生はカルシウムの補給により
阻害され、高レベルのカルシウム補給は高血圧を低下す
るのに有効であることが見出された。カルシウム補給の
効果は、血液中の高レベルのカルシウムが抗高血圧症効
果に限れば、カルシウムの血管平滑筋組織へのバイオ−
アベイラビリテイを増加するという事実のために予測で
きない。更に極めて高レベルのダイエタリーカルシウム
は関節に望ましくない苦痛を伴うカルシウムの沈着を引
き起こし、腎臓結石を引き起こす可能性がある。
態性高血圧症の原因を同定し、その適切な治療法を選択
し、モニターする診断テストを行うことができる。レニ
ンと同様ＰＨＦ（ｓ）の産生はカルシウムの補給により
阻害され、高レベルのカルシウム補給は高血圧を低下す
るのに有効であることが見出された。カルシウム補給の
効果は、血液中の高レベルのカルシウムが抗高血圧症効
果に限れば、カルシウムの血管平滑筋組織へのバイオ−
アベイラビリテイを増加するという事実のために予測で
きない。更に極めて高レベルのダイエタリーカルシウム
は関節に望ましくない苦痛を伴うカルシウムの沈着を引
き起こし、腎臓結石を引き起こす可能性がある。
【００２７】本態性高血圧症の同定に加えてＰＨＦ及び
ＰＨＦアツセイは主要な症状として高血圧症を含み又は
含まない他の疾病の研究及び治療に適用可能である。例
えばインシユリン非依存性糖尿病患者はしばしば高血圧
症である。逆に高血圧症患者はしばしば低いグルコース
トレランスを示す。両方の場合において細胞内遊離カル
シウムの増大が認められた。ＰＨＦは肥満で高血圧性で
インシユリン非依存性糖尿病であるＯｂ／Ｏｂマウスの
プラスマ中に検出された。このマウスからのＰＨＦはＳ
ＨＲラツトからのＰＨＦと同じサブフラクシヨン中の血
清から単離された。ＰＨＦの検出はインシユリン非依存
性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の診断に有用であり、ＮＩＤＤ
ＭにおけるＰＨＦの役割の研究に新しい領域を開く。
ＰＨＦアツセイは主要な症状として高血圧症を含み又は
含まない他の疾病の研究及び治療に適用可能である。例
えばインシユリン非依存性糖尿病患者はしばしば高血圧
症である。逆に高血圧症患者はしばしば低いグルコース
トレランスを示す。両方の場合において細胞内遊離カル
シウムの増大が認められた。ＰＨＦは肥満で高血圧性で
インシユリン非依存性糖尿病であるＯｂ／Ｏｂマウスの
プラスマ中に検出された。このマウスからのＰＨＦはＳ
ＨＲラツトからのＰＨＦと同じサブフラクシヨン中の血
清から単離された。ＰＨＦの検出はインシユリン非依存
性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の診断に有用であり、ＮＩＤＤ
ＭにおけるＰＨＦの役割の研究に新しい領域を開く。
【００２８】ある種のキヤンサーは高い細胞内遊離カル
シウムによつて特徴づけられる〔オカザキら，Ｃanc．
Ｒes.，４６（１２ Ｐt １），６０５９−６０６３
（１９８６）；リプトン及びモリス，Ｃanc．Ｃhemothe
r．Ｐharmacol.，１８（１），１７−２０（１９８
６）；チエン及びワレン，Ｃanc．Ｒes.，４６（１
１），５７０６−５７１４；シラカワら，Ｃanc．Ｒe
s.，４６（２），６５８−６６１（１９８６）；及びメ
イヤー，Ｊ．Ｈypertens.，５（suppl．４），Ｓ３−Ｓ
４１９８７）〕。又、副甲状腺活性は或る種のキヤンサ
ーと関連がある〔パルマーら， Ａm．Ｊ．Ｅpidemio
l.，１２７（５），１０３１−１０４０（１９８８）及
びヘイグ及びゴツテスマン，Ｃancer，６０（３），４
２９−４３２（１９８７）〕。ＰＨＦは副甲状腺由来で
あり予備データはＰＨＦが細胞内カルシウムレベルを増
大することができると示唆しているので、ＰＨＦはこれ
ら及び他の形態のキヤンサーと関係があると考えられ
る。このようにＰＨＦのスクリーニングはその検出方法
及び治療法の発展のみならずこれらのキヤンサーの病因
を理解する上で価値がある。
