JPH03505963A - 共通の急性リンパ芽球性白血病の抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 共通の急性リンパ芽球性白血病の抗原 発明の背景 共通の急性リンパ芽球性白血病の抗原（ＣＡＬＬＡ）は、１００ＫＤの細胞表面 の糖タンパク質であることが示されｔ；。それは最初にヒトのリンパ芽球性白血 病細胞上で同定された。リッツ（Ｒｉ　ｔ　ｚ）、Ｊ、ら、ネイチャー（Ｎａｔ ｕｒｅ）（Ｌｏｎｄｏｎ）、２８３：５８３−５８５（１９８０）。後の研究に おいて、ＣＡＬＬＡは、また、他のリンパ系の悪性疾患、例えば、リンパ芽球腫 、バーキットリンパ腫、および節の分化に劣ったリンパ球のリンパ踵により、お よび胎児の肝臓および胎児、小児および大人の骨髄および胎児および小児の胸腺 からの早期のリンパ系の子孫により発現されることが示された。グリーブス（Ｇ ｒｅａｖｅ　ｓ）　、Ｍ、Ｆ、ら、血液（Ｂｌｏｏｄ）、６上：　６２８−６３ ９　（１９８３）；ホクラン（Ｈｏｋｌａｎｄ）、Ｐ、　、ジャーナル・オブ・ イクスベリメンタル・メディシン（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、）　、上ｌヱ１１４− １２９　（１９８３）　：ホクラン（Ｈｏｋｌａｎｄ）、Ｐ、ら、皇玉（Ｂｌｏ ｏｄ）、６４：６６２−６６６　（１９８４）；ホ７マンーフエゼル（Ｈａ　ｆ 　ｆｍａｎ−Ｆｅｚｅ　ｒ）　、Ｇ、ら、白血病の研究（Ｌｅｕｋ、Ｒｅｓ、） 、６７６１−７６７　（１９８２）；ネウドル７（ｎｅｕｄｏｒｆ）、ＪＳ、Ｍ 、ら、白血病の研　（Ｌｅｕｋ、Ｒｅｓ、）、８：１７３−１７９　（１９８４ ）。ＣＡＬＬＡに対する抗体はこれらの悪性疾患の診断および治療の同者におい て広く使用されてきているが、ＣＡＬＬＡの主な構造および機能は知られていな い。

及盟Ω！ね 本発明は、ヒトＣＡＬＬＡをエンコードするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｓ　またはその断 片に関する。ｃＤＮＡは、抗ＣＡＬＬＡ抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｊ５ ）に結合することができるＣＡＬＬＡをエンコードする。エンコードされたヒト ｃＡＬＬＡの主な構造および機能は決定された。ｃＤＮＡは、ラットおよびウサ ギの亜鉛のメタロエンドペプチダーゼ、中性のエンドペプチダーゼ２４．１１（ エンケファリナーゼ）との近い同一性を有し、そして機能的な中性のエンドペプ チダーゼ活性をエンコードすることが示された。

ＣＡＬＬＡまたはその断片をエンコードするｃＤＮＡまたはＤＮＡをベクター中 に挿入し、これはＣＡＬＬＡまたはＣＡＬＬＡ断片の産生のために培養した細胞 を形質転換するために使用することができる。好ましくは、このＤＮＡによりエ ンコードされるＣＡＬＬＡ断片は可溶性である。可溶性であるためには、本発明 のＣＡＬＬＡ断片は、好ましくは、ＣＡＬＬＡの疎水性トランスメンブレン部分 のいずれをも含存しないか、あるいは可溶化を妨害しないトランスメンブレン部 分の一部分（一般に、６まｔ；はそれより少ないアミノ酸）のみを含有する。本 発明のＣＡＬＬＡ断片は、天然に産出するＣＡＬＬＡの対応する領域との相同性 を有する必要がなく、そしである場合（例えば、抗体の産生）において、完全ま たは全体より少ない相同性は好ましい。一般に、天然に産出するＣＡＬＬＡのア ミノ酸配列と本発明のＣＡＬＬＡまたはＣＡＬＬＡ断片のアミノ酸配列との間の 少なくとも約５０％の相同性が存在するであろう。

本発明の結果として、例えば、ＣＡＬＬＡをそれらの表面に発現する細胞の存在 によって特徴づけられる医学的状態の診断および処置において使用するために、 純粋なＣＡＬＬＡが今回利用することができる。

図面の簡単な説明 第１図は、ＣＡＬＬＡのトリプシン消化物のＨＰＬＣのプロフィルのグラフであ る。

第２図は、ＣＡＬＬＡのｃＤＮＡのクローンの制限地図を示す。

第３図は、ヒトＣＡＬＬＡのヌクレオチド配列およびエンフードされたヒトＣＡ ＬＬＡの予測されたアミノ酸配列である。

第４図は、翻訳されたＣＡＬＬＡのｃＤＮＡ配列のヒドロバシシティ（ｈｙｄｒ ｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）のプＯットである。

第５図は、ｐｌＧＴＥ／Ｎ　　ＣＡＬＬＡ、構成体において使用するＣＡＬＬＡ 　　ｃＤＮＡクローンの制限地図である。

第６図は、ｐｌＧＴＥ／Ｎ　　ＣＡＬＬＡ、構成体の線図的表示である。

第７図は、Ｎａ１ｍ−６、ＪＳ５、Ａ２−３およびＡ２−２細胞系上の相対的細 胞表面のＣＡＬＬＡの発現のグラフの比較を表す。

のすべてまｔ二は一部分をエンコードするＤＮＡ　、エンコードされｔニポリペ プチド、またはその断片；エンコードされたポリペプチドまたはその断片を作り かつ使用する方法；およびＣＡＬＬＡに対してレイズされかつＣＡＬＬＡに結合 することができる抗体に関する。次の節における筒単に記載しそして引き続〈実 施例において詳細に記載するように、抗ＣＡＬＬＡ抗体に結合するヒトＣＡＬＬ ＡをエンコードするｃＤＮＡが分離および配列決定され、そしてエンフードされ ｊ；ポリペプチドをその主な構造およびその機能で特性決定された。ヒトＣＡＬ ＬＡをエンコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびエンコードされたＣＡ ＬＬＡの予測されｔ；アミノ酸配列は、第３図に表されている。ここに記載する 研究の結果、ヒトＣＡＬＬＡ　　ｃＤＮＡ配列およびラットおよびウサギの中性 のエンドペプチダーゼ２４．］、ｌ（ユンケ７アリナーゼ）の間の顕著な相同性 、およびヒトＣＡＬＬＡのアミノ酸配列およびラットのエンケファリナーゼおよ びウサギの中性のニンドベプチダーゼ分子の間の密接な同一性（すなわち、９４ ％）が示された。

本発明のヒｈ　ＣＡ、　Ｌ　Ｌ　Ａのアミノ酸配列を最近報告されｔ；ヒトエン ケファリナーゼ（または中性のエンドペプチダーゼ）のアミノ酸配列とを比較す ると、２つのポリペプチドのアミノ酸配列は事実上同一であることが示された。

（すなわち、２つの配列は単一のアミノ酸であり、これは配列決定または遺伝子 の多形性の結果であることができる。マルフロイ（Ｍａｌｆｒｏｙ）、Ｂ、ら、 ＦＥＢＳ　　レターズ（Ｌｅｔｔｅｒｓ）、−石■−：２０６−２１０　（１９ ８８）。）引き続いて、また、後述しそして実施例に記載するように、本発明の ｃ　Ｄ　ＮＡによりエンコードされるヒトＣＡＬＬＡの評価は、それが中性のエ ンドペプチダーゼの活性を有する３七、およびその活性が細胞膜の分画に関連し そ）、て特異的中性のエンドペプチダーゼ阻害因子（すなわち、ホスホルアミト ン）により妨害されることが示された。機能的エンドペプチダーゼとしてのＣＡ ＬＬＡの明白な同定は、正常および悪性の両者のリンパ系の機能におけるその潜 在的役割の洞察、および診断および治療の関係（例えば、痛などの処置および解 放においてＣＡＬＬＡを発現する細胞の存在により特徴づけられる病気の条件の 診断）においてその可能な使用の洞察を提供する。

中性のエンドペプチダーゼ２４．１．Ｉエンケファリナーゼは、疎水性アミノ酸 のアミン側鎖上のペプチド結合を切断する、細胞膜に関連する＋　３５−４３　 （１９８２）、この酵素はエンケファリンのＧｌｙ−Ｐｈｅ４結合っを切断する ので、脳においてエンケファリナーゼとして同定された。マルフロイ（Ｍａｌｆ ｒｏｙ）、Ｂ、ら、ネイチＪＰ−（ＮａｔｕｒｅＬ２ヱａ　：５２３−５２６　 （１９８７）：　この酵素は引き続いて多数の他の組織中に見いだされ、これら の組織はその酵素が高いレベルで存在する腎臓を含む。腎臓において、エンケフ ァリナーゼ活性は、基質としてインスリンのＢ細胞を使用して、数年前に同定さ れた中性のエンドペプチダーゼ２４．１１のそれと同一であることが示された。

ケ４８８　（１９７４）Ｈケル（Ｋｅ　ｒ　ｒ）　、Ｍ、Ａ、およびＡ、Ｊ、ケ ニ２４．１１は、化学走性のペプチド、物質Ｐおよびニューロテンシン、オキン トンン、ブラディキニン、アンギオテンシンＩ８よびＩＩを包含する種々の生理 学的に活性なペプチドおよび種々のオピオイドペプチドと反応することが示さｔ ；。コンネリイ（Ｃｏｎｎｅ　ｌ　ｌｙ）、Ｊ、Ｃ。

８７３７−８７４１　　（１９８５）；アルメノフ（Ａｌｍｅｎｏｆｆ）、ニケ ーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、トン、ＩＬ− １を加水分解することが示された。ビーラルト（Ｐ　ｉ　ｅ　ｒ　ａダーゼ２４ ．１１は、末梢血液顆粒球、線維芽、小腸および胎盤を包含する、腎臓および脳 以外の多数の組織中に見いだされた。コンネリイ（Ｃスキー（Ｂｏｒｋｏｗｓｋ ｉ）、、Ｇ、ら、バイオケミカル・ジャーナノヒ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、）、２ ４８：３４５−３５０　（１９８７）；ギ−（Ｇｅｅ）　、Ｎ、Ｓ、ら、生化学 （Ｂ　ｉ　ｏｃｈｅｍ、）、ｌ上ユニ３７７−３８６　（１９８３）；マル７０ イ　（Ｍａ　ｌ　ｆ　ｒｏｙ）　、Ｂ−ら、ＦＥＢＳ　　レターズ（Ｌｅｔｉｅ ｒｓ）、２２９：２０６−２１０　（１９８８）、１．かしながら、リンパ系細 胞は、この酵素活性を有することが従来示されていない。ポラス（Ｂｏｗｅ　ｓ ）、Ｍ、Ａ、　およびＡ、Ｊ、ケ＝　−（Ｋｅｎｎｙ）、生化学（Ｂ　ｉ　ｏｃ ｈｅｍ、）　、２３６　：　８０１−８１０　（１９８６）。エンケファリンが 亜鉛メタロエンドペプチダーゼであることが与えられると、ＣＡＬＬＡをエンコ ードする遺伝子の染色体の位置は３ｑ２１−２７、すなわち、トランスフェリン 、ラクトトランスフェリン、メラノトランスフェリン、トランスフェリン受容体 およびセルロブラスミンを包含する、金属タンパク質に富んだ領域であることは 興味あることである。

実施例１〜４に詳細に記載するように、ヒトＣＡＬＬＡタンパク質はＮａ１ｍ− ６細胞系から抗ＣＡＬＬＡモノクローナル抗体（Ｊ５）および標準の技術を使用 して分離された。Ｎａ１ｍ−６細胞系をリンパ系の芽細胞のクリーゼにある慢性 骨髄性白血病の患者から本来誘導され、そして高い１〆ベルの表面ＣＡ　Ｌ　Ｌ 　Ａを発現することが知られている。フル土ｙ・イＡ、１０ジー（ｊ、Ｔｍｍｕ ｎｏｌ）、上３６　：　３２０　（１９８６）。Ｊ５抗体の使用は、９７−１０ ０ＫＤの大きさの成分の＋４６１表面標識しｆ＝Ｎａ１ｍ−６細胞系から免疫沈 澱を生じたゆエンドグリコシダーゼＦによる消化は、免疫沈澱しｔ；成分の分子 量をほぼｌ０ＫＤだけ減少させた。これにより、ＣＡＬＬＡの分子量の少なくと も１０％はＮ−結合した炭水化物から生ずることが示される。

分離したタンパク買を引き続いて、５！施例において認識しかつ記載する技術を 使用して均質に精製した。ＮＨｆｆｉ末端の配列の情報は、表１に示すように、 完全なＣＡＬＬＡタンパク質からおよびトリプシンのベプチドおよびＶ８プロテ アーゼの断片から得られｔ；。

