JPH0383993A - 合成ｎ―連結複合糖質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、オリゴ糖ｔβ−アノマーコンフィギュレーシ
ョンを維持できる状態で誘導化して、合成Ｎ一連連結複
合糖類影形成せる方法に関する〇一般的に、炭氷化素は
、様々な接合体（たとえば蛋白質ｐよび脂質）に、Ｎ（
窒素）−グリコシドまたはＯ（［８）−グリコシド結合
のいずれかによって結合するＯ大部分の動物糖蛋白質は
、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ　）　（！
：アスノくラギン（Ａｓｎ　）の間のＮ−グリコシド結
合によってポリペプチドのバックボーンに結合するオリ
ゴ糖を含有しているＯ還元末端単ＩＩＣピラノース型）
とアスパラギンの間の糖蛋白質にひける窒素グリコシド
結合は、以下の式！に示すように、β−アノマーコンフ
イ’ｌｔ’ニレ−ジョンで６．ｂ。

遊離の還元末端七有するオリゴ糖は各種の植物および動
物源から単離できる０さらに、オリゴ糖は、糖蛋白質か
ら化学的または酵素的方法によって遊離させることがで
きる０これらの糖類は、還元末端単糖残基、通常は＋１
ｃＮＡｃまたはＧａ１ＮＡｃ（ｈ−アセチルガラクトサ
ミン）も持っている〇これらのオリゴ糖の誘導体は、基
礎研究ては天然に生存する複合糖物の炭水化物残基の機
能に関連した活性の研究、また臨床医学では診断医学な
らびに臨床薬理学シよび治療の分野での研究に有用であ
る０以下にこれらの有用な誘導体を列記する０ （１１，ｔｌＪゴ糖のビオチン接合体 （２）、ｔｌＪゴ糖のフルオレセント接合体（３）　　
オリゴ糖の脂質接合体 （４）オｌＪゴ糖のペプチド接合体 （５）オリゴ糖のアミノ酸接合体 （６）固体支持体（７ｔとえばアガロースゲルカラム、
シリコン薄片、ぺ）　１７皿等）への固定化オリゴ糖 （７）　　オリゴ糖の薬剤接合体 （８）オリゴ糖の色素園接合体 （９）　　たとえばカルボベンゾキシ（ｃＢｚ）！＊は
９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）保護
基のような１−Ｎ−保護グリコシルアミン誘導体 グリコシルアミンはまた、生物学的ｐよび医学的興味が
あるＮ−ヌクレオシド、グリコジルチオ尿素シよびグリ
コシルアミノ異項環の合成に有用な中間体でもある（た
とえば、Ｃａｒｂｏｈｙｌｒ、Ｒｅｓ。

１８８：３５〜４４．１９８８、およびそれに引用され
た文献を参照）Ｏ これらのオリゴ糖肪導体は、式■に示すように糖蛋白質
に生じるアスノくラギンと還元末端ＧｌｃＮＡｃの間の
結合（すなわちＧｌｃＮＡｃ　−４Ａａｎ　）が維持さ
れるように作成されるのが望ましい）Ｏすなわち、ピラ
ノース型とアスノくラギンのカルボニルｐよびメチレン
成分、β−アノマーコンフィギュレーションを保持する
ことが望ましいＯ式■は、２−アセトアミド−１−Ｎ−
（４’−Ｌ−アスノくルチル）−２−デオキシ−β−ｖ
−ｆルコビラノシルアミン（Ｇ：ＬｃＮＡｃ−Ａｓｎ　
）糖蛋白質にかけるＧ１ｃＮＡｃ→Ａ３１１結合の性質
上例示するものでらる０穴口は、 ＧｌｃＮＡｃ　−４Ａａｎ結合の特性１ｊｔ維持する誘
導体の化学的形態を例示的に示したものである０オリゴ
糖の誘導化に関してはこれｌで多くの方法が報告されて
いて利用できるが、それらは、１１ｃＮＡｃ−４Ａａｎ
結合の上述の所望の特性のナベてを維持するものではな
い０ オリゴ糖の誘導化についての従来法の一つでは、たとえ
ばＢｔｏｗｅｌｌ　＆　Ｌｅｅ　：　Ａｄｖ、Ｃａｒｂ
ｏｈｙｄｒ−Ｃｈ８ｎ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ１３７　：　２５′５〜２７９．１９８
０、とくに２４５Ｍに記載されているように還元アくノ
化を使用するものでらるＯしかしながら、ここに記載−
ｇｎた方法では、ピラノース型も還元末端単糖のアノマ
ー中心も、また以下の２つの例示的反応式から明らかな
ようにアスノくラギンのカルボニルとメチレン基も維持
されない口 オリゴ糖誘導体化の他の従来法では、ＰＣＴ国際特許出
願ｗｏ８８１０４３２３（１９８８年６月１６日公開）
に例示されているように、グリコシルアミンの直接誘導
体化によって複合糖質が形成されるｏＣｆ′Ｌらの方法
では還元Ｇ１ｃＮＡｃのピラノース型は維持されるが、
β−アノマーコンフィギュレーションは必じしも維持さ
れず（生成物は混合物が得られる）、以下に例示する式
■の生成物から明らかなようにアスパラギンのカルボニ
ル釦よびメチレン基も維持さｎ□いｏしかも、この方法
は糖蛋白質に付着したＮ一連結オリゴ環にしか適用でき
ず、その使用は限られたものである０グリコシルアミン
の直接誘導化による 複合糖質の形成 発明の詳細な説明 本発明ハ、β−アノマーコンフィギュレーションを保持
する条件下にオリゴ環を誘導体化して合成Ｎ一連結複合
糖質七形成させる新規な方法を提供する。上記オリゴ環
のグリコシルアミン誘導体上、所望のＮ一連結複合糖質
の生成に先立って、中間化合物としてハロアセチル化誘
導体に変換することによシ、β−アノマーコンフィギュ
レーションが実質的に保持できることが見出さｊＬｆｃ
ｏハロアセチル化誘導体は好１しくはクロロアセチル化
誘導体である０グリコシルアミンのハロアセチル化誘導
体への変換は、グリコジルアミ／にハロアセチル基を与
えることができる試薬との反応によって実施できる０本
発明によれば、任意の還元単糖または還元単糖ヲ有する
多糖が誘導体化できる０ 本発明の他の好ましい態様によれば、オリゴ環の誘導体
化には以下の全三工程法が使用される０１）還元末端単
糖のピラノースｅ＞よびβ−コンフィギユレーションが
保持されたオリゴ環のグリコシルアミン誘導体（通常Ｇ
ｌｃＮＡｃ　）の合成２）グリコシルアミンのノ・ロア
セチル化誘導体の合成０この合成工程では、グリコシル
アミンのβ−コンフィギユレーションに変旋光七生じて
はならない０ ３）ハロアセチル化誘導体の、合成的に有用な中間体ま
たはハロアセチル化グリコシルアミンと接合体の直接誘
導体化のいずれかへの変換本発明の方法にかいては、ハ
ロアセチル化は、グリコシルアミンを過剰の無水クロロ
酢酸（対称ジクロロ酢酸無水物ともいう）と反応させる
ことによって行うのが好！しい０ブロモジよびヨード誘
導体の場合には、酸のＮＨＳエステルたとえばｌＣａ２
ｃｏｏｈａｓ　ｋ使用することができるＯ好ましくは、
少なくとも５倍モル過剰、丸とえは５〜１０倍過剰のＮ
−アセチル化試薬が使用ぢれるＯ無水クロロ酢酸の使用
により、約９８〜９９％がβ−アノマーコンフイギュレ
ーション紮維持した中間体上生成することが見出さｎた
０これは従来技術、たとえばダンシルクロリド乞使用し
た場合、かなシの量のα−アノマー生成物との混合物が
得られるのに対比して驚くべきことである０無水クロロ
酢酸はアミノ酸のＮ−アセル化試薬として公知であり、
會たハロゲン脂肪酸のアンモノリシスによるα−アミノ
酸の製造法も知られているがＣ０ｈｓｒｏｎｉｓ　＆　
Ｓｐｉｔｚｍｕｅｌｌｅｒ　：　、ｒ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ
、Ｓｏａ、。

