JPH0381295A - 心房性ナトリウム利尿因子（ａｎｆ）のキレート誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 心房は細胞外液量の変化を検出する上で重要なセンサー
として機能するものと長年にわたり推定されてきた〔ガ
ウアー（Ｇａｕｅｒ）ら、フィジオロジカル・レビュー
ズ（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ）、
第４３巻、第４２３頁、１９６３年〕。心房に関するこ
のようなレセプター機能は、体液の浸透濃度を調節する
上で重要な視床下部ホルモルであるパップレシンの場合
に知られている。

尿ナトリウム排出を高め、ひいては細胞外液量の調節に
関与する物質の推定的存在は最近立証された。デ・ボル
ド（Ｄｅ　Ｂｏｌｄ）ら、ライフ・サイエンス（Ｌｉｆ
ｅ　５ｃｉｅｎｃｅ）　、第２８巻、第８９頁、１９８
１年ではラット心房の部分的精製抽出物を他の麻酔ラッ
トに注射し、尿量及び尿ナトリウム排出量の多大な増加
について観察した。この比較的粗製の抽出物は内在性ナ
トリウム利尿物質の適切な特徴を有していた。

その強い利尿及びナトリウム利尿効果、即ち体液量調節
に大きな効果を発揮させる上でその物質を特に適したも
のとする性質に加えて、これらの心房抽出物は強い平滑
筋弛緩活性を有することも発見された〔カリ−（Ｃｕｒ
ｒｉｅ）　　ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２
２１巻、第７１頁、１９８３年］このような作用は血圧
調節に関する潜在的な直接的役割及び細胞外液量調節に
関する役割について示唆している。

体液量及び血圧の調節を解明したこの発見に関して直ち
に認識された重要性並びにうっ血性心不全及び高血圧の
治療に関するこの天然物質の明らかな治療可能性のため
に、様々な研究所は心房抽出物中の活性物質を単離し、
特徴付は及び化学的に同定することに着手した。心房中
の活性物質は心房性ナトリウム利尿因子又はＡＮＦと呼
ばれるが、但しカルジオナトリン（デ・ボルドら、ライ
フ・サイエンス、第３３巻、第２９７−３０２頁、１９
８３年）及びアトリオベブチン（カリ−ら、サイエンス
、第１１１巻、第６７頁、１９８４年）とも呼ばれてい
た。心房性ナトリウム利尿因子はすべてが共通のアミノ
酸配列を有するが但しアミノ又はカルボキシル末端にお
ける１〜８アミノ酸の存在又は不存在によって鎖長が異
なるペプチド群であることが示された。

ペプチド化学者らは心房から単離されたペプチド群の生
物学的活性に似せた完全合成物質を短期間で製造した。

ＡＮＦの生物学的活性は標準療法で末梢血管拡張剤と共
に強い利尿剤を用いる場合のうっ血性心不全に関して効
用を示す。心房性ナトリウム利尿因子は体内で自然産生
される一分子中にこれら双方の作用を併有している。う
っ血性心不全に伴う塩及び水滞留は不十分なＡＮＦ産生
の結果であるかもしれない、これが真実ならば、ＡＮＦ
の投与は十分量の物質の代わりになりうるであろう。

ＡＮＦの生物学的活性が効用を示す第二の主な疾患は本
態性高血圧である。高血圧に関する標準療法では利尿剤
及び末梢血管拡張剤を用いる。心房性ナトリウム利尿因
子はこれら双方の特徴を併有している。特別な用途はＡ
ＮＦの強力な血管拡張効果が最適である悪性高血圧のよ
うな高血圧危機の緊急治療でもみられる。

これら２つの非常に広範なカテゴリーの治療効用に加え
て、腎機能の低下で特徴付けられる疾患も腎血行動態に
関するＡＮＦの好ましい作用、特に髄質血流量の増加の
せいで効果があるであろう。

ブラダ４　（Ｒｒａｄｙ）らの米国特許第４，６０９，
７２５号明細書では、ＡＮＦＯ合戒断片がヨウ素で求電
子標識することによりチロシン残基のカルボキシル末端
で標識でき、かつこれらの放射線標識誘導体がＡＮＦの
インビボ及びインビトロ代謝の研究に有用であると開示
している。

