JPH0384000A - 血管新生活性物およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、ヒト卵巣腫瘍細胞またはその樹立細胞（以後
ＨＵＯＣＡ−１１という）あるいは樹立したヒト卵巣腫
瘍細胞のサブクローニングにより得られたヒト卵巣１１
！瘍細胞（以後ＨＵＯＣＡ−ＩＨという）が産生ずる血
管新生因子を含む血管新生活性物およびその製造方法に
関する。

〈従来の技術〉 血管を構成する主要な細胞は、内膜の血管内皮細胞、中
膜の平滑筋細胞、それに外膜に存在する線維芽細胞であ
る。　また、末梢に存在する毛細血管は、内皮細胞のみ
によって構成されていると考えられている。　血管新生
の機序の詳細については不明な点が多いが、まず血管壁
マトリックスが溶解し、内皮細胞の増殖、遁走が起こり
、血管新生が始まると考えられている。

血管新生は、新しい組織・器官が形成される胎生期、戒
律における子宮内膜の周期的発達、卵巣における黄体形
成のような生理的現象や慢性炎症創傷治癒などの病理的
状態などで認められる。　また、腫瘍の増殖にも血管新
生が認められる。

血管内壁をおおう内皮細胞は、抗血栓性の維持、物質透
過の調節、血圧調節などの多くの生理的機能を有してい
る。　動脈硬化や心筋梗塞などの血管が関与する疾患で
は、血管を構成するこれら諸細胞の異常が認められてい
る。

ｉｎ　ｖｉｖｏでの血管新生実験系、例えば、ニワトリ
漿尿膜を用いた実験で、血管を新生する因子は数多く知
られている。　タンパク性因子で一般に知られている血
管新生因子に、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ；ａ
ｃｉｄｉｃ　ＦｉｂｒｏｂｌａｓｔＧｒｏ胃ｔｈ　Ｆａ
ｃｔｏｒ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；ｂ
ａｓｉｃ　Ｆｌｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａ
ｃｔｏｒ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ；Ｅｐｉｄｅｒｍ
ａｌ　ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ）　　血小板由来成長
因子（ＰＤＧＦ；Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ　
Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ）　　　トランスフォーミ
ング成長因子（ＴＧＦ；Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　Ｇ
ｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ）等がある。

〈発明が解決しようとする課題〉 しかし、これらの因子は、血管を新生する活性の他に、
他の種類の細胞の増殖も強く刺激することが知られてい
る。　例えば、ｂＦＧＦは、線維芽細胞、平滑筋細胞、
上皮細胞など幅広く細胞の増殖を刺激する。　このよう
に幅広く細胞を増殖させると、血管の新生は行なわれる
ものの、他の細胞を増殖させることによる副作用が生じ
るおそれがあるといった副次的問題が生じてくる。

本発明は、血管を新生する因子を用いた医薬・医療器を
目指し研究を重ねた結果、得られたもので、上述した従
来技術の問題点を解決し、血管内皮細胞の増殖を刺激し
、他の平滑筋細胞や線維芽細胞等の細胞の増殖をほとん
ど刺激しない血管新生活性物およびその製造方法を提供
することを目的とする。

ここで平滑筋細胞増殖活性および／または線維芽細胞増
殖活性をほとんど有していないとは、内皮細胞増殖活性
を示すのに必要な最小濃度においては平滑筋細胞増殖活
性および／または線維芽細胞増殖活性を有していないも
のと定義する。

すなわち上記の性質を有すれば、平滑筋細胞の増殖活性
および／または線維芽細胞の増殖活性がまったくないか
、あるいは活性があってもほとんど無視できる程度のも
のであるため本発明の血管新生活性物質を用いれば、内
皮細胞の増殖が首尾よく進行するものである。