６１：３４９〜３７５．１９４１）、本明細書に記載し
たような、そのグリコシルアミンとの高いＮ−特異的反
応性、およびＮ一連結オリゴ環の生成にかケるβ−アノ
マーコンフィギュレーションの保持は全く予想できない
ものであった。

全３工程にひける、最初のオリゴ環のグリコジル化は、
オリゴ環を飽和炭酸水素アンモニウム中、わずかにアル
カリ性の〆】、約８〜８．５、好ましくは約−８，３で
インキエペーションして行うのが好ましい０これらの条
件下でのグリコジル化はβ−アノマーコンフィギュレー
ションのグリコシルアミンを生成する。

上述のようなハロアセチル化反応に続いて、所望のハロ
アセチル化グリコシルアミン中間体は、上述のような様
々のＮ−グリシル−グリコシルアミンまたはＮ一連結複
合糖質の合成に使用することができる０たとえば、オリ
ゴ糖の螢光性接合体は、Ｎ−グリシル−グリコシルアミ
ン中間体と螢光団たとえばフルオレセインまたはローダ
□ン誘導体の反応によって作成できる０ 複合糖質の形成に先立って、グリコシルアミンの中間ハ
ロアセチル化誘導体を生成させるために、ハロアセチル
供与試薬を使用することが本発明の必須条件である０酸
クロライド、酸無水物または、ｐａτ国際出鵜ｗｏ　　
８８／’０４３２３号に開示されているような他の活性
アシル化合物のようなトラッピング試桑七用いたグリコ
シルアミンの直接誘導体化は、β−アノマー戯の複合糖
質を高収率に製造する実用的な方法ではないことが明ら
かにされた０また、酸クロリドは糖のヒドロキシ基と反
応し、すなわちＮ−’！？異的誘導体化試薬ではなく、
＃氷酢酸はグリコシルアミンの合成的に無用な誘導体を
生成する０ 本発明を形成する主題は、特許請求の範囲にとくに指摘
され、明瞭に請求さ−ｎたとシシであるが、以下に本発
明の好ましい態様について、添付の図面を参照しながら
、詳細に説明するＯこれによって、本発明の理解が容易
になるものと確信するＯ図中、 第１図は、グリコシルアミンの変旋光）よび加水分解の
一依存性を示すグラフである（工５ｂｅｌ’ｌ　＆Ｆ’
ｒｕｅｈ　：　、Ｔ、Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、、　２５　１
３０９　）　。

