JPH03505675A - 新生表現型の抑制を制御する産生体及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新生表現型の抑制を制御する産生体及び方法関連出願の説明 本出願は以下の米国特許出願の一部継続出願である。

名称　　　　　出願番号　　　　出願臼ヒトエステラーゼＤ、　　　０９１，５ ４７　　１９８７年　８月３１日その用途、及び精製方法 ｐｐＲＢ１１０核リンタン　０９８．６１２　　　１９８７年　９月１７日バク 質、及びその網膜芽腿感受遺伝子産生体核すンタンパク質遺伝　１０８．７４８ 　　１９８７年１０月１５日子癌抑制剤及び調節剤技術分野 本発明は癌の表現型（形質）発現を制御する、哺乳動物の治療・予防産生体及び 方法に、そして環境物質の発癌性についてテストする産生体物及び方法に関する 。

本発明は政府の援助を受けて（認可番号ＥＹＯ５７５８）、全国保険協会（ｔｈ ｅ　　Ｎａｔｉｏｎａｌ　　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　　ｏｆＨｅａｌｔｈ）及び力 １ノフｄ）レニア大学と協力して達成したものである。政府（こζよ本発明につ いて一定の権利がある。

背景技術 癌は数々の形態をとるが、長年にわたり人類社会にとって恐るべき災厄になって いる。多（の場合、癌が発見されるのは、病理学的症状が患者の生命にとって手 遅れになり、症状の好転を望めな〜）点まで進行してからである。

一部の痛症状は、適切な方法で診断され、治療されるなら進行をくい止めること ができ、患者の寿命を延ばすことができる。このような希望があるから、癌患者 は各種の癌治療について多額の治療費を支払うのである。癌は基本的な細胞レベ ルでは細胞の無制限な増殖を通じて生体を冒すので、歴史的にみれば癌の治療は 生体にとっては劇的であると同時に、時には破壊的である。

事実、多くの癌治療は細胞レベルで劇的な機能を発揮することを意図しているの で、時にはそれ自体が正常な細胞まで破壊する。よく認められることだが、十分 な数の正常な細胞が破壊されると、それだけを原因とするわけではないが、患者 が死亡することがある。代償としては直接的な死があるにもかかわらず、患者は 荒原法で治療費が高（、その上生命にとって危険な療法、例えばＸ線照射や化学 療法を受けているのが現状である。

このような療法がたとえ成功したとしても、患者は治療後かなり期間にわたり自 由がｔＸ　＜　、また健康でない状態にある。一般に、患者は治療期間はいうに およばず、治療後のかなりの期間入院していなければならない。

これらの理由から、癌にかかるのではないかという恐れは人類社会に大きな恐怖 をもたらしている。患者に対する治療費からみた経済的なインパクトが癌の治療 困難という考えと結びついて、癌の診断だけではなくその素因の究明について、 また癌の治療及び／又はその素因を極めることについて信頼性の高い方法を実現 するため研究が進行中である。　癌研究の焦点の多くは症状の診断や治療に向け られている。最近、細胞レベルや細胞下レベルにおける生化学プロセスの認識が 進んできたため、癌の診断や治療だけでな（、生体における癌素因の発見につい ての方法に注意が払われるようになってきた。このような素因を究めるために、 生体における癌抑制機構・を確定する研究が行われている。

これら研究では、“癌抑制”は元来腫瘍細胞と通常の線維芽細胞、リンパ球やケ ラチノサイトとが形成する融合細胞に認められる腫瘍形成性の欠損と定義されて いた。

そしてこの作用は通常細胞における支配的な抑制因子によって仲介されると考え られていた。Ｎａｔｕｒｅ２２３：３６３　（１９６９）及びＪ、Ｃｅ１ｌ　　 Ｓｃｉ、８：６５９（１９７４）。

証拠によればこれら因子は一部は個体発生的であった。

というのは、Ｉｔ！！瘍形成外形成性と融合細胞におけるある種の染色体の存在 との間には相関関係が認められたからである。Ａｄｖ、Ｖｉｒａｌ　　０ｎｃｏ １．６：８３（１９８７）。例えば、ウィルムス腫瘍、即ち胎生性腎混合腫瘍は 染色体１１の遺伝子の不活化により発症すると考えられる。単染色体のマイクロ セル融合仲介転移技術を使用した場合、ウィルムス１！瘍細胞への通常染色体１ １の導入によりその腫瘍形成性を抑制できることが証明されている。一方、染色 体Ｘ及び１３を導入した場合、効果は認められなかった。５ｃｉｅｎｃｅ２３８ ：１７５（１９８７）。

ところが、全ヒト染色体は転移されていたので、癌抑制を分子的に定義された遺 伝要素に結びつけることはできなかった。加えて、全ヒト染色体の転移は実験以 外の基準で試みた場合には、大きな問題になることがある。

治療に好適な染色体を調製するのはかなりの熟練を必要とし、時間だけでな（コ ストもかかる作業である。この結果、多（の用途にとってこの技術は許容できな い。これら理由から、患者への染色体導入に伴う問題を解決できる、治療上及び 予防上の両者からみて、癌治療を生物工学的に実現する方法が強（望まれている 。

ある種の幼児新生物に関する遺伝学的研究、Ｃａｎｃｅｒ３５：１．０２２（１ ９７５）及びＮａｔｕｒｅ３１６　：　３３０　（１９８５）及び成人腫瘍症候 群に関する遺伝学的研究、Ｎａｔｕｒｅ３２８：８１４　（１９８７）、１ｂｉ ｄ３３２：８５　（１９８８）、１ｂｉｄ３２９：２４６　（１９８７）及び１ ｂｉｄ３２２：６４４　（１９８６）に関連して癌抑制遺伝子に別な意味がある ことがわかった。即ち、これら腫瘍の形成に関与する遺伝子は従来の腫瘍遺伝子 の場合と同様に、活性化というよりは機能欠損によってＢＩＩ形成性になるもの 考えられる。５ｃｉｅｎｃｅ２３５：３０５（１９８７）、１ｂｉｄ２３８：１ ５３９　（１９８７）、Ｎａｔｕｒｅ３２３：５８２　（１９８６）及びＣａｎ ｃｅｒ　　Ｒｅｓ、４８：１５７３　　（１９８８）　　。

この典型的な例はＪ、Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、（１９８８）に発表された通 常は３年後以内にみられる網膜芽腫である。Ａｍ、Ｊ、Ｄｉｓ、Ｃｈｉ　Ｉｄ、 １３２：１６１．５ｃｉｅｎｃｅ２０８：１０４２（１９８０）及びＪ、Ｍｅｄ 、Ｇｅｎｅｔ、２１　：９２　（１９８４）に発表された厳密な分析や、Ｎａｔ ｕｒｅ３０５ニア７９（１９８３）に発表された制限鎖多形性（ＲＦＬＰ）に関 する研究の示唆によれば、網膜芽腫は染色体バンド１３ｑ１４に認められ、かつ ＲＢ又はＲＢ−１と呼ばれる遺伝子座の欠損により発症することがある。ＲＢ遺 伝子に一致する特性をもつこの領域からの遺伝子は分子生物学的に既にクローン 化されている。Ｎａｔｕｒｅ２３５　：　１３９４　（１９８７）及び１ｂｉｄ ２３６：　１６５７　（１９８７）、この遺伝子が４．７ｋｂｍＲ，ＮＡ転写と して発現することは検査された正常組織にすべて認められたが、網股芽肝細胞で は検出できな〜）が、変化していた。５ｃｉｅｎｃｅ２３５：１３９４（１９８ ７）。

また、多くの場合、ＲＢ遺伝子内部に突然変異が認められた。５ｃｉｅｎｃｅ２ ３６：ｌ６５７（１９８７）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８５： ２２１０　（１９８７）及び１ｂｉｄ８５：６０１７　（１９８８）。このデー タはクローン化ＲＢ遺伝子が一応同定されたことを示唆している。

従来は、ＲＢ遺伝子のタンパク質産生物はＲＢｃＤＮＡから予想された所定エビ トーメに対して発生した抗体を使用することにより約１１０ｋｄ　（ｐｐｔ　ｌ ０ＲＤ）の核リンタンパク質と同定されていた。Ｎａｔｕｒｅ３２９　：　８４ ２　（１９８７）。