すなわち、本発明は、ヒト卵巣腫瘍細胞またはその樹立
細胞（以下）１ｔｌＯＣ＾−ＩＩという）あるいは樹立
したヒト卵巣ｌ！！瘍細胞をサブクローニングすること
により得られたヒト卵巣腫瘍細胞（以下ＨＵＯＣＡ　−
ＩＩＩという）の培養上清から産出され、かつ塩基性を
示す血管新生活性物を提供するものである。

本発明の血管新生活性物は、内皮細胞増殖活性を有し、
平滑筋細胞増殖活性および／または線維芽細胞増殖活性
をほとんど有していないので、内皮細胞増殖用試薬とし
て有用である。

本発明の血管新生活性物は、ＩＩＩｌＯＣＡ　−ＩＩあ
るいはＩＩＩｌＯＣＡ　−ＩＩＩの培養上清を陽イオン
交換体に接触させて培養上清中の塩基性物質を付着させ
、ついで該陽イオン交換体を塩溶液で処理することによ
り、前記塩基性物質を溶出させることにより製造するの
が好適である。

以下に本発明の血管新生活性物およびその製造方法につ
いて更に詳細に説明する。

ヒト卵巣腫瘍由来樹立細胞はヒト卵巣腫瘍細胞より本発
明者である石渡、石川らにより樹立され、これは本発明
者らによって通商産業省工業技術院微生物工業技術研究
所に、平成元年３月１日に、受託番号、徴工研条寄第２
３１０号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２３１０）として寄託され
ている。　以下の説明では、上記のヒト卵巣腫瘍細胞ま
たはその樹立細胞を広＜　ＨＩＩＯＣＡ−１ｆ　トイう
。

本発明者らは、ＨＵＯＣＡ−１１およびその新生活性物
について研究したところ、ＨＵＯＣＡ−１１よりも高い
血管新生活性物質を分泌するヒト卵巣腫瘍由来樹立細Ｉ
ｌ！（以下）Ｉ　Ｕ　ＯＣＡ　−ＩＩＩ　）をＨｔｌＯ
ＣＡ−１１ノ”ｌ−ブクローニングにより見い出した。

　ここで、サブクローニングとは、）ＩＵＯＣＡ−１ｆ
を公知のシングルセルダイリューション法でより高い血
管新生活性物分泌能をもつ細胞を選択し、樹立された細
胞株を得る方法を意味する。

ＨＵ　ＯＣＡ　−ｍ細胞は本発明者らによって通商産業
省工業技術院微生物工業技術研究所に、平成元年３月１
日に、受託番号、徴工研条寄第２３１１号（ＦＥＲＭ　
ＢＰ−２３ｔ　ｔ）として寄託されている。

本発明の血管新生活性物は、ヒト卵巣腫瘍細胞またはそ
の樹立細胞（ＨＵＯＣＡ−１１またはＩＩＩｌＯ［：Ａ
−ｒｎ　）を培養することによってその培養上清中に産
生される。

ここで、本発明の血管新生活性物は、１（ＩＪＯＣＡ−
ＩＩまたはＨＵＯＣＡ−ＩＩＩによって産生されるもの
と実質的に同一である限り、細菌、酵母、動物細胞など
を用いる遺伝子操作の手法で製造されたものも広く含む
。

ＨＵＯＣＡ−ｒｒＩを培養し、その培養上清を得、これ
から例えば陽イオン交換により分別されたものを含むも
のが本発明の血管新生活性物である。

Ｈｔｌ　ＯＣＡ　−ＩＩＩの培養方法および条件など培
養に関する特別な制限はなく、−数的な培養方法を用い
ればよい。　しかし、精製の容易さという点では、最初
は牛胎児血清を含む培地で細胞を培養し、その後無血清
培地を用いて培養し、その培養上清から血管新生活性物
を得る方法が好ましい。

また、これら細胞の培養上清より、血管新生活性物を大
量にしかも効率良く製造する方法について検討を行なっ
た結果、ビーズを用いた浮遊培養法を用いることで、効
率良く大量に血管新生画分を得られることを知見した。