第２図は、凍結乾燥時のオリゴ糖からの炭酸水素アンモ
ニウムの経時的消失七本すグラフであるＯ第３図は、本
発明の一態様にかいて、オリゴ糖の飽和炭酸水素アンモ
ニア甲でのインキュベーション時のグリコシルアミンの
生成速度（Ｈ１７’０トンの上方領域への経時的シフト
％）を示すグラフである０ 第４図は、第３図のグリコシルアミンのクロロアセチル
化によって得らｒｔた生成物のＨＰＩＪＯ溶出像（結合
アミノ相ＨＰＬＯからのクロロアセチル化生成物の溶出
）を示すグラフであるＯ 第５図は、第４図のクロロアセチル化グリコサミンのア
ンモノリシスからの生成物のＨＰＬＯ溶出像（結合アミ
ノ相１１１Ｐ’ｆ、Ｏからのアンモノリシス生成物の溶
出）を示すグラフである０ 第６図は、第５図にかける第２のアンモノリシス反応（
１−アミノ−０１ＯＮＡＱのクロロアセチル誘導体のア
ンモノリシス）の完結を示すグラフでらる０ 第７図は、本発明の他の態様にかけるＮ−アセチルグル
コサミンＯＮ−グリシル−グリコサミン誘導体のフルオ
レセイン誘導体の逆相ＩＩＰＬＯ溶出像（５５０ｎｓ２
逆相ＨアＬａからのグリシル−〇１ｃＮＡｃのフルオレ
セイン誘導体の溶出）を示すグラフである〇 本発明の方法に使用されるオリゴ糖は、様々な植物）よ
び動物材料から単離ｌたは誘導できる０たとえば、 （１）和製糖蛋白質シよび環ホルモン （２）全血清シよびその分画 （３１生物学的分泌物たとえば尿、乳汁、胎便、粘液、
初乳および類似物質 （４）　　全臓器たとえば、腎臓、肝臓、心臓、肺臓、
膵臓、肺臓 （５）植物の幹および葉抽出物 （６）種子 （７）　レクチン、ならびに （８）　　エムルゾン を挙げることができるＯ このような植物および動物材料からのたとえばヒドラゾ
ン分解のような化学的手段によるオリゴ糖の遊離は、米
国特許第４．７１９．２９４号釦よび第４，７３６，０
２２号ならびにＴａｋａｓａｋｉら：　Ｍｅｔｈ。

Ｋｎｇｙｍｏｌ、、　８３　：　２６３〜２６８．１９
８２に記載されている０ 酵素的方法によるオリゴ糖の遊離の例には、Ｈ１ｒａｎ
ｉら：　ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ、、　１６２　：’　
４８５〜４９２．１９８７に記載されているようなＮ−
グリカナーゼを用いる方法があるＯ β−アノマーコンフィギュレーション’Ｔｈｆａ持ｆる
条件下での全３工程法によるオリゴ糖の誘導体化、合成
Ｎ一連結複合糖質の生成上以下に詳細に説明する０ 本発明の以前には、グリコシルアミンの合成に適当な一
般的方法はなかつ７’ＣＯ 以下の方法が以前に報告されている。

ｔグリコジルアシドを経由するグリコシルアミンの製造
方法（Ｇａｒｇ　＆　Ｊｅａｎｌｏｇ　：　Ａｄｖ、０
ａｒｂｏｈ％。

Ｏｈｅｍ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　４３　：　１３５〜１
３９．１９８５；Ｏｏｗｌｓｙら：　０ａｒｂＯｈｙｄ
ｒ、Ｒｅｇ、＊　１９　：　２３１〜２４１．１９７１
　；＞よびＮａｋａｂａｙａｓｈｉら：同誌、１７４　
：　２７９〜２８９．１９８８）２メタノール性アンモ
ニアを用いるグリコシルアミンの製造方法（Ｆ’ｒｕｓ
ｈ　＆工ｅｂｅ１１：　Ｊ、Ｏｒｇ。

Ｏｈｅｍ、、　２３　：　１３０９　、１９５８　；　
ＩＦｒｕｓｈ　＆工ａｂｅｌｌ　：　Ｊ、Ｒｅｓ、Ｎａ
ｔｌ、Ｂｕｒ、５ｔｄｓ、、　４７　（４）　：２３９
〜２４７．１９５１）ｏこの方法は、この溶媒系に不溶
のため、また還元性末端Ｎ−アセチルグルコサミン残基
が０２で塩基触媒エビモル化を受けやすく、また１−３
連結核フコースのβ−離脱のため大構造には適用できな
い０ ６、飽和炭酸水素アンモニウム上用いる糖とアンモニア
の１工程縮合（Ｌｉｋｈｏｓｈｅｒａｔｏｖら：０ａｒ
ｂｏｈｙｄｒ、Ｒｅａ、、、　１４６、ａｉ〜ａ５．１
９８６）４、ａＪ蛋白質ヲβ−アスパルチルグリコシル
アミンアミドヒドロラーゼと反応させる酵素的方法ＣＩ
’ＯＴ国際特許出願、ｗｏ８８１０４３２３）−膜内な
ｔＲ酸７？Ｃ素アンモニウム法の改良洗上ここでは使用
する０単糖とアンモニアの縮合によるグリコシルアミン
の生成は、上述のように、Ｆｒｕｓｈ　＆工ｇ’ｂｓｌ
ｌによって詳細に掴究されている。

この反応は、非環状アンモニウムイオン（シック付加物
）を経て進行し、ついで再び環化してグリコシルアミン
４与えるものと考えられ、ている０Ｌｉｋｈｏｓｈｅｒ
ｓｔｏｖらはｌ５ｂｅｌｌ　＆　Ｆｒｕｓｈによって用
いられたメタノール性アンモニアではすく、アンモニア
源として炭酸７Ｘ素アンモニウムに便用している０この
方法は、この水性系に大きなオリゴ糖でも溶解するとい
う利点がある。アンモニウム塩では、アンモニア分子が
２個のグリコシルアミン分子の間に分配されてビスグリ
コシルアミンの生成が増大するが、糖の濃度を低下させ
ることでこの副反応ｒｅ小眼にすることができる０グリ
コシルアミンは急速な開環転位を受け、これらの結果は
強く−に依存する＠ｐＨ８，［］以上では、工５ｂｅｌ
ｘ　＆　Ｆｒｕｓｈ　：　Ｊ、Ｏｒｇ、Ｏｈｅｍ、、　
２３　：　３０９．１９８５によって示されたように、
平衡はβ−型に偏して急速に変旋光する（第１図参照）
０グリコシルアミンはわずかに酸性なｐＨ（約４．５）
では速やかに加水分解される（第１図参照）０このよう
な化学的性質の結果として、後処理操作）よびその後の
合成反応は、−膜内酸触媒側木分解（？！。