ＣＡＬＬＡ　　ｃＤＮＡは、Ｎａ１ｍ−６細胞系λｇｔｌＯライブラリーから、 重複オリゴヌクレオチドのプローブを使用して分離した。シップ（Ｓｈｉｐｐ） 、Ｍ、Ａ、ら、プロ・ンーデインダス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・ サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　１．Ａｃａｄ。

Ｓｃ　ｉ、　）　ＵＳＡ％旦：４８１９−４８３２　（１９８８）、　ＣＡＬＬ Ａ　　ｃＤＮＡ配列は７４９アミノ酸の一体の膜タンパク質を予測し、このタン パク質はトランスメンブレン領域およびシグナルペプチドの両者として機能する ことができる、巣−の２４アミノ酸疎水性セグメントを有する。最初のメチオニ ンの切断後装る２５ＮＨ，末端のアミノ酸は、細胞質のティルを形成する。ヒト ＣＡＬＬＡをエンコードするＤＮＡおよびヒトＣＡＬＬＡのアミノ酸配列を、最 も最近のゲンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）の解放（＃５６）におけるデータと比較 すると、ヒトＣＡＬＬＡは中性のエンドペプチダーゼ２４．１１（エンケファリ ナーゼ）、すなわち、ラットの脳およびウサギの腎臓からクローニングした膜結 合した亜鉛メタロエンドペズチダーゼとアミノ酸レベルで９４％の相同性ンスフ エクシヨンした細胞系を引き続いて産生じ、そして感受性酵素のアッセイを特異 的中性のメタロペプチダーゼ阻害因子と組み合わせて使用して、ＣＡＬＬＡがこ の膜結合した酵素の機能的形態であることを実証した。

ネズミトランス７エクション体中のヒトＣＡＬＬＡの発現リンパ芽球性白血病細 胞系から誘導されたＣＡＬＬＡが機能的中性のエンドペプチダーゼ２４．１１活 性を有するどうかを決定するために、免疫グロブリンプロモーターおよびエンハ ンサ−の制御下に、白血病の細胞系からのＣＡＬＬＡオーブンリーディングフレ ームを含有する構成体（ｐＩＧＴＥ／Ｎ　　ＣＡＬＬＡ、）は、細胞表面のＣＡ ＬＬＡの発現を欠く、ネズミの骨髄腫細胞系に操作およびトランスフェクション した。

Ｇ４１８び選択後、ＣＡＬＬＡ十Ｊ５５８細胞をＪ５抗ＣＡＬＬＡモノクローナ ル抗体でフェノタイピング（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）することによって同定し 、貯蔵しそして制限希釈培養法によりクローニングした。それぞれ、高いおよび 低いレベルのＣＡＬＬＡの発現を有する、２つのＪ５＋サブクローン、Ａ２−３ およびＡ２−２をそれ以上の分析のために選択した。第２図はこれらの２つのＣ ＡＬＬＡ＋の安定なトランスフェクション体、親のＣＡＬＬＡ−多重骨髄腫系統 、Ｊ５５８、ｃＡＬＬＡ　　ｃＤＮＡを分離したＣＡＬＬＡ十急性リンパ芽球性 白血病系、Ｎａ１ｍ−６の比較を表す。示すように、Ｊ５５８は検出可能な試料 表面のＣＡＬＬＡの発現を欠く（平均のチャンネル蛍光０）。Ａ２−３およびＡ ２−２はｍ脳表面のＣＡＬＬＡを発現する。Ａ２−３はＡ２−２より実質的に高 い数／細胞のＣＡＬＬＡ部位を発現する（平均のチャンネル蛍光は、それぞれ、 １１６．８および７．６）ことに注意すべきである。Ａ２−３およびＡ２−２の 平均のチャンネル蛍光をＮａ１ｍ−６の平均のチャンネル蛍光（１７２，６）と 比較すると、Ａ２−３はＮａ１ｍ−６のそれお６７．７％のレベルでＣＡＬＬＡ を発現するが、Ａ２−２はＮａ１ｍ−６のレベルのわずかに４．４％でＣＡＬＬ Ａを発現する。

Ａ２−３、Ａ２−２、Ｊ５５８およびＮａ１ｍ−６の系統に関連する中性のエン ドペプチダーゼ活性は、２つのアプローチにより評価した。

基質グルタリール−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−４−メトキシ−２−ナフチルアミ ドの切断に基づく感受性の蛍光測定のアッセイを、実施例７に記載するように、 使用した。表２は、個体の細胞集団の全細胞懸濁液を使用して実施した、酵素の アッセイの結果を示す。Ｎａ１ｍ−６、Ａ２−３、Ａ２−２およびＪ５５８の細 胞懸濁液は、それぞれ、１０’細胞当たり、４７８９．１９０６．４４６および ０．２ナノモルの産生物の中性のエンドペプチダーゼ活性を示した。０．２ナノ モル／時間／１０６細胞の値は、活性のもｔ；ない実験誤差内である。

中性のエンドペプチダーゼ活性に対するＮａ　１ｍ−６、Ａ２−３およびＡ２− ２細胞懸濁液への特異的な阻害因子のホスホルアミトンの添加の作用は、また、 評価した。それは、それぞれ、５３．５２および１８ナノモル／時間／１０＠細 胞への活性の顕著な減少が生じた（表２）。

７ジン（Ｈｕｄｇｉｎ）、Ｒ，Ｌ、ら、ライフ・サイエンシズ（Ｌｉｆｅ　　Ｓ ｃｉ、）、２９＋２５９３−２６０１　（１９８１）−表３に示すように、Ｎａ １ｍ−（３、Ａ２−３、Ａ２−２およびＪ５５８からの細胞リゼイトは、それぞ れ、９．９６．２．３５．１．１８および０．０８ナノモル／分／ｍｇの中性の エンドペプチダーゼ活性のタンパク質の中性のエンドペプチダーゼの比活性を含 有した。アッセイはホスホルアミトンの存在下に実施したとき、Ｎａ１ｍ−６、 Ａ２−３およびＡ２−２細胞のリゼイトに関連する中性のエンドペプチダーゼ活 性は、それぞれ、０．２０．０．０８および０．２９ナノモル／分／ｍｇタンパ ク質に劇的に減少した（表３）。１５５８細胞中の見掛けの活性がホスホルアミ トンの阻害に対して不感受性であるという観察は、この低いレベルの見掛けの活 性が中性のエンドペプチダーゼ２４．１１の１こめでなくそして活性のない実験 誤差の範囲内にあることを示唆する。中性のエンドペプチダーゼ２４．］、１お よびＡ２−３細胞の細胞下分画は、Ｎａ１ｍ−６の１００％およびＡ２−３中性 のエンドペプチダーゼ活性の９５％以上が膜分画と関連することを実証した（表 ３）。中性のエンドペプチダーゼ活性のレベル（表２および３）および４つの細 胞系のＣＡＬＬＡの発現ルベルの比較（第５図）は、中性のエンドペプチダーゼ 活性と細胞表面のＣＡＬＬＡの発現との間の相関関係の存在を示した。

ここに記載する研究の結果から明らかなように、ヒトＣＡＬＬＡは活性な中性の エンドペプチダーゼ２４．１１　　（エンケファリナーゼ）の機能的形態である 。ＣＡＬＬＡタンパク質が早期の正常のリンパ系の子孫およびそれらの悪性の相 手の両者上に存在し、そして急性りレバ芽球性白血病からのＣＡＬＬＡ　　ｃＤ ＮＡが中性のエンドペプチダーゼ２４゜１１をエンコードするという事実は、酵 素がリンパ系の分化において重要な段階において機能することを示す。これは、 細胞表面の結合した酵素が種々の組織において広い範囲の生物学的活性を仲介す る潜在性を有することを実証する、従来の研究に照らしてとくに興味ある。例え ば、中性のエンドペプチダーゼ２４．１１（エンケファリナーゼ）は、脳中のニ ューロン上の内因性オピオイドペンタペプチド、多形核の顆粒球上の化学走性ペ プチド（ｆ−Ｍｅ　ｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ）および腎臓の近位の細管の上皮細胞の 表面上の種々の調節ペプチドを不活性化することが示された。バーシュ（Ｈｅ　 ｒ　ｓ　ｈ）　％　ｌ−Ｂ１、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー （Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）、土ヱ：３５−４３　（１９８２）：マルフ ロイ　（Ｍａ　Ｉ　ｆ　ｒ　０３’）　、Ｂ−ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ） 、２ヱ６：５２３−５２６　（１９７８）；コン不すイ（Ｃｏｎｎｅ　ｌ　ｌｙ ）、Ｊ、Ｃ，ら、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・ サイエンジズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　Ｉ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）工且Δ、８２　：　８７３７−８７４１　（１９８５）： ガラフォード（Ｇａ　ｆ　ｆ　ｏ　ｒｄ）、１．Ｔ、ら、生化学（Ｂ　ｉ　ｏ　 ｃ　ｂｅｍ−）、λλ：３２６５−３２７１　（１９８３）。３種における３つ の組織源（脳、腎臓および胎盤）からならびにヒトリンパ芽球性白血病細胞系か ら誘導さねｔ；酵素のアミノ酸配列は、事実上同一であることが示された。これ らの結果は、亜鉛の結合、基質の結合および触媒分解のための重要な機能的ドメ インの保存を説明する。シップ（Ｓｈｉｐｐ）、８５　：　４８１９−４８２３ 　（１，９８８）；マル７０イ（Ｍａ　ｌ　ｆ　ｒｏｙ）ｍ、）、ｊ４４５９− ６６　（１９８７）；デバウルト（Ｄｅｖａ、ｕｌｔ）、Ａ、ら、旦Ｍ旦旦−ｊ ヤーナル（Ｊ、−Σ−１６．１３１７−１３２２　（１組織における酵素の構造 の同一性に照らして、ＣＡＬＬＡ／中性のエンドペプチダーゼ２４．１１の生物 学的活性は、酵素の異なる機能的形態の存在によるよりむしろ、個々の器官にお ける特異的基質の有効性により検出さねるように思わねる。早期のリンパ系の子 孫の細胞表面のＣＡＬＬＡ／中性のエンドペプチダーゼ２４．１１のｊ；めの基 質は、まだ知られていない。しかしなが呟中性のエンドペプチダーゼ２４．１１ の前の研究は、酵素のｔ：めの最適な基質は大きいタンパク質よりむしろ小さい ペプチドであることが示された。結局、ＣＡＬＬＡ、／中性のエンドペプチダー ゼ２４．１１は、また、リンパ系の子孫の細胞表面における小さい調節ペプチド と反応することができるように思われる。このような作用は、生理学的に活性な ペプチドの不活性化に導くか、あるいは不活性な形態のペプチドを活性なものに 転化することができるであろう。

リンパ系の子孫のためのＣＡ、　Ｌ　Ｌ　Ａ基質は、前に定義されたペプチドで ありうる。

中性のエンドペプチダーゼ２４．１１は、従来リンパ系の細胞上で同定されてき ていない。しかしながら、節の組織中で検出された。ポウウェー８１０　（１９ ８６）。ブタのリンパ節において、この酵素は線維芽の形態学的特性をもつ付着 細胞の下位集団上で発見される。ポウウェス（ＢＯ（１９８６）、これらの細胞 は、髄質領域中に最も広く分布しそして、また、小胞の中心に見いだされそして それらを取り囲む。興味あることには、これらの中性のエンドペプチダーゼ２４ ．１１＋細胞はそれらの細胞表面にしっかり結合し、たりンバ系の細胞のクラス ターを有することが観察される。ポウウェス（Ｂｏｗｅ　ｓ）、Ｍ、Ａ、および Ａ、Ｊ、ケＪ、）−１＾ユ６：８０１−８１０　（＋９８６）。扁桃、牌臓、胸 腺およびバイヤー三において、中性のエンドペプチダーゼ２４．１１＋細胞はリ ンパ節中に見られるものに類似する網状パターン中に存在し、ここで酵素は非常 によりｉ列−？〈豊富に存在する。ポウウェス（Ｂｏｗｅｓ）、Ｍ、Ａ　。　、 ’９ｅ４．’＄　　（ｌ　　ｍｍｕ、　　ｎ　　ｏ　　１．　　ｏ　　Ｈｙ）７ １８、６０：２４７−２５３　　（１９８７）。リンパ系の組織中の中性のエン ドペプチダーゼ２４．１１＋網状細胞の同定により促進された最近研究は、この 酵素がＩＬ−１を生体外で不活性化し、そして投与量依存性の特異的に阻害可能 な方法でり〉・バ球を阻害することを示す。ビエラルト（Ｐｉｅｒａｒｔ）、Ｍ 、Ｅ。

ら、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ）、１４０＋３８０ ８−３８］　１　　（１９８７）。

