JPH0375160B2

JPH0375160B2 -

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Publication number: JPH0375160B2
Application number: JP58101634A
Authority: JP
Priority date: 1983-06-09
Filing date: 1983-06-09
Publication date: 1991-11-29
Also published as: JPS59227299A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は発酵法によるサイクリツク−3′、5′−
アデニル酸（以下cAMPと略記する）の製造法に
関し、その目的とするところは生化学試薬、医薬
品として有用なcAMPを工業的に有利に製造する
ことにある。従来、発酵法によるcAMPの製造方法としては
核酸系アナログに耐性を有せしめたミクロバクテ
リウム属に属するcAMP生産菌を使用する、本発
明者によるcAMPの製造法が知られるいる（特公
昭52−37077号）。一方、発酵法によるcAMPの製造方法におい
て、cAMP生産菌はcAMPアナログに耐性ではな
く、またcAMPアナログに耐性の菌株を造つたと
いうことは全く知られていない。そしてcAMPア
ナログに耐性菌、例えばcAMP耐性菌を創生する
ことも考えられるが、その場合創生される耐性菌
は一般にcAMP分解酵素（ホスホジエステラー
ゼ）を著量生産することによりcAMPを分解し、
cAMPの毒性をなくすことによつて耐性になるこ
とが予想され、該cAMP耐性菌によりcAMPの製
造を行なうと、該耐性菌株のもつホスホジエステ
ラーゼにより細胞中に一旦蓄積されたcAMPが分
解消失し、cAMPの収量が却つて低下するのでは
ないかと予想され、実施されなかつた。本発明者は、このようなcAMP生産菌を改良し
て、より生産性の高い菌株を得べく、種々研究を
重ねた結果、上記の核酸系アナログに加えて、更
にアデノシン−3′、5′−モノホスフエイトアナロ
グ又は高濃度グルコースから選ばれる少なくとも
１種に耐性を有せしめたミクロバクテリウム属に
属する微生物変異株は予想に反して、従来の核酸
系アナログに耐性のcAMP生産菌よりもさらに著
量のcAMPを生成著積する現象を見出し、本発明
を完成した。以下、本発明を詳細に説明する。本発明で使用する微生物はミクロバクテリウム
属に属する核酸系アナログに耐性の菌株で、更に
次の性質を有するものが使用し得る。すなわち、
上記の性質に加えて、アデノシン−3′、5′−モノ
ホスフエイトアナログ又は150ｇ／以上のグル
コースから選ばれる少なくとも１つに耐性の性質
を付与せしめた菌株である。本発明の核酸系アナログとしては１−アミノ−
アデノシン、２−アミノ−アデノシン、８−アザ
グアニン、６−チオ−８−アザグアニン、６−マ
ーカプトグアニン、６−ハロゲノープリン、２−
ハロゲノ−アデニン、２−マーカプトアデニン、
２−マーカプトプリン、６−メチルプリン、６−
メトキシプリン、１−メチルアデニン、２−メチ
ルアデニン、６−メチルアデニン、７−メチルグ
アニン、１−メチルグアニン、１−メチルハイポ
キサンチン、６−チオイノシン、６−メチルアミ
ノプリン、６−メチルチオ−２−ヒドロキシプリ
ン、２、８−ジチオ−６−オキシプリン、２−マ
ーカプトピリミジン、５−マーカプトウラシル、
５−マーカプトサイトシン、６−アザウラシル、
５−メチルピリミジン、２−チオサイトシン、５
−メチル−２−チオサイトシン、４−メチル−２
−チオウラシル、２−チオウラシル、３−メチル
ウラシル、５−メチルウラシル、６−メチルウラ
シル、スルフアアミノウラシル、４−アミノ−２
−チオピリミジン、６−アミノ−２−チオウラシ
ル、５−アミノ−２、４、６−トリヒドロキシ−
ピリミジン、４−アミノウラシル、５−アミノウ
ラシル、６−アザウラシル、６−アミノウラシ
ル、アニユリン、５−フルオロウラシル、５−フ
ルオロシトシン、２、４−ジチオ−ピリミジン、
ビイス−４、４−ジチオウリジン、４、５−ジア
ミノ−５−ニトロ−ピリミジン、４、５−ジアミ