１図に示した逆の反応順序による）と平衡金保ち、反応
性求核試薬として（すなわちプロトンが引抜かれた形に
）維持；れるように、適当に緩衝化てれなければならな
い〇 したがって、グリコシルアミンの生成訃よび得られる収
率ば、出発原料の糖の副反応を最小限にする穏和な塩基
性条件の使用、υよびアミンの加水分解金触媒する酸性
条件の回避に依存する０さらに、塩基触媒によって起こ
る可能性のあるＣ２でのエピメリ化、ｐよびβ−離脱の
発生は、反応を穏和なアルカリ性−１約８〜８．５、好
１しくは約８．３で行えば、最小限にすることができる
０Ｌｉｋｈ０８ｂｅｒ８ｔＯｖらの一膜内炭＃Ｘ素アン
モニウム洗上要約すると、次の反応図で示すことができ
る０ Ｌｉｋｏｅｈｅｒｓｔｏｖらの方法によるグリコシルア
ミンの製造 オリゴ糖を飽和炭酸水素アンモニウム甲３０℃でＩＰＪ
４〜５日間インキュベート 等容の水ｔｍえ、最初の容量に急速に蒸発とせ（６回反
復）、４℃に冷却 ↓ Ａｍ’ｂｅｒｌｙｓｔ　１５陽イオン交換樹脂で−６，
０の酸性とし カラムに注ぎ、 １）木で出発原料の糖を浴出し ２）　（１，５Ｍメタノール／アンモニアでグリコシル
アミン七溶出し ↓ 溶出液を蒸発させ、グリコシルアミンを結晶化させる 著渚らは、この方法が簡単な単＃ｌｈよび複環のグリコ
シルアミンの製造に有効で収率は６０％と述べているが
、本発明者らは、報告された操作を用いては、その収率
上再現することができていないｎ以下のような事実が観
察さｆ″した０（１）グリコシルアミンの加水分解はわ
ずかに酸性のＰＨでもきわめて迅速であるので、反応混
合物の酸性化は深意深く制御しなければならない（第１
図参照）０この工程は少量のオリゴ糖サンプル（分析規
換）では制御が困難である０ ＜２７使用されるＡｍｂｅｒｌｙｓｔ交換樹脂はメタノ
ール性アンモニア溶出液甲で不安定である０完全に洗浄
しても、樹脂が溶解して、変色がみられたＯＡｍｂｅｒ
１７ｓｔ樹脂の性質ｔさらに検討したところ（以下の実
験の部参照）、報告されている条件下ではグリコシルア
ミンを定量的に溶出できないことも明らかにされた。他
の樹脂、ＡＣ）５０Ｘ１２（Ｈ＋）についても試験した
が、これも酸性のｐＨではグリコシルアミンを強力に結
合した。Ｎ　−７セチルグルコサミンの簡単なグリコシ
ルアミンは、この樹脂のカラムから定量的に溶出させる
ことはできなかった。

実験の部 飽和炭酸水素アンモニウムの酸性化を、ＬｉｋｌｃＯｅ
ｈｅｒｓｔｏｖらの方法に従って実施し７′ｃＯ穏和な
酸性ｐＨでの加水分解はきわめて迅速であるので（上記
参照）、これは注意深く制御しながら行われた０ 溶出実験では、’Ｈ−Ｇ１ｃＮＡｃ　を再飽和炭酸水素
アンモニウム２００μＪ（５６０μＫｑ　）を３０℃で
４日間インキュベートし、ついで、予め１０カラム容量
のＩＭＥＩＭ、１０カラム容量の０．５ＭＭｐＯ！Ｉ　
／　ＮＨ３、続いて２０カラム容量の水で完全に洗浄し
たＡｍｂｅｒｌｙｓｔ樹脂４００μＪ（６００μＥｑ　
）のカラムに適用した０結合しない糖（遊離Ｎ−アセチ
ルグルゴサミン）は１０カラム容量の水で溶出し、蒸発
乾固してカウントした０結合したグリコシルアミンは第
１表に示すように、様様な濃度のアンモニア／メタノー
ル４用いて溶出した０浴出液を乾燥し、カウントした。

第１表には、これらの溶出液を用いて樹脂から溶出され
た結合単糖のｆｔｋ示す。これらのデータから、アミン
の大部分の分画が樹脂に強力に結合したままであること
がわかる０この相互作用の本質については明らかでない
。

第１表：　Ａｍｂｅｒｌｙｇｔ　１５樹脂からの”Ｈ−
Ｎ　−アセチルグルコサミンの溶出 結合多 ８３．５％ ７１．４％骨 ５０．８優畳 ３９．９％骨 ３６．０嘩脣 遊離優 １５．５％ 溶出液 水 ０．５Ｍ １．０Ｍ ２．０Ｍ ４．０Ｍ 脣水で溶出しなかった物質の多 これらの問題から、零発明者らは、オリゴ糖グリコシル
アミンに一般的に（分析用にも製造用にも）適用できる
他の単離万かの開発上意いだ＾混合物からの炭酸水素ア
ンモニウムの完全な除去が主たる問題である。上述の結
果から、イオン交換樹脂からのグリコシルアミンの定量
的な回収は不可能と考えられる０より大量のグリコシル
アミンの脱塩は単純に、ゲル濾過クロマトグラフィｆ用
い京で浴出することにより実施できるが、一般に次のよ
うな問題が生じる。すなわち、（１）グリコシルアミン
の氷中でのカ０水分解、（２）　　オリゴ糖はカラムマ
トリックスと相互作用して非定量的回収が起こる。