　ここでいうビーズによる浮遊培養法とは、担体として
のビーズに細胞を付着させ、この状態にてビーズを培地
中に浮遊させて細胞を培養する方法であり、担体として
作用するビーズを特にキャリアビーズという。　　ビー
ズとしては、ゼラチンマイクロキャリアビーズ、コラー
ゲンマイクロキャリアビーズ、アクリルマイクロキャリ
アビーズ、デキストランマイクロキャリアビーズなどを
用いることができるが、ゼラチンマイクロキャリアビー
ズが特に好ましい。

ゼラチンマイクロキャリアビーズは常法に従ってリン酸
緩衝液、ハンクス緩衝液などの中性緩衝液で膨潤させて
調製する。　培養に用いるゼラチンマイクロキャリアビ
ーズの大きさおよびそのばらつきは、細胞の接着、増殖
、分泌能をより高めるために、均一化するのがよい。

ビーズの大きさおよびそのばらつきを均一化するのは、
ナイロンメツシュ、ステンレスメツシュなどを用いたろ
適法、篩適法などの方法によればよい。

上記のような方法によりビーズの直径を１５０〜２３０
μｍにするのが好ましい。　このときビーズ直径のばら
つきをビーズの平均径に対し上２０〜±３０μｍとする
のが好ましい。　このようにビーズの直径を均一化して
やれば細胞のビーズへの接着が良好となり、さらに細胞
の増殖、活性の分泌が良好となるため好ましい。

そして、ビーズ数と細胞数の比は、ビーズ膨潤体積５±
１ｍＪＺ当り細胞７Ｘ１０’〜１．５×１０８個にする
のがよい。　この範囲をはずれると、細胞のビーズへの
接着が不良であったり、あるいは細胞の凝集、あるいは
接着、細胞の増殖・分泌が不良となるためである。

上述したようにしてヒト卵巣腫瘍細胞またはその樹立細
胞）１ｔｌＯｃＡ−１１またはＨｔｌ　ＯＣＡ　−ｍの
培養上清が得られる。

本発明においては、この培養上清を陽イオン交換体で処
理することにより培養上清中に含まれている塩基性物質
を分別する。　ここで、陽イオン交換体とは、培養上清
中の塩基性物質に対して親和性を示してこれを保持する
性質を有するものをいい、カルボキシメチル弱陽イオン
交換体（ｗｈａｔｍａｎ　ＣＭ−５２）　、スルホプロ
ピル強陽イオン交換体（ファルマシアＣＭ−ｓｅｐｈａ
ｄｅｘ　）などを代表的に挙げることができる。

また、この処理においては、陽イオン交換体を平衡化す
るＭ荷液の塩濃度はＯ，１Ｍ以下、ｐＨは５．０〜６．
０が好ましい。　ま　た培養上清を陽イオン交換体に接
触させるとき、酢酸等を用いてｐＨを５．０〜６．０に
調整するのが好ましく、また流速は２〜１０ｍｊ２　／
ｈｒ−ｃｍ−”　　温度は０〜１０℃が好ましい。

培養上清を陽イオン交換体に接触させた後、陽イオン交
換体に付着保持されている塩基性物質はＮａＣ１等の塩
溶液により陽イオン交換体から溶離する。

最も好ましい方法としては、ＯＭから２．　０ＭのＮａ
Ｃｊ２を含む中性緩衝液の直線濃度勾配により分別する
ことであるが、簡易的には２ＭＮａＣｆＬを含む中性緩
衝液でステップワイズに分別する方法もとられ得る。

このようにして得られた培養上清中の塩基性物質は、上
述したように、平滑筋細胞増殖活性、線維芽細胞増殖活
性をほとんど有していす、実質的に内皮細胞増殖活性の
みを有しているので、内皮細胞増殖用試薬として有用で
あり、血管特に毛細管を副作用なく増殖させるのに有効
である。