本発明の目的は、放射性原子がキレート分子によりペプ
チドのＮ末端に結合されたＡＮＦ合戒断片の放射性誘導
体を提供することである。

本発明のもう１つの目的は、キレート化学がＡＮＦのキ
レート体と放射性金属との単純混合によりＡＮＦ放射性
体の台底を可能にすることから、現在ヨウ素で求電子標
識して入手する場合よりも容易なＡＮＦの放射性標識体
へのアクセス法を提供することである。

本発明のもう１つの目的は、インビボ及びインビトロに
おけるＡＮＦの代謝及び半減期を研究する上で有用な化
合物を提供することである。

本発明のこれらの及び他の目的は以下の記載から明らか
になるであろう。

ＡＮＦの放射線標識体は、Ｎ末端にキレート官能基を有
する哺乳動物心房性ナトリウム利尿因子の合Ｉｖ、誘導
体をＴｃ−９９ｍ、　　Ｇａ−６７又はＩｎ−１１１の
ような適切な金属放射性同位元素と混合することにより
製造される。

本発明によるＡＮＦのキレート体は下記アミノ酸配列を
有する： Ａ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ｇｌ　ｙ−Ａｒｇ−
Ｘ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−１１ｅ−Ｇ　１ｙ−Ａ　Ｉａ−Ｇ
ｌｎ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−八ｓ
ｎ−５ｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−上記式中ＸはＩ
ｌｅ又はＭｅｔである；Ａは Ｃｈ−Ｓｅｔ− Ｃｈ−５ｅｒ−３ｅｔ Ｃｈ−Ａｒｇ−５ｅｔ Ｓｅｔ− Ｃｈ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−５ｅｒ−５ｅｒＣｂ−Ｌｅｕ−
八ｒｇ−Ａｒｇ−８ｅｒ−５ｅｒＣｈ−３ｅｒ−１，ｅ
ｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−５ｅｒ−３ｅｒＣｈ−Ａｒｇ−５
ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−＾ｒｇ−ＳｅｒＣｈ−Ｐｒｏ−
Ａｒｇ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｃ−ＡｒｇＣｂ−Ｇｌｙ
−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−ＡｒｇＣｈ−Ａｌ
ａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−５ｅｒ−ＬｅｕＣｂ−Ｌ
ｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−１’ｒｏ−Ａｒｇ−５ｅｒであ
る； Ｂは不存在又は存在であり、 には、 Ａｒｇ Ａｒｇ−Ａｒｇ である； 上記式中ｃｈは Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ−３ｅｒ− Ａｒｇ−３ｅｒ−３ｅｒ 八ｒｇ−Ａｒｇ−３ｅｒ 存在する場合 Ｓｅｒ 及び （上記式中Ｒ３ は １ 八ＮＦ−Ｃ−Ｎｌｌ− Ｎ）１ １ 八ＮＦ−Ｃ− １ ＾ＮＦ−Ｃ− ＡＮＦ− ここでｎは２〜６である） からなる群より選択されるキレート残基である；上記に
おいてペプチドは直鎖であるか又は２システィン残基間
の共有結合によって環化されている；Ｒ１及びＲ３は同
一でも又は異なっていてもよく、水素、Ｃ，−Ｃ？デア
ルル、Ｃ，−Ｃ，アルコキシ、Ｃ３Ｇ？　シクロアルキ
ル、するノ、ハロ、即ちクロロ、ブロモ、フルオロ及び
ヨード、トリフルオロメチル等から選択される。

上記においてＸが口ｅ、　ＡがｔｌＢＥＤ−Ａｒｇ−Ａ
ｒｇＳｅｒ−５ｅｒのように定義されるキレートかつＢ
が不存在である場合が好ましいキレートであって、ＨＢ
ＥＤはＮ、Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシベンジル）エチ
レンシア嵩ンーＮ−Ｎ’　−二酢酸である。

ＡＮＦのキレート体は最初ＡＮＦ誘導体を適切なイオン
交換カラムに通して四基酸形に変換することにより合成
される。これはＡＮＦが当初四酢酸形である場合に特に
重要である。次いで四基酸形は反応がペプチドのＮ末端
で生しるような方法でキレート分子の活性エステル誘導
体と反応せしめられる。次いで得られたキレート化ＡＮ
Ｆ、未キレート化Ａ　Ｎ　Ｆ及び未反応活性キレートエ
ステルの混合物は純粋なキレ−１・化ＡＮＦ誘導体を得
るためプレパラティブＨＰ　Ｌｃで精製される。次いで
このキレート化ＡＮＦ体はクエン酸ガリウムの”Ｇａ、
塩化インジウムのｌｌｌＩｎ又は■もしくはＶ価状態の
９９′″Ｔｃ−テクネチウムイオンのような金属放射性
同位元素と無イオン水Φで反応せしめられる。