本発明者らは、メタノール七約９０容量嘩まで加えるこ
とによって、グリコシルアミンの刀ＯＸ分解七生じるこ
となく、かなりの愈のアンモニウム塩金除去できること
ケ見出した０これは、この塩の溶解度乞２２０■／ｄ（
２０°０）から約０．０１■／　ｔｉｌに低下させる０
沈殿した塩は濾過し、洗浄して表面に結合したＭを回収
できる０残った塩は凍結乾燥によって除去できる０少量
のオリゴ糖サンプルの場合は、実際には直接、反応混合
物を凍結乾燥できることも明らかにされた０ 例１ 飽和炭酸水素アンモニウム中のオリゴ糖サンプル（通常
５０〜１００μｌ）を１１！！ｌに希釈し、ドライアイ
スでシェル凍結した０次にこれ七室圧１０８５パールで
凍結乾燥した０第２図には炭酸水素アンモニウムの経時
的な消失を示す０実務的には、水の添加シよび凍結乾燥
の６時間反復サイクルによって炭酸７Ｘ素アンモニウム
の除去上加速できる（データは示していない）０凍結乾
燥終了後、サンプルは乾燥剤の存在下に一２０℃で保存
する。

これらの条件で少なくとも１力月間は安定であることが
明ら加にさｆした０以下に記載するようにｌＨ−ＮＭＲ
スペクトルて測定したその生成率を第３図に示す。この
ゲルコサ宅ンはピラノース型で、α／βアノマー比は約
１：２４である０グリコシルアミンのＩｍ！−ＮＭＲス
ペクトル還元糖からのグリコシルアミンの生成はｌＨ〜
船スペクトルで追跡できるｏ８ｉのアンモニアとの縮合
は、遊離糖のアノマープロトンの消失、および立体配置
的に（４Ｃ１コンフイギユレーシヨン）よう安定なアノ
マーであるグリコシルアミンのβ−アノマーに基づく主
共鳴の出現によって示されるＯＮ−了セチルグルコサミ
ンでは、遊離糖のアノマープロトンは、　　５．１９　
ｐｐｚ　（α）および４，７０　ｐＩ）ｍ（β）で共鳴
し、その場合のＪｌｐ＊はそれぞれ約５．５Ｈｚｂよび
Ｐ′：Ｊ８　Ｅｚであることが見出された〇グリコシル
アミンは主共＠　ｋ　４．１５　ｐｐｍに示し、約８　
ＨｚのＪｌ、２値から、こｎはβ−アノマーと同定でき
た０他の微小成分も＊Ｂされ、そのひとつはα−アノマ
（４，３９１）ｐｍ％　Ｊｌ、２約４．７　Ｈｚ　）で
ある（α／β比１：２４）。

実験の部 Ｇ４ｑＮＡａ　、　Ｇ４ｃＮＡａβ１４４Ｇ１ｑＮＡｃ
　釦よびＧａｌ／１　→４Ｇ１ｃＮＡｃβ１−＋　２Ｍ
ａｎα１−６（Ｇａｌβ１−４Ｇ１ｃＮＡｃβ１→２Ｍ
ａｎα１−ｈ３）Ｍａｎ）１　→４Ｇ１ｃＮＡａβ１−
４ＧｌｃＮＡｃのサンプルを炭酸７Ｘ素アンモニウムを
用いて誘導化し、２４時間時のサンプルを採取し、凍結
乾燥した〇これらをついで、Ｄ２０　（９９，９６ａｔ
ｏｍ　）中で交換し、１Ｄ−スペクトルを得た０アノマ
ー領域の全体を取ｐ、メチル領域と比較して、各種の百
分率を得た０得られた結果を第３図に示す０これらのデ
ータは、糖とアンモニアの縮合が室温で３〜４日後には
完結することを示唆している。

工程２．グリコシルアミンのハロアセチル化ハロアセチ
ル化は、以下の反応式に例示するように、グリコシルア
ミン七たとえば無水クロロ酢絨と反応させることにより
実施した。