前述のように、ＣＡＬＬＡ／中性のエンドペプチダーゼ２４．１１は基質として 化学走性ペプチドを切断する。コン不すイ（Ｃｏｎｎｅｌ１表面上のＣＡＬＬＡ ／中性のエンドペプチダーゼ２４．１１の存在は、この酵素が、多分化学走性ペ プチドの局所的濃度を減少することにより、下の（ｄ　ｗ　ｎ　）調節化学定性 のプロセスにおいて重要な役割を演じうろことを示唆する。モルフインによる慢 性の処置は、脳のニンケファリナーゼ活性の選択的、特異的増加を誘発し、同様 にこの酵素がオピオイド神経伝達物質の局所的濃度を調節できること、およびこ のような神経伝達物質の濃度が１．まｌ；、酵素のレベルに影響を与えうろこと を示す。マル７０イ　（Ｍａ　ｌ　ｆ　ｒｏｙ）　、Ｂ、　ら、ネイチャー（Ｎ ａｔｕｒｅ）、ｌヱ６：５２３−５２６　（１９７８）。

早期の研究は、ＣＡＬＬＡ＋リンパ系の細胞の特異的抗体の処理が、ＣＡ、　Ｌ 　Ｌ　Ａ−抗体複合体の急速な細胞表面の再分布、内在化およ分解をヱブ・イム ノロジー（Ｊ、ＩｍｍｕｎＯｌ）、上２５　：　）５０６−１５１４　（１９８ ０）。ＣＡＬＬＡの抗体誘発変調は、ペプチドホルモンにより誘発される細胞表 面の１／セプターの特異的な下の調節または損失に類似することが認められた。

ボルドスティン（Ｇｏ　ｌｄｓ　ｔｅ　ｉｎ）、ｒｅ）（Ｌｏｎｄｏｎ）、２８ ０：１０９−１１６゜ＣＡＬＬＡは機能的リンパ系の中性のエンドペプチダーゼ ２４．１１をエンコードし、こうして、そのペプチド配位子は、また、細胞表面 のＣＡＬＬＡを変調するように思われる。これは配位子の効率よい内在化を生じ うる。このような推定上のペプチドは未成熟の正常または悪性のＢ細胞の移動、 増殖または他の機能的面に影響を与えるかどうかはまだ知られていない。しかし ながら、機能的中性のエンドペプチダーゼ２４．１１（エンケファリナーゼ）と してのＣＡＬＬＡの明白な同定および特異的エンドペプチダーゼ阻害因子の入手 可能性（オ１．リンパ系の発生におけるＣ　Ａ、　Ｌ　Ｌ　Ａの役割の評価を可 能とするであろう。

ヒトＣＡＬＬＡをエンコードするＤＮＡ、ＣＡＬＬＡ、、ＣＡＬＬＡと反ヒトＣ ＡＬＬＡをエンコードするＤＮＡ、ＣＡＬＬＡまたはその断片討よびＣＡＬＬＡ と反応性の抗体は、診断および治療の両者の応用を有する。

例えば、ヒトＣＡＬＬＡをエンコードするｃＤＮＡは、当業者において知られて いる技術（例えば、実施例において詳述するもの）により、ＣＡＬＬＡの産主に 使用することができる。例えば、第３図のヌクレオチド配列ののすべてまたは一 部分を有するＤＮＡは、適当な宿主細胞中に導入することができ（一般に、ベク ターの１成分として）、ここでそれは引き続いて調製されそしてそれからそれを 分離することができる。

このＤＮＡは既知の技術（例えば、同時培養、エレクトロボレイション）により 細胞中に導入することができる。このようにして導入されたＤＮＡは、ここに記 載するように、分離することができるか、あるいは機能的ＣＡＬＬＡをエンコー ドするＤＮＡであることができる（例えば、同等のＤＮＡと呼ぶＤＮＡ、これは 機能的ＣＡＬＬＡをエンコードすると第３図に表されているものに十分に類似す る配列を有する）。用語ｃＤＮＡは、ここで使用するとき、任意の手段により産 生されるか、あるいは得られるＤＮＡを包含することを意図し、これは第３図に 表す配列または同等のＤＮＡを有する。ＣＡＬＬＡをエンコードするＤＮＡを使 用してＣＡＬＬＡのすべてまたは断片を産生することができる１つの方法は、次 の通りである・ ＣＡＬＬＡまｌ；は所望のＣＡＬＬＡの断片をエンコードするヒトｃＤＮＡ配列 （例えば、トランスメンブレン領域を越えて発現されるＣＡＬＬＡの部分のみを エンコードする配列）を、普通の技術を使用して、適当な発現ベクター中に導入 することができる。例えば、所望のｃ　ＤＮＡは、米国特許第４，６５６．１３ ４号（Ｒｉｎｇｏｌｄ）、その開示をここに引用によって加える、に記載されて いる発現ベクター中に挿入することができる。次いで、生ずるプラスミドを使用 して哺乳動物細胞を形質転換することができ、そしてヒトＣＡＬＬＡの断片を普 通の方法に従いそれらの細胞および／まｔ；はそれらの培地から分離および精製 することができる。

それらのグリコジル化されない形態において、ポリペプチドはバクテリアの宿主 （例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ）中の産生ずることができる。所望の断片をエンコード するｃＤＮＡは、例えば、デベル（ＤｅＢｏｅｒ）２１　（１９８３）に記載さ れている発現ベクター中に挿入することができる。次いで、生ずるプラスミドを 、普通の方法に従い、使用してＥ。

ｃｏｌｉ細胞を形質転換し、モしてＣＡＬＬＡ断片を分離および精製することが できる。

嬉３図のヌクレオチド配列のすべてまｔ；は一部分は、また、プローブとして使 用して、問題の試料（例えば、細胞）中のＣＡＬＬＡをエンフードするＤＮＡを 検出し、同定しおよび／または定量することができる。

これらのプローブは、一般に、標識されており（例えば、放射線、酵素などで） そして標準の技術において使用することができる。

本発明のＣＡＬＬＡポリペプチドは、例えば、治療の目的で使用することができ る。これに関して、可溶性ＣＡＬＬＡ断片（例えば、細胞のトランスメンブレン 領域を越えて延びるＣＡＬＬＡ領域の部分のすべてまたは一部分）はとくに有用 である。可溶性ＣＡＬＬＡ断片は、製剤学的に許容されうる担体物質、例えば、 生理的塩類溶液と混合し、そして医学的に許容されうる投与のルート（例えば、 静脈内、筋肉内、または経口的）により、病気に関連するＣＡＬＬＡを有する細 胞の存在により特性決定される医学的状態に悩まされる患者に、ＣＡＬＬＡを有 する細胞の増殖を阻害するために十分な量で投与することができる。可溶性ＣＡ ＬＬＡ断片は、表面結合したＣＡＬＬＡの自然の結合の事象を競合的に阻害する ことによって機能し、前記事象はこのような細胞（例えば、急性リンパ芽球性白 血病綿Ｍ！ｉ）の増殖および／または移動性のために必要である。可溶性ＣＡＬ ＬＡ断片の投与量は、個々の基準に基づいて決定されるが、一般にほぼｌＯμｇ ／ｋｇ体重〜はぼ５０μｇ／ｋｇ体重／日であろう。

本発明の結果として、従来入手不可能であった診断的に有用な抗体をつくること ができる。ＣＡＬＬＡのアミノ酸配列が今回提供されたので、その分子の所定の 領域に相当する合成ペプチドを日常的につくることができ、そしてそのペプチド を使用して高度に特異的な抗体をレイズすることができる。各々がＣＡＬＬＡの 異なる領域に対して特異的である、２つの抗体は、イムノアッセイ、例えば、標 的分子上の２つの異なる部位に結合する、２つの異なる抗体を必要とするサンド イッチアッセイにおいて使用することができる：このようなアッセイは、例えば 、米国特許第４．３７６．１１０号（Ｄａｖｉｄら）、その教示をココニ引用ニ よって加える、に記載されている。

本発明により可能とされる抗体の他の重要なりラスは、変性されたＣＡＬＬＡ　 （すなわち、その自然の三次元のコンフォメーシミンを損失しｔ：ＣＡＬＬＡ） と反応性の抗体である。このような抗体は、そのタンパク質の正常の７オルデイ ングを防止するアミノ酸置換を含有するＣＡＬＬＡ断片まｔ；はＣＡＬＬＡ類似 体で動物を免疫化することによって、つくることができる。これらの抗体はホル マリン中で固定しｔ；病原性標本の分析にとくに有用であり、その方法は、例え ば、リンパ節中の癌細胞上に存在するＣＡＬＬＡを変性する。その三次元の構造 を保持する、自然ＣＡＬＬＡに対して作られた抗体は、変性したＣＡＬＬＡと非 反応性であり、こうしてホルマリン固定した標本中のＣＡＬＬＡを有する細胞の 検出に使用することができない。変性したＣＡＬＬＡと反応性の抗体は、標識し く例えば、蛍光色素で）そして病理学の分野において標準である免疫蛍光手順に おいて使用することができる。

ここにおいて提供されるＣＡＬＬＡの理解は、一般の鎮痛薬として使用すること ができる「薬物」硫酸アンモニウム使用することができる。

エンケファリンは、痛みの知覚ならびに他の機能に関連する中枢神経系の領域に 存在する、内因性オピオイド様ペンタペプチドである。前述のように、中性のエ ンドペプチダーゼ２４．１１（エンケファリナーゼ）は脳中のニューロン上の内 因性オピオイドペンタペプチドを不活性化することが示された。すなわち、中性 のエンドペプチダーゼ２４．１１（エンケファリナーゼ）は、生体外および生体 内の両者において、オピオイドペンタペプチド、エンケファリンのＧｌｙ’−Ｐ ｈｅ”アミド結合を切断することが知られている。非経口的に活性エンケファリ ナーゼ防害因子（アセドルファン）は、ヒトにおいて鎮痛性質を表すことが示さ れた。

マル７ｏイ（Ｍ　ａ　ｌ　ｆ　ｒ　ｏ　ｙ　）　ｓ　Ｂ　、ら、ＦＥＢＳ　　レ ターズ（Ｌｅｔｔ　ｅ　ｒ　ｓ）、２２９：２０６−２１０　（１９８８）、ラ ットおよびウサギの中性のエンドペプチダーゼ２４．１１はエンケファリンを切 断する二とが示された。ここに記載するように、ＣＡＬＬ、ＩＮま機能的中性の エンドペプチダーゼ活性、ならびにアミノ酸レベルにおいてヒトのエンケファリ ナーゼおよびラントのエンケファリナーゼおよびウサギの中性のエンドペプチダ ーゼ分子と顕著な類似性を有することが示された。こうして、オピオイドペンタ ペプチドを切断し、内因性オピオイド（このオピオイドは鎮痛作用を生成する） の延長し、増大した濃度を産生ずるＣＡＬＬＡ／中性のエンドペプチダーゼ２４ ．１１の能力を妨害することができる物質を設計できるであろう。

本発明に基づ（１て、ま！―、細胞の白血病の増殖または挙動を阻害／減少する ＣＡＬＬＡの阻害因子を設計することができる。例えば、ＣＡＬＬＡｔま白血病 の増殖または挙動に影響を及ぼしうる（増大しうるン酵素の機能を示す。本発明 の結果として、ＣＡ　Ｌ　Ｌ　Ａに結合しかつその酵素活性を減少または排除す るＣ　Ａ　Ｉ−Ｌ　Ａの阻害因子を設計し、そしてこのような増殖の阻害に使用 することができる。別のアプローチは、ここに提供する知識、および白血病の細 胞の増殖に含まれるＣＡＬＬＡの自然の配位子が存在すると思われるという事実 に基づく：この推定上の自然配位子ＣＡ　Ｌ　Ｌ　Ａに結合１．そして、切断後 、活性となることができる。

こうして、自然ＣＡ、　Ｌ　Ｌ　Ａ配位子の結合を阻害する（例えば、ＣＡＬＬ Ａｌ二結・ａじ、こうして、ＣＡ　Ｉ−Ｌ　Ａの自然配位子の結合を防止するこ とによるか、あるいは自然配位子に結合１、そして、再び、ＣＡＬＬＡの自然配 位子の結合を防止することによって）「人工的配位子」を設計することができる 。

次の実施例によって、本発明をさらに説明する。こね、らはいかなる方法（−お いても限定を意図しない。

実施例Ｉ　　ＣＡＬＬＡタンパク質の分離および特性決定ＣＡＬＬＡタンパク質 を分離するために、Ｎａ１ｍ−６系ヲ、抗ｃＡＬＬＡモノクローナル抗体Ｊ５と 組み合わせて、細胞源として利用しＩ；。