ＲＢ遺伝子の癌抑制特性を確定した証拠に照らして、ＲＢ遺伝子を網膜芽腫感受 性の診断手段として使用することが既に行われている。これら診断法及び診断手 段はＲＢ遺伝子のクローン化、単離、同定及び配列決定について開示している米 国特許出願第１０８，７４８号明細書に記載されている。さらに、この出願明細 書には網膜芽腫、骨肉腫や線維肉腫を診断する手段としてクローン化網膜芽腫遺 伝子ｃ　ＤＮＡを使用する方法についても開示がある。

さらに別な米国特許出願第０９８，６１２号明細書には、主に細胞核に存在し、 かつＤＮＡ結合活性をもつリンタンパク質ｐｐＲＢ１１０が開示されている。Ｒ ＢｍＲＮＡと同様に、このタンパク質は多くの型の培養ヒト細胞にも認められて いる。また、ａｐＨＯＲＢはそれぞれＤＮＡ！！１！ウィルス及びアデノウィル スの転移タンパク質であるラージＴ抗原及びＥＩＡと密接な関係があることも判 明している。Ｎａｔｕｒｅ３３４：　１２４　（１９８８）及びＣｅ　Ｉ　１５ ４：２７５　（１９８８）、ＲＢ遺伝子産生物やこれを含む複合物についても、 これらがＤＮＡ結合活性をもつことが判明している。Ｎａｔｕｒｅ３２９：８４ ２　（１９８７）。これら研究が間接的に示唆していることは、１）Ｉ）ＩＩＯ ＲＢが他の細胞遺伝子の発現制御に関与し、かつある種の転移タンパク質の腫瘍 形成作用を緩和することもあるということである。

現状の癌研究の多（は癌発見と癌を発症しやすい素因を対象としている。従って 、非常に望ましいことは、腫瘍発生を未然に阻止できるか、より重要には発症を 完全に防止できる癌治療の予防方法を確立することである。

この点に関して、米国特許出願系０９１，５４７号明細書には、Ｍ膜芽腫やウィ ルソン病、あるいはその他の１３染色体１３ｑ：１４１１領域に認められる遺伝 子によって制御される遺伝病や後天的な疾病の診断手段になる遺伝学的標識とし てクローン化ヒトエストラーゼＤａＤＮＡを使用する方法が記載されている。ま た、この出願明細書には、網膜芽腫遺伝子をクローン化するエストラーゼＤｃＤ ＮＡプローブについて、そしてクローン化ヒトエストラーゼｃＤＮＡを網膜芽腫 やウィルソン病の遺伝学的素因を診断する診断手段として使用することが開示さ れている。

かなり進んでいるにもかかわらず、癌の治療や予防には依然として前に述べたよ うな重大な制限がある。この点に関して、どの人が癌に罹患しやすいかを判断す るためにはスクリーニングが作動であるが、これには予後診断手段が極めて作動 である。このように、ある人が予後診断手段により癌に罹患しやすい疾病素質を もっていることが判明したならば、癌の早期徴候について短い間隔をおいて定期 検診すればよい。徴候が発見されたならば、外科手術などの適当な方法が早期に 実施できる。

ところが、癌に罹患しやすい疾病素質を診断するのに上記診断手段を適用するの は非常に有利であるが、このような素因の知識は通常の診断方法によって患者が 、例えば、癌がかなり進行した状態にあると診断された場合には役にたたない。

このような場合には、通常の方法や治療は全く無効である。

従、て、生物工学的な技術により癌を予防及び／′又は治療できるにようになる ことが強々望まれている。さらに、殆ど副作用を示ざない、多くの形態の癌に有 効な生物工学的物理療法も重要である。また、タバコの煙り等のある種の環境物 質が癌の原因になることを証明する技術も求められている。このような情報があ ると、人が発癌性物質に接触するのを防止できる。というのは、これら物質の腫 瘍形成への関与が疑念でな（、はっきり証明できるからである。

発明の開示 本発明の第１目的は癌抑制を制御するのに有用である全体的に安全な治療−予防 方法及び産生物を提供することにある。

本発明の別な目的は生物工学的な方法及び産生物を使用することによって癌ａｍ 根絶の特効を示す癌抑制な制御する産生物及び方法を提供することにある。

本発明のさらに別な目的は活性成分が自然遺伝子又は置換遺伝子からなる癌治療 用又は癌予防用薬剤組成物を提供することにある。　本発明のさらに別な目的は 活性成分が自然及び／又は置換癌抑制遺伝子からなる癌治療用又は癌予防用薬剤 組成物を提供することにある。

本発明のさらに別な目的は活性成分が自然及び／又はクローン化非欠陥形ＲＢ遺 伝子又は遺伝子フラグメントからなる、網膜芽腫に罹患した、あるいはその他の 欠陥、突然変異または欠損ＲＢ遺伝子をもつ遺伝子を保育する動物の治療及び／ 又は予防治療に使用する薬剤組成物を提供することにある。

本発明のさらに別な目的は欠陥、突然変異又は欠損癌抑制遺伝子を保育する動物 モデルを提供することにある。

本発明のさらに別な目的は癌の原因となる薬剤や物質を判別する方法及び産生物 を提供することにある。

本発明は不活性又は欠陥層抑制遺伝子の染色体位置を確定する癌の遺伝子治療方 法を提供するものである。この場合には、好ましくはクローン化した置換遺伝子 を使用して、染色体中の不活性又は欠陥層抑制遺伝子と置換する。これを治療に 使用するだけでなく、本発明は癌に罹患しやすい遺伝学的素因をもつ者を予防治 療する手段、及び環境要因の発癌性をテストする動物モデルを提供するものでも ある。本明細書で使用する用語“要因”については、広いに意味に解釈すべきで 、例示のみを目的として言及すれば、環境に存在する各種放射線や各種の物質が これに含まれる。

本発明は放射線療法及び／又は化学療法の必要性が少ない、癌治療方法を提供す る。さらに、本発明方法は癌に罹患しやすい遺伝学的素因を発見した後比較的早 い段階で、しかもＩｌ！瘍形酸形成始前に適用することができる。

さらに、本発明には、全染色体より小さく、かつ一般に安定性が窩（、クローン 化が容易な遺伝学的物質を使用できる利点がある。　本明細書に開示する、本発 明組成物及び方法では、腫瘍細胞の新形成挙動が正常なＲＢ遺伝子により抑制さ れているならば、ＲＢ遺伝子の不活化がｍ瘍形成時に重要な役割を果しているの ではないかということを仮説とし、ている。

細胞中の一つかそれ以上の癌抑制遺伝子がはたして十分な癌の原因になるかどう かについては一部懸念があるが、腫瘍細胞中の不活化抑制遺伝子の置換は悪性Ｉ ｌｉ瘍治療の新たなアプローチになるのは事実である。従来からの細胞毒性療法 とは異なり、遺伝子治療は腫瘍細胞の基礎的な欠陥の永久的な矯正を前提とする ものである。更に、遺伝子療法は予防治療に適用することができる。というのは 、癌抑制遺伝子は正常細胞に悪影響しないからである。

図面の簡単な説明 本発明による上記やその他の目的及び特徴、及びこれらを実現する方法、また本 発明それ自体は添付図面を参照して、本発明の実施態様に関する以下の説明を読 めば明らかになるはずである。