シウムによつて特徴づけられる〔オカザキら，Ｃanc．
Ｒes.，４６（１２ Ｐt １），６０５９−６０６３
（１９８６）；リプトン及びモリス，Ｃanc．Ｃhemothe
r．Ｐharmacol.，１８（１），１７−２０（１９８
６）；チエン及びワレン，Ｃanc．Ｒes.，４６（１
１），５７０６−５７１４；シラカワら，Ｃanc．Ｒe
s.，４６（２），６５８−６６１（１９８６）；及びメ
イヤー，Ｊ．Ｈypertens.，５（suppl．４），Ｓ３−Ｓ
４１９８７）〕。又、副甲状腺活性は或る種のキヤンサ
ーと関連がある〔パルマーら， Ａm．Ｊ．Ｅpidemio
l.，１２７（５），１０３１−１０４０（１９８８）及
びヘイグ及びゴツテスマン，Ｃancer，６０（３），４
２９−４３２（１９８７）〕。ＰＨＦは副甲状腺由来で
あり予備データはＰＨＦが細胞内カルシウムレベルを増
大することができると示唆しているので、ＰＨＦはこれ
ら及び他の形態のキヤンサーと関係があると考えられ
る。このようにＰＨＦのスクリーニングはその検出方法
及び治療法の発展のみならずこれらのキヤンサーの病因
を理解する上で価値がある。
【００２９】
【実施例】以下に本発明の実施例を示すがこれらに限定
されるものではない。本発明の範囲を越えないで当業者
に自明な種々の変形が可能であることは明らかである。
されるものではない。本発明の範囲を越えないで当業者
に自明な種々の変形が可能であることは明らかである。
【００３０】実施例１ＳＨＲラツトにおけるＰＨＦの存在の立証 雄性の、ＳＨＲ，ウイスター−キヨウト（ＷＫＹ）及び
スプラーグ−ダウレー（ＳＤ）系のラツトを断頭し瀉血
して、各系のプールした血液をヘパリン化（１００ＩＵ
／ml）し、４℃で１０分間、３Ｋ×gで遠心分離した。
得られたプラスマを分子量のカツトオフラインが１,０
００ダルトンの膜を用いて、蒸留水で透析した。ペント
バルビタールＮa（５０mg／kg、腹腔内投与）を用いて
ＳＤラツトを麻酔し、プラスマ及び薬物を注射するため
に頚静脈にカテーテルを挿入し、血圧（b.p.）を測定す
るために頚動脈にカテーテルを挿入した。プラスマは３
ml／kg／hrの割合で持続注入により、或いは２.５ml／k
gの単回注入で投与した。図４はＳＨＲ, ＷＫＹ及びＳ
ＤラツトからのプラスマをＳＤラツトに持続注入した際
の平均動脈血圧の時間的変化を示す。１０５分の後、Ｓ
ＨＲプラスマの持続注入を終了し、ＳＤプラスマに置き
換えたところ、３０分以内にベースラインb.p．に戻つ
た。 図５にＳＨＲ, ＷＫＹ及びＳＤラツトからのプラス
マをＳＤラツトに単回注入で投与した際の効果を示す。
図４と比較して、血圧の時間的変化は同様であつたが、
相対的効果は同様でなかつた。
スプラーグ−ダウレー（ＳＤ）系のラツトを断頭し瀉血
して、各系のプールした血液をヘパリン化（１００ＩＵ
／ml）し、４℃で１０分間、３Ｋ×gで遠心分離した。
得られたプラスマを分子量のカツトオフラインが１,０
００ダルトンの膜を用いて、蒸留水で透析した。ペント
バルビタールＮa（５０mg／kg、腹腔内投与）を用いて
ＳＤラツトを麻酔し、プラスマ及び薬物を注射するため
に頚静脈にカテーテルを挿入し、血圧（b.p.）を測定す
るために頚動脈にカテーテルを挿入した。プラスマは３
ml／kg／hrの割合で持続注入により、或いは２.５ml／k
gの単回注入で投与した。図４はＳＨＲ, ＷＫＹ及びＳ
ＤラツトからのプラスマをＳＤラツトに持続注入した際
の平均動脈血圧の時間的変化を示す。１０５分の後、Ｓ
ＨＲプラスマの持続注入を終了し、ＳＤプラスマに置き
換えたところ、３０分以内にベースラインb.p．に戻つ
た。 図５にＳＨＲ, ＷＫＹ及びＳＤラツトからのプラス
マをＳＤラツトに単回注入で投与した際の効果を示す。
図４と比較して、血圧の時間的変化は同様であつたが、
相対的効果は同様でなかつた。
【００３１】実施例２カルシウム取り込みのコントロール パングら、Ｌife Ｓci.，４２，１９３５（１９８８）
に記載された低親和性ランタン耐性プール法を用いて、