リッツ（Ｒｉ　ｔ　ｚ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５８４５４　（１ ９５７）、Ｎａ　１ｍ−６細胞系は、リンパ系芽細胞りリーゼの患者から本来誘 導し、そして高いレベルの表面ＣＡ、　Ｌ　Ｌ　Ａを発現することが知られてい る。フルウィツ（Ｈｕ　ｒｗｉ　ｔ　ｚ）ら、癌（Ｃａｎｃｅｒ）、２３　＋１ ７４　（１９７９）；ゴールドマチャ−（Ｇｏ　Ｉ　ｄｍａｃｈｅ　ｒ）ら、ジ ャーナルφオブ・イムノ計ジー（Ｊ、１ｍｍｕｎｏｌΣ、１３６コ３２０　（１ ９８６）。Ｊ５抗体は９７−１００ＫＤの構造体を１２５１表面標識した細胞か ら免疫沈澱することが発見された。エンドグリコシダーゼＦで消化した後、ＣＡ ＬＬＡの分子量はほぼ］、ＯＫＤだけ減少し、ＣＡＬＬＡの分子量の少なくとも １０％がＮ結合した炭水化物から生ずることを示す。二次元の電気泳動は、ＣＡ ＬＬＡタンパク質が巣−のポリペプチドとして移動し、制限された微小異質性を 示すことを実証する。

ニューマン（Ｎｅｗｍａｎ）ら、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ）、±２６　：　２０２４　（１，９８１，）。

鮮 ％ａｌｒｎ−６Ｗｉ胞（３ＸＩＯ’）をラクトベルオキンダーゼを使用して放射 線ヨウド化し、そして１％のトリトンＸ−１，００，０，１５モルのＮａＣｌ、 ＩミリモルのＰＭＳＦ、８０ミリモルのヨウドアセトアミド、０．０２μｇ／ｍ Ｑのトリプンン阻害因子および０．５ｍｇ／ｍｆｆの各キモスタチン、ロイペプ チン、ペプスタチンおよびアントベインを含有するＲＩＰＡ緩衝液中で溶解した 。７アビ（Ｆａｂｂｉ）ら、ネイチャー（Ｎユ」」−り先と、３１２・２６９　 （１９８４）、超遠心しｔ；リセイ［・をプロティンＡセファローズ（Ｓｅｐｈ ａｒｏｓｅ）にカップリングした免疫前のウサギＩｇおよびマウスモノクローナ ル抗体抗β２ミクログロブリンで順次に予備清浄化し、モしてＣＡＬＬＡをプロ ティンＡセファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）にカップリングしたマウスモノク ローナル抗体Ｊ５で免疫沈澱させた。抗ＣＡＬＬＡビーズを、次のもので洗浄し ノ：：　１）ＴＢＳ／１％ＤＯＣ；　２）ＴＢＳ／１％ＤＯＣ１０゜０５％ＳＤ Ｓ；および３）ＴＢＳ／１％ＮＰ４０゜結合Ｌ　タＣＡ　Ｔ−Ｌ　Ａを５％の２ −メルカプトエタノールを含有するＳＤＳ試料緩衝液で溶離した。エジドーＦグ リコシダーゼ処理を実施し、そして試料のアリコートを１０％の５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅで処理しておよび処理しないで分析した。

ルエシャー（Ｌｕｅｓｈｅｒ）およびブロン（Ｂｒｏｎ）、ジャーナル・才ブ・ イムノロジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ）、上３４　：１０８４　（１９８５）。

ＣＡ　Ｌ　Ｌ　Ａタンパク質の調製的分離のために、ＩＱＩＩのＮＢｌｍ−５細 胞を前述のように４００ｍ４の溶解緩衝液中で４℃において１時間溶解した。′ ｍ＠のリゼイトを３０ＱＯＸｇで２０分間遠心した。上澄み液をソジウムデオキ シコレート中で０．５％とし、そして１５０．０００×ｇで６０分間超遠心した 。ヨウド化Ｎａ１ｍ−６細胞（３ＸＩＯ’）をＯ−５ｍＱの溶解緩衝液で処理し 、そして大観、撲の調製のために添加する。−緒にしたリゼイトを次のカラムに 適用した：３２ｍＱ／時間で、無関係のマウスモノクローナル抗体抗Ｔ３　（８ Ｃ８）　、抗Ｔ　ｉ　３　（９Ｈ５）、およびプロティンＡ−セファローズＣＬ −４Ｂビーズに５ｍｇ／ｍＱでカップリングしｌ；抗β２ムクコグロブリンを含 有するｌ０ｒｒ＋＋２の「予備清浄」免疫吸収剤のカラム、次いでプロティンＡ −セファローズビーズに５ｍｇ／ｍＩ２でカンプリングした抗ＣＡＬＬＡ抗体（ Ｊ５）を含有する５ｍ＋Ｑの特異的抗体のカラム。抗Ｊ５カラムを順次に１０ミ リモルのトリス、ｐＨ８１０，１５モルのＮ　ａ　Ｃｌおよび１）０．０５％５ ＤＳ１０．５％ＴＸ−１００／１％ＤＯＣ；２）ｏ、５％ＴＸ−１００，１％Ｄ ＯＣ、および３）０．５％ＴＸ−１００の５０ｍＱのアリコート。結合しｔ；物 質を０．１モルのグリシン、ｐＨ３，０１０，５％トリ；・ンＸ　−１００で溶 離し、そして１ｍρの分画で６０μαの１モルのトリス、ｐ　Ｈ８を含有する管 中に集めた。引き続いて、■００μＱの１０％ＳＤＳを容管に２２℃において添 加した。

放射能を含有する分画をプールし、グリセロール中で１０９６　（ｖ／ｖ）と、 そしてＮａＤｏｄｅＳＯ４中で２％とし、６０℃２０分間加熱し、そして１０％ の調製用（３ｍｍの厚さ）ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動にかけた。０． ５ｃｍのゲルのストリップを乾燥し、そしてオートラジオグラフィーにかけ、そ して残りをクーマツシーブルーで着色した。ＣＡＬＬＡを含有する着色したバン ドを、オートラジオグラフィーにかけたストリップにより示すように、表面標識 したＣ　Ａ、　Ｌ　Ｌ　Ａの移動と比較して局在化した。１００ＫＤのＣＡＬＬ Ａのバンドを０．１％のＳＤＳを含有する５０ミリモルの重炭酸アンモニウム中 で電気溶離し、そしてアリコートを定量し、そして純度についてＮａＤｏｄｅＳ Ｏ４／ＰＡＧＥで分析し、次いで銀着色により分析した。分析において、ＣＡＬ ＬＡタンパク賞は均質に精製されたことが示された。

５０ピコモルの精製したＣＡＬＬＡをアミノ末端の配列決定にかけ、そして５ピ コモルのみのシグナル（ＸＸＳＥＳＱ）が得られ、ＣＡＬＬＡは大部分Ｎ末端が エドマン分解に対してブロッキングされていることが示唆される。この理由で、 ＣＡＬＬＡをトリプシンおよび■８プロテアーゼで消化しｆ：、５０ミリモルの 重炭酸アンモニウム１０．１％のＳＤＳ中の電気溶離し？：ＣＡＬＬＡの４００ ピコモルをｖ８プロテアーゼ［ベーリンガー・マンヘイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ ｒ　　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）］　と混合して、タンパク質／酵素の比を５：ｌとし た。３７℃において１時間および２２°Ｃにおいて１６時間インキュベーシッン しｔ；後、試料をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中で０．１％とし、そして逆相Ｃ ｌ８ＨＰＬＣカラムに適用して、後述するように断片を分離した。各Ｖ８断片の アリコートを、ＮａＤｏｄｅＳＯａ／ＰＡＧＥおよび引き続く銀着色により分析 した。

１ナノモルの電気溶離しｔ：ｃＡＬＬＡを０．１モルのトリス−ＭＣＩｐＨ８／ ２０ミリモルのジチオスレイトール／２％のＳＤＳで構成し、そして６０分後、 ヨウド酢酸中で５０ミリモルにした。次いで、還元したＳ−カルボキンメチル化 調製物を一２０℃において１６時間９体積のエタノールの添加により沈澱させ、 ０．１モルのトリス−ＭＣＩ　　ｐＨ８／２ミリモルのＣａＣ１，中に溶解し、 ＴＰＣＫ　トリプシン（Ｃ００ｐｅｒ）と混合して、タンパク質／酵素比を５０ ：１とし、そして３７℃において１６時間インキュベージ１ンした。ＴＦＡをＯ ，１％に添加し、そしてミクロ遠心後、上澄み液を逆相ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｋ、 ＴＰ５４．４．６ｍｍＸ２５ｃｍ、５μＣｌ　８）に１ｍＱ／分でかけ、００１ ％のＴＦＡで溶離し、ダイオード列の検出器（Ｈｅｗｌ　ｅ　ｔ　ｔ−Ｐａｃｋ ａｒｄ）を装備したＨＰ１０９０クロマトグラフを使用した。５０分かけて０− ５０％のアセトニトリルの勾配を確立し、１ｍＱの溶離分画を集めた。選択しｔ ；分画をさらにＨＰＬＣにより１５分かけて２５−４５％のアセトニトリルの勾 配を使用して１ｍ１２／分の流速で精製し、そしてＯ−５ｍＱの分画を集めた。

次いで、ＣＡＬＬＡタンパク質、ｖ８断片、およびトリプシンペプチドをＮ末端 配列について、プログラム０３ＰＴＨを装備した気相タンパク質配列決定装置［ アプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、 ４７ＱＡｉ］で分析した。

３つの純粋なＶ８断片を同定および配列決定すると、表１に示す残基が得られた 。

２・ σ・ ｖ８ペプチドＩＩＩは完全なＣＡＬＬＡタンパク質から得られるものと同一の配 列を含有し、ｖ８ペプチドＩＩＩは部分的にブロッキングされｆニー　Ｎ　Ｈ２ 末端から誘導されることを示す。

トリプシン消化の産生物の逆相ＨＰＬＣ分離は、少なくとも８０の異なるピーク を生じた（第１図）；これらのうちの８つを別の勾配を使用するそれ以上のＨＰ ＬＣのために選択し、表１に示す配列をもつ１１のトリプシンペプチドを得た。

トリプシンペプチドＶＩＩＩおよびｖ８ペプチドｌは、オーバーラッピングする アミノ酸配列ＬＮＹＫＥＤＥＹＦＥＮＩＩＱＮを含有する。（ＴＰＶＩＩＩ中の りジン残基は酵素により切断されないように思われた。なぜなら、リジン残基の トリプシン消化および引き続くＣ末端の酸性アミノ酸は無効であるからである。

クンニゲハム（Ｃｕｎｎ　ｉ　ｎｇｈａｍ）ら、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、 上λｇｔｌＯｃＤＮＡライブラリーの構成に利用した。グブラー（Ｇｕｂｉｅｒ ）、Ｖおよびホフマン（Ｈｏ　ｆ　ｆｍａｎ）、Ｂ、Ｓ、　、ａｆｉｘ±（Ｇｅ ｎｅ）、２５：２６３　（１９８３）；マイアーズ（Ｍｙｅｒｓ）ら、ＰＮＡＳ 、ヱ７　：１３１６　（１９８４）、；フンス（Ｈｕｙｎｔｈ）ら、ＤＮＡクロ ーニング技術（ＤＮＡ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ　　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）、０ｘｆｏ ｒｄ　　Ｐｒｅｓｓ　（１９８４）ｏオリゴ（ｄＴ）でプライミングしたｌＯμ ｇのポリＡ十ＲＮＡを逆トランスクリプターゼでコピーした。ＲＮアーゼＨおよ びＤＮＡポリメラーゼｌを利用して第２鎖を合成した。内因性ＥｃｏＲ１部位の メチル化後、ｃＤＮＡを平滑末端にし、ＥｃｏＲＩリンカ−に結合し、モしてＥ ｃｏＲＩで消化しｔ；。

ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａをバイオゲル（Ｂ　ｉ　ｏＧｅ　１）Ａ５０カラムで大きさで分 画し、過剰のリンカ−および７００ＢＰより小さいｃＤＮＡを除去１１、引き続 いて３ｇ＋１０のＥｃｏＲ１部位中に結合し１、そして生体外でバッケーＣＡ　 Ｌ　Ｌ　ＡをエンコードするｃＤＮＡを分離するために、トリプシンおよびｖ８ ベブナドからのアミノ酸配列に相当する余分のオリゴヌクレオチドのプローブを 使用してＮａ１ｍ−６λｇｔｌｏ　　ＣＤＮＡライブラリーをスクリーニングし た。余分オリゴヌクレオチドのプローブをアプライド・バイオシステムス（Ａｐ ｐｔｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｒｎｓ）３８１Ａ型ＤＮＡ合成装置で合成し、 そしてそれらの５”末端で標識しｔ−。フィルターを適当なオリゴヌクレオチド のプローブと１６Ｂｌ？間５ｘ　　ＳＳＣ／１５Ｘデンハルト／Ｉ　Ｏμｇ／ｍ Ｑの５ＳＤＮＡ１０゜１％５ＤＡ１０．０５％ＮａＰｉＰＯ，中でハイブリダイ ゼーンｓ”ｙし、そして６ｘＳＳＣ１０，］％ＳＤＳ中で洗浄した。ハイブリダ イゼ＝ンヨンおよび洗浄の最後の温度は、オリゴヌクレオゲート＃ｌについて４ ４℃および′４８℃、オリゴヌクレオチド＃２について２６℃および３０’ｃｂ そしてオリゴヌクレオチド＃３について３８℃および４２℃であった。