第１Ａ図及び第１Ｂ図はＲｂウィルス及びＬｕｘウィルスの産生方法を説明する 図である。

第２Ａ図はＲＢウィルス感染、そして０４１８（癌細胞）選択後の細鞄系統にお ける通常サイズのＲＢ蛋白質の存在を示すクロマトグラムである。

第２Ｂａ図及び第２Ｂｂ図はＵ−２０５細胞の核内に局在化させた固’１ｉｒＲ Ｂ蛋白質を示す写真である。

第３Ａないし３Ｆ図はＧ４１８（癌細胞）選択後のＲＢ及びＬｕｘウィルス感染 腫瘍細胞の培養物を示す図である。

第４Ａ図及びｉ４Ｂ図は５日間にわたり成長させたＷＥＲＩ−Ｒｂ２７．５ａｏ ｓ−２及びＵ−２０Ｓ細胞コロニーを示すグラフである。

第５図は９種類の５ａｏｓクローンのおけるＲＢＭ白質発現の欠損を示すクロマ トグラフである。

発明を実施する最良の態様 本出願明細書には多くの言及があるが、いずれも本発明の参考である。

以下詳細に説明するが、その順序は次の通りである。

Ａ、緒言 Ｂ、癌抑制遺伝子同定の第１段階 Ｂ１．標識遺伝子の同定 Ｂ２．ＥＳＤ遺伝子の地図作成 りＳ、エステラーゼＤ遺伝子のクローン化ｃ、ｍ瘍形成の遺伝学及び癌抑制遺伝 子のクローン化Ｃ１，Ｗ４Ｍ芽腫の遺伝学 Ｃ２，遺伝子の分子レベルクローン化 Ｃ３，染色体ウオーキングによるＲＢ遺伝子の同定 Ｃ４，他の癌におけるＲＢ遺伝子 Ｃ５，ＲＢ遺伝子のクローン化 Ｃ８，突然変異体ＲＢ遺伝子による腫瘍形成り、癌抑制遺伝子産生物を利用する 診断方法Ｄ１．癌素因の診断方法 Ｄ２．ＲＢ蛋白質の同定及び機能 Ｄ３−１）ｌ）ＲＢＩＩＯの定位及び機能Ｄ４．Ｉ）Ｉ）ＲＢＩＩＯの調節機能 Ｄ５．診断手段としてのｐｐＲＢｌｌｏＥ、遺伝子療法及び予防 Ｅｌ、！Ｎ細胞系統のＲｂ及びＬＵＸウィルス感染発生 Ｅ２．ＲＢ遺伝子の癌抑制への使用 Ｅ３．ＲＢｉ！ｉ伝子による生体外及び生体内腫瘍形成の抑制 Ｅ４．ＲＢ遺伝子の不活化による形質転換Ｆ０発癌性の疑いがある環境要因の判 別するための動物モデル Ａ、緒言 本発明は癌の診断及び治療だけでなく、環境要因の発癌性を判別する技術を提供 することに関する。

本発明による診断技術は、場合によっては癌表現型が発現する前に、患者の癌に 罹患しやすい傾向を判別することをその基礎としている。一般に、癌診断の場合 、癌抑制遺伝子の染色体遺伝子座を定位する。また、遺伝子座の定位後、癌抑制 遺伝子の有無を判別、そして存在する場合には、この癌抑制遺伝子がその機能を 十分に発揮しているか否かを判別する方法を考案する。

癌抑制遺伝子の遺伝子座を定位し、そしてこの遺伝子が存在していることが判明 したなら、制御状態で、遺伝子の表現型発現を観察することによって遺伝子の機 能を判別できる。表現型発現を評価する一つの方法では、癌抑制遺伝子の産生物 の存在についてテストする。また、好ましい方法では、遺伝子産生物について、 この産生物と免疫複合体を形成できる抗体を作り出すことによって、組織サンプ ル中の遺伝子産生物の蛋白質及びその量について正確にテストする。

また、癌抑制遺伝子染色体の定位後、遺伝子それ自体をクローン化すると、これ を本発明の治療法に従って薬剤として使用できる。この点について、クローン化 癌抑制遺伝子は癌治療に加えて、癌予防にも使用できる。この場合には、対象者 に癌表現型が発現する前に、癌抑制遺伝子の機能を判別し、遺伝子欠陥又は欠損 が認められた場合には、このような欠陥又は欠損遺伝子の代わりに正常なりロー ン化癌抑制遺伝子を使用すればよ〜）。

さらに、本発明は遺伝学的に変更しであるため、タバコの煙り、食品保存剤、代 替砂糖等の環境要因の発癌性を調べるさいに信頼性高（使用できるマウスモデル を作り出すことにも関する。

本発明は前記米国特許出願明細書に開示され、かつ特許請求されている発明の特 定実施例に基づくものである。

本明細書に開示した発明、また前記出願明細書に記載された発明はいずれも実体 的かつ科学的な証拠、即ち発癌性は遺伝的変化や腫瘍細胞にある種の関係がある ことを示す証拠を基礎としている。これら変化は突然変異、遺伝子不活化、抑制 、欠損等の原因によると考えられる。

前記出願明細書の各特定態様については後で詳細に説明するが、それぞれが本発 明の基礎を確立するさいに段階的な役割をどのように果したかをまづ要約してお くのが役にたつはずである。

本発明、及び前記出願明細書に記載されている発明はいずれも発癌性は腫瘍細胞 の遺伝性変化に関係があることを示す実体的かつ科学的証拠に基づいている。こ れら変化は突然変異、遺伝子不活化、抑制、欠損等を原因とすると考えられてい る。

発癌性の仮説的原因としての遺伝性変化についていえば、これら変化の遺伝子座 及び原因を究明することが重要である。さらに、予防的な措置によりこれら遺伝 性変化を未然に防止する方法を見つけ出すことも大事である。

また、環境要因の発癌性をテストする動物モデル等のモデルを確立することが有 効である。

これから、本発明診断方法について詳細に説明する。

本発明方法では、まづヒトエストラーゼＤのアミノ酸配列及びエストラーゼＤｃ ＤＮＡのヌクレオチド配列を同定した。エストラーゼＤは重要である。理由はそ の遺伝子座が網膜芽腫遺伝子（ＲＢ）の位置に一致しているからである。即ち、 クローン化エストラーゼｃ　ＤＮＡは遺伝標識として、また網膜芽腫、ウィルソ ン病やその他の遺伝病、あるいは１３染色体１３ｑ１４：　１１部位に認められ る遺伝子によって制御される後天病等を診断する手段として有効である。

診断手段として使用するほかに、クローン化エストラーゼｃ　ＤＮＡはＲＢをク ローン化するプローブとして、また網膜芽腫、ウィルソン病やその他の１３染色 体１３ｑ１４目１部位に認められる遺伝子によって制御される病気の診断手段と して有効である。

エストラーゼＤと網膜芽腫遺伝子とは同一の染色体部位に認められるので、ＲＢ 遺伝子の機能及びその染色体パターンを調べることは可能であった。染色体ウオ ーキングによりＲＢ遺伝子を単離し、そのヌクレオチド配列を同定した。

ＲＢ遺伝子は調Ｈ機能をもち、またその存在及び正常な機能が網膜芽腫の発症を 阻止するものと考えられる。

一方、ＲＢ遺伝子の欠損、機能不全や不活化は網膜芽腫に遺伝的に罹患しやす（ すると共に、これを発症させる。

さらに、ＲＢ遺伝子不在、機能不全や不活化は遺伝的−後天的な網膜芽腫だけで なく、他の癌についてもその原発性的な原因であると考えられる。

このように正確なＲＢ遺伝子の定位、モしてＲＢ遺伝子の単離、同定、配列決定 やクローン化により、網膜芽腫及びその二次性Ｒ瘍の診断や治療が可能になる。

また、これによりＲＢ遺伝子機能に関係がある他の癌の診断や治療も可能になる 。

さらに、本発明の診断方法について説明を進めると、リンタンパク質の同定と軌 を−にして、網膜芽腫や、網膜芽腫あるいはその他の癌に罹患しやす０素因の診 断が進歩してきている。リンタンパク質は核に認められるＤＮＡ結合活性と関係 がある。ｐｐＲＢｌｌｏと同定されるリンタンパク質には、ＲＢ遺伝子以外の遺 　伝子の腫瘍形成活性を抑制する役割があるだけでなく、悪性Ｊ）！瘍の成長を 抑制する作用もある。

ＲＢ遺伝子の同定、単離、ヌクレオチド配列決定及びクローン化は、そのリンタ ンパク質の同定と共に、多くの使い道がある。

重要な第１の用途はＲＢ遺伝子蛋白質産生体を調製できる点にあるが、この産生 体は次に特定の抗蛋白質抗体を得るさいに抗原として使用できる。そしてこの抗 体は被検査組織におけるＲＢ遺伝子蛋白質の育無を検査するさいに診断用免疫標 識として使用できる。蛋白質の存在が検出された場合には、ＲＢ遺伝子は欠損が なく、網膜芽腫は認められないことになる。一方、蛋白質が不在であったり変化 している場合には、欠損ＲＢ遺伝子が検出され、網膜芽腫やその他の癌が発症し ているか、これに罹患しやすいと診断されることになる。