ブロモおよびヨード誘導体の場合には、酸のＮ１３−エ
ステルが、工ＯＨ，Ｃ００ＮＨ８を用いる場合は以下の
反応式で例示されるように、使用できる。

例２ １４（）−ラクトシルアミン（０，３２ｍｏｉ　／　ｍ
ｍｏｌｅ）は炭酸水素アンモニウムとの縮合によって製
造した０上記工程１１Ｃ記載したようにアンモニウム塩
妃除去したのち、サンプルｆ　１−　ＯＭ　Ｎ！ＬＨＯ
Ｏ３に再Ｍ濁し、５倍モル過剰の対称ジクロロ酢酸無水
物（Ｆｌｕｋａ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　）　’（加
えてりｏロアセチル化した０室温で２時間インキエベー
トシタのち、２回目の塩基と無水物を加えた０さらに６
時間後に、混合物ｋ　Ａ　Ｇ　５０−　Ｘ　１２　（Ｈ
”）とＡＧ３−Ｘ　４　Ａ　Ｃ０Ｅ−）イオン交換樹脂
の混合床に通した〇溶出液を集めて蒸発乾固した０反応
生成物の分離はＭｅｌｌｉｓ　＆　Ｂａｅｎｚｉｎｅｒ
　：　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１３４　：４４
２．１９８４の記載に従い、イオン抑制アミン吸収ＨＰ
Ｌ○によって実施した０反応生成物を、ＭｅＯＮ　９０
％／　５０　ｍＭ　）リエチルアくン酢酸塩（Ｔｌ！ｔ
ＡＪ緩衝液、−５，５含有木１０％に再懸濁し、同じ緩
衝液で平衡化したＶａｒｉａｎ　Ｍｉｃｒｏｐａｋ　Ａ
Ｘ　５カラムに注入した０溶出は、平衡条件に５分間保
持したのち、ＴＥＡ緩衝液の２１１分勾配を用いて行っ
たＯ放射性生成物は、　Ｂｅｒｔｈｏｌ　ＬＢ　５０５
　ＨＦＬＯ放射能モニターを用いて検出した口実型的な
検出像を第４図に示すＯ放射性分画？！−集め、乾燥し
たＯ以下に示すように、１−アミノクロロアセチルグリ
コシルアミンのＮＭＲ分析による％徴は、グリコシルア
ミンがハロアセチル化後もなお、β−アノマーコンフィ
ギュレーションが優位でα／βは（１：２４）であった
ことを示した０これは、以下に示すように、グリコシル
アミンのたとえばダンシルクロリドによる直接誘導化で
、変旋光を生じた場合と対照的である０ １−アミノ−Ｎ−アセチルグルコサミンのＮ−クロロア
セチルか工びＮ−アセテルーグリシル誘導体のＩＢ−知
ＭＲ分析 １−アミノ−Ｎ−アセチルグルコサミンのサンプル七Ｎ
−クロロアセチル化しｆｃｏインキュベークヨン期間終
了後、混合物ｔ−ＡＧ５０ｘｘ１２＞よびＡＧ３−Ｘ４
Ａイオン交換樹脂の混合床に通した０次に溶出液を減圧
下に蒸発乾固し、凍結乾燥した０こｒｔ、ｔついで、Ｄ
２０甲で２回交換し、１−　Ｄ　”Ｈ−ＮＭＲ分析に付
したＯ得られたスペクトルは、アノマー領域に４個の別
個の糖成分の存在七本した０これらは、遊離ｗ１カよび
Ｎ−クロロアセチル誘導体のα−Ｍ＞よびβ−型である
Ｏこれらの４種について全体を検査した結果、クロロア
セチル瞳尋体の生成の総状率は約７５多、その割合はＩ
−アノマーが多（，２４：１であったＯ仄に鶴合物を５
０℃でアンモノリシスに付し、反応の時間経過を追跡す
るためにＡＧ５０Ｘ１２−結合アンモ１を使用したＯグ
リシル誘導体をついでＣＭ−８ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａ
ｓｔ　ＩＦ’ｌｏｗの短いカラム上でＪｔ製し、最初は
水で次に０．５Ｍ＊ｉ＠アンモニウムで浴出し１ｃｏこ
の塩で浴出した物質をプールし、蒸発させて壇上除去し
たＯ仄に、混合物上飽和炭酸水素ナトリウム中無水酢酸
七用いてＮ−アセチル化し、ＡＧ５０／Ａｅ３樹脂七用
いて脱塩し７ＣＱ生戒物’ｊｉ　ＮＭＲ分析のために２
分した〇−万の半分は乾掬してＤ　Ｍｈｏ−＋１５　（
Ａｌｄｒｉｏｈ）甲に再溶解し、他方はＤ２０甲で交換
して、上述のように分析したＯＤＭＢＯ中で侍らｆした
スペクトルの部分には、通常はＤ２０甲で交換される下
方領域ＮＨプロトンを示した。７，８４シよび７．８８
　ＰＩ）Ｉｎに２ける２本の二重線は、４．５５　ｐｐ
ｍ　（Ｈ１の三重共鳴）の照射によるスピン説結合に基
づ＜ｈＨｌ＞よびＮＨ２に帰属できるＯ第三の共鳴、８
．０９　ｐｐｍ　Ｋ　＞ける三１線は「グリシン」アセ
トアミド基のＮＨＫ帰属された。この共鳴の照射が、グ
リシンスペースの２１向のメチレンプロトンに帰属され
る３、４（：ｌ−よひ３．６０　ｐｐｍの間の共鳴の摂
動を生じるＯ最後に、２本よく分離されたメチルの共鳴
が１−７０＞よひ１．８０　ｐｐｍ　Ｋある０ ルオレセイン窮導体） １−アミノ−２−アセトアミド−１，２−Ｖｆオキシ−
Ｄ−グルコピラノシル−アミンとンメチルアミノナ７タ
レンスルホ二ルクロリド（ダンシルクロリドノの間の反
応は、Ｇｒａｙの方法（Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚ、　、ＸＸＶ、１２１．１９７１）の改良法にヨ
ッて実施した０このアくン１０μｍｏｘｅを０．５ＭＮ
ａＨＯＯ３２００μｊに溶解した０次に、２４．５■の
ダンシルクロリドを含むエタノール２００μｊｔ攪拌下
に加え、反応を室温で２時間進行させ九〇沈殿した炭（
！！水素ナトリウムをわずかに含む褐色の溶液が得らｌ
ｒしたｏ１００μｊの木を加えて沈殿を＃解させたのち
、生成物は、Ｂｐｂｅｒｉ日ｏｒｂ８５０ＤＳ２８ｒカ
ラム（８，ＯＸ　３００１１１１）上逆相りロマトグラ
フィー七用いて分離し、ＵＶ（２５８ｎｍ）および螢光
検出（励起光：　３５６　ｎｍ−発光：５６６ｎＸｎ）
ｋ用いて検知しｆｃｏカラムからの分画を集め、５０μ
ｌのサンプルを取りカウントしたＯ放射能を含む分画上
プールし、蒸発乾固し、水１１Ｉｌｊに再懸濁し、カウ
ントして収率を求めたＯこの方法で得られた典型的な収
率は、出発した糖に基づいて１０〜１５１である０ この方法で得られたダンシル−アミノ糖を凍結乾燥し、
ついで２回Ｄ２０　（９９，９６ａｔｏｍ　）甲で交換
したのち同じ溶媒に再溶解してＮＭＲ分析用に準備しｚ
ｒｓ　Ｂｒｕｋｅｒ　５００　ｓｚスペクトロメーター
を用いて、１−ＤＰよひ２−Ｄ分析を実施した０この誘
導体の１Ｄスペクトルは、特徴的な下方領域の芳香族共
鳴と、よく分離された芳香族、骨格訃よびアセトアミド
メチル領域上用したＯこの誘導体は、未反応グリコシル
アミンに認められた１：２４０比（上記参照）に比べて
、α釦よσβ型はそれ（′ｆ’Ｌ１：４の比を示しｆｃ
Ｏこり観察に対しては少なくと％２つの説明が可能であ
る。すなわち、第−匝、ダンシル訪導体は開環型を経て
変旋光七受ける、また第二にα型はβ型よジも速や力為
にダンシルクロリドと反応し、−旦生成するとこの誘導
体は特定のアノマーに固定されるの２つである０温度釦
よび一依存注Ｑ検討では、後者の解釈の万が可能性が高
いよ５に思われる（データは示していない〕０ ダンシルクロリドについて得らｔ″Ｌだ一般的な低収率
ハ、グリコシルアミンの反応に典型的であることが明ら
かにさＩｆ”Ｌ７ｊｏたとえば、インチオシアネートお
よびフルオレセイ／のＮＨ３−エステルについても類似
の収率が得られた０ダンシルクロリドのような酸クロリ
ドでは、反応性の高い種による０−アシル化の可能性が
さらに困難が加わるものと考えられる０実際、これは各
種グリコシルアミンについてのダンシル化の反応速度の
検討によって確認された（データは示していない）００
−ダンシルｖｊ導体の生成が、酸クロリドを消費させる
別の経路となっている〇 すなわち、グリコシルアミンの直接誘導体化は、生成物
としてαおよびβの池合物を与え、収率は常に低いと語
間された。