オリゴヌクレオチド＃ｌ　　（３’　ＴＴＹ−ＣＴＹ−ＣＴＲ−ＣＴＹ−ＡＴＲ −Ａ、’１−ＣＴＹ−ＴＴ’５’　、Ｙ−ＴまたはＲ−ＡまたはＧ）、これはＴ Ｐ　　ＶｌｉｌおよびＶＰＩの両者において８アミノ酸に相当する（表１）、を 最初のスクリーニングにおいて便用した。、陽性のクローンを、オリゴヌクレオ チド＃１において表したものに対してＮＨ，末端の６アミノ酸残基に相当する、 第２オリゴヌクレオチド（３’　ＴＴＲ−ＴＴＲ−ＣＴＹ−ＡＴＲ−ＲＡＮ−Ｃ Ｔ５’　、Ｎ−Ａ、Ｔ、、Ｃまｆ−ハＧ　）で再スクリーニングしＩ；（表１） 。両者のプローブに対して相補的な配列を含有するクローンからのｃＤＮＡイン サー］・をさらに分析しＩ；。各二重の陽性クローンはほぼ１．６Ｋｂの大きさ の同一のＥｃｏＲＩ断片を含有し、そしである種のクローンはより小さい大きさ の追加のＥｃ。

Ｒ１断片を含有した。Ｒ長のｃＤＮＡインサート（はぼ３．５Ｋｂ）を含有する クローンをｍ１３ベクタ−ｍｐｌａ中にスクリーニングし、そしてクローン１． ｌ　（］　２．１）と呼ぶ。完全なＮＨ，末端を含有する、オーバーラッピング クローン、ｌ、１　（５″　４−１）を、Ｖ８ペプチドｌ１１ｉ：相当するオリ ゴヌクレオチド＃３　（３’　ＧＴＹ−ＴＡＣ−ＣＴＲ−ＴＡＤ−ＴＯＮ−ＣＴ Ｎ−ＴＡ５’　、Ｄ−１，Ｇｔ？、はＴ）でＮａ１ｍ−６ｃＤＮＡライブラリー をスクリーニングした（表１１第３図）。

クローン１．１および１．２から得られたＣＡＬＬＡ　　ｃＤＮＡ配列を確証す るために、第２組のオーバーラッピングするＣＡＬＬＡ　　ｃＤＮＡクローン（ ２，１，２，２および２．３、第２図）を特性決定した。

クローン］、１および２．１は開始メチオニンＡＴＧに対する１００ＢＰ５’　 で始まる。第２図において、クローン１．１，１．２８よび２゜１．２．２から のオープンリーディングフレームを示す。クローン１゜２．２．２および２．３ からの３′の翻訳されない配列は１４７２８Ｐの長さであり、ポリＡ配列中で終 わる。クローン３．ｌ　（１−８）は他のＣＡＬＬＡ　　ｃＤＮＡとその５′末 端において示すように同一であるが、ポリＡティルにおいＣ終わる３′翻訳され ない配列の追加の１７７５ｂｐを含有する。

前述の、それぞれ、ｃＤＮＡセグメント１．１．１．２および３．１を含有する ３つの２アージは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクンｙｘン（ｔｈｅ 　　Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ ｎ、マリイランド州ロックビレ）に、それぞれ、ＡＴＣＣ受は入れ番号４０３９ ５．４０３９６および４０３９７で受託され！；。この出願の出馴大のダナーフ ァーバー・キャンサ・−・インスチチュー　ト　（Ｄａｎａ−Ｆａｒ　　ｂ　ｅ ｒ　　　　Ｃａｎｃｅｒ　　　　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）は、この発行された特許 が終わる前に無効とされるたとき、培養物について最後の要求後５年で、あるい は３０年のいずれかのより長い期間後、これらの培養物を置換する責任、および このような特許の発行の受託を通知する責任を認め、その時受託物は一般に最終 的に入手可能となるであろう。その時まで、受託は規定３７Ｃ，Ｆ、Ｒ，＠１． ４１および３５Ｕ、Ｓ、Ｃ，６１，１２の下で特許庁長官に対して入手可能とな るであろう。

示したヌクレオチド配列はクローン１．］、、１．．２および３．１の複合体で ある（第３図）。位［１（ＡＴＧに対して１１ｂｐの５′）は、クローンＬｌお よび２．１が同一となる位置を表す。翻訳されたＣＡＬＬＡ、　　ｃＤＮＡの配 列は、６つの潜在的Ｎ結合したグリコジル化部位をもつ示した７　５０アミノ酸 のタンパク質を予測する（Ａ、５ｎ−Ｘａａ−５ｅｒ／Ｔｈｒ＊）。タンパク質 のミクロ配列決定により同定された１１のＣＡＬＬＡ　トリプシンペプチドおよ び３つのＣＡＬＬＡ　　Ｖ８断片は、翻訳されたＣＡＬＬＡ　　ｃＤＮＡ配列に おいて下線を付されている。単一の２４アミノ酸の疎水性セグメント（アミノ酸 ２７−５０）に下線を付しである。

クロー７１１および１，２からの個々のＥｃｏＲＩインサートは、サンガーのジ デオキシ連鎖停止法により配列決定した；普遍Ｍ１３ブライマーおよび配列特異 的オリゴヌクレオチドのブライマーを利用した。すＢｇｌ　ＩＩ／Ｈｉｎｃｌｌ ＴＩ断片を、まＩ；、個々のＥｃｏＲＩ断片の向きおよび位置を確証した。クロ ーン１．２．２．２．２．３＞、ｉよび３゜ｌを、また、配列決定した。配列は ＰＣ遺伝子データベースのプログラムでアセ〉・ブリングし、そしてナショナル ・インスチチュート・オブ・ヘルス（Ｎａｔｉｏｎａｌ　　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ 　　ｏｆ　　Ｈｅａｌｔｈ）１９８７遺伝子配列のデータバンク（ＧｅｎＢａｎ ｋ、Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　ＳｙＳｔｅｍＳ　Ｄｉｖ、、Ｂｏｌｔ、Ｂｒａｎｃｈ 　　ａｎｄ　　ＮｅＷｍａｎ％マサチュセッツ州ケンブリッジ）のリリース５６ ゜０、およびタンパク質同定リソースのデータバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ　　Ｉｄ ｅｎヒ１ｆｉｃａｔｉｏｎ　　Ｒｅ５ｏｕｒｃｅｓ　　Ｄａｔａｂａｎｋ）を利 用して分析した。

クローン１．２（第２図、ＢＰ１９９〜３７３４、第３図）はオープンリーディ ングフレームおよび翻訳されたアミノ酸配列を有し、前記配列は、ＣＡＬＬＡタ ンパク質のミクロ配列決定により決定して、すべての３つのトリプシンペプチド を含有するが、３つのＶ８ペプチドのうち２つのみを含有する（表１１第２図お よび第３図）。クローン１，２の翻訳された配列は、完全なＣＡＬＬＡタンパク 質およびｖ８ペプチド■ＩＩの両者から同定されたＮＨ，末端残基を欠く（表１ 、第３図）。１゜１／１．２および２．１／２．２／２．３からの独立に誘導さ れたＣＡＬＬＡ　　ｃＤＮＡ配列は、５′翻訳されない配列の１１ヌクレオチド を包含する、ＢＰＩ〜３７３４と同定である。各クローンは、多分別の５′スプ ライシングを表す、５′配列の追加の独特のほぼ１ｏｏｂｐを含有する。追加の オーバーラッピングするクローン（３，１）は同一され、これはその５″末端（ ｂｐ２３２１）〜ｂｐ３７３３の前に特性決定されｔ；クローンに相当する；そ の後、クローン３．１は追加の１７７５ｂｐの配列を含有し、この配列はポリＡ テイルにおいて終わる（第２図および第３図）。

ＣＡＬＬＡのクローン１．Ｌ　　１．２および３．１から誘導された完全なヌク レオチド配列は、インフレームのｂｐ６−８においてＴＡＧ停止コドンが先行す るＡＴＧメチオニンのコドンで開始する、２２５０塩基（位置１２−２２６１） のオープンリーディングフレームを含有する。

オープンリーディングフレームをエンコードするヌクレオチドの２２５０ｂｐ後 、ｂｐ５５０８においてポリＡテイルで終わる３″翻訳されない配列の位置２２ ６２−２２６４８よび３２４４においてＴＧＡ停止コドンが存在する。標準のポ リアデニル化シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）は、クローン３．１においてポリアデニ ル化部位より２５ｂｐ上流に見いだされる。追加の襟準のポリアデニル化シグナ ルは、３′翻訳されない領域中にｂｐ３０８８−３０９３．３３７１−３３７６ ．３７９２−３７９７および４４０６−４４１１において見いだされる。翻訳さ れたＣＡＬＬＡ　　ｃＤＮＡ配列は、ＣＡＬＬＡタンパク質のミクロ配列決定に より同定された１８２アミノ酸残基の１７０、誘導されたトリプシンペプチド、 およびｖ８プロテアーゼ断片を包含しく表１１第３図）、ｃＤＮＡが真性のＣＡ ＬＬＡを表すという決定的な証拠を提供する。

ＣＡＬＬＡ　　ｃＤＮＡは、８５．５ＫＤのポリペプチドのコアの分子量および アミノ酸位置１４４．２８４．３１０，３２４．６２７に位置する６つの潜在的 Ｎ結合グリコジル化部位（Ａｓｎ−Ｘａａ−３ｅ　ｒ／Ｔｈｒ）を予測する。実 際に利用した潜在的なＮ結合したグリコジル化部位の数は未知であるが、Ｎ結合 した糖の除去後のＣＡＬＬＡの分子量はＣＡＬＬＡ　　ｃＤＮＡから予測される ものとよく一致する。翻訳したＣＡＬＬＡ　　ｃＤＮＡ配列は、免疫グロブリン のドメインまたは他の構造を思い出させない間隔で１２システイン残基を含有す る。

翻訳されたＣＡ、ＬＬＡ　　ｃＤＮＡ配列は、トランスメンブレン領域の特性を もつ位置２７−５０に、単一の疎水性の２４アミノ酸のセグメントを有する。こ の疎水性セグメントの前に５つの塩基性残基が存在し、ＣＡＬＬＡはＮ　Ｈを末 端が細胞質テイルを構成するような向きをもつことを示唆する。翻訳されたＣＡ ＬＬＡ配列は、シグナルペプチドとして機能することができる、最初の疎水性Ｎ Ｈ２末端セグメントを含有する。

事実、翻訳されたｃＤＮＡ配列を、完全なタンパク質思い出させないＮＬＬＡ合 成の間に起こる唯一のＮＨ，末端のタンパク質分解のプロセスは開始メチオニン を除去することを明らかにする（表１、第３図）。疎水性値は、５つのアミノ酸 の窓（ｗｉｎｄｏｗ）に割り当てたＰＲ３Ｔ上の位置は疎水性である。アミノ酸 位置はプロットより下に示し、そしてトランスメンブレンは明暗を付されている 。

ＣＡＬＬＡが非一体の膜部分であることを示唆する前の研究と対照的に。これら の結果が示すように、ＣＡＬＬＡは型Ｉ！の一体膜部分であり、これは短い（２ ５アミノ酸）　Ｎ）Ｉ、末端の細胞質テイル、切断されない一体のシグナル配列 およびトランスメンブレンセグメントの両者として機能する単一の２４アミノ酸 の疎水性領域、および大きい（７００アミノ酸）のカルボキシ末端の細胞外ドメ インを宵する。ライフナ−（Ｗｉｃｋｎｅｒ）、Ｗ、Ｔ、およびロディッシ（Ｌ ｏｄｉｓｈ）、Ｋ、Ｆ、、サイエンス（’３ｃ　１ｅｎｃｅ）　、２３旦：４０ ０　（１９８５）、すべての６つの推定上のＮ結合グリコジル化部位がカルボキ シ末端のセグメント中に位置するという事実は、ＮＨ，末端セグメント中のチロ シン残基が存在しないことが与えられると　ｌ！１１表面標識の研究と同様に、 この解釈と一致する。