ノピリミジン、４、５−ジアミノ−６−チオピリ
ミジン等、若しくはそのリボサイド、デオキシリ
ボサイド類、及びそれらのヌクレオタイド類が挙
げられる。また、アデノシン−3′、5′−モノホスフエイト
アナログとしては、cAMP、２−クロロ−アデノ
シン−3′、5′−モノホスフエイト、２−フロロ−
アデノシン−3′、5′−モノホスフエイト、２−ブ
ロモ−アデノシン−3′、5′−モノホスフエイト、
２−メチル−アデノシン−3′、5′−モノホスフエ
イト、２−アミノ−アデノシン−3′、5′−モノホ
スフエイト、２−チオ−アデノシン−3′、5′−モ
ノホスフエイト、２−アザ−アデノシン−3′、
5′−モノホスフエイト、８−クロロ−アデノシン
−3′、5′−モノホスフエイト、８−ブロモ−アデ
ノシン−3′、5′−モノホスフエイト、８−フロロ
−アデノシン−3′、5′−モノホスフエイト、８−
アザ−アデノシン−3′、5′−モノホスフエイト、
８−アジド−アデノシン−3′、5′−モノホスフエ
イト、８−メチル−アデノシン−3′、5′−モノホ
スフエイト、８−メチルチオ−アデノシン−3′、
5′−モノホスフエイト、８−アミノ−アデノシン
−3′、5′−モノホスフエイト、１、N⁶−エテノ−
アデノシン−3′、5′−モノホスフエイト、２−フ
ロロ−１、N⁶−エテノ−アデノシン−モノホス
フエイト、２−ブロモ−１、N⁶−エテノ−アデ
ノシン−3′、5′−モノホスフエイト、２−クロロ
−１、N⁶−エテノ−アデノシン−3′、5′−モノホ
スフエイト、２−アミノ−１、N⁶−エテノ−ア
デノシン−3′、5′−モノホスフエイト、６−ベン
ジル−プリン−3′、5′−モノホスフエイト、６−
チオ−プリン−3′、5′−モノホスフエイト等が挙
げられる。第１の核酸系アナログ耐性株の獲得方法は既に
知られており、例えば特公昭52−37077号公報に
記載の如き人工変異処理や自然の選択によつても
得られる。更に第２の性質（アデノシン−3′、5′−モノホ
スフエイトアナログ耐性及び／又は150ｇ／以
上のグルコース耐性）を加えてもつ、本発明に使
用する微生物変異株は、ミクロバクテリウム属に
属する核酸系アナログ耐性株を変異処理すること
によつて、アデノシン−3′、5′−モノホスフエイ
トアナログ及び／又は150ｇ／以上のグルコー
スによる生育阻害に耐性を有せしめた変異株とし
て得ることができる。また逆の方法、すなわちア
デノシン−3′、5′−モノホスフエイト及び／又は
150ｇ／以上のグルコースに耐性の変異株を親
株としてこれを変異処理して、これに核酸系アナ
ログ耐性を有せしめることによつても本発明に使
用する菌株を得ることができる。尚ここにいう核酸系アナログ耐性株及びアデノ
シン−3′、5′−モノホスフエイトアナログ耐性株
とは、それぞれ0.01〜5000mg／及び10mg〜200
ｇ／のアナログの存在で生育する変異株を言
い、150ｇ／以上のグルコース耐性株とは少な
くとも150ｇ／のグルコースの存在で生育する
変異株をいう。また耐性株を誘導するための親株
としては栄養要求変異株であつても、栄養要求変
異株でなくても使用できる。このように変異処理によつて得られる菌株を培
養して、cAMP生成能が核酸系アナログのみに耐
性の変異株よりも顕著に向上した菌株を選択して
本発明に使用する。このような菌株を得る具体的な操作例について
説明すると次の通りである。操作例１ミクロバクテリウムNo.205菌株の６−メチルプ
リン（核酸系アナログ）耐性で、更にcAMP（ア
デノシン−3′、5′−モノホスフエイト）耐性及
び／又はグルコース耐性の菌株の獲得例。ミクロバクテリウムNo.205（FERM−ＰNo.106）
を0.1mg／mlのニトロソグアニジンで０℃、30分
変異処理した後、下記培地組成の寒天培地（PH
7.0）を用いて６−メチルプリン（核酸系アナロ
グ）耐性株を採取した。培地〔Ａ〕（NH₄）₂SO₄ 0.2ｇ／dl KH₂PO₄ 1.0 〃 MgSO₄・7H₂O 1.0 〃 ZnSO₄・7H₂O 1.0mg／dl MnCl₂・4H₂O 10.0 〃 FeSO₄・7H₂O 10.0 〃ビオチン 10.0μｇ／dl ６−メチルプリン 10.0mg／dl PH（3N・KOH） 7.0 寒天 2.0ｇ／dl 上記方法で得た核酸系アナログ耐性株のなかか