実際には、これらのＡＮＦ修正キレート体は緩衝液キャ
リアに溶解され、凍結乾燥され、ＡＮＦ１０〜３００　
ｕ　ｇ／バイアルの単位用量で最終ユーザーに供給され
る。ユーザーは金属放射性同位元素の溶液を凍結乾燥キ
レートに加え、金属キレート錯体が生成する数分間の経
過後標識ＡＮＦ錯体が使用可能となる。

これらのキレートに通した放射性同位元素は９９杓テク
ネチウム、ｂ７ガリウム、６′ガリウム、訓クロム、″
コバルト、ｈ０コバルト、１′インジウム、　＋１３１
１１インジウム、　′６レニウム、　＋ａａレニウム、
ｑ０イツトリウム等である。

本発明の実施について更に説明するため、下記実施例が
示されている。

実施例１ ＡＮＦ四　　の ヒトＡＮＦ断片（１０位にメチオニン）を３００ＭＨｚ
　　ＮＭＲスペクトル測定で調べ、四節酸基の存在につ
いて確認した。これらの基は第１図中σ１．９４でみら
れる。このサンプル１１０ｌｌ１を超純水（抵抗≧１８
Ｍオーム）２ｍｌに溶解し、ダウエックス（Ｄｏｉ＋ｅ
ｘ）　Ａ　Ｇ　３−χ４（クロリド形）Ｉｇ含有小カラ
ムに通した。溶出液を回収し、カラムを更に超純水で洗
浄した。四基酸ＡＮＦを凍結乾燥で溶出液から回収した
。収１９．６ｍｇ、この物質のＮＭＲスペクトルでσ１
．９〜２．１における酢酸残基の不存在を確認できる（
第２図）。

実施例２ ＡＮＦとＮ、Ｎ−ビス（２−（２，６−ジオキソモルホ
リノ　エチル　グリシンとの　応四塩酸ヒトＡＮＦ（１
０位にメチオニン）１．Ｏｍｇをｐｏａ、ｚの０．　Ｉ
　Ｍ　Ｎａ１ｌＣＯ３緩衝ン夜４０　ｔｔ　１中でＮ、
Ｎ−ビス（２−（２，６−ジオキソモルホリノ）エチル
〕グリシンの）容？Ｆｌ　（ジメヂルスルホキシド（Ｄ
ＭＳＯ）４ｕｆｆ中１６０μｇ、４４８ｎｍｏｆ）と反
応させた。混合物を一夜放置し、しかる後　ＣＯ□ガス
で飽和させた。ラジオクロマトグラフィー（ｒＴＬｃシ
リカゲル／Ｃｏ２飽和塩水）によるこの溶液の分析を”
　’　ｒｎｃ　Ｑ　３で行ったところ、放ＪＬＪＩの８
２％がＡＮＦ分子に結合していることを示した。

粗ＡＮＦ誘導体のこの混合物をウォーターズ（Ｗａｔｅ
ｒｓ）　　Ｃ８逆相カラム及び溶媒として８１：１９水
／アセトニトリルを用いてプレバラティブＨＰ　Ｌ　Ｃ
クロマトグラフィーにより精製した。この系を用いた未
キレート化ＡＮＦの溶出時間は２．１８分、キレート化
体の場合は３．２８分であった。

精製されたジエチレントリアミン五酢酸ＡＮＦの単離収
量は３１９μｇであった。この物質の３００ＭＨｚ　　
ＮＭＲスペクトル図は第３図で示されている。

実施例３ ＡＮＦのジエチレントリアミン五酢酸誘導体と１１１１
０−インジウムクロリドとの 超純水２５μｌを１目インジウムクロリドス１−ンクン
容液〔アトミック・エナジー・オフ゛・カナダ・リミテ
ッド（Ａｔｏｍｉｃ　Ｅｎｅｒｇｙ　ｏｆ　Ｃａｎａｄ
ａＬｉａ＋４ｔｅｄ））　２５　ＩＩ　Ｎに加えた。ｐ
Ｈ５，０の０．０１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液１００
ａＬｌかる後ＡＮＦのジエチレントリアミン五節酸誘導
体１６μｇ含有溶液１０μｌを加えた。反応はほとんど
瞬時的であり、ＩＴＬＣラジオクロマトグラフィーによ
る分析では標識収率８３％を示した。