〈実施例〉 以下に本発明を実施例に基づいて具体的に説明する。

（実施例１） ＨＵＯＣＡ−１１およびＨＵ　ＯＣＡ　−ＩＩＩを個別
に２０％血清（１１％牛新生児血清、６％牛脂児血清、
３％馬血清）を含むＨａｍＦ　１２あるいはＭＣ０Ｂ　
１０７培地で培養し増殖させた。　培養は３７℃、５％
炭酸ガス条件下で行なった。　無血清培養上清を得るた
めにコンフルエントになった細胞を無血清のＨａｍＦ　
１２培地で培養した。　３日培養後培養上清を集め、血
管新生活性物の精製のための原材料とした。

このようにして得た）ｌＵＯｃＡｌｆおよびＩ（ＩＪ　
ＯＣＡ　−Ｉｌｌの培養上清を−１それぞれ酢酸でｐＨ
５，０に調整した後、１０ｍＭリン酸ＩＩｙｉ衝液（荷
液６．０）で平衡化した陽イオン交換体（ｓｐ−ｓｅｐ
ｈａｄｅｘ　Ｃ−５０：ファルマシア社製）を培養上清
１ｆｔ当たり５０ｍｆｔ加え、４℃で１６時間穏やかに
攪拌し、吸着処理を行った。

ついでこの陽イオン交換体をカラムに充填し、１０ｍＭ
リン酸Ｍ衝液（ｐ）（６，０）で洗浄し、２Ｍ　　Ｎａ
Ｃｊ！を含む１０ｍＭリン酸緩衝液を用いてワンステッ
プで溶出した。

このようにして得たＨＵＯ（：＾−！■およびＨＵＯ［
：Ａ−１１１の陽イオン交換体溶出画分の活性を次の３
つの方法により測定した。

■細胞数計測法 コラーゲンコーティング２４穴マルチプレート（コーニ
ング社製）に、２０％牛脂児血清入りＭＣＤＢ１０７培
地（極東製薬株式会社製）を用いて、ヒト・サイ帯由来
血管内皮細胞を１　ｘ　１０　’　ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ
の細胞密度でシーディングした（０．　５　　ｍＪＺ／
ｗｅｌｌ　）。　シーディングした翌日から、１日おき
にサンプルを含有する５％血清入り培地で４回培地を交
換し培養した。　シーディングしてから９日日にトリプ
シンで細胞を剥離し、その細胞数を血球計算盤を用いて
顕微鏡下にて測定した。

■［Ｈ’］−Ｔｙｍｉｄｉｎｅ法 ９６穴マルチプレート（コーニング社製）に、６０　ｔ
ｌ　ｇ　　／ｗｅｌｌのコラーゲン（新田ゼラチン株式
会社製）をコーティングし、これに血管内皮細胞を、４
　Ｘ　１０　’　ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの細胞密度で、■
と同様の培地条件にてシーディングした（１００　μｌ
ｌ　／ｗｅｌｌ）。　およそ１６時間後に５％血清入り
培地に交換し、さらにその２４時間後にサンプルを含有
する５％血清入り培地に交換した。　　１８時間培養後
、０．５μＣｉ　／ｗｅｌｌ）となるように［６−Ｈ’
ｌ−Ｔｙｍｉｄｉｎｅ　　（アマ−ジャム社製）を添加
した。　再び２４時間培養した後、細胞をディスパーザ
で完全に剥離し、細胞をガラスフィルターに集めた。

液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）に
て細胞中のＤＮＡに取り込まれた［６−Ｈ’］−Ｔｙｍ
ｉｄｉｎｅの放射活性を測定した。