ゲンバンク（ｇｅｎＢａｎｋ）のデータベース（リリース５２．０）およびプロ ティン・アイデンテーフイケイシ３ン・リソースのデータベース（リリース１２ ．０）のサーチは、ＣＡＬＬＡが有意の内部の重複をもたないか、あるいは前に 特徴づけられｔ；活性部位まｔ；はコンセンサス結合部位の配列をもつ新規なタ ンパク質であることを明らかにする。

直前に位置かつＣＡＬＬＡのトランスメンブレンセグメントを包含する領域は、 他の型ＴＩの膜のタンパク質、ブロースクラーゼイソマルトースのそれとの部分 的同一性（ギャップをもたない３１アミノ酸のうちの１４アミノ酸）を有し、あ る種の型ＩＩタンノ（り質の二重の機能のトランスメンブレンセグメントが共通 の特徴を有することができる可能性を発生させる。７ンジカー（ｌ（ｕｎｚｉｋ ｅｒ）ら、細胞（Ｃｅｌｌ）、４６　：　２２７　（１９８６）。ＮＨ！末端の メチオニン残基の同様な翻訳後の切断は、他のクラスＩＩの膜タンパク質ついて 示された。フンシカ−（Ｈｕｎｚ　ｉｋｅ　ｒ）ら、細胞（Ｃｅｌｌ）、土６： ２２７（１９８６）；ホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）ら、プロ−ビンダス・オブ・ ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａ ｄ、Ｓｅ　ｔ、）ＵＳＡ％　８土７３３８　（１９８４）。

ＲＮＡのプロットハイプリダイゼーシ瑳ン分析ＲＮＡ試料を調製し、そして前に 記載されたようにノザンブロツテイングにより分析した。シップ（Ｓｈｉｐｐ） 、Ｍ、Ａ、およびレインヘルツ（Ｒｅｉｎｈｅｒｚ）、Ｅ、Ｌ、、ジャーナル・ オブ・イムノロジー　（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ　り　、上主旦：　２１４３　（１９ ８７）、　フィルターをｂｐ５４１−２２２７、中断されないオープンリーディ ングフレームを包含する、！二Ｐ標識した１、６ＫｂのＥｃｏＲＩのＣＡＬＬＡ 　　ｃＤＮＡ断片とハイブリダイゼーシ麿ンした。フィルターを２ＸＳＳＣ１０ ，１％ＮａＤｏｄｓＳＯ，中で２５℃において３０分間および６５℃において３ ０分間、そして０．２ｘＳＳＣ１０，１％Ｎ　ａ　Ｄ　ｏ　ｄ　ｅ　Ｓ　Ｏ４中 で６５℃において６０分間洗浄した。

ＣＡＬＬＡ＋およびＣＡＬＬＡ−リンパ系の細胞および主な腫瘍のパネルからの ＲＮＡを、ノザン分析において、１．２ｃＡＬＬＡ　　ｃＤＮＡクローンからの ほぼ１．６ＫｂのＥｃｏＲＩ断片でプロービングした。

次の細胞の型からの合計のＲＮＡの１２μｇを分析した：Ｎａ１ｍ−６；Ｒａｊ ｉ、ＣＡＬＬＡ＋バーキットリンパ腫の細胞系；Ｍｏ１ｔ４、ＣＡＬＬＡ＋Ｔ細 胞の急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）細胞系、Ｈ５Ｈ１ジャーカットおよびＪ ７７、ＣＡＬＬＡ−Ｔ細胞の白血病細胞系；非刺激の末梢血液単核細胞（ＰＢＭ Ｃ）；　ミトゲントリダートＰＢＭＣ，ＬＡＺ２２１、ＣＡ　Ｌ　Ｌ　Ａ十Ａ　 Ｌ　Ｌ細胞系、およびＬＡＺ　３８８、ＬＡＺ２１１と同一のドナーからのＣＡ 　Ｌ　Ｌ　Ａ、　−Ｅ　Ｂ　Ｖ形質転換したリンパ芽様系。ポリＡ選択したＮａ １ｍ−６ＲＮＡのＩＯμｇの試料を、まノ；、分析しｊ；。Ｎａ１ｍ−６、ＡＬ Ｌ細胞系Ｌａｚ２２１およびＭ。

Ｉｔ−４、そしてバーキットリンパ踵細胞系Ｒａｊｉを包含するＣＡＬＬＡ陽性 として定義される細胞系（Ｊ５抗体を使用する免疫蛍光により）は、２つの主要 なＣＡＬＬＡ　　ｍＲＮＡを含有する：３．７Ｋｌよび５．７ＫｂのＣＡＬＬＡ の転写体。対照的に、３つのＴ細胞腫瘍系、ジャーカットＪ７７（第２ジヤーカ ツトクローン）、およびＨ３Ｂ、およびＥＢＶ形質転換したリンパ芽球様系、Ｌ ａｚ３８８、および静止するミトゲン刺激した末梢細胞り／バ球を包含する、Ｃ ＡＬＬＡ陰性源はこれらの転写体を欠く。３．７および５．７ｋｂのｍＲＮＡに 加えて、他の低い存在量のＣＡ　Ｌ　Ｌ　Ａ転写体がｊ５陽性の細胞中に存在す る。例えば、Ｎａ１ｍ−６からのポリＡ＋ＲＮＡにおいて、４．５．３．１劣る ２７に１）の追加の存在量に劣るＣ　Ａ　Ｌ　Ｌ　Ａ関連ｍＲＮＡを、また、ノ ザンブロソティングにより検出する。　５−７　ｋ　ｂの転写体はクローン３． １中に位置する下流の余分のポリアデニル化部位の利用から生ずるようであるわ 、クローン３．１に対して独特の３′の非翻訳領域（ｂｐ４８６５−４９０３） から誘導さね、たアンチセンスオリゴヌクレオチドは、この解釈と一致する、よ り大きい５．７Ｋｂの転写体のみを同定するゆ３゜７Ｋｂの転写体はｂｐ３７９ ２におけるポリアデニル化シグナルの利用から生じ、モして４，５．３．１およ び２．７Ｋｂの小さいｍＲＮＡは、それぞれ、４４０６−４４１１．３３７１− ３３７６および３０８８−１０９３に位置するポリアデニル化シグナルの利用か ら生ずる。

抗ＣＡＬＬＡモノクローナル抗体の反応性は、また、正常の顆粒球、骨髄の支質 細胞の下位集団、腎臓、胎児腸、および乳におけるある種の要素、およびある種 の非リンパ系のＩ１１瘍細胞上に観察された。ブラウン３）：キーティン（Ｋｅ ａｔｉｎｇ）ら、Ｂｒ　ｉ　ｔ、Ｊ、Ｈａｅｒｎａ　ｔ５４　：　１２４９　（ １９８１）；カレル（Ｃａｒｒｅｌ）ら、ジャーナ４−オブ・イム１０ジー（Ｊ 、Ｉ　　ｍｕｎｏり、上１旦：２４６５　（１９８３）。ペプチドのマツピング が示されている顆粒球を除外して、リンパ系のＣＡＬＬＡタンパク質との顆粒球 タンパク質との関連性、これらの細胞源との抗体の反応性の性質は誤って定義さ れている。マクコルマノ系の細胞からのＣＡ　Ｔ、、、　Ｌ　Ａ転写体がリンパ 系の細胞中のそれらに類似するかどうかを決定する！こめに、合計のＲＮＡは顆 粒球、ＣＡＬＬＡ十線維芽系（ＨＢ−１ｏｏ）、および２つの追加のＣＡＬＬｋ 十ｍ瘍細胞系、黒色症系（Ｇ３６１）および結腸癌系（ＣＬＬ−２２７）から分 離し、モしてノザンプロットによりブロービングした。ペサンド（Ｐｅｓａｎｄ ｏ）ら、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ＋）、±３１　： ２０３８　（１９８３）、２０ｐｇの各細胞型を分析した：ＨＢ−１００％ＣＡ 、ＬＬＡ十線維芽系統；Ｇ３６１．ＣＡＬＬＡ−黒色症系、ＣＬＬ−２２７、Ｃ ＡＬＬＡ十結腸癌系；Ｎａｔｍ−６（比較のため）；および顆粒球。Ｎａ１ｍ− ６細胞における場合のように、３．７Ｋｂの転写体はＨＢ−１００８よびＣＬＬ −２２７細胞中の主要なＣＡＬＬＡ　　ｍＲＮＡである。対照的に、３．７およ び５．７Ｋｂの転写体の両者はＧ−３６１において豊富であるが、５．７Ｋｂの ｍＲＮＡは顆粒球中で主要なＣＡＬＬＡ転写体である。異なるＣ　Ａ、　Ｌ　Ｌ 　Ａ子細胞型中の３゜７および５．７ＫｂのＣＡＬＬＡ型のこの組織特異的な弁 別の発現のための基準は現在知られていない。それにもかかわらず、同一の主要 なＣＡＬＬＡのメツセージがこれらの非リンパ系源中で発現されるという事実は 、Ｊ５がこれらの細胞上の真性のＣＡＬＬＡを認識し、そして共通のＪ５エピト ープをもつ他のタンパク質を認識しないことを示す。リンパ系および顆粒球のＣ ＡＬＬＡタンパク質の大きさの小さい差（９５−１００対９５−１．１．０ＫＤ ）は、多分Ｎ結合グリカン付加の異なるバタ６つの潜在的Ｎ結合グリコジル化部 位が予測された８５ＫＤコアのポリペプチド中で同定されるが、すべてがＮａ　 １ｍ−６ＣＡＬＬＡタンパク質中で利用するように思われないということは、こ の解釈と一致する。

ＤＮＡのプロ／トハイブリダイゼーンヨン分析ＤＮＡを調製し、そして標準のプ ロトコルに従いサザンブロツティンプリングＨハーバ−（Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉ ｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク（１９８２）。

ＣＡＬＬＡ型およびＣＡＬＬＡ−源（Ｎａ１ｍ−６、Ｌａｚ２２１１Ｌａｚ３８ ８、およびＰＢＬ）のパネルからのＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄｌｌｌ消化したゲ ノムＤＮＡを、サザンブロッティングし、そしてほぼ１．６ＫｂのＥｃｏＲＩの ＣＡＬＬＡ、　　ｃＤＮＡ断片とハイブリダイゼー’ｉｓンした。ＰＢＬ；Ｌａ ｚ３８８；Ｌａｚ２１１；およびＮａ１ｍ−６からの高分子量のＤＮＡのｌ　Ｏ ｔｔ　ｇをＨｉｎｄｌｌｌまｔ；はＢａｍＨ７で消化し、そして１．６ＫｂのＣ ＡＬＬＡ　　ｃＤＮＡプローブを使用してサザンプロット分析しｆ：、、３つの ＢａｍＨＩゲノム断片（大きさ：２つのバンドは３５Ｋｂより大さくそして１つ は６２．５Ｋｂである）およびほぼ１．１３ＫｂのＣＡ、ＬＬＡ　　ｃＤＮＡズ ロープとハイブリダイゼーシミンする８つのＨｉｎｄＪＩＩゲノム断片（大きさ ：３５．２６．１７．８．４．４．８．３．７．２．９および２．５Ｋｂ）が存 在する。これらの制限酵素で検出可能なＣＡＬＬＡ十悪性症中の遺伝子の転移は 存在しないように思われる。さらに、制限パターンはＣＡＬＬ八遺伝へがヒトの ハブロイドゲノム中に単一のコピーの遺伝子として存在する可能性が最もつよい ことを示唆する。

ＣＡＬＬＡの分子クローニングおよびＩＩ型トランスメンブレン糖タンパク質と してその同定は、直接の方法で、リンパ系の機能におけるその役割を推定するこ とを可能としない。このクラスにおいてタンパク質はレセプターから膜結合した 酵素までの範囲の種々の機能を有し、そしてトランスフェリンレセプター、アシ アロ糖タンパク質レセプター、インフルエンザウィルスのニューロアミニダーゼ 、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ、プロスクラーゼ−イソマルターゼ複 合体およびＨＬＡの不変の鎖を包含する。

ＣＡＬＬＡが一体の（ｉｎｔｅｇｒａｌ）膜タンパク質であるという事実は、急 速な細胞表面の再分布、内部化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）、および３ ７°ＣにおけるＣＡＬＬＡ十細胞の特異的抗体処理後のＣＡＬＬＡ−抗体複合体 を実証する前の研究と一致する。ＣＡＬＬＡの抗体誘発変調は、細胞表面レセプ ターで見られるもの、例えば、表面ＩｇおよびＴ３−Ｔｉに類似することが記載 された；それは、また、多数のペプチドホルモンにより誘発される特異的下の調 節（ｄｏｗｎ　　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）まｔ；は細胞表面のレセプターの損失 に類似した。

ＣＡＬＬＡが比較的短い細胞質テイルを有するという事実により、ＣＡＬＬＡは 直接のシグナル形質導入機能に役立つと思われない。

ＣＡＬＬＡの発現はアンコミッテッド（ｕｎｃｏｍｍｉ　ｔ　ｔｅｄ）ＴｄＴ＋ ’Ｊンパ系子孫上に現れ、そして細胞がＢ細胞またはＴ細胞のコミットメント（ ｃｏｍｍｉ　ｔｍｅｎ　ｔ）の証拠を表すとき、一般に減少する。