実施例４ Ｎ、Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシベンジル）エチレンジ
アミン−Ｎ、Ｎ’−二酢酸−Ｎ’−ヒドロキシスクシン
イミドエスールの Ｎ、Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシベンジル）工チレンジ
アミンーＮ、Ｎ’　−二酢酸（ＨＢＥＤ）１０６＋＋＋
ｇをアセトニトリル１　ｍｌに溶解し、？８液をトリメ
チルアミンガスで飽和させた。不溶物を濾去し、溶質を
高減圧下９０°Ｃで蒸発乾固させた。

残渣をジスクシンイごジルカーボネート２０５■含有ア
セトニトリル５ｄに溶解した。１時間後、アセトニトリ
ルを減圧除去した。残渣を迅速に水及びクロロホルムに
分配し、クロロホルム層を単離し、硫酸ナトリウムで乾
燥し、減圧除去して、相エステルを得た。　　’ＨＮＭ
ＲではＩ（Ｂ　Ｅ　Ｄ分子当たり２つのスクシンイミジ
ル残基の存在について確認できる。これは非常に反応し
やすいエステルであるため、それを更に精製せず用いる
。

実施例５ ＡＮＦとＮ、Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシベンジル）エ
チレンシアξンーＮ、Ｎ’−二酢酸−Ｎ′ヒドロキシス
クシンイξドエスールとの上記活性エステル０．３８ｍ
ｇを乾燥ジメチルスルホキシド１１０μｌ及び乾燥ピリ
ジン２．７ｕｅ中でヒト心房性ナトリウム利尿因子四塩
酸１ｍｇと反応させた。薄層クロマトグラフィー分析で
はＡＮＦ（０−フタルアルデヒド陽性、ＵＶ陰性）から
新規誘導体（Ｏ−フタルアルデヒド陰性、ＵＶ陽性）へ
の変換を示した。１６時間抜溶液を蒸発乾固させ、残渣
をメタノールに溶解し、不溶性タンパク質分画をクロマ
トグラフィーにより単離かつ精製し、０．５■のロフト
として凍結乾燥した。

実施例６ １′インジウムクロリドによるＡＮＦのＮ、Ｎ’−ビス
（２−ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン−Ｎ　　
Ｎ’　−二　　峰　　の ０．１　Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐｔ１５．４）
　１戚中１目ＴｎＣｌ　２２ｎ＋Ｃｉを凍結乾燥ＡＮＦ
０．５ｍｇ含有バイアルに加えた。５分間後溶液をＩＴ
ＬＣで分析したところ、標識収率９０％を示した。

手続補正書 （方式） ％式％ １、慣件の表示 平成２年特許願第１５５６２９号 ２、発明の名称 心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）のキレート誘導体
３、補正をする者 事件との関係

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記アミノ酸配列の１つを有するペプチド：【遺伝
   子配列があります】 〔上記式中ＸはＩｌｅ又はＭｅｔである； Ａは 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 である； Ｂは不存在又は存在であり、存在する場合 には、 Ａｒｇ Ａｒｇ−Ａｒｇ である； 上記式中Ｃｈは ａ）▲数式、化学式、表等があります▼ ｂ）▲数式、化学式、表等があります▼ ｃ）▲数式、化学式、表等があります▼ 及び ｄ）▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼、 ▲数式、化学式、表等があります▼、 ▲数式、化学式、表等があります▼、 ▲数式、化学式、表等があります▼、 ＡＮＦ−、 又は▲数式、化学式、表等があります▼である； ここでｎは２〜６である） からなる群より選択されるキレートである；上記におい
   てペプチドは直鎖であるか又は２システイン残基間の共
   有結合によって環化されている；Ｒ＿１及びＲ＿２は同
   一でも又は異なっていてもよく、Ｃ＿１−Ｃ＿７アルキ
   ル、Ｃ＿１−Ｃ＿７アルコキシ、Ｃ＿３−Ｃ＿７シクロ
   アルキル、ハロ、アミノ及びトリフルオロメチルから選
   択される〕。 ２、ＸがＩｌｅである、請求項１記載のペプチド。 ３、ＸがＭｅｔである、請求項１記載のペプチド。 ４、ＸがＩｌｅ、ＡがＨＢＥＤ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅ
   ｒ−Ｓｅｒ、Ｂが不存在である、請求項１記載のペプチ
   ド。