■ニワトリ受精卵漿尿膜 （ＣＡＭ：　ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｌｃ　ｍｅｍ
ｂｒａｎｅ）法受精卵８日日のニワトリ受精卵を用い、
常法に従って漿尿膜上にサンプルを含浸させたガラスフ
ィルターを置き、加湿状態（３７℃）で３日間培養した
。　３日後血管新生を実態顕微鏡下で観察して判定した
。　判定は、強陽性（＋）、擬陽性（±）、陰性（−）
として、強陽性の率を算出した。

［）１３］−Ｔｙ＋ａｉｄｉｎｅ法には、各サンプルを
２阜位／　ｍ　ｆＬで使用した。　また、細胞数計測法
には５０単位／ｍＩＬ、ＣＡＭ法には１００阜位／ｍｌ
ｌ使用した。　その結果を表１に示す。

なお、ここで活性単位とは、精製の度合を示すために仮
に定義されたもので、ＥＣＧＳ（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａ
ｌ　　ｃｅｌｌ　　ｇｒｏｗｔｈ　　ｓｕｐｐｌｅｍｅ
ｎｔ）１　　μ　ｇ／　ｍ　Ｉｔが［Ｈ’ｌ−Ｔｙｍｉ
ｄｉｎｅ法で示す取り込み量と同等の取り込みを示す活
性量を１阜位と定義するものである。

表　　１　（ｓｅｐｈａｄｅｘ溶出画分の血管新生活性
）表１から明らかなように、ＨＵＯＣＡ−ＩＩおよびＨ
Ｕ　ＯＣＡ　−ＩＩＩの陽イオン交換体溶出画分は顕著
な血管新生活性を示すことがわかる。

さらにＨｔｌ　ＯＣＡ　−ＩＩＩから得られた陽イオン
交換体溶出画分を精製するために、限外ろ過器（アミコ
ン社製　ＹＭ５　　分画分子量５，０００）を用いて、
限外ろ過し、ＩＭ　　ＮａＣｊ２を含む１０ｍＪ！リン
酸緩衝液で平衡化した５ｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２００Ｈ
Ｒ（ファルマシア社製）でゲルろ過を行った。　ゲルろ
過は４℃、流速２０ａｉｌ　／ｈｒ　、　　２　１１１
ＪＺ　／ｆｒａｃｔｉｏｎで行った。　分子量標準タン
パク質としては、リボヌクレアーゼ（分子量１３７００
　）　　キモトリプシノーゲンＡ（分子量２５０００　
）　　オボアルブミン（分子量４３０００　）　、牛血
清アルブミン（分子量６７０００　）を用いた。　その
結果を第１図に示す。

活性は［Ｈ’］−Ｔｙｆｆｌｉｄｌｎｅ法で、各フラク
ションを５００倍希釈して測定した。　フラクションＮ
ｏ、２０〜３１に活性のピークが見られ、これは分子量
的３５０００〜２００００に相当することが判った。

このようにして得られたＨ　ＩＪ　ＯＣＡ　−ＩＩＩの
５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００ＨＲ活性分画を用いて
、ヒトサイ帯血管内皮細胞、ヒト真皮由来線維芽細胞、
ヒトサイ帯由来平滑筋細胞の増殖に対する活性を、前述
の細胞数計測法、［Ｈ３１−Ｔｙｍｉｄｉｎｅ法、ＣＡ
Ｍ法で比較した。　ヒト真皮由来線維芽細胞、ヒトサイ
帯由来平滑筋細胞は常法に従って分離・培養し実験に供
した。　その結果を表２、表３に示す。

表　　　２ （ＨＵＯＣＡ−ｍ　５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００Ｈ
Ｒ活性画分２車位／１ｔｒｌｌの［Ｈ’］−Ｔｙｍｌｄ
ｉｎｅ法による活性）表　　　３ （）ＩｔｌＯＣＡ−ｍ　５ａｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２０
０ＨＲ活性画分１００隼位／ＩＩＩＪ２の細胞数計測法
定よる活性） （ｃｅｌｔｓ／ｗｅｌｌ） 表２および表３から明らかなように、血管内皮細胞を増
殖させるのに十分な濃度においても、平滑筋細胞および
線維芽細胞に対してはほとんど増殖活性を示さないこと
がわかる。