工程３．１Ｊ−グリシル−グリコシルアミンの合成ハロ
アセチル化グリコシルアミン誘導体は、多くの合成計画
に使用できる０たとえば、ハロ官能基は、−級アミンに
よって置換でき、たとえばクロロ酢ｍ金用いてグリシン
七合成できるし、ヨード誘導体はチオールと結合させて
チオエーテルを形成できることは、前掲の反応式に示し
たとシシである〇 例３ ハロアセテート誘導体のアンモノリシスは、封管中（ア
ンモニアの蒸発による喪失を防止するため）、室温にお
いて、飽和炭酸アンモニウム甲でインキュベートするこ
とによって実施した０生成物は・上述したのと同じＨＰ
ＬＣ！　＠に用いて分析した０反応中に、１８．８分で
溶出するクロロアセテート誘導体は徐々に、約２４分で
溶出する生成物に変換し、この生成物はニンヒドリン陽
性であった（第５図参照）０反応は、室温で９６時間後
にはほとんど完結し７′？、（第５図参照）０第二のア
ンモノリシス反応は５０℃で実施し、−夜のインキュベ
ーションで完結することが見出された（第６図参照）ｏ
クロロアセチル基に対して過剰のアンモニアは、二級お
よびさらに高級のアミンの生成を最小限にするために必
須であることが明らかにされた〇 アンモノリシス生成物（上記工程６）七精製し、Ｇｒａ
ｙの方法（Ｍｅｔｈ、Ｋｎｇｙｍｏｌ、、　ＸＸＶ　：
　１２１．１９７１）に従ってダンシル化し、収率上ラ
クトシルアミンの直接ダンシル化（中間体のＮ−ハロア
セチル化グリコシルアミンを生成させない）で得られた
収率と比較した０２種の反応混合物を。

７：１のＭｅＯＮ／　０．０５多りアミノプタン含頁水
を用い、８１１１ｃａ　６０　ＴＬＯに流した０ダンシ
ル化生成物はＵＶ光（３６６ｎｍ　）下に５１認し、こ
れらおよび原料（遊離ラクトース／Ｎ−グリシル−ラク
トシルアミン）’を溶出し、カウントした。得られた結
果は第１表に示す〇 第璽表 生　　成　　物 ダンシル−Ｎ−グリシル−ラクトシルアミンＮ−グリシ
ル−ラクトシルアミン Ｎ−ダンシル−ラクトシルアミン 遊離ラクトース 全体に対する嘩 ６９．５ ３０．５ １０．１ ８９．９ ２）フルオレセイン誘導体 Ｎ−アセチルグルコサミンのＮ−グリシル−グリコシル
アミン誘導体’ｉ０．１Ｍ炭酸Ｘ素ナトリウム１００μ
ＪＫ溶解した０これに１０倍過剰の５（−６）−カルボ
キシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド
エステル（Ｍｏｘｅｃｕ１ａｒＰｒｏｂｅｓ工ｍｅ、、
　ＩＣｕｇｅｎｅ　、　Ｏｒｅｇｏｎ　）　’ｒ：含む
ＤＭＩＩ’１００μｔＷ加えたＯ反応は室温で６時間進
行させた０ついで、混合物を乾燥し、水に再溶解し、氷
酢酸を用いて酸性にし、最後にエーテル抽出して、遊離
のフルオレセイン七除去した０次に〜水相？ｒ：　８ｐ
ｈｅｒｉｓｏｒｂ　５５０ＤＳ２８Ｐカラム（８，０×
３００鵬）上、逆相ＨＩ’ＬＯに適用し、ＵＶ　（２５
８ｎｍ　）および螢光（励起光：　３３６　ｎｍ−発光
＝５６６ｎｍ　）　ｋ用いて検出した０傅られた分画の
５０μｊを取ってカウントした０典型的な滲出像を第７
図に示す口遊離のＳ＞よびフルオレセイン接合体を含有
する分画を集め、乾燥し、カウントして、出発した糖に
対する総状″４七求め、以下の第１表に示す、５（−６
）−力ルボキシテトラメチルローダミンーＮ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステルの誘導体によっても類似の結
果が得られた。