ＳＤテイル動脈のカルシウム〔45Ｃa〕取り込みを試験
管的に測定した。ラツトテイル動脈細片を、酵素を添加
した（９５％Ｏ2，５％ ＣＯ2）クレブスーハンスライ
トバツフアー中で２時間、平衡に達しめた。平衡後、
０.１μキユリーの45Ｃaの存在下、クレブスバツフアー
中３０％のプラスマに上記細片を培養した。所定の培養
時間の後、組織を冷たいＣa2+フリー、Ｌa3+含有溶液中
でリンスし、次いで拭き、秤量して、パングら、Ｌife
Ｓci.，４２，１９３５（１９８８）に記載されたよう
に消化した。カルシウム取り込みをシンチレーシヨンカ
ウンターにより測定した結果を示す。45Ｃaの取り込み
は血圧の増加カーブに従い、投与依存性であつた。
に記載された低親和性ランタン耐性プール法を用いて、
ＳＤテイル動脈のカルシウム〔45Ｃa〕取り込みを試験
管的に測定した。ラツトテイル動脈細片を、酵素を添加
した（９５％Ｏ2，５％ ＣＯ2）クレブスーハンスライ
トバツフアー中で２時間、平衡に達しめた。平衡後、
０.１μキユリーの45Ｃaの存在下、クレブスバツフアー
中３０％のプラスマに上記細片を培養した。所定の培養
時間の後、組織を冷たいＣa2+フリー、Ｌa3+含有溶液中
でリンスし、次いで拭き、秤量して、パングら、Ｌife
Ｓci.，４２，１９３５（１９８８）に記載されたよう
に消化した。カルシウム取り込みをシンチレーシヨンカ
ウンターにより測定した結果を示す。45Ｃaの取り込み
は血圧の増加カーブに従い、投与依存性であつた。
【００３２】実施例３イクスクルージヨンクロマトグラフイーによるＰＨＦの
単離 ＳＨＲ，ＷＫＹ及びＳＤラツトからのプラスマを蒸留水
で一晩（１,０００mwco）透析し、アミコン限外濾過セ
ル（５,０００mwco）を用いて濾過し、Ｂio−Ｇel Ｐ
−６を充填したカラムでクロマトグラフし、０.０５Ｍ
酢酸アンモニウムで溶出し、溶出画分をフアーマシア
Ｕ.Ｖ.フオトメーターを用いて２８０nmで測定した。
６.６７mlの部分標本（アリクウオツト）が集められ
た。約３,５００ダルトンの分子量の画分がＳＨＲプラ
スマには認められたが、ＷＫＹ又はＳＤラツトからのプ
ラスマには認められなかつた（図１）。カラムの大きさ
を測定するのに用いられた分子量のマーカーは副腎皮質
刺激ホルモン（ＡＣＴＨ，m.w.４５４１.７）、インシ
ユリンＢチエイン（m.w.３４９６）、インシユリンＡチ
エイン（m.w.２５３０）及び１３アミノ酸合成ペプチド
（m.w.１４６４）である。ＳＨＲラツトからの特異な画
分を凍結乾燥により濃縮し実施例１に記載した様にカテ
ーテルを挿入したＳＤラツトに注入した。ＳＨＲラツト
からのプラスマに対して同様の開始時間及び大きさの血
圧の増加が見られた。データを図７に示す。
単離 ＳＨＲ，ＷＫＹ及びＳＤラツトからのプラスマを蒸留水
で一晩（１,０００mwco）透析し、アミコン限外濾過セ
ル（５,０００mwco）を用いて濾過し、Ｂio−Ｇel Ｐ
−６を充填したカラムでクロマトグラフし、０.０５Ｍ
酢酸アンモニウムで溶出し、溶出画分をフアーマシア
Ｕ.Ｖ.フオトメーターを用いて２８０nmで測定した。
６.６７mlの部分標本（アリクウオツト）が集められ
た。約３,５００ダルトンの分子量の画分がＳＨＲプラ
スマには認められたが、ＷＫＹ又はＳＤラツトからのプ
ラスマには認められなかつた（図１）。カラムの大きさ
を測定するのに用いられた分子量のマーカーは副腎皮質
刺激ホルモン（ＡＣＴＨ，m.w.４５４１.７）、インシ
ユリンＢチエイン（m.w.３４９６）、インシユリンＡチ
エイン（m.w.２５３０）及び１３アミノ酸合成ペプチド
（m.w.１４６４）である。ＳＨＲラツトからの特異な画
分を凍結乾燥により濃縮し実施例１に記載した様にカテ
ーテルを挿入したＳＤラツトに注入した。ＳＨＲラツト
からのプラスマに対して同様の開始時間及び大きさの血
圧の増加が見られた。データを図７に示す。
【００３３】実施例４ＨＰＬＣによるＰＨＦの精製 実施例３で得られた上記特異な画分を凍結乾燥し、０.