従って、網膜芽腫やこれに関連する癌の診断は２つの方法によって実施できる 。第１の場合には、ＲＢｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡをＲＢ遺伝子の染色体遺伝子 座に欠損があるか否かを判別するプローブとして使用する。第２の場合には、特 異的な抗−ｐｐＲＢＩＩＯ抗体を用いる組織生検の免疫スクリーニングが可能で あ　る。いずれ診断方法も、遺伝的に網膜芽腫に罹患した履歴のある家族に、そ してその子供のスクリーニングに使用できる。さらに、骨肉腫、線維肉腫、グリ ア芽腫、乳癌やその他の癌−網膜芽腫に関連があるなしにかかわらず−等の２次 性癌の発症予知にも使用することができる。　次に本発明の治療方法について説 明する。欠損、不活性層抑制遺伝子があるとの診断後、あるいは癌抑制遺伝子が ないとの診断後、ＲＢ遺伝子等のクローン化層抑制遺伝子、またはｌ）　ｐＲ８ １１０等の　癌抑制遺伝子蛋白質産生体を与えることによって腫瘍形成を抑制で きる。これら物質は分子誘導やＲＢｃＤＮＡの遺伝子移植によりこれらを必要と する患者に与えることができる。すなわち、これら方法は予防だけでな（、腫瘍 形成を阻止することにも適用できる。

本発明は癌抑制遺伝子及びその関連蛋白質の診断、予防及び治療への適用だけで な（、動物モデルの作成に適用でき、これについて以下説明する。即ち、本発明 によれば、本明細書に開示した方法を用いて、癌抑制遺伝子の機能を研究する動 物モデルを確立できる。−例として、ＲＢ遺伝子の一組の不活性対立遺伝子を用 いて突然変異体マウスを作り出した。これら動物は癌抑制遺伝子の役割や有意味 性を解明するのに役立つ。

さらに、腫瘍形成の先行状態は“異型接合”と考えられるので、突然変異体マウ スは環境物質の発癌性をテストするさい有効なモデルになる。即ち、例えば、こ のようなマウスにはタバコの煙や人工甘味料等を始めとする無数の発癌性を疑わ れている発癌物質を暴露することができる。マウスに腫瘍が形成したならば、こ れは被試験物質が発癌性をもつことを明らかに示すものである。従って、突然変 異体マウスモデルを使用すると、どの環境物質を避けるべきかを判断できる。

環境物質をテストできるほかに、突然変異体マウスモデルは癌治療の研究にも有 効である。

なお、ここで述べた基本的な考えはＲＢ遺伝子以外の遺伝子を単離、クローン化 及び利用するのにも有効であるある上に、他の癌抑制遺伝子にも同様に適用でき る。

以下に、以上説明してきた方法の各状態を詳細に説明すると共に、ＲＢ逍伝子を 使用した実施例を詳細に述べる。

Ｂ、癌抑制遺伝子同定の第１段階 癌抑制遺伝子を同定かつクローン化するためには、特定な癌に関係があると知ら れている染色体を同定する。

一般に、欠損症抑制遺伝子をもつ染色体については、染色体のない状態でその表 現型発現を調べることによって決定することができる。さらに、この検査は上記 染色体の一部を化学的方法やその他の方法によって、あるいはその一部を切除す ることによって変化させた後実施できる。一般に、遺伝的表現の理解はその多く をＤＮＡ遺伝子、あるいはそのよくわかっているセグメントの細胞への注入及び 該遺伝子の通常に機能できる能力に基礎をおいている。

染色体を一旦選択したならば、決定すべき癌抑制遺伝子について遺伝子座を選択 する。このためには、例えば、癌に関係があると考えられる染色体の部位にプロ ーブをランダムに挿入し、遺伝子を定位すればよい。この方法には限界がある。

というのは、多数の遺伝子が典型的な真核生物細胞染色体に関係しているからで ある。

第２の方法では、癌に関係しているとみられる遺伝子をもつ染色体ＤＮＡを、例 えば機械的な切除や適当な制限酵素の使用等の手段によってフラグメント化する 。この方法を使用すれば、最終的にＤＮＡフラグメントの表現型発現を調べるこ とによって遺伝子を定位することができる。

第３の、好ましい癌抑制遺伝子の定位方法では、標識遺伝子を利用する。理想的 には、この標識遺伝子を癌抑制遺伝子の遺伝子座にかなり近接させる。更に、こ の標識遺伝子は観察が容易な表現型発現である。標識遺伝子を一旦同定した後は 、染色体ウオーキング方法により染色体ＤＮＡ部分を分析し、癌抑制遺伝子を定 位する。この染色体ウオーキング方法では第１組換え体の一端からＤＮＡの小さ なセグメントを単離するが、このＤＮＡ部分をプローブとして使用して、ファー ジ又はコスミットライブラリー（ｃｏｓｍｉｔ　　１ｉｂｒａｒｙ）を再スクリ ーニングして、該ＤＮＡ部分とゲノムの真正部分をもつ組換え体を得る。

次に第２の組換え体を使用して第３、・・争の組換え体を作り、−組の重複クロ ーン化セグメントを得る。一般に、染色体ウオーキング方法は、標識遺伝子から 出発して、染色体にそって両方向に使用することができる。

Ｂ１．標識遺伝子の同定 標識遺伝子の実際の使用例はエストラ−ゼロ遺伝子の同定、精製及びクローン化 であった。染色体１３Ｑ１４゜１１に対するエストラ−ゼロ遺伝子の染色体地図 はエストラ−ゼロ遺伝子活性の欠損を突然変異体細胞の染色体１３の既知染色体 欠失に相関させることにより作成していた。

エストラ−ゼロ遺伝子はＲＢ遺伝子に極めて近接していることが知られていたの で、これをＲＢ遺伝子を染色体ウオーキングにより同定するための出発点として 使用した。ＲＢ遺伝子に近接しているため、エストラ−ゼロ遺伝子が標識遺伝子 として理想的であった。この近接性が癌抑制遺伝子を定位するのに必要な染色体 ウオーキング量を抑えるだけでなく、エストラ−ゼロ遺伝子によりエストラーゼ Ｄ遺伝子表現型のみならず、癌抑制遺伝子表現型も変化した。

標識遺伝子については、ヒトエストラ−ゼロ酵素のアミノ酸配列を同定した。ま たエストラーゼＤｃＤＮＡのヌクレオチド配列についても同定した。この遺伝子 の染色体を定位し、クローン化エストラーゼＤｃＤＮＡを標識遺伝子として使用 した。

この標識遺伝子を染色体ウオーキングの出発点として使用し、さらにエストラー ゼＤｃＤＮＡをプローブとして使用したところ、網膜芽腫遺伝子を定位、クロー ン化できた。

以上、ヒトエストラーゼＤｃＤＮＡを遺伝的標識として使用することについて要 約したが、これについての完全な開示については、米国特許出願束０９１．５４ ７号明細書を参照すべきである。

エストラーゼはエステルの加水分解を触媒する非特異的酵素に属する酵素である 。ヒトエストラーゼＤ（ＥＳＤ）はその電気泳動移動度及び基質としてのメチル ウンベルフェリルに対してのその相対特異性により区別できるエストラーゼ醪素 属の一員である。ヒトＥＳＤは、相互優性常染色体対立遺伝子、主に対立遺伝子 ＥＳＤＩ及びＥＳＤ２の発現の結果、幾つがの表現型として振る舞う点において ２Ｊｔ体酵素である。ヒトＥＳＤが集団遺伝学研究における標識として使用でき るのはその多形性による。Ｎａｔｕｒｅ３０４：４５１−４５３　（１９８３） 、及びＨｕｍ、Ｇｅｎａｔ、３９：　１−２０　（１９７５）ＥＳＴ酵素の活性 はＥＳＤ遺伝子の健全な機能に依存するものである。従って、ＥＳＤ配列に−っ のＥＳＤ対立遺伝子の不在、完全なあるいは部分的な不活化、欠失、あるいは突 然変異やその他の変化が生じると、ＥＳＤ活性が低下することになる。例えば、 一つの染色体１３の欠失を生じている個体の組織は、二つの染色体１３を組とし てもつ健康な個体に見られるＥＳＤ活性の僅が５０％に過ぎな〜１゜５ｃｉｅｎ ｃｅｓ　２ｉ９：９７３−９７５　（１９８３）。　染色体１３ｑ１４：１１部 位に対するＥＳＤの遺伝子座地図は酵素活性の不在を染色体１３の欠失と相関さ せることにより作成されていた。５ｃｉｅｎｃｅ２０８：１０４２（１９８０） 、ＥＳＤの１３ｑ１４：１１部位への部位的転移は、網膜芽腫の腫瘍形成に関与 する網膜芽ｍ　（ＲＢ）遺伝子の位置に一致している。Ａｍ、Ｊ、Ｄｉｓ、Ｃｈ ｉ　Ｉｄ、１３２：　１８１−１８３　（１９７８）、５ｃｉｅｎｃｅ２１９： ９７１−９７３、及び５ｃｉｅｎｃｅ２１３：１５０１−１５０３　（１９８１ ）。また、染色体欠失、育糸分裂組換えや染色体欠損による１３ｑ１４部位にお ける同型接合性や異型接合性の発生は網膜芽腫の第１要因として説明されている 。これはｌ！瘍影形成は１３Ｑ１４：１に認められる遺伝子の両対立遺伝子が必 要であるという俣説に一致する。