また、ＨＵＯＣＡ−ｍ　　５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２
００８Ｒ活性画分１００車位７’　ｍ　ＪＺを用いてＣ
ＡＭ法にて活性を測定したところ、１０検体中５例に強
陽性が見られた。

さらに、ＨＵＯＣＡ−１１およびＨυＯＣＡ　−ＩＩＩ
の培養上清各々３Ｊ２から、上記実施例と同様にして５
ｐ−ｓｅｐｈａｄｅｘ溶出分画、５ｅｐｈａｃｒｙｌ　
Ｓ−２００ＨＲ活性分画を精製し、それぞれのタンパク
量、回収率を測定し、比活性を算出した。　なお、タン
パク量はＢｉｏｒａｄ社プロティンアッセイを用いて測
定した。　その結果を表４に示す。

表　　　４ （ｓｐ−ｓｅｐｈａｄｅｘ溶出画分及び５ｅｐｈａｃｒ
ｙｌ　Ｓ−２００ＨＲ活性分画の比活性）表４にて明ら
かなように、陽イオン交換処理、ゲルろ過処理により比
活性は増加し、精製されていることがわかる。

〈発明の効果〉 ヒト卵巣腫瘍細胞あるいはその樹立細胞ＨＵＯＣＡ−１
１およびＨＵ　ＯＣＡ　−ＩＨからサブクローニングに
より樹立されたヒト卵巣腫瘍樹立細胞ＨＵＯＣＡ−ＩＨ
の培養上清を陽イオン交換体に吸着させた後溶離した塩
基性物質は、血管新生活性あるいは血管の内皮細胞に対
する増殖活性を有する。

そして、それ以外の細胞たとえば線維芽細胞、平滑筋細
胞などに対しては増殖活性をほとんど有していない。　
ＨＩＩＯＣ＾−ＩＩＩ細胞およびその分泌物の血管新生
活性物は従来知られていす、その分泌物は高い血管新生
活性を有する種々の試薬あるいは治療薬として利用可能
である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＨＵ　ＯＣＡ　−ＩＩＩの陽イオン交換体溶
出画分をゲルろ過した結果を表す図である。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト卵巣腫瘍細胞またはその樹立細胞（以下ＨＵ
   ＯＣＡ−IIという）の培養上清から産出され、かつ塩基
   性を示す血管新生活性物。
2. （２）樹立したヒト卵巣腫瘍細胞をサブクローニングす
   ることにより得られたヒト卵巣腫瘍細胞（以下ＨＵＯＣ
   Ａ−IIIという）の培養上清から産出され、かつ塩基性
   を示す血管新生活性物。
3. （３）内皮細胞増殖活性を有し、平滑筋細胞増殖活性を
   ほとんど有していない請求項１または２に記載の血管新
   生活性物。
4. （４）内皮細胞増殖活性を有し、線維芽細胞増殖活性を
   ほとんど有していない請求項１ないし３のいずれかに記
   載の血管新生活性物。
5. （５）請求項１ないし４のいずれかに記載の血管新生活
   性物を含む内皮細胞増殖用試薬。
6. （６）ＨＵＯＣＡ−IIの培養上清を陽イオン交換体に接
   触させて培養上清中の塩基性物質を付着させ、ついで該
   陽イオン交換体を塩溶液で処理することにより、前記塩
   基性物質を溶出させることを特徴とする血管新生活性物
   の製造方法。
7. （７）ＨＵＯＣＡ−IIIの培養上清中の塩基性物質を付
   着させ、ついで該陽イオン交換体を塩溶液で処理するこ
   とにより、前記塩基性物質を溶出させることを特徴とす
   る血管新生活性物の製造方法。