JPH0354087B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は胃酸分泌抑制物質の分別採取法に関す
る。

哺乳動物の体内に胃酸分泌抑制物質が含まれて
いることは知られている。そして、これまでに哺
乳動物の尿中に含まれる胃酸分泌抑制物質を分離
する方法が種々提案されている。

たとえば、カツツマンらのアセトン・パウダー
法〔P.A.Katzman，et al.：J.Biol.Chem.98，
739（1932）〕、ローレンスらのイオン交換樹脂吸着
法〔A.J.Laurence，et al.：Br.J.Pharmacol.41，
８（1971）〕、アール．エー．グレゴリーらの活性
炭吸着法〔R.A.Gregory，et al.：J.Physiol.129，
528（1955）〕等が挙げられる。

しかしながら、これらの方法によつて得られる
胃酸分泌抑制物質の本体は明かでなく高分子の糖
たんぱく質であるといわれている。

本発明者らは尿中に作用機序を異にする二成分
の胃酸分泌抑制成分が存在すること、従来の方法
によつて得られる胃酸分泌抑制物には二成分が混
在することを発見した。

胃酸分泌抑制物質の活性測定法としては、シエ
イのラツトによる幽門結紮法〔H.Shay，S.A.
Komarov et al.：Gastroenterogy.５，43
（1945）：ラツトの胃幽門部を結紮して胃内に貯留
する胃液の酸度を測定する。以下シエイ法と略称
する。〕とライのラツトによる胃潅流法〔K.S.
Lai：Gut.５，327（1964）：ヒスタミンで予め胃
酸分泌を亢進しておき、胃ゾンデおよびカニユー
レを通じて胃内に潅流液を潅流し、経時的に潅流
液の酸度を測定する。以下ライ法と略称する。〕
がよく知られている。

従来の方法によつて得られた胃酸分泌抑制物質
は上記の両生物試験法のいずれにおいても有意に
胃酸分泌を抑制する。しかしながら、本発明者ら
の研究によれば、同物質からシエイ法において抑
制作用を示すが、ライ法では有意に抑制作用を示
さない第１成分と、ライ法において、抑制作用を
示すが、シエイ法では有意に抑制作用を示さない
第２成分が含有され、両者を分別し採取できるこ
とが判つた（第１，２図参照）。

第１成分は分子量10万、等電点約5.6、ニンヒ
ドリン試験陽性、フエノール−硫酸試験法陽性で
糖たんぱく質様性状を示し、生物試験においては
シエイ法活性、ライ法不活性である。

第２成分は分子量約6000、等電点約4.6、ニン
ヒドリン試験陽性、フエノール−硫酸試験法陰性
でペプチド様の性状を示し、ライ法で活性、シエ
イ法で不活性である。

本発明は、これらの新知見に基づくもので、哺
乳動物の尿から得られる胃酸分泌抑制成分の混合
含有物にゲル過、イオン交換体への吸着と脱着
および電気泳動法の少くとも一つの手段を適用し
て成分を分画し、シエイ法のラツトによる幽門結
紮法およびライのラツトによる胃潅流法のいずれ
か一方に胃酸分泌抑制作用を示すが他方には示さ
ない二つの画分をそれぞれ採取することを特徴と
する胃酸分泌抑制成分の分別採取法である。

本発明において用いる胃酸分泌抑制成分の混合
含有物としては、従来公知の方法によつて哺乳動
物の尿中から採取される胃酸分泌抑制物を使用す
ることができるが、予め生物試験により活性をチ
エツクしておくことが望ましい。

混合含有物中の前記第１成分と第２成分とは、
ゲル過、イオン交換体への吸着と脱着、および
電気泳動法の少くとも一つの手段を適用すること
により分別される。これらの分別手段は各成分の
分子量の差、等電点の差、イオン交換体に対する
親和力の差などの理学的性質の差を利用するもの
である。

ゲル過は二成分間の分子量の差を利用し分子
篩によつて分別するもので、分子篩としては、た
とえば、バイオラド社製のバイオゲルＰ−10，同
Ｐ−15，同Ｐ−20、フアルマシア社製のセフアデ
ツクスＧ−50，同Ｇ−75，同Ｇ−100，セフアロ
ース6B、セフアクリルＳ−200などを用いること
ができる。好ましいものはバイオゲルＰ−15、セ
フアデツクスＧ−100である。