１３ｑ１４：１１へ地図作成するエストラーゼＤのレベルの調査から、以前は、 網膜芽腫患者の体性細胞中の一つの染色体１３には超顕微鏡的にみた場合、ＲＢ 及びエストラーゼＤ遺伝子座がなく、またこの染色体は、正常な染色体１３が失 われた状態で、！！瘍に認められると考えられていた。Ｃａｎｃｅｒ　　Ｇｅｎ 、Ｃｙｔｏｇｅｎ６：２１３−２２１　（１９８３）。

同じ染色体部位にＥＳＤ及びＲＢ遺伝子を局在化することは、ＲＢ遺伝子機能の 評価、ＲＢ染色体パターンの発見、ＲＢ遺伝子の単離、及びＥＳＤを出発点とし て使用する、染色体ウオーキングによるＲＢ遺伝子の同定に育利な一つのアプロ ーチである。Ｓｃ　ｉ　ｅｎｃｅ２３５：１３９４−１３９９　（１９８７）。

これら２つの遺伝子が強く結合しているため、ＥＳＤ遺伝子がＲＢ遺伝子の振る 舞いを解明する決定的な標識として作用する。５ｃｉｅｎｃｅ２１９：９７３− ９７５（１９８２）、及びＮａｔｕｒｅ３０４：４５１−４５３　（１９８３） 。

ＲＢ遺伝子以外の、例えばウィルソン病における欠損遺伝子も同じ染色体部位、 １３ｑ１４：１１に存在していることが、従ってＥＳＤ遺伝子に結合しているこ とが判明している。ウィルソン病は肝しンズ核変性症として知られているが、こ れは常染色体劣性遺伝として伝達されるセルロプラスミン形成遺伝病である。そ の特徴はセルロプラスミン中の銅含有量が大きく低下する結果、血清セルロプラ スミン及び銅価が減少すると共に、尿に多量の銅が排泄される点にある。ウィル ソン病遺伝子座と、ウィルソン病の多形性標識として作用できるＥＳＤ遺伝子と の間には密接な関係が認められ、これは原発性遺伝子欠損の検査上、臨床上の両 者にとって大きな意味がある。

従って、同定−クローン化されたＥＳＤｃＤＮＡはＲＢ遺伝子及びウィルソン病 遺伝子の同定及び配列決定における有用な標識になり、これら疾病の診断・治療 に役立つはずである。

前記米国特許出願第０９１，５４７号明細書には、まづヒトの組織からヒトＥＳ Ｄを取り出し、該組織を溶解し、有機溶剤を用いて溶解組織を抽出し、抽出物を 部分精製してから、カラムクロマトグラフィーによって精製ＥＳＤを分離するこ とによりヒトＥＳＤを精製する方法が記載されている。

得られた精製ＥＳＤを次に特異的なウサギ抗エストラーゼ抗体の調製に使用した 。

この抗体を使用して、特異的な抗体をプローブとして使用することにより遺伝子 をクローン化し、そしてクローン化ＤＮＡによりコード化された未知蛋白質を同 定する方法によりＥＳＤｃＤＡＮクローンを同定かつ単離した。一般に、この方 法では、β−グルコシダーゼ構造遺伝子１ａｃＺに異質ＤＮＡを挿入でき、かつ ハイブリッド融合蛋白質の合成を促進する発現ベクターλｇｔｌｌ（ｌａｃ５ｎ ｉｎ５　　ｃ１８５７　５１００）を使用した。ＤＮＡ３　：　３４７−４４７ 　（１９８４）。

Ｂ２．ＥＳＤ遺伝子の地図作成 染色体１３ｑ１４．１１部位に対するＥＳＤ遺伝子の染色体地図はＥＳＤ酵素活 性の欠損を各種突然変異体細胞の染色体１３の染色体欠失と相関させることによ り作成した。さらに、分析により、染色体１３４１４部位に対してエストラ−ゼ ロ遺伝子をもつＥＬ２２クローンの地図を作成できたことが確認された。

プローブとしてエストラーゼＤｃＤＮＡを使用したところ、（ｉ）ｒ−ストラー ゼＤｍＲＮＡの大きさは１．３〜１．４ｋｂ、（ｉ　ｉ）遺伝子はほぼ２０〜３ ５ｋｂ−このゲノムに大きなイントロンが散在していることを示す−で、そして （ｉｉｉ）エストラ−ゼロ遺伝子が現実に３０染色体１３ｑ１４部位に存在する ことが判明した。

また、他の４０００種の十分に特性化されている蛋白質に比較した場合、エスト ラ−ゼロ遺伝子の推定アミノ酸は特異的であった。

上記地図作成データから、ＥＳＤ遺伝子が染色体１３ｑ１４．１１部位に存在し 、ＲＢ遺伝子については減数分裂組換えが認められないことがわかった。これら 発見はいずれも両遺伝子が近接状態にあることを示している。

但し、両者間の正確なキロ塩基対距離についてはまだ判明していない。通常、ｑ １４：１１等のバンドの最大ＤＮＡ含量は平均して１０００ｋｂを越えない。一 方、ＲＢ遺伝子とＥＳＤ遺伝子との間の距離はちょうど数キロ塩基である。

ＬＡ−ＲＢ８９ｍ＃芽腫細胞にはエストラ−ゼロ活性がないが、これが何を示唆 しているかといえば、超顕微鏡的レベルでみた場合、腫瘍細胞に染色体欠失が生 じている結果、ＲＢ遺伝子及びエストラ−ゼロ遺伝子の両者が欠損していること である。また、何らかの異常性が、恐らくは調節部位に発生していなければなら ず、これによりエストラ−ゼロ遺伝子の発現が実質的に抑えられ、また酵素活性 が低下していると考えられる。この異常性がＲＢ遺伝子発現を阻害し、ｍｉ影形 成導くことは十分に予測できることである。

Ｂ３．ニスラーゼＤ遺伝子のクローン化網膜芽腫の発生に関与する遺伝子座がニ スラーゼＳ遺伝子に強く結合して〜）るので、ニスラーゼＤ遺伝子をクローン化 することは決定的に重要であった。完全に配列決定されたｃＤＮＡクローン及び ＥＳＤ遺伝子を利用できるようになったことから、網膜芽腫研究が盛んになった 。すなわち、ＲＢ遺伝子、そのクローン化及び配列決定が可能になり、このため 網膜芽腫の臨床診断及び遺伝的治療が可能になったからである。

ヒトニスラーゼＤの精製が成功したのは最近である。

即ち、ポリクローン性抗り抗体が調製され、そしである種のＥＳＤポリペプチド に相補的なオリゴヌクレオチドが構成されている。また、ＥＳＤＭ白質のアミノ 酸の配列が完全に決定されている。そしてＥＳＤｃＤＮＡについてはクローン化 されている。さらに、ＥＳＤｃＤＡＮ及びＥＳＤ遺伝子両者のヌクレオチド配列 かについては完全に同定され、そしてＥＳＤ遺伝子については局在化されている 。

さらに、特異的なヒト抗ニスラーゼＤ抗体については、これはポリペプチドをそ の後ＥＳＤとして同定された約３３〜３４ｋＤａの分子体に結合できた。

抗−ニスラーゼＤ抗体を使用して、ヒトニスラーゼＤに対応する蛋白質をマウス 、ラット、ハムスターやサルの細胞から免疫沈降により得た。

上記の免疫学的反応を利用して、ＥＳＤｃＤＮＡの同定及び２つのλｇｔ　Ｉ　 ｌ　ｃＤＮＡライブラリーからのＥＳ　Ｄ　ｃ　ＤＮＡの単離を行った。プロー ブとして特異的な抗体を使用することにより遺伝子をクローン化し、そしてクロ ーン化ＤＮＡによりコード化された未知蛋白質を単離する方法は公知である。一 般にこの方法では異質ＤＮＡをＢ−ガラクトンダーゼ構造遺伝子１ａｃｚに挿入 でき、かつハイブリッド融合蛋白質の合成を促進する発現ベクターλｇｔｌｌ（ ｌａｅ５　　ｎ１ｎ５　　ｃ１８５７　　Ｓ　　１００）を使用する。