ＣＡＬＬＡが、また、骨髄支質細胞の下位集団により発現されるという事実は、 ＣＡＬＬＡが早期のリンパ系の成熟に必要な微細環境に参加することができるこ 可能性を引き起こす。

実施例５　　ＣＡＬＬＡのオーブンリーディングフレームの構成全体のオーブン リーディングフレーム（ｂｐ　１２−２２６１）を含有するＣＡＬＬＡ　　ｃＤ ＮＡを発生させるために、ＣＡＬＬＡ　　ｃＤＮＡ断片ｈｐ−１３２〜＋５８３ （クローンｌ、１）およびｂｐ＋１２７〜＋３７２３　（クローン２）を含有す る２つの組み換えλｇｔ　１０クローンを利用した（第１図）、２つのλｇｔｌ ｏのための番号付けは、シップ（Ｓｈｉｐｐ）らから誘導し、ここでｂｐｌは開 始メチオニンに対し−４８２３（１９８８）。クローン１．１からＤＮＡをＥｃ ｏＲＩおよびＡｐａＩで消化し、０．４３５Ｋｂの断片を生成しｔ；（第５図） 。クローン２からのＤＮＡのアリコートを、それぞれ、ＡｐａｌおよびＣ】ａｌ で消化し、０．４９９Ｋｂ断片を生成し、またはＣ１ａｌおよびＡｐａｌで消化 し、１．５４Ｋｂの断片を生成した（第５図）。プラスミドベクターｐＢｌｕｓ ｃｒｉｐｔ　　ＳＫ（→−）（Ｓｔｒａｔａｇｅ’ｎｅ）をＥｃｏＲＩおよびＡ ｐａｌで消化した。０．４３５ＫｂのＥｃｏＲＩ−Ａｐａｌ、０．４９９Ｋｂの Ａｐａｌ−Ｃ１ａｌ、１．５４６ＫｂのＣ１ａｌ−ＡｐａｌのＣＡＬＬＡ　　ｃ ＤＮＡ断片およびＥｃｏＲＩ−Ａｐａｌルミｌ切断プラスミドベクター精製し、 結合しそしてＤＨ５α＋Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ（Ｂｅｔｈｅｓｄ ａ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　Ｌａｂｓ）の形質転換に使用した。

組み換え体を％　　ｌ　ＯＯｐ　ｇ　／　ｍＱのアンピシリン、８０μｇ／ｍα のＸ−ｇａｌおよび２０ミリモルのＩ　ＰＴＧを含有するＬＢ平板上の青／白色 の選択の基準で同定した。大規模のプラスミドの調製後、完全なオーブンリーデ ィングフレームを含有する再構成したＣ　Ａ　Ｌ　Ｌ　Ａ　　ｃ　Ｄ　ＮＡをプ ラスミドベクターからＤｒ　Ｉ−Ａｐａ　＋で切除し、モしてＴ４ＤＮＡポリメ ラーゼでその３″末端を平滑末端とした。５’５ａＩ１部位を発生するために、 生ずる５′および３′の平滑末端のＣＡＬＬＡｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片を、ポリリン カー中に５ａＩ１部位を含有する、ＥｃｏＲ５消化したｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ　 　ＳＫ（＋）中に結合した。

形質転換後、組み換え体を同定し、そして診断制限エンドヌクレアーゼのバ洋ル を使用して向きについて分析した。適当なりローンを、ジデオキシ連鎖停止法を 使用して、ＣＡＬＬＡインサートの５′および３′末端およびＥｃｏＲＩ−Ａｐ ａｌ、Ａｐａｌ−Ｃ１ａｌ、Ｃ１ａＩ−Ａｐａ！接合を配列決定することによっ てさらに分析した。サンガー（Ｓポリリンカーからの５ａＩ１部位をもつＣＡＬ ＬＡのオーブンリーディングフレームを得るために、断片をＳｍａ　ＩおよびＡ ｐａＩで切除し、これらは、それぞれ、ＣＡＬＬＡ断片のポリリンカーの３′部 位およびＣＡＬＬＡ断片の５′部位および５ａＩ１部位において切断した。Ａｐ ａｌ末端を７４　　ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、そして修飾されたＣＡ ＬＬＡのオーブンリーディングフレームのインサートをＥｃｏＲ５切断しｔ：ｐ Ｂｌｕｓｃｒｉｐｔ　　ＳＫ（＋）中に結合した。形質転換後、ポリリンカーか ら生ずる３″　５ａ１１末端を含有する組み換え体を診断５ａ１１消化で同定し た。代表的クローンの大規模のグラスミド調製後、ＣＡＬＬＡオープンリーディ ングフレームを５ａｌｌで消化し、そしてｐ　ＩＧＴＥ／ＮのＸｈｏ　１部位中 に結合した（第６図）、ｐｌＧＴＥ／Ｎプラスミド（第６図）は、ヒト免疫グロ ブリンプロモーター、ヒトおよび不ズミの両者の免疫グロブリンエンハンサ−１ ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化ングナル、およびＣＭＶ−ネオマイシ ン抵抗性を含有する。形質転換後、組み換え体を診断の制限エンドヌクレアーゼ のパネルを使用して向きについて分析しｔ；。プラスミド、ｐｌＧＴＥ／Ｎ　　 ＣＡＬＬＡ、と表示する、が得られ、これはセンスの向き（Ｓｅｎｓｅ　　ｏｒ ｉｅｎｔａｔｉｏｎ）を含有した。

実施例６　　ＣＡ　Ｌ　Ｌ　Ａ子細胞系の　生ｐｌＧＴＥ／Ｎ　　ＣＡＬＬＡ、 構成体を、前に記載されｔ；ようにニレ８、中にトランスフェクションした。バ ッテン（Ｐａｔｔｅｎ）、Ｈ。

７１６１−７１６５　（１９８４）。簡潔的には、２Ｘ１０’の細胞を水冷リン 酸塩緩衝液（７，７ミリモールのに２ＨＰＯ＊、１４５ミリモルのＮａｃｌ、２ ．３ミリモルのＫＨ，Ｐｏｔ）中で１回洗浄し、そして５００μΩの５０μｇの ｐｌＧＴＥ／Ｎ　　ＣＡＬＬＡ、を含有する水冷リン酸塩緩衝液中で懸濁した。

細胞／　Ｄ　Ｎ　Ａ溶液をエレクトロボレイションのクベットに移しそして、氷 上で５分後、２０００■でエレクトロポレイシａンにかけた。室温において１０ 分間インキュベーション後、細胞を１０％の胎児仔ウシ血清７２％のグルタミン ／　ｌ　ＯＯＵ／ｍＱのペニシリンおよび１００μｇ／ｍ（ｌのストレプトマイ シンを補充した１０ｍＱのＲＰＭＩ中で希釈し、そして５％のＣＯ３中で３７℃ において４８時間培養しｔ；。その後、細胞を１０％の胎児仔ウシ血清／２％の グルタミ：／／　ｌ　００　Ｕ／　ｍＱのペニシリンおよび１００　／１ｇ／ｍ Ｑのス）・レブトマイ／ンおよび９ＱＱμｇ／ｍ１２の０４１８を補充したＲＰ ＭＩ中で１４日間維持し、そして抗ＣＡＬＬＡモノクローナル抗体、Ｊ５、を使 用してＣＡＬＬＡの発現についてフェノタイピングした。リッツ（ＲｉｔＺ）ら 、不イチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）、２８３：５８３−５８５　（１９８０）。引き 絖いて、Ｊ５＋細胞を蛍光活性化細胞の分類（Ｅｐｉｃｓ）により、標準技術を 使用して選択し、そして０４１８含有培地中で０゜５細胞／ウエルで制限希釈培 養法によりクローニングした。リッツ（Ｒｉｔｚ）ら、ネイチャー（Ｎａ　ｔ　 ｕ　ｒｅ）（Ｌｏｎｄｏｎ）　、２８３　：５８３−５８５　（１９８０）。

実施例７　不ズミトラ／ス７エクン３ン体中のヒトＣＡＬＬＡの発現Ｇ４１８選 択後、実施例６に記載されているように、ＣＡＬＬＡ、＋Ｊ５５８細胞をＪ５抗 ＣＡＬＬＡモノクローナル抗体でフェノタイピングにより同定し、分類し、そし て制限希釈培養法によりクローニングした。

２つのＪ５＋サブクローン、Ａｓ−３８よびＡ２−２、これらは、それぞれ、高 いおよび低いレベルのＣＡＬＬＡの発現を有した、をそれ以上の分析のために選 択しｌ；。第２図は、これらの２つのＣＡＬＬＡ＋ん安定なトランスフェクンヨ ン体、すなわち、親のＣＡＬＬＡ−多重骨髄腫系、Ｊ５５８およびＣＡＬＬＡ＋ 急性リンパ芽球性白血病系の比較を表し、これらからＣＡＬＬＡ　　ｃＤＮＡを 分離した、Ｎａ１ｍ−６゜示すように、Ｊ５５８は検出可能な細胞表面のＣＡＬ ＬＡを欠く（平均のチャンネル蛍光Ｏ）。２つのＪ５＋ｎｏサブクローン（Ａ２ −３およびＡ２−２）は細胞表面のＣＡＬＬＡを発現する。Ａ２−３はＡ２−２ より実質的に高い数／細胞のＣＡＬＬＡを発現する（それぞれ、平均のチャンネ ル蛍光１１６．８および７．６）ことに注意すべきである。Ａ２−３およびＡ２ −２の平均のチャンネル蛍光をＮａ１ｍ−６の平均のチャンネル蛍光（１７２， ６）を比較すると、Ａ２−３はＣＡＬＬＡｔ−Ｎａ　１ｍ−６のそれの６７．７ ％のレベルで発現し、モしてＡ２−２はＮａ１ｍ−６のレベルの４．４％のみを 発現することを示される。

実施例８　中性のエンドペプチダーゼ２４．１１活性の酵素アッセイ前に記載さ れたように、ゲンバンク（リリース５６．６／８８）に対する（ＡＬＬＡ　　ｃ ＤＮＡ配列のサーチは、「エンケファリナーゼ」と普通に呼ばれる、ラットおよ びウサギの中性のエンドペプチダーゼ２４゜１１との顕著な相同性を明らかにし た。

ダッシャ−（ＤＡ、５ＨＥＲ）プログラム［Ｄ、Ｖ　　ファウルクナー（Ｆａｕ ｌｋｎｅｒ）、分子生物学のコンピューター源センター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　 　Ｂｉｏｌｏｇｙ　　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　　Ｒｅ５ｏｕｒｃｅＣｅｎｔｅｒ）、 ダナ・ファーバー癌研究所（Ｄａｎａ’ＦａｒｂａｒＣａｎｃｅｒ　　　Ｉｎ５ ｔｉｔｕｔｅ）フ　を使用して、各々６００ｂｐのＣＡＬＬＡ　　ｃＤＮＡセグ メント、１００ｂｐのオーバーラツプを有する、各配列の］、　００　ｂ　ｐの ６００ｂｐのセグメントと、ゲンバンクのデータベースにおいて比較しノ；。Ｃ ＡＬＬＡ　　ｃＤＮＡ、ラットのエンケファリナーゼおよびウサギの中性のエン ドペプチダーゼ２４．１１の関係するセグメント（ｂｐ　　１−６００．５０１ ．−１１００．１００１−１６００．１５０１．−２１００および２００１−２ ６００）は、１２１〜２３６の相同性のスコアを有した。ダッシャープログラム において、１２より大きい相同性のスコア１ま潜在的意味をもつと考えられる。

こうして、ここに記載されている高いスコアは、近似の同一性を示す。ヒトのＣ ＡＬＬＡおよびラットのエンケファリナーゼおよびウサギのエンケファリナーゼ の分子は、各場合において、９４％の同一性を示した。シップ（Ｓｈ　ｉ　ｐ） 、Ｍ、Ａ、ら、ブロンーデインダス・オブ・ナン町ナル・アカデミ−・オブ・サ イエンンズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡＳ８５：４８ １９　４８２３　（１９８８）；マルフロイ（Ｍａ　ｌ　ｆ　ｒｏｙ）、、Ｂ、 ら、バイオケミカル・アンド・バ」匝カル・リサーチ・コミュニケーション（Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、）、上ユ４　：　５９−６ ６　（１９８７）；デバウルト（Ｄｅｖａｕ　ｌ　ｔ）　、Ａ、ら、ＥＭＢＯジ ャーナル（Ｊ、）、６：　１３１７−１３２２　（１９８７）。最近報告された ヒトの相同体の分析において、ＣＡＬＬＡとの事実上の同一性が示される；後者 の２つの配列は１つのアミノ酸だけ異なり、これは配列決定の誤差または遺伝子 の多形性の結果である。マル７０イ（ｍａ　１　ｆ　ｒｏｙ）ｓ　Ｂ、ら、旦旦 ３ｓ　　レターズ（Ｌｅｔｔｅｒｓ）、２２９：２０６　２１０（１９８８）。