イオン交換体への吸着と脱着は二成分間の等電
点の差およびイオン交換体に対する親和力の差を
利用して分別するものである。

イオン交換体としては、セルロース系、多糖
系、ポリアクリルアミド系の交換体が好んで用い
られる。

セルロース系としては、たとえば、ワツトマン
社製のCM−セルロース、DEAE−セルロース、
多糖系としては、たとえば、フアルマシア社製の
DEAE−セフアデツクス，CM−セフアデツク
ス、SP−セフアデツクス、ポリアミド系として
は、たとえば、バイオラド社製のCM−バイオゲ
ル、DEAE−バイオゲルなどが挙げられる。

そのほか、スチレン系のイオン交換樹脂、ダイ
ヤイオン（三菱化成製）、アンバーライト（日本
オルガノ製）など蛋白やペプチドの分離に用いら
れるイオン交換体をいずれも用いうる。

特に好ましいイオン交換体は蛋白質の非特異吸
着力の弱い陰イオン交換体で、その例としては、
たとえばDEAE−セルロース、DEAE−セフアデ
ツクス、アンバーライトIRA−93、同IR−45な
どである。

電気泳動法の場合は等電点の差を利用して行う
のが好ましい。具体的には等電点分画法の様式で
行われる。その分画は常法に従つて行うことがで
きる。

上記の各分別手段は単独にあるいは適宜組合せ
て二成分の分画に適用することができる。

以下、実施例において本発明の詳細な態様を示
す。

参考例 １ ヒト尿５に6N−塩酸を加えてPH5.5に調整
し、安息香酸飽和アセトン溶液500mlを攪拌しな
がら徐々に加え、２時間攪拌後生じた沈澱を取
して安息酸ケーキを得た。

これを500mlのアセトンに懸濁し、不溶物を
取し、少量のアセトンで洗浄したのち減圧デシケ
ーター中で乾燥して粗製乾燥粉末50mgを得た。

この粗製物はライ法およびシエイ法のいずれの
試験においても3.5mg／Kgの静脈投与で活性を示
した。

実施例 １ 参考例１で得られた粗製物50mgを0.15M酢酸ア
ンモニウム水溶液10mlに溶解し、セフアデツクス
Ｇ−100のカラム（φ2.8×90cm）にかけ、0.15M
酢酸アンモニウム水溶液で溶出し、溶出液を5.0
mlずつ分画捕集し、280nmの吸収を測定して第３
図に示すように第１および第２成分を確認し、そ
れぞれ凍結乾燥して第１成分20mg、第２成分５mg
の各粉末を得た。ゲル過法による分子量測定に
より、第１成分は約100000、第２成分は約6000の
分子量を示し、等電点は第１成分はpI約5.6、第
２成分はpI約4.6であつた。

また、各成分の生物試験の結果は、各１mg／Kg
の静脈内投与量において、第１成分はシエイ法で
活性、ライ法で不活性であり、第２成分はシエイ
法で不活性、ライ法で活性を示した。

すなわち、シエイ法については、一群10匹のラ
ツトに試料を生理食塩水に各濃度に溶解した溶液
0.2mlを尾静脈より投与し、４時間後に貯留した
胃酸の酸度を測定し、生理食塩水を投与した対照
群の酸度を基準として胃酸分泌抑制率（％）を算
出し、第１図に示す結果を得た。

また、ライ法については、ラツト大腿部静脈よ
り10μｇ／Kg／ml／hrの速度でヒスタミンを点滴
投与して胃酸分泌を亢進したのちに、試料0.2ml
を静脈投与し、生理食塩水を10ml／7minの速度
で胃内に潅流し、胃カニユーレより流出してくる
潅流液の酸度を経時的に測定することにより胃酸
分泌量を測定した。

その結果を第２図に示す。

実施例 ２ セフアデツクスＧ−100の代りにバイオゲルＰ
−10を用い、粗製物の溶解およびカラムの溶出に
0.15Mに代えて0.1Mの酢酸アンモニウム水溶液
を用いるほかは実施例１と同様に行い、乾燥粉末
として第１成分20mg、第２成分５mgを得た。