また、ＥＳＤは多くの生体組織に存在することがわかっているので、ＥＳＤにつ いてコード化するｍＲＮＡも組織抽出物及び／又はある種の組織腫瘍にも存在し ているはずである。ヒトへバトームやヒト胎盤腫瘍はいずれも比較的高レベルで ＥＳＤｍＲＮＡを発現するので、ライブラリーの特異的なＥＳＤｃＤＮＡクロー ンの検出に特に好適である。従って、λｇｔｌ！ベクターにおけるＥＳＤｃＤＮ Ａライブラリーを構成するためにこれら２種類の腫瘍を使用した。　抗−エスト ラーゼＤ抗体を使用してこれらライブラリーを免疫スクリーニングした後、４種 類のクローンを得た。これらクローンのうち１．１ｋｂ　（１１００ｂｐ）の同 じ挿入部をもつ２種類をＥＬ２２ａ及びＥＬ２２ｂとした。分析により、ＥＬ２ ２クローンは実際にはエストラーゼＤｃＤＮＡであった。

ＥＳＤｍＲＮＡＯサイズを求めるために、ＲＮＡブロッティング分析したところ 、２種類の細胞系統のｍＲＮＡのサイズはおよそ１４．５５　（１，３〜１．４ ｋｂ）ｐ−標識化ＥＬ２２クローンを使用するサザン・プロッティング分析によ りこれを求めた。この結果、エストラ−ゼロ遺伝子はヒトゲノムに２０〜４Ｏｋ 　ｂ程分布していた。陽性のハイブリダイゼーシ冒ンを示すＤＮＡフラグメント を合わせたサイズは２０〜４０ｋｂで、これはＥＳＤゲノムに大きなイントロン 配列が存在することを示す。これを次に完全なゲノムエストラ−ゼロクローンを 特性化することにより確認した。

ｃ、ｉ瘍形成の遺伝学及び 癌抑制遺伝子のクローン化 標識遺伝子の同定及びクローン化後、対応する癌抑制遺伝子を同定及びクローン 化する。染色体つｔ−キング法を使用して、癌抑制遺伝子を定位する。ここに開 示する実施例では、エストラ−ゼロ遺伝子を使用すると共に、ＲＢ遺伝子を腫瘍 形成について評価するが、これら実施例は標識遺伝子や乳癌抑制遺伝子、ウィル ムＩｌｉ！瘍抑制遺伝子、ベックウィズ舎ヴイーデマン症候群抑制遺伝子、膀胱 移行性細胞癌抑制遺伝子、神経芽腫抑制遺伝子、腎細胞癌抑制遺伝子、聴神経腫 抑制遺伝子、結腸直腸癌抑制遺伝子等の各種癌抑制遺伝子にも等しく連用できる 。

染色体ウオーキング法を前記と同様に使用して、上記癌抑制遺伝子を定位、同定 、精製及びクローン化する。

一般に、癌抑制遺伝子活性は遺伝子の表現型発現を調べることによりに分析かつ 決定できる。

Ｃ１，網膜芽腫の遺伝学 本発明を実施する一例として、網膜芽腫抑制におけるＲＢ遺伝子の役割を調べて みた。

網膜芽腫遺伝子のクローン化、単離、同定及び配列決定により網膜芽腫の遺伝的 制御及び発癌性抑制について評価した。クローン化網膜芽腫遺伝子ｃＤＮＡを調 製し、網膜芽腫、骨肉腫、線維肉腫の診断手段として使用した。

発生した網膜芽腫遺伝子を治療に使用して、癌細胞の欠損遺伝子を正常な遺伝子 で置換し、癌発生を抑制した。

上記で網膜芽腫遺伝子の発生方法についてまとめたが、これに関する完全な開示 につ１１１では、米国特許出願第１０８．７４８号明細書を参照すべきである。

発癌が腫瘍細胞の遺伝的変化に関係があることについてはその確実なことがます ます明らかになっている。これら変化の一部は個体の一生にわたり前駆体体性細 胞に認められる。一方、他の突然変異は両親の生殖細胞系統から遺伝的に継承す るものである。後者の遺伝形質が家族性癌の症例や遺伝的に癌になりやすい素因 を説明するものである。家族性癌の既知例には網膜芽腫、腎芽細胞ｍ＜ウィルム 病）、神経芽腫、骨肉腫、腎細胞癌、黒色腫や乳癌がある。

腫瘍発生に関与する遺伝的要素を確認するアプローチが幾つかある。肝癌遺伝子 が最初に認められたのは、培養物中のｌｌ！ｆ１１誘導レトロウィルス及び非ｍ ｖｓ性細胞を形質転換できる［ｊｌＤＮＡであった。これらｌ！ｉ［遺伝子の多 くは正常な細胞に存在する原形腫瘍遺伝子の相同染色体である。

遺伝子機能の欠損が！！瘍影形成関係があると゛認められている別なりラスの癌 遺伝子もある。この遺伝子の存在が間接的ではあるが最初に示唆されたのは、同 一患者からの体性ＤＮＡに比較した場合、１ｉ１１ＤＡＮの特異的染色体部位の 欠損を示す制限鎖地図多形性（ＰＦＬＰ）に関する研究によってであった。′異 型接合性の欠損”は網膜芽腫、骨肉腫、ウィルムＩｌ！瘍、肝芽腫や横紋筋肉腫 を始めとする多くの腫瘍形態に認められている。

機能欠損によって腫瘍を発生する遺伝子は“劣性ａ瘍遺伝子”又は“癌抑制遺伝 子”と呼ばれている。その理由はある細胞内に一つかそれ以上の正常な対立遺伝 子が存在しているならば、層表現型の発現を抑制するのにそれで明らかに十分で あるからである。

網膜芽腫は発育中の網膜から生じる幼児の眼内癌である。報告によれば、その発 症率は新生児２０，０００人に一人であり、幼児に最もよくみられる眼内癌であ る。

遺伝学的基準からは、２形態の網膜芽腫が認められる。

そのうち遺伝性形態のものは常染色体が支配する痛感受性素質である。即ち、両 親がキャリヤの場合、その子供の該素質の遺伝率は５０％で、キャリヤの９０％ が網膜芽腫を発症する。多発性又は左右性の網膜ｍ瘍は遺伝網膜芽腫を示すもの で、その典型例でもある。さらに、キャリヤは長するに及んで別な２次性新生物 を発生する危険が高（、これら２次性癌はＭ４膜芽腫以外の骨肉腫や線維肉腫等 の癌であり、通常は致命的なものである。逆に、非遺伝性網膜芽腫患者について は左右いずれかの網膜腫瘍で、２次性癌の恐れは高くない。ところが、左右いず れかの網膜芽腫患者のある者には実際は遺伝素質が認められる。その明確な遺伝 性のため、網膜芽腫は癌遺伝研究の原形モデルになっている。

網膜芽腫は少なくとも２つの“ヒツト”、即ち突然変異要因から発症すると考え られ、これら２つのヒツトが、本質的に網膜芽腫形成を抑制する単一遺伝子（Ｒ Ｂ）の両対立遺伝子を不活化すると仮説されていた。従って、体性細胞すべてに 突然変異体ＲＢ対立遺伝子を継承した個体はある前グ体細胞（網膜芽細胞）の一 方のＲＢ対立遺伝子が突然変異により網膜芽腫を発症する素因をもつと考えられ る。散発的な症例では、ＲＢ対立遺伝子両者をひとつの網膜芽細胞のおける２つ の独立した体性突然変異により不活化する必要があると考えられる。このモデル により、素因をもつ者に腫瘍が早期に発生し、かつ多発する理由は説明すること ができるが、この仮説の作力性は分子レベルではまだ証明されていない。