らcAMP生成能の高いものを選別し、その一つと
してミクロバクテリウムNo.205−Mp−１（FERM
Ｐ−7101）を得た。次いでこの菌株を更に0.1mg／mlのニトロソグ
アニジンで０℃、30分変異処理し、これを上記核
酸系アナログ添加培地〔Ａ〕を基礎培地とした下
記の各培地〔Ｂ〕〜〔Ｄ〕に、１ml当たり10⁹個
の細胞を有する懸濁液を、それぞれ0.1mlづつ塗
抹し、30℃、２〜７日間培養した。その結果、〔Ｂ〕〜〔Ｄ〕の各培地とも１平板
培地当たり10〜50個のコロニーが観察された。培地〔Ｂ〕核酸系アナログ添加培地〔Ａ〕＋cAMP10ｇ／
dl 培地〔Ｃ〕核酸系アナログ添加培地〔Ａ〕＋グルコース200
ｇ／dl 培地〔Ｄ〕核酸系アナログ添加培地〔Ａ〕＋cAMP10ｇ／
dl＋グルコース20ｇ／dl 上記培養で出現した各コロニーの中からcAMP
生産能の高いものを選別した。その結果、培地
〔Ｂ〕よりミクロバクテリウムNo.205−MpCa−１
（FERM Ｐ−7104）、培地〔Ｃ〕よりミクロバク
テリウムNo.205−MpGu−１（FERM Ｐ−7103）、
培地〔Ｄ〕よりミクロバクテリウムNo.205−
MpCaGu−１（FERM Ｐ−7102）の株が得られ
た。次に本発明方法に従つてcAMPを製造するに
は、上記菌株を、その利用し得る炭素源、窒素
源、無機燐酸塩及び必要に応じてこれら以外の無
機塩や他の成分を適当に配合した培地に接種し
て、PH５〜10、温度20〜40℃でcAMPが最大にな
るまで、例えば24〜120時間位培養を行う。炭素源としては例えばグルコース、澱粉加水分
解物、糖蜜などの糖質化合物、イノシトール、マ
ルトール、ソルビトールなどのアルコール類、フ
マール酸、コハク酸、リンゴ酸などの有機酸類、
ノルマルパラフイン、ケロシンなどの炭化水素な
どが、また窒素源としては例えば硫安、塩安、尿
素、各種アミノ酸、アミノ酸高重合体加水分解
物、肉エキス、コーンステープリカー、米糖、フ
イシシユソルブル及び酵母エキスなどの生物体エ
キスが使用される。また無機燐酸塩としては例え
ば燐酸一カリ又はソーダ、燐酸二カリ又はソー
ダ、燐酸アンモニウム等が使用される。そしてま
た必要に応じて加えられる無機燐酸塩以外の無機
塩としては例えば硫酸マグネシウム、塩化マグネ
シウム、硫酸鉄、塩化鉄、硫酸亜鉛、硫酸コバル
ト、硫酸マンガン、塩化マンガンなど、弗化ソー
ダ、弗化カリ、弗化カルシウム、弗化バリウム、
弗化アンモニウム、弗化亜鉛などの各種弗化物、
硼酸、硼酸アンモニウムなどの硼酸又はその塩類
などが挙げられる。その他に微量成分としてはビタミン類例えばビ
オチン、ビタミンB₁、B₂、パントテン酸及びそ
の関連化合物の添加が効果的である。また、培地に対してサイクリツク−3′、5′−ヌ
クレオタイドホスホジエステラーゼの阻害剤であ
る、例えばカフエイン、テオフイリン、テオブロ
ミン、メチルキサンチン類（イソブチルメチルキ
サンチン）、植物フラボノイド（ブラボン類、パ
パベリン類、ベルベリン類）、アルカロイド、配
糖体、２、３（または２、４または２、５）−ピリ
ジンジカルボン酸、ジピコリン酸、８−ハイドロ
キシキノリン、ポリ燐酸、ピロ燐酸等を0.001〜
500mg／の濃度で加え、該阻害剤の存在下にお
いて培養するとcAMPの生産が更に増加するまた後記注１に記載の如きサイクリツク−3′、
5′−アデニル酸の前駆体物質を入れると、cAMP
は更に増大する場合がある。すなわち使用菌の能
力からしてcAMP生産がマキシマムに達している
場合には後記注１の物質を培地に添加してもさし
たる増加は認められないが、マキシマムに達して
いない場合には、後記注１の物質を入れることに
よつてcAMPの生産量は更に増大する。注１アデニン、ハイポキサンチン、サクシニルア
デニン、５−アミノ−４−イミダゾールカルボ
キサマイド、７−アミノ−ピラゾロ−（４、３
−ｄ）−ピリミジン、ピラゾロ−（４、３−ｄ）
−ピリミジン、４−アミノ−ピロロ−（２、３
−ｄ）−ピリミジン、ピロロ−（２、３−ｄ）−
ピリミジンまたはこれらを塩基とするリボサイ
ド〔アデノシン、イノシン、サクシニルアデノ
シン、５−アミノ−４−イミダゾールカルボキ