１％トリフルオロ酢酸：アセトニトリルの溶媒を用いた
ブラウンリーＲＰ−Ｐ（Ｃ−８）逆相カラムＨＰＬＣに
より分画し、２８０nmでモニターした。生物学的活性を
示すピークが得られた〔図２（Ａ）を参照〕。該ピーク
はＷＫＹラツトから得られたプラスマサンプルには認め
られなかつた〔図２（Ｂ）参照〕。
１％トリフルオロ酢酸：アセトニトリルの溶媒を用いた
ブラウンリーＲＰ−Ｐ（Ｃ−８）逆相カラムＨＰＬＣに
より分画し、２８０nmでモニターした。生物学的活性を
示すピークが得られた〔図２（Ａ）を参照〕。該ピーク
はＷＫＹラツトから得られたプラスマサンプルには認め
られなかつた〔図２（Ｂ）参照〕。
【００３４】実施例５細胞培地からの単離 ＳＨＲ及びＷＫＹラツトから甲状腺を伴う副甲状腺（th
yroparathyroid）を切除した。該腺をハンクの培地で培
養し培地を毎日交換した。プールした培地を蒸留水で透
析しプラスマ処理と同様の方法を用いて濾過した。１０
００〜５０００の分子量を有する画分を凍結乾燥し、
０.１％トリフルオロ酢酸：アセトニトリルの溶媒を用
いたブラウンリーＲＰ−Ｐ（Ｃ−８）逆相カラムＨＰＬ
Ｃにより分画し、２８０nmでモニターした。ＳＨＲから
の活性画分をプラスマと同じ位置で溶出したが、ＷＫＹ
ラツトの細胞からの培地には相当する画分は得られなか
つた。図８（Ａ）にＳＨＲ細胞ラインからの培地の溶出
プロフイールを示し、図８（Ｂ）にＷＫＹラツトのそれ
を示す。
yroparathyroid）を切除した。該腺をハンクの培地で培
養し培地を毎日交換した。プールした培地を蒸留水で透
析しプラスマ処理と同様の方法を用いて濾過した。１０
００〜５０００の分子量を有する画分を凍結乾燥し、
０.１％トリフルオロ酢酸：アセトニトリルの溶媒を用
いたブラウンリーＲＰ−Ｐ（Ｃ−８）逆相カラムＨＰＬ
Ｃにより分画し、２８０nmでモニターした。ＳＨＲから
の活性画分をプラスマと同じ位置で溶出したが、ＷＫＹ
ラツトの細胞からの培地には相当する画分は得られなか
つた。図８（Ａ）にＳＨＲ細胞ラインからの培地の溶出
プロフイールを示し、図８（Ｂ）にＷＫＹラツトのそれ
を示す。
【００３５】実施例６ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる培地の分離 実施例５の方法で得られたＳＨＲ及びＳＤ甲状腺の培養
で得られた細胞培地を凍結乾燥し再懸濁（Ｈ2Ｏ）した
ものを、トリスバツフアー（pＨ８.３）中にトリス（p
Ｈ８.８）を含有する１５〜１８％アクリルアミド／ビ
スアクリルアミド（Ｂio−Ｒad）を含むミニＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥスラブゲルに満たした。このゲルに２００Ｖの電
圧を約１時間かけた（Ｂio−Ｒad ミニ−プロテインI
I）。結果を図１０（ａ）〜（ｄ）に示す。
で得られた細胞培地を凍結乾燥し再懸濁（Ｈ2Ｏ）した
ものを、トリスバツフアー（pＨ８.３）中にトリス（p
Ｈ８.８）を含有する１５〜１８％アクリルアミド／ビ
スアクリルアミド（Ｂio−Ｒad）を含むミニＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥスラブゲルに満たした。このゲルに２００Ｖの電
圧を約１時間かけた（Ｂio−Ｒad ミニ−プロテインI
I）。結果を図１０（ａ）〜（ｄ）に示す。
【００３６】実施例７ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる細胞抽出物の分離 ハンクの培地で８時間培養されたＳＨＲ及びＳＤラツト
からの甲状腺を伴う副甲状腺の細胞を単離し５０mＭの