遺伝性網膜芽腫患者の体性細胞（線維芽細胞）の核型検査から明らかになったこ とは、染色体１３の長腕に可視的な染色体欠失をもつ少数の症例が認められたこ とである。同様な染色体欠失は網膜芽腫細胞にも認められている。また、広範な 網膜芽腫家系図の研究から、正常な個体は平衡転座に関与する１　３　ｑ　１． ４をもっているが、網膜芽腫患者はただ一つの１３ｑ１４部位をもつに過ぎない ことがわかった。この部位１３ｑＬ４はすべての染色体欠失に共通で、恐らく遺 伝網膜芽腫に対する感受性を決定する遺伝子（ＲＢ）をもつと考えられる。即ち 、これら染色体欠失により多形性標識遺伝子であるエストラーゼＤについて遺伝 子から一つの対立遺伝子が取り除かれている。

また、ＲＢ遺伝子は調部機能をもち、そしてその存在及び正常な機能が網膜芽腫 の発症を阻止することは知られている。一方、ＲＢ遺伝子が認められない場合や 、それが機能不全だったり不活化していると、網膜芽腫が発症したり、遺伝的に それに罹患しやす（なる。そしてこれが遺伝的網膜芽腫及び後天的網膜芽腫両者 の１次的原因であり、また網膜芽腫患者によくみられる骨肉腫や線維肉腫等の２ 次性悪性腫瘍の原発性原因になると考えられる。

従って、胎児に遺伝的素因があるか否か、あるいは、後天的に網膜芽腫に罹患し ゃいすか否かを決定できるようになることが有利である。なぜなら、遺伝学的手 法より早期に診断でき、また治療できるからである。

Ｃ２，染色体部位１３ｑ１４からの 遺伝子の分子クローン化 ＲＢ遺伝子については先験的に何も知られていないので、候補遺伝子を適当な染 色体位置のみを基準にして同定し、これが“劣性”的な振る舞いをもつと仮定し た。

即ち、欠損のないＲＢ遺伝子が正常な網膜組織に発現するはずであるが、網膜芽 腫ではそうではないと仮定した。

“逆遺伝的”クローン化手法では、対象部位から一つかそれ以上のＤＮＡプロー ブを採取する必要がある。ＲＢ遺伝子をクローン化しようとする前は、主に部位 １３ｑ１４についてプローブを得る試みが幾つかの実験室で行われていた。多形 性標識酵素エストラーゼＤを１３ｑｆ４に対して定位し、既知組換え体のない状 態でＲＢ遺伝子に密接結合した。特異的抗血清を発生し、蛋白質を部分配列化す ることによって、エストラーゼＤｃＤＮＡを同定した。また染色体１３−特異性 ライブラリーからランダム選択によって単離したＨ３−８、Ｈ２−４２及び７０ ２等の１３ｑ１４に定位するＤＮＡも利用した。

ＲＢ遺伝子の同定後、そのｃＤＮＡ配列及びゲノム組織を決定した。前記米国特 許出願第０９８．６１２号明細書には、細胞核に認められ、かつＤＮＡ結合活性 をもつリンタンパク質のアミノ酸配列が開示されている。

Ｃ３，染色体ウオーキングによるＲＢ遺伝子の同定及びその役割 エストラーゼＤ遺伝子を定位、同定、配列決定及びクローン化した。さらに、こ の遺伝子をＲＢ遺伝子にかなり近接させた。従って、この遺伝子はＲＢ遺伝子を 染色体ウオーキングにより同定する出発点として宵月である。

この方法により単離したＤＮＡフラグメントを次にプローブとして使用すると、 胎児網膜細胞及び網膜芽腫細胞からのｍＲＮＡにおける定量的又は定性的差異を 調べることができる。このような差異が検出された場合には、これは腫瘍細胞の ＲＢ遺伝子に体性突然変異が発生している証拠になる。欠損ｍＲＮＡに対応する ＤＮＡフラグメントはＲＢ遺伝子について最善の候補である。さらに、それぞれ １３ｑ１３．１−１４．１１及び１３ｑ１４゜１ｌ−ｑ２２に欠失があることが 知られている突然変異体細胞を利用できることにより、ＲＢ遺伝子に体するりオ ーキングの正確な方向を決定できる。

公知ＲＢ遺伝子の定位と同様にして、同じ染色体部位１３ｑ１４に体して特異的 エストラ−ゼロクローンＦＬ２２を別なプローブＨ３−８と一緒に定位した。

プローブとしてエストラーゼＤＮＡ及びＨ３−ｄを使用して染色体１３ＤＮＡに そうで両方向染色体ウオーキングを行い、ゲノムＤＮＡ及びｃ　ＤＮＡをクロー ン化した。この代替的なスクリーニングにより、５Ｄ−１，５Ｄ−２、ＲＢ−１ 、ＲＢ−２及びＲＢ−５等の幾つかのそれぞれ異なるクローンを同定した。

ＲＮＡプロッティングのプローブとして候補ＲＢ遺伝子を用いてｍＲＮＡ転写を 検出し、正常な網膜及び胎盤組織から得た４、６ｋｂｍＲＮＡフラグメントを用 いて、クローンＲＢ−１及びＲＢ−５をハイブリダイゼーションした。網膜芽腫 ｍＲＮＡ転写から得たｍＲＮＡを用いて同じ条件でハイブリダイゼーン「ンを行 ったが、全く認められなかった。

網膜芽腫に関係がない他の！瘍、即ち線維肉腫及び髄芽腫は正常な４．６ｋｂｔ ｒ＋ＲＮ、Ａ転写を呈した。

２つのｃ　ＤＮＡライブラリー、即ち胎盤及び胎児網膜をクローンＲＢ−１を用 いて再スクリーニングして、完全なｃ　ＤＮＡを得たところ、クローンＲＢ−５ を単離できた。

さらに、ＲＢ−１及びＲＢ−５をプローブとして使用して２０以上のファージク ローンを単離してから、制限定位及びハイブリダイゼーシヨンによりサブフラグ メン）ｃＤＮＡプローブにすることによって特性化した。次にに、ＲＢ遺伝子の 制限地図を作成したところ、ＲＢ遺伝子は少な（とも１２のエキランが１１０ｋ ｂ以上のＤＮＡに散在していることが判明した。

ＲＢ遺伝子蛋白質産生体の配列を次に推定し、アミノ酸バイトロバシープロット を作成した。

米国特許出願第１０８．７４８号明細書に記載されている方法により、：ストラ ーゼＤに近接して認められる４、８ｋｂのメツセンジャーＲＮＡコード化遺伝子 については、染色体位置、同型接合性欠失及び発現におけるＩｌ！瘍−特異性変 化を基にして、これを網膜芽腫感受性遺伝子として同定した。この遺伝子の転写 は調べた網膜芽腫６種のすべてにおいて異常性であった。対照的に、ヒト胎児網 膜及び胎盤Ｈ瘍には、そして神経芽腫や髄芽腫等の他の腫瘍には完全な長さのＲ ＢｍＲＮＡが認められた。網膜芽腫細胞からのＤＮＡはある例では同型接合性遺 伝子欠失をもち、別な例では半接合性欠失をもっていた。それ以外の例では、い ずれも正常なヒト制御ＤＮＡと全く異なっていた。

ＲＢ遺伝子は２７のエキランが２００ｋｂ以上の部位にわたり分布していた。相 補ＤＮＡクローンの配列分析により一つのロング９オープン争リーデイングフレ ームが得られ、これにより９２８種類のアミノ酸からなる仮説的な蛋白質をコー ド化できた。

蛋白質配列データベースをコンピュータ検索したところ、密接な関連をもつ蛋白 質は認められなかった。推定アミノ酸配列には、核酸結合蛋白質に存在するのと 同様な潜在的金属結合ドメインが含まれていた。これら結果は、ヒト癌を調節す る劣性遺伝機構としてＲＢ遺伝子が関与していることを示唆している。

上記に指摘したように、初期出発点は、１５００ｋｂの範囲にある推定される部 位１３ｑ１４．１１の網膜部Ｗ４ｇ受性遺伝子座に結合している遺伝子コード化 工ストラーゼＤであった。エストラーゼＤｃＤＮＡクローンＥＬ−２２をプロー ブとして使用して、そのゲノムＤＮＡクローンを単離した。これらゲノムクロー ンの末梢ＤＮＡ区画を使用して、さらにゲノムクローンを単離した。