第璽表 遊離Ｇ’１ｃＮＡｃ フルオレセイン−ＧｌｃＮＡｃ　（直接）遊離ＧｌｏＮ
Ａａ　＋　Ｇ１ｙｃｙｌＧｌｅＮＡｃフルオレセイン−
ＧｌｙｃｙＩＧ１ｃＮＡｃ３．１９に５　　９０３ ３．４３Ｆ２４　　　９．７ １２４ｍ５　　４７．３ １３８１５　　５２．６ 上述のデータは、ハロアセチル化−グリコシルアミンが
β−Ｎ一連結構連結体接合体に有効な中間体であること
七示している。各工程は事実上完全に進行し、総出弗化
合物に対してほぼ７０〜８０％の収率で誘導体上製造す
ることができた〇オリゴ糖防導体化の一膜内万汲 オリゴ糖、飽和Ｎ１１［４ＨＯＯ３に溶解し、３０℃で
４日間インキュベーション ７Ｋｔ−繰り返し加えて凍結乾燥 ↓ Ｎ−ハロアセチル化→直接誘導体化 飽和（ＮＨ４）２ａｏ３２加えｏ／ｎ５０℃でインキュ
ベーション ↓ 残ったグリシン、塩を除去 ↓ Ｎ−グリシル−グリコシルアミンの誘導体化これらの誘
導体の有用性を示す他の例を以下の反応式で表す０これ
らの誘導体の構造には、′Ｓ蛋白質にかいてＮ一連結炭
水化物とアスパラギンの間の生物学的結合に見出される
アミド結合とメチレン基を包含することが、もう−度指
摘されねばならない０ハロアセチル化グリコシルアミン
およびグリシルグリコシルアズンとたとえばそれぞれチ
オグリコールｗｌ′ｓ？よび無水コハク酸の反応性は、
末端カルボキシ基の導入を可能にする０これは、オリゴ
糖の糖蛋白質またはペプチドもしくは蛋白貢への・慣用
のＩＤＯ／　Ｎｌ！Ｅｌ化学〔１−（エチル−３−（６
−クメチルアミノプロビル）−カル７ＩＣシイ ミ ド／Ｎ ヒ ドロキシコハク酸イ ミ ドカップリ ング反応〕による連結に使用することができる〇以上、
本発明の開示を参考に、本技術分野の熟練名によれば、
本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な
他の例を実施できることが自明であろう。このような他
の例は、本発明の特許請求の範囲に包含されるものであ
る−

【図面の簡単な説明】

第１図は、グリコシルアミンの変旋光訃よび加水分解の
一依存性を示すグラフでめる〇第２図は、オリゴ糖から
、凍結乾燥時にかける炭＃＊素アンモニウムの経時的消
失を示すグラフである〇 第３図は、本発明の一態様にひける、飽和炭酸＊素アン
モニウム甲でのオリゴ糖のインキュページ１フ時のグリ
コシルアミンの生成速度を示すグラフである・ 第４図は、第３図のグリコシルアミンのクロロアセチル
化によって得られた生成物のＨＰＬａ　ｓ出像七示すグ
ラフである〇 第５図は、第４図のクロロアセチル化グリコサミンのア
ンモノリシスからの生成物のＥＰＬＯ浴出像を示すグラ
フである〇 第６図は、第５図にひける第二のアンモノリシス反応の
完結を示すグラフである０ 第７図は、本発明の他の態様にかけるＮ−アセチルグル
コサミンのＮ−グリシル−グリコシルアミン誘導体のフ
ルオレセイン誘導体の逆相ＨＰＸＡ溶出像を示すグラフ
である０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）オリゴ糖を誘導体化して合成Ｎ−連結複合糖質を
   形成させる方法において、合成Ｎ−連結複合糖質の形成
   前に中間化合物として、上記オリゴ糖のグリコシルアミ
   ン誘導体をハロアセチル化誘導体に変換して、上記合成
   Ｎ−連結複合糖質のβ−アノマーのコンフィギュレーシ
   ョンを維持させる改良方法 （２）ハロアセチル化誘導体はクロロアセチル化誘導体
   である請求項（１）記載の方法 （３）クロロアセチル化誘導体を形成するために無水ク
   ロロ酢酸の少なくとも５倍モル過乗を使用する請求項（
   ２）記載の方法 （４）ハロアセチル化誘導体はオリゴ糖のグリコサミン
   誘導体のＩＣＨ＿２ＣＯＯＮＨＳとの反応によつて製造
   される請求項（２）記載の方法 （５）グリコシルアミン誘導体は、オリゴ糖を飽和炭酸
   水素アンモニウム中、約８から約８．５までのわずかに
   アルカリ性のｐＨでインキュベートすることによつて形
   成される請求項（１）記載の方法（６）ｐＨは約８．３
   である請求項（５）記載の方法（７）グリコシルアミン
   誘導体は、オリゴ糖の飽和炭酸水素アンモニウム甲、約
   ８から約８．５までのわずかにアルカリ性のｐＨにおけ
   るインキュベーションによつて形成され、ついでグリコ
   シルアミン誘導体をハロアセチル化する請求項（１）記
   載の方法（８）ハロアセチル化グリコシルアミンの形成
   には無水クロロ酢酸を使用する請求項（７）記載の方法
   （９）ハロアセチル化グリコシルアミンをアンモニウム
   塩と反応させてグリシル−グリコシルアミンを形成させ
   る請求項（７）記載の方法 （１０）グリシル−グリコシルアミンを螢光団と反応さ
   せて、実質的にβ−アノマーコンフィギュレーションの
   Ｎ−連結複合糖質を形成させる請求項（９）記載の方法 （１１）螢光団はフルオレセイン誘導体である請求項（
   １０）記載の方法