酢酸中でホモジナイズし、５０００×ｇで遠心分離し１
０〜１８％アクリルアミド／ビスアクリルアミドスラブ
ゲルに注入し２００Ｖで１時間展開した。結果を図９
（ａ）〜（ｃ）に示す。
からの甲状腺を伴う副甲状腺の細胞を単離し５０mＭの
酢酸中でホモジナイズし、５０００×ｇで遠心分離し１
０〜１８％アクリルアミド／ビスアクリルアミドスラブ
ゲルに注入し２００Ｖで１時間展開した。結果を図９
（ａ）〜（ｃ）に示す。
【００３７】実施例８等電点電気泳動（focusing） カラム画分の分析的等電点電気泳動をＢio−Ｒadモデル
１１１ミニ−ＩＥＦセルを用いて行つた。この方法によ
り等電点に基づいてプロテインは分離され、実施例３で
単離されたカラム画分の純度が測定された。用いられた
方法はリゲツテイ“Ｉsoelectric Ｆocusing Ｔheor
y，Ｍethodology and Ａpplications”，Ｅlsevier
Ｂiomedical Ｐress，Ａmsterdam（１９８３）に記載
された方法をＢio−Ｒadモデル１１１ミニ−ＩＥＦセル
Ｉnstruction Ｍanual，Ｂio−Ｒad Ｌabs.，Ｒichmo
nd，Ｃaliforniaによりモデイフアイした方法である。
両性電解質を含有するポリアクリルアミドゲルの薄いス
ラブをゲル支持体フイルム上に載置した。ＳＨＲプラス
マ及び甲状腺を伴う副甲状腺細胞培地から精製されたサ
ンプルを標準サンプルと一緒にゲルに注入し、次いで直
接グラフアイト電極に接続した。６０〜９０分でプロテ
インが集中し、そのプロテインのバンドをクマシーブル
ー及びクロセインスカーレツトの両方を含む染料で染色
した。図１３に結果を示す。約pＨ６のバンドにプラス
マと培地の両方が現われた。
１１１ミニ−ＩＥＦセルを用いて行つた。この方法によ
り等電点に基づいてプロテインは分離され、実施例３で
単離されたカラム画分の純度が測定された。用いられた
方法はリゲツテイ“Ｉsoelectric Ｆocusing Ｔheor
y，Ｍethodology and Ａpplications”，Ｅlsevier
Ｂiomedical Ｐress，Ａmsterdam（１９８３）に記載
された方法をＢio−Ｒadモデル１１１ミニ−ＩＥＦセル
Ｉnstruction Ｍanual，Ｂio−Ｒad Ｌabs.，Ｒichmo
nd，Ｃaliforniaによりモデイフアイした方法である。
両性電解質を含有するポリアクリルアミドゲルの薄いス
ラブをゲル支持体フイルム上に載置した。ＳＨＲプラス
マ及び甲状腺を伴う副甲状腺細胞培地から精製されたサ
ンプルを標準サンプルと一緒にゲルに注入し、次いで直
接グラフアイト電極に接続した。６０〜９０分でプロテ
インが集中し、そのプロテインのバンドをクマシーブル
ー及びクロセインスカーレツトの両方を含む染料で染色
した。図１３に結果を示す。約pＨ６のバンドにプラス
マと培地の両方が現われた。
【００３８】実施例９ポリクロナール抗体の産生 雄性のＢalb／ＣマウスをＰＨＦの部分的精製品（純度
２０〜３０％）で免疫化した。ＰＨＦの量は２１０nmの
吸収で測定した。ＰＨＦを約１０μg含むペプチドのサ
ンプルを、ビアモンテスら（Ｊ．Ｉmmun．Ｍetho．９
４，１３−１７１９８６）に記載された方法により、ジ
アゾ結合によつてアミノフエニルチオエーテル含浸（Ａ
ＰＴ）ペーパーデイスクに結合した。２回蒸留した蒸留
水中の１０mg／mlのＮaＮＯ3溶液の０.３mlのアリクウ
オツトを１.２Ｎ塩酸の１０mlアリクウオツトに加え
た。ＮaＮＯ3／ＨＣlの０.３mlアリクウオツトを６mmＡ
ＰＴの各デイスクの上端に加え、デイスクを皿に載せて
４℃で３０分間振盪した。デイスクを冷蒸留水及び０.