実施例 ３ 実施例２におけるバイオゲルＰ−10の代りにセ
フアクリルＳ−200を用いるほかは同例と同様に
して第１成分および第２成分を得た。

参考例 ２ ヒト尿５を6N−塩酸でPH5.6に調整し、25％
（ｗ／ｖ）タンニン酸水溶液250mlを徐々に加えた
のち冷所に12時間静置した。次いで上清の大部分
を傾潟法で除去し、析出している沈澱を取し、
メタノールで洗浄した。残渣を１％塩酸−メタノ
ール５mlで抽出し、抽出液にアセトン20mlを加
え、生成した沈澱を遠心分離で捕集し、アセトン
次いでエーテルで洗浄し、減圧下デシケーター中
で乾燥して粗製物45mgを得た。

この粗製物は３mg／Kgの静脈内投与により、シ
エイ法、ライ法のいずれの試験においても活性を
示した。

実施例 ４ 粗製物として参考例２の製品45mgを用い、粗製
物の溶解およびカラムの溶出に0.15M酢酸アンモ
ニウム水溶液を用いるほかは実施例２と同様にし
て第１成分乾燥粉末15mg、第２成分乾燥粉末３mg
を得た。

実施例 ５ 参考例２で得られた粗製物45mgを0.05M酢酸ア
ンモニウム緩衝液（PH5.2）50mlに溶解し、同緩
衝液で平衡化させたアンバーライトIR−45のカ
ラム（２×25cm）に流した。第１成分はカラムに
吸着せず通過する。通過液を凍結乾燥して第１成
分の乾燥粉末15mgを得た。一方、カラムを50mlの
0.2M酢酸アンモニウム緩衝液（PH4.5）で溶出
し、溶出液を凍結乾燥して第２成分の乾燥粉末
2.5mgを得た。各成分の生物試験は実施例１の場
合と同様であつた。

実施例 ６ 参考例１で得られた粗製物80mgを１％アンホラ
イン（PH範囲3.0〜10.0）を含むアンホライン−
シヨ糖濃度勾配を作製した110cmのカラム
（LKB）中で900Vの電圧で72時間通電したのち、
カラム内液を２mlづつ溶出分画し、各分画の
280nmの吸収とPHを測定し、第４図のごとく、PH
5.6を中心として第１成分を含む画分12ml、PH4.6
を中心として第２成分を含む画分10mlを得た。

各画分を0.1M酢酸アンモニウム水溶液にて平
衡化させたセフアデツクスＧ−15のカラム（２×
50cm）を用いて脱塩したのち凍結乾燥して第１成
分の乾燥粉末24mg、第２成分の乾燥粉末12mgを得
た。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図はそれぞれ実施例１におけ
るシエイ法およびライ法による試験成績で、白丸
は第１成分、黒丸は第２成分を示し、第１図の縦
軸は胃酸分泌抑制率（％）、横軸は各成分の投与
量（mg／Kg）を表し、第２図の縦軸は胃酸分泌量
（μeq.）、横軸は時間（分）を表わす。第３図は実
施例１におけるセフアデツクスＧ−100を用いた
ゲル過による第１成分と第２成分の分画を示す
もので、白丸は個々のフラクシヨン、縦軸は吸光
度（280nm）、横軸は分画数を表わす。第４図は
実施例６における電気泳動法による第１成分と第
２成分の分画を示するもので、黒丸はPH、白丸は
個々のフラクシヨンの吸光度、左側の縦軸は吸光
度（280nm）、右側の縦軸はPH、横軸は分画数を
表わす。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 哺乳動物の尿から得られる胃酸分泌抑制成分
   の混合含有物にゲル濾過、イオン交換体への吸着
   と脱着および電気泳動法の少くとも一つの手段を
   適用して成分を分画し、シエイのラツトによる幽
   門結索法およびライのラツトによる胃潅流法のい
   ずれか一方に胃酸分泌抑制作用を示すが他方には
   示さない二つの画分、すなわち分子量約10万、等
   電点約5.6、ニンヒドリン試験陽性、フエノール
   −硫酸試験法陽性で糖たんぱく質様性状を示し、
   生物試験においてはシエイ法で活性、ライ法で不
   活性である第１成分と分子量約6000、等電点約
   4.6、ニンヒドリン試験陽性、フエノール−硫酸
   試験法陰性でペプチド様の性状を示し、ライ法で
   活性、シエイ法で不活性である第２成分をそれぞ
   れ採取することを特徴とする胃酸分泌抑制成分の
   分別採取法。