サマイドリボサイド、７−アミノ−３−（β−
Ｄ−リボフラノシル）−ピラゾロ−（４、３−
ｄ）−ピリミジン（ホルマイシンＡ）、３−（β
−Ｄ−リボフラノシル）−ピラゾロ−（４、３−
ｄ）−ピリミジン（ホルマイシンＢ）、４−アミ
ノ−３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピロロ−
（２、３−ｄ）−ピリミジン（ツベルシジン）、
３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピロロ−（２、
３−ｄ）−ピリミジン（６−デアミノツベルシ
ジン）〕又はこれらのモノリボヌクレオタイド
〔2′（又は3′又は5′）−イノシン酸、2′（又は3′
又は
5′）−サクシニルアデニル酸、５−アミノ−４
−イミダゾールカルボキサマイドリボース−
2′（又は3′又は5′）−モノホスフエート、６−デ
アミノツベルシジン−2′（又は3′又は5′）−モノ
ホスフエートなど〕。次に培養方法は振盪培養、撹拌培養、通気培養
などの好気的条件が良い。この場合、生育期（培養開始後８〜16時間）に
は培養液中の溶存酸素分圧を0.1〜0.6気圧、溶存
炭酸ガス分圧を0.08気圧以下に、そしてcAMP生
産期（培養開始後16〜60時間）には前者を0.2〜
0.8気圧、後者を0.05気圧以下に、それぞれコン
トロールしながら通気撹拌を行うことが好まし
い。かくしてcAMPが最高に達したら培養を止め常
法に従つて、培養物よりcAMPを分離し精製す
る。すなわち活性炭などによる吸着法、陰イオン
交換樹脂、陽イオン交換樹脂などによるイオン交
換樹脂処理法、アルコール、アセトンなどcAMP
不溶性有機溶媒沈澱法及び抽出法など公知の（例
えば特公昭52−37077号公報参照）精製手段が適
当に組合わされてcAMPを分離、精製することが
できる。このようにして得られる物質は元素分析、リボ
ースの定量、リンの定量、更に紫外線吸収スペク
トル、赤外線吸収スペクトルなどで測定した結果
純品のcAMPと一致する。本発明方法によれば、cAMPの生成量を極めて
顕著に増大させることができ、本発明はcAMPの
工業的製造法として極めて有利である。以下、実施例を示して本発明を更に詳細に説明
する。実施例１

【表】

【表】第１表の種培地３mlを試験管（1.5cm×18cm）
に分注し、115℃で10分間オートクレーブで殺菌
した後、これに予め同培地で前培養した第２表の
菌株の培養液0.3mlを接種し、28℃で20時間、
300r.p.m.の振盪培養した。この培養液５mlを第１表の主発酵培地50ml当り
を500ml容坂口フラスコに分注し、115℃で10分間
オートクレーブで殺菌したものに接種し、28℃で
５日間140r.p.m.で振盪培養した。次に、この各々の培養液100mlを遠心分離し、
菌体を除いた上清液を10％HClでPH3.0に調整し、
活性炭カラム（５×20cm）に通し活性炭カラムを
水400mlで水洗後、0.5％NH₄OH含有50％エタノ
ール500mlでcAMPを溶出した。溶出液を減圧下
に50mlまで濃縮した。これに５％アンモニアを添
加し、PH８〜10にしてからアルコール200mlを添
加し良く撹拌した後５℃以下で一夜放置した。次
いで生じた沈澱物を遠心で除去し、得られた上清
のPHを5N・HClでPH2.0にして、５℃にて一夜放
置し、cAMPの結晶を得た。この結晶を水50mlよ
り再結晶化し、分離した後乾燥してcAMPを得
た。

【表】実施例２実施例１の方法において、第１表の主発酵培地
に下記第３表で示される各物質を第３表に記載の
量で添加する以外は全く同様にして各菌株を培養
し、結晶cAMPを取得した。その結果を第３表に
示す。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】

１ミクロバクテリウム属に属し、核酸系アナロ
グ耐性を有し、更にアデノシン−3′、5′−モノホ
スフエイトアナログ耐性及び／又は150ｇ／以
上のグルコース耐性を有するサイクリツク−3′、
5′−アデニル酸生産菌を培地に培養し、生成蓄積
したサイクリツク−3′、5′−アデニル酸を採取す
ることを特徴とするサイクリツク−3′、5′−アデ
ニル酸の製造法。