２Ｍ ＮaＯＡcバツフアー（pＨ４）で洗浄し、乾燥し
た。次いでペーパーデイスクをフロイント完全アジユバ
ントに浸漬し、腹腔内に移植した。２週間で抗ＰＨＦの
力価をＥＬＩＳＡで測定し、デイスクをフロイント不完
全アジユバントを移植した以外は上記と同様にしてマウ
スに再接種（ブースト）した。力価をＥＬＩＳＡにより
１週間後調べた。マウスを２週間ごとにブーストし、サ
ンプルを下記ＥＬＩＳＡによりアツセイした。
２０〜３０％）で免疫化した。ＰＨＦの量は２１０nmの
吸収で測定した。ＰＨＦを約１０μg含むペプチドのサ
ンプルを、ビアモンテスら（Ｊ．Ｉmmun．Ｍetho．９
４，１３−１７１９８６）に記載された方法により、ジ
アゾ結合によつてアミノフエニルチオエーテル含浸（Ａ
ＰＴ）ペーパーデイスクに結合した。２回蒸留した蒸留
水中の１０mg／mlのＮaＮＯ3溶液の０.３mlのアリクウ
オツトを１.２Ｎ塩酸の１０mlアリクウオツトに加え
た。ＮaＮＯ3／ＨＣlの０.３mlアリクウオツトを６mmＡ
ＰＴの各デイスクの上端に加え、デイスクを皿に載せて
４℃で３０分間振盪した。デイスクを冷蒸留水及び０.
２Ｍ ＮaＯＡcバツフアー（pＨ４）で洗浄し、乾燥し
た。次いでペーパーデイスクをフロイント完全アジユバ
ントに浸漬し、腹腔内に移植した。２週間で抗ＰＨＦの
力価をＥＬＩＳＡで測定し、デイスクをフロイント不完
全アジユバントを移植した以外は上記と同様にしてマウ
スに再接種（ブースト）した。力価をＥＬＩＳＡにより
１週間後調べた。マウスを２週間ごとにブーストし、サ
ンプルを下記ＥＬＩＳＡによりアツセイした。
【００３９】プレートをトリスバツフアー（pＨ９.０）
中５００ng／mlＰＨＦの１００μl／ウエル（well）で
コートし、一晩放置しホスフエイトバツフアーサリーン
（ＰＢＳ）−ツイーン２０により洗浄し、次いでＰＢＳ
により３回洗浄した。プレートを次にＰＢＳ中０.２％
ゼラチンでコートし３７℃で３０分間培養しＰＢＳ−ツ
イーン２０で３回洗浄した。上記に記載したマウスから
得られた免疫された血清を加え（ＰＢＳ−ツイーン２０
の１％ゼラチン中１００μl／ウエル）（結果及び処方
は矛盾する）、プレートを室温で１時間培養し、次いで
ＰＢＳ−ツイーン２０で３回洗浄した。１％ゼラチンＰ
ＢＳ−ツイーン２０中のホースラデイシユパーオキシダ
ーゼ（１：２０００）を１００μl／ウエルの量で添加
し、室温で１時間培養し次いでプレートをＰＢＳ−ツイ
ーン２０で洗浄した。クエン酸１０ml、pＨ４、０.０５
Ｍの２,２'−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリン
スルホン酸）１００μl及び２０mg／mlの過酸化水素溶
液４０μlを混合して新しく作つた溶液を１００μl／ウ
エルの量で加え、室温で２時間培養した後、４０５nmで
測定した（Ｔiter−Ｔek Ｍulti Ｓcan）。結果を表
１〜２に示し、図１１及び図１２にプロツトした。
中５００ng／mlＰＨＦの１００μl／ウエル（well）で
コートし、一晩放置しホスフエイトバツフアーサリーン
（ＰＢＳ）−ツイーン２０により洗浄し、次いでＰＢＳ
により３回洗浄した。プレートを次にＰＢＳ中０.２％
ゼラチンでコートし３７℃で３０分間培養しＰＢＳ−ツ
イーン２０で３回洗浄した。上記に記載したマウスから
得られた免疫された血清を加え（ＰＢＳ−ツイーン２０
の１％ゼラチン中１００μl／ウエル）（結果及び処方
は矛盾する）、プレートを室温で１時間培養し、次いで
ＰＢＳ−ツイーン２０で３回洗浄した。１％ゼラチンＰ
ＢＳ−ツイーン２０中のホースラデイシユパーオキシダ
ーゼ（１：２０００）を１００μl／ウエルの量で添加
し、室温で１時間培養し次いでプレートをＰＢＳ−ツイ
ーン２０で洗浄した。クエン酸１０ml、pＨ４、０.０５
Ｍの２,２'−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリン
スルホン酸）１００μl及び２０mg／mlの過酸化水素溶
液４０μlを混合して新しく作つた溶液を１００μl／ウ
エルの量で加え、室温で２時間培養した後、４０５nmで
測定した（Ｔiter−Ｔek Ｍulti Ｓcan）。結果を表
１〜２に示し、図１１及び図１２にプロツトした。
【００４０】
【表１】
【００４１】
【表２】
【００４２】
【発明の効果】本発明において高血圧性哺乳動物のパラ
シロイドから得られる新規な循環性因子が単離され特定
された。この因子に対するポリクロナール及びモノクロ
ナール抗体はこの因子の存在をスクリーニングするのに
有用である。この因子は細胞内へのカルシウム取り込み
のコントロールに関与する。
シロイドから得られる新規な循環性因子が単離され特定
された。この因子に対するポリクロナール及びモノクロ
ナール抗体はこの因子の存在をスクリーニングするのに
有用である。この因子は細胞内へのカルシウム取り込み