中性のエンドペプチダーゼ２４．１１活性は、基質としてグルタリール−Ａｌａ −Ａｌａ−Ｐｈｅ−４−メトキシ−２−ナフチルアミドを使用するカップリング アッセイにおいて蛍光測定的に測定した。オルロウスキー（Ｏｒ　ｌ　ｏｗｓｋ 　ｉ）　、Ｍ＆Ｓ、ウイルク（Ｗｉｌｋ）、匡焦主（Ｂｉｏｃ　　ｅｍ、）、２ ０：４９４２　４９５０（１９８１）。中性のエンドペプチダーゼ２４．１．Ｉ によるこの基質の切断はＰｈｅ−４−メトキシ−２−ナフチルアミドを生成し、 このアミドは、アミノペプチダーゼ活性の存在下に、蛍光性生成物の４−メトキ シ−２−す７チルアミドに転化される。反応混合物は、ｏ、ｉミリモルの基質、 １００ミリモルのＭＥＳ　［Ｎ−Ｍ−オルホリノ）エタンスルホン酸］、ｐＨ６ ，５，０，３モルのＮａＣＩ、０．５ミリ単位の精製したラットの脳のアミノペ プチダーゼおよび酵素を１００μＱの最終体積で含有した。マクレラン（ＭｃＬ ｅ　ｌ　ｌ　ａｎ）　、Ｓ、　　ら、１．Ｎｅｕｒｏｉ、　（１９８８）。

反応は酵素を使用して開始し、そして３０℃において３４０ｎｍの励起波長およ び４２５ｎｍの放射波長で、サーモスタット制御のセルホルダーおよびストリッ プチャーｉ・のレコーダーを装備したアミンコーホラマン（Ａｍｉｎｃｏ−Ｂｏ ｗｍａｎ）分光蛍光メーターを使用して追跡した。ホスホルアミトン（２μモル ）により阻害を使用して、アッセイの特異性を確証した。７ドギン（Ｈｕ　ｄ　 ｇ　ｉ　ｎ）　、　Ｒ，’Ｌ、ら、ライフ・サイエンシズ（Ｌｉｆｅ　　Ｓｃｉ 、）、２９：２５９３−２６０１　（１９８１）。タンパク質はＢＣＡ法により 決定した。スミス（Ｓｍｉｔｈ）、細胞抽出物は、洗浄しｔ；細胞を２００〜４ ００μＱの１％のオクチルグリコシド（１０−ｎ−オクチル−β−Ｄ−グリコピ ラノシド、Ｓｌｇｍａ）を含有する２０ミリモルのＭＥＳ、　ｐＨ６，５、中に 再懸濁することによって調製した。室温において１時間インキュベーションした 後、試料をエッペンドルフ遠心装置で３０分間遠心し、そして上澄み液を酵素の アッセイのために取った。全細胞の懸濁液をＲＰＭＩ中で１回洗浄し、次いで１ ０１〜１０６細胞／１０μａ反応混合物の濃度で利用した。膜の分画の調製のｔ ；め、洗浄した細胞を１ｍ（＋のトリス緩衝化生理的塩類溶液中でテフロンガラ スのホモジナイザーを使用して均質化し、そして膜の分画を４０．０ＯＯＸにむ いて３０分間遠心することによって分離しｌ；。この分画をＭＥＳ／オクチルグ リコシド緩衝液中に再懸濁し、そして前述のように処理した。

表２は、個々の細胞集団の全細胞の懸濁液を使用して実施した酵素のアッセイの 結果を示す。Ｎａ１ｍ　　６、Ａ２−３、Ａ２−２８よびＪ５５８の細胞懸濁液 を、それぞれ、４７８９．１９０６．４４６および０゜２ナノモルの産生物／時 間／１０″細胞の中性のエンドペプチダーゼ活性を示した。

表２．全細胞の懸濁液中の中性のエンドペプチダーゼ活性の決定Ｎａ　１ｍ−６ ４、７８９５３ Ａ２−３　　　　　　　　　　１．９０６　　　　　　　　　　５２Ａ２−２　 　　　　　　　　　　４４６　　　　　　　　　　’　１８Ｊ５５８　　　　　 　　　　　　　０．２　　　　　　　　　０．２０．２ナノモルの７時間／１０ ６細胞の値は、活性のない実験誤差の範囲内である。

Ｎａ１ｍ−６、Ａ２−３およびＡ２−２細胞懸濁液への特異的阻害因子ホスホル アミトンの添加は、エンドペプチダーゼ活性を５３．５２および１８ナノモル／ 時間／１０６細胞に顕著に減少させた（表２）。

表３ 合計の細胞リゼイト中の中性のエンドペプチダーゼ活性の決定Ｎａ１ｍ−６９， ９６０，０２９，９６Ａ２−３　　　　　　　２．３５　　　　　　　　０．０ ８　　　　　　２．１２Ａ２−２　　　　　　　１　、１８　　　　　　　　０ ．２９　　　　　　　ＮＤＪ５５８　　　　　　　０．０８　　　　　　　　０ ．０５　’　　　　　　　ＮＤＮＤ−決定せず 表に示すように、Ｎａ１ｍ−６、Ａ２−３、Ａ２−２およびＪ５５８からのリゼ イトは、それぞれ、中性のエンドペプチダーゼ活性の９．９６．２．３５．１． １８および０．０８ナノモル／分／　ｍ　ｇタンパク質の中性のエンドペプチダ ーゼの比活性を含有した。アッセイはホスホルアミトンの存在下に実施したとき 、Ｎａ　１ｍ−６％　Ａ２−３およびＡ２−２細胞リゼイトに関連する中性のエ ンドペプチダーゼ活性は、それぞれ、０．２０．０．０８および０．２９ナノモ ル／分／ｍｇタンパク質に劇的に減少した（表３）。観察において、Ｊ５５８細 胞中の見掛けの活性はホスホル７ミドンの阻害に対して不感受性であり、これは 見掛けの活性の低いレベルは中性のエンドペプチダーゼ２４．１１のためでなく 、そして活性のない実験誤差の範囲内であることを示唆する。Ｎａ１ｍ−６８よ びＡ２−３の細胞下分画の分画化は、Ｎａ１ｍ−６の中性のエンドペプチダーゼ 活性の１００％およびＡ２−３の中性のエンドペプチダーゼ活性の９６％より多 くが膜分画に関連することを実証した（表３）。中性のエンドペプチダーゼ活性 のレベル（表２および３）および４つの細胞系のＣＡＬＬＡの発現のレベル（第 ７図）を比較すると、中性のエンドペプチダーゼ活性よ細胞表面のＣＡＬＬＡの 発現との間の相関関係が存在することが示された。

同等の実施態様 当業者は、ここに記載しｔ；発明の特定の実施態様と同等の多くの実施態様を認 識するか、あるいは日常の実験を越えない実験を使用して確証することができる であろう。このような同等の実施態様は次の請求の範囲により包含されることを 意図する。

微　　生　　物 Ａ、受託の証明 受託機関名 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション受託機関の住所 米国マリイランド州２０８５２、ロックビレ、バークローンドライブ１２３０１ 受託日　　１９８７年１２月２日 取得番号　４０３９５．４０３９６および４０３９７欧州特許が探求されている 表示に関して、出願人はここで欧州特許局に欧州の規定２８（４）の下に、欧州 特許の許可の陳述が発表されるまでか、あるいは欧州特許出願が拒絶されるかあ るいは取り下げられるか、あるいは取り下げられると認められる日まで、アメリ カン・タイプ・カルチャー・コレクションに受は入れ番号４０３９５．４０３９ ６および４０３９７で受託された生物学的物質の入手可能性は欧州の規定２８（ ５）に従い要求により任命された専門家への試料の供給により実態されることを 知らせる。

Σ゛工ＧＵＲＥ　　６ Ｆ工ＧＵＲＥ　　７ Ｌｏｇ　　チャシネＩＬ／空克 国際調査報告 １Ｍｍｌｖｌｌ１Ｍｌ＾請１崗−”””ＰＣＴ／ｌＪｓ１１８１０４２８０１ｍ ｔ１％ａｌｌＩＲＩｌ＾鰭１□ｃｍ＋−ａｅ　−、Ｑｆｍ　／ｌｉｅ　　Ｑ口／ 八ＡＪＯ’１国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、抗ＣＡＬＬＡ抗体に結合することができるヒトＣＡＬＬＡをエンコードする 分離したＤＮＡまたはその断片。 ２、可溶性ヒトＣＡＬＬＡ断片をエンコードする、上記第１項記載の分離したＤ ＮＡ。 ３、機能的エンドペプヂダーゼ活性を有する可溶性ヒトＣＡＬＬＡ断片をエンコ ードする、ヒ記第２項記載の分離したＤＮＡ。 ４、第３図のヌクレオチド配列のすべてまたは一部分を有する、上記第３頂記載 の分離したＤＮＡ。 ５、受け入れ番号４０３９５でＡＴＣＣに受託されたファージ；受け入れ番号４ ０３９６でＡＴＣＣに受託されたファージ；および受け入れ番号４０３９７でＡ ＴＣＣに受託されたファージから成る群より選択されるファージ中に含有される ヒトＣＡＬＬＡのｃＤＮＡ。 ６、抗ＣＡＬＬＡ抗体に結合することができる可溶性ヒトＣＡＬＬＡ断片。 ７、前記断片はＣＡＬＬＡのトランスメンブレン部分を含まないか、あるいはそ の一部分のみを含む、上記第６項記載の可溶性ＣＡＬＬＡ断片。 ８、中性のエンドペプチダーゼである、上記第６項記載の可溶性ヒトＣＡＬＬＡ 断片。 ９、第３図のアミノ酸配列またはその一部分を有するタンパク質またはポリペプ チド。 １０、ヒトリンパ芽球性白血病細胞により発現される本質的に純粋な中性のエン ドペプチダーゼ。 １１、上記第６項記載の可溶性ＣＡＬＬＡ断片をエンコードするＤＮＡ配列から なるベクター。 １２、上記第１１項記載のベクターを含有する細胞。 １３、受け入れ番号４０３９５でＡＴＣＣに受託されたファージ；受け入れ番号 ４０３９６でＡＴＣＣに受託されたファージ；および長け入れ番号４０３９７で ＡＴＣＣに受託されたファージから成る群より選択される、ヒトＣＡＬＬＡのｃ ＤＮＡを含有するファージ。 １４、受け入れ番号４０３９５でＡＴＣＣに受託されたファージ；受け入れ番号 ４０３９６でＡＴＣＣに受託されたファージ；および受け入れ番号４０３９７で ＡＴＣＣに受託されたファージから成る群より選択されるファージを含有する細 胞。 １５、医学的状態に関連する細胞のヒトの患者中の存在により特徴づけられる前 記医学的状態に悩まされるヒトの患者を処置する方法であって、前記患者に、上 記第３項記載の可溶性ＣＡＬＬＡ断片を、前記細胞の増殖を阻害する量で投与す ることからなる方法。 １６、出血病細胞の増殖が存在する個体に、白血病細胞の増殖を阻害するために 十分な量のＣＡＬＬＡの阻害因子を投与することからなる、白血病細胞の増殖を 減少する方法。 １７、ＣＡＬＬＡの阻害因子はＣＡＬＬＡへ結合しかつＣＡＬＬＡの酵素活性を 減少することができる物質からなる、上記第１６項記載の方法。 １８、ＣＡＬＬＡの阻害因子は、ＣＡＬＬＡに結合することができそして、これ により、ＣＡＬＬＡおよびＣＡＬＬＡに結合する天然に産出する配位子の結合を 予防する、上記第１６項記載の方法。 １９、無痛覚作用が望まれる個体に、オピオイドペンタペプチドを切断するＣＡ ＬＬＡの能力を妨害する物質を投与することからなる、個体において痛覚作用を 生成する方法。 ２０、ＣＡＬＬＡの阻害因子からなる、個体における白血病細胞の増殖を処理す るための組成物。 ２１、前記阻害因子は、ＣＡＬＬＡに結合しかつＣＡＬＬＡの酵素活性を減少す ることができる物質からなる、上記第２０項記載の方法。 ２２、前記阻害因子は、ＣＡＬＬＡに結合しそしてＣＡＬＬＡとＣＡＬＬＡに結 合する天然に産出する配位子との結合を防止することができる物質からなる、上 記第２０項記載の方法。 ２３、オピオイドペンタペプチドを切断するＣＡＬＬＡの能力を妨害する物質か らなる鎮痛薬。