のコントロールに関与する。
【図１】 実施例３におけるＳＨＲラツトのプラスマ溶
出プロフイールを示す。
出プロフイールを示す。
【図２】 （Ａ）はＳＨＲラツトから図１のプラスマサ
ンプルの逆相高速液体クロマトグラフイー（ＨＰＬＣ）
分離プロフイールを示す。（Ｂ）はＷＫＹラツトからの
プラスマのＨＰＬＣプロフイールを示す。
ンプルの逆相高速液体クロマトグラフイー（ＨＰＬＣ）
分離プロフイールを示す。（Ｂ）はＷＫＹラツトからの
プラスマのＨＰＬＣプロフイールを示す。
【図３】 細胞へのカルシウムのエントリーの機構及び
そのコントロールを示す概略図である。
そのコントロールを示す概略図である。
【図４】 ＳＨＲ，ＳＤ及びＷＫＹラツトから得られた
プラスマを持続注入されたＳＤラツトにおける平均動脈
血圧の変化を示す。
プラスマを持続注入されたＳＤラツトにおける平均動脈
血圧の変化を示す。
【図５】 ＳＨＲ，ＳＤ及びＷＫＹラツトから得られた
プラスマを単回注入されたＳＤラツトにおける平均動脈
血圧の変化を示す。
プラスマを単回注入されたＳＤラツトにおける平均動脈
血圧の変化を示す。
【図６】 ＳＤ，ＷＫＹ及びＳＨＲラツトからのプラス
マを含有するクレブスバツフアー中で培養されたラツト
テイルの動脈切片の45Ｃaの取り込みを示す。
マを含有するクレブスバツフアー中で培養されたラツト
テイルの動脈切片の45Ｃaの取り込みを示す。
【図７】 ＳＨＲラツトからモレキユラーイクスクルー
ジヨンクロマトグラフイーにより単離されたプラスマの
種々の画分を投与したＳＤラツトにおける平均動脈血圧
の変化を示す。
ジヨンクロマトグラフイーにより単離されたプラスマの
種々の画分を投与したＳＤラツトにおける平均動脈血圧
の変化を示す。
【図８】 （Ａ）はＳＨＲラツトからの甲状腺を伴う副
甲状腺（上皮小体）細胞からの培地の逆相ＨＰＬＣプロ
フイールを示す。（Ｂ）はＷＫＹラツトからの甲状腺を
伴う副甲状腺細胞培地の比較プロフイールを示す。
甲状腺（上皮小体）細胞からの培地の逆相ＨＰＬＣプロ
フイールを示す。（Ｂ）はＷＫＹラツトからの甲状腺を
伴う副甲状腺細胞培地の比較プロフイールを示す。
【図９】 （ａ）は１４ＫＤスタンダードを用いたＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥゲルスキヤンを示す。（ｂ）はＳＤラツト
の８時間培養後の甲状腺を伴う副甲状腺抽出物のゲルス
キヤンを示す。（ｃ）はＳＨＲラツトの８時間培養後の
甲状腺を伴う副甲状腺抽出物のゲルスキヤンを示す。
Ｓ−ＰＡＧＥゲルスキヤンを示す。（ｂ）はＳＤラツト
の８時間培養後の甲状腺を伴う副甲状腺抽出物のゲルス
キヤンを示す。（ｃ）はＳＨＲラツトの８時間培養後の
甲状腺を伴う副甲状腺抽出物のゲルスキヤンを示す。
【図１０】 （ａ）はスプラーグ−ダウレー甲状腺細胞
からの培地（１２時間培養）を通過したＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅゲルのスキヤンを示す。（ｂ）はＳＨＲラツトの４時
間培養後の甲状腺を用いた比較スキヤンを示す。（ｃ）
はＳＨＲ甲状腺の１２時間培養後の培地のスキヤンを示
す。（ｄ）は１４ＫＤスタンダードを用いたゲルスキヤ
ンを示す。
からの培地（１２時間培養）を通過したＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅゲルのスキヤンを示す。（ｂ）はＳＨＲラツトの４時
間培養後の甲状腺を用いた比較スキヤンを示す。（ｃ）
はＳＨＲ甲状腺の１２時間培養後の培地のスキヤンを示
す。（ｄ）は１４ＫＤスタンダードを用いたゲルスキヤ
ンを示す。
【図１１】 表１に示されたデータをグラフ化したもの
である。
である。
【図１２】 表２に示されたデータをグラフ化したもの
である。
である。
【図１３】 ＰＨＦプラスマ及び細胞培地の等電点電気
泳動ゲルを示す。
泳動ゲルを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 レーバンチユク リチヤード ゼツト カナダ国 Ｔ６Ｃ ０Ｘ７ アルバータ エドモントン 9636−81 アベニユー (72)発明者 ベニシン クリスチーナ ジー カナダ国 ＴＯＢ ０Ｅ０ アルバータ アルドツサン 218−53431 レインジ ロード 221 (72)発明者 カネコ トヨジ カナダ国 Ｔ６Ｇ ２Ｐ２ アルバータ エドモントン 115−11110−86 アベ ニユー (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/53
Claims (11)
- 【請求項１】 ａ）脊椎動物（ヒトを除く）にパラシロ
イド高血圧性因子（ＰＨＦ）を含有する溶液を注入する
ことにより脊椎動物にポリクロナール抗体を生じさせ、
ｂ）ＰＨＦに対する抗体を含有する血清を集め、ｃ）イ
ムノアツセイ法により血清サンプルをスクリーニングす
ることを特徴とするパラシロイド高血圧性因子の検出方
法。 - 【請求項２】 イムノアツセイ法が酵素リンクイムノア
ツセイである請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 イムノアツセイ法が酵素リンクイムノソ
ーベントアツセイである請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 イムノアツセイ法が免疫沈降アツセイで
ある請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 ａ）脊椎動物（ヒトを除く）にパラシロ
イド高血圧性因子を注入することによりパラシロイド高
血圧性因子に対する抗体を引き起こし、ｂ）免疫された
脊椎動物から抗体を分泌するＢ−リンパ球を単離し、
ｃ）上記抗体を分泌するプラスマ細胞をミエローマ細胞
と融合してハイブリドーマを形成し、ｄ）ＰＨＦ抗体を
分泌するハイブリドーマを選別及びクローニングし、
ｅ）上記抗体を分泌するハイブリドーマを増殖し、ｆ）
上記ハイブリドーマからモノクロナール抗体を単離し、
ｇ）上記モノクロナール抗体を用いてイムノアツセイ法
により哺乳動物の血液から得た血清サンプルをスクリー
ニングすることを特徴とする患者の血清中のパラシロイ
ド高血圧性因子の同定方法。 - 【請求項６】 イムノアツセイ法が酵素リンクイムノア
ツセイである請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 イムノアツセイ法が酵素リンクイムノソ
ーベントアツセイである請求項５に記載の方法。 - 【請求項８】 イムノアツセイ法が免疫沈降アツセイで
ある請求項５に記載の方法。 - 【請求項９】 上記哺乳動物の血液から得た血清につい
て請求項５に記載の方法により、パラシロイド高血圧性
因子の存在をテストすることからなる本態性高血圧症の
原因を同定する方法。 - 【請求項１０】 シングルパツケージに、ａ）固相に結
合したパラシロイド高血圧性因子に対する抗体、ｂ）酵
素でラベルされた抗パラシロイド高血圧性因子に対する
第２の抗体、ｃ）上記第２の抗体上の酵素ラベルのため
の基質及びｄ）パラシロイド高血圧性因子の標準溶液を
含有することを特徴とする哺乳動物血液中のパラシロイ
ド高血圧性因子の同定キツト。 - 【請求項１１】 シングルパツケージに、ａ）パラシロ
イド高血圧性因子に対する抗体、ｂ）上記抗体が付加す
る固相及びｃ）パラシロイド高血圧性因子の標準溶液を
含有することを特徴とする哺乳動物血液中のパラシロイ
ド高血圧性因子の同定キツト。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10368332A JP3037942B2 (ja) | 1998-12-25 | 1998-12-25 | パラシロイド高血圧性因子の検出及び同定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10368332A JP3037942B2 (ja) | 1998-12-25 | 1998-12-25 | パラシロイド高血圧性因子の検出及び同定方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2505860A Division JP2919607B2 (ja) | 1989-03-22 | 1990-03-22 | パラシロイド高血圧性因子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11258235A JPH11258235A (ja) | 1999-09-24 |
| JP3037942B2 true JP3037942B2 (ja) | 2000-05-08 |
Family
ID=18491556
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10368332A Expired - Lifetime JP3037942B2 (ja) | 1998-12-25 | 1998-12-25 | パラシロイド高血圧性因子の検出及び同定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3037942B2 (ja) |
-
1998
- 1998-12-25 JP JP10368332A patent/JP3037942B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH11258235A (ja) | 1999-09-24 |
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