ウオーキング部位には２０ｋｂの間隔をおいて特異的な配列が同定された。これ ら配列をプローブとして使用して、胎児網膜及び胎盤ライブラリーからｃＤＮＡ クローンを単離した。プローブとしてＨ３−８を使用する同様な方法により候補 遺伝子を単離した。数１００ｋｂをカバーする両方向染色体ウオーキングをゲノ ム及びｃＤＮＡライブラリーを交互にスリーエングすることにより確立した。

ＲＮＡプロッティング分析のさいプローブとして候補ＲＢ遺伝子を使用して、関 連するメツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写を検出した。そして（約２５の第 １又は第２転移胎児限の切開により得た）ヒト胎児網膜及び正常なヒト胎盤部分 からポリアデニル化ＲＮＡを調製した。通常、分析に十分なｍＲＮＡを産生ずる のに十分大きい原発網膜芽腫サンプルは利用できな〜）ので、６種類の網膜芽腫 の培養細胞からポリアデニル化ＲＮＡを単離した。さらに、ポリアデニル化ＲＮ Ａを３種類の線維芽腫、１Ｎ類の髄芽腫及び原発性髄芽腫試料から調製した。

腫瘍及び組織サンプルすべてにエストラ−ゼロ転写（１，４ｋｂ）が認められた 。この知見はエストラーゼＤの既知“構成”発現に一致していた。この場合、エ ストラーゼＤハイプリダイゼーシロンを陽性コントロールとして使用した。

即ち、これらＩｌ！瘍にはＲＢ遺伝子の全体的な欠失のみが認められたが、小さ な部分的な欠失は見られなかった。

そして欠損のないゲノムが検出されたが、正常の遺伝子発現を意味するものでは なかった。この不一致はプロモータ一部位における突然変異によると考えられる 。ｍＲＮＡ転写サイズの減少はエキソン内の小さな欠失により説明できる。即ち 、大きなエキソン切り継ぎ配列、あるいはその他のｍ　ＲＮ　Ａプロセシング信 号のゲル移動度が十分に変化しなかったことにより説明できる。

ＤＮＡプロッティング分析により数多くの大きなＨｉｎｄｌｌｌが観察されたが 、これはＲＢ遺伝子座がかなり大きなゲノム部位に広がっていることを示唆して いる。

さらにゲノム構造を解明するためにプローブとしてＲＢ−１及びＲＢ−５を使用 して、ヒトゲノムＤＮＡライブラリ−から２０以上のファージクローンを単離し た。これらクローンを制限地図作成及びハイプリダイゼーンｅンによりサブフラ グメントｃ　ＤＮＡプローブに特性化した。ゲノムＤＮＡブロッティングデータ を使用して、ＲＢＢ伝子のＨｉ　ｎ　ｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ制限地図を作成した。この ＲＢＢ伝子は２７のエキランがＤＮＡの２００ｋｂ以上の範囲にわたり散在して いた。

ＲＢＢ伝子による特性を示すｃ　ＤＮＡクローンについて記載が発表されたのは 最近になりでからである。Ｎａｔｕｒｅ、３２３：６４３−６４６　（１９８Ｂ ）。このクローンによりアデノウィルス１−形質転換網膜細胞に４．７−ｋｂの ｍＲＮＡ転写が存在することが認められたが、４種類のＷＩＮ芽腫細胞系統には 全くみられなかった。この辺伝子の一部又は全部に関与する欠失は５種類の網膜 芽腫に観察されたが、これらはいずれも内部同型接合性欠失ではなかった。これ ら知見だけでは、ＲＢＢ伝子を正確に同定するのには十分でなかった。また、上 記報告には配列データはなく、ｃＤＮＡクローンの制限地図は本発明のと同じで あった。

上述したように、網膜芽腫中で特異的に変化した状態にあるＲＢＢ伝子発現は正 常な胎児網膜だけでなく、少なくとも１種の他の正常な、関係のない組織、即ち 胎盤にも認められた。調査をさらに広げるために、ラット胎児及び成体組織を用 意し、ＲＮＡブロッティング分析した。量にはかなりの変動があったが、組織す べてに４゜６−ｋｂｍＲＡＮ転写（恐らくはラットの正常サイズ）が認められた 。約２．３ｋｂの、第２の転写試料はラット胎児の脳に明らかであった。この短 転写はＲＢＢ伝子の差次的プロセシングかあるいは別種の遺伝子ではあるが関係 の近い遺伝子の転写を表すと考えられる。

別なＲＢｃＤＮＡＢローンが最近になって単離されたが、これは５′末端にさら に２３４個の塩基対をもつものであった。このＲＢｃＤＮＡはヌクレオチド１３ ９にさらにメチオニンコドンをもっていた。このメチオニンを開始コドンとして 使用した場合、推定ＲＢＢ白質はアミノ酸数が９２８で、分子量が１１０　ｋ　 Ｄであった。第１ＡＴＧにおけるヌクレオチド配列は他の既知ｍＲＮＡについて は特有゛のものではないので、開始コドン割当ては仮のものとみるべきである。

この後のインビトロ翻訳結果は、第１メチオニンを確実な開始位置であるとみる ことに育利であった。また、国立生物研究協会（ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌ　　Ｂ ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）の蛋白質 配列データベースにおけるコンピュータ調査では、４０００以上の発表されてい るアミノ酸配列にいずれとも強い相似性が認められなかった。ところが、多数の 核酸結合蛋白質及びウィルス蛋白質は最も高い相似性を示す酵母ＤＮＡ依存性Ｒ ＮＡポリメラーゼに対しては弱い配列相似性を示した。

推定蛋白質配列には１０の潜在的なグリコジル化位置が含まれていたが、候補膜 内外ドメイン（少なくとも２０の連続した疎水性残基）は存在していなかった。

アミノ酸ハイドロパン−プロットは想像上のアミン末端付近に疎水性が中程度の 部位を、そしてカルボキシル末端に親水性部位を示した。核酸結合Ｅ白質に存在 ブる金属結合ドメインと同様にシスティン及びヒスチジンが境界になる２対の短 いアミノ酸配列についてこれを同定した。位［６６３から７１６にいたる５４の アミノ酸からなる部位には工４のプロリン残基がある（２６％）、。

また、このプロリンに富む部位は核腫瘍遺伝子ｎ’ｉ　ｙ　ｃ及びｍｙｂにも認 められた。これら観察−結果の重要性についてはよく解明されていないが−は、 ＲＢ遺遺伝子牛生体核酸結合蛋白質である可能性を示唆している。また、ＲＢｉ Ｂ質１）Ｉ）ＲＢＩＩＯに　ついては、主に細胞核に存在していることも判明し た。

網膜芽腫遺伝子については以前はその性質が劣性であるとみられていた。遺伝子 発現における腫瘍特異性変化はこの遺伝子をＲＢと同定する最も強い証拠であり 、同型欠失の例、そしてｍＲＮＡの不在はその劣性であるという仮定を支持して いる。

遺伝網膜芽腫患者は２時的な原発性態として骨肉腫を発症する恐れが高い。網膜 芽ｌ１ｉＦ４歴をもつもたないにかかわらず、幾人かの骨肉腫患者に認められる １３４１４部位の染色体同型接合性による骨肉腫の形成に関与しているのは網膜 芽Ｂ感受性（ＲＢ）の不活化である。

上記から明らかなことは、ＲＢＢ伝子の腫瘍形成における役割については、それ が一般的にいって、希な症例である幼児癌に単に関与している以上のものである ことである。まづ第１に、ＲＢ等のような劣性遺伝子は腎部細胞ｍ＜ウィルム病 ）、肝芽腫、胚芽髄芽腫や線維肉腫等の通常ではない胚芽幼児癌をコントロール することができる。網膜芽腫と同様に、これらすべてのｌ！瘍は正常な胚形成に みられる組織の広範な過剰成長に似ている。

腎部細胞腫は染色体部位１１ｐ１３の欠失に関係があり、これらｊ！瘍において は隣接多形性標識は同型接合性になる。

Ｃ４，他の癌における遺伝子 ＲＢＢ伝子配列はまだ解明されていないので、他の腫瘍に於けるＲＢＢ伝子の役 割については現在も究明中である。網膜芽１ｈＪｉ患者は各部位における２次性 の悪性腫瘍の発症率が高い。最もよくみられるのは骨肉腫である。

以前に網膜芽腫が発症していな（でも、骨肉腫の場合部位１３ｑ１４において同 型接合性が低くなるという報告がある。これは、組織学的不一致やＩ！！瘍形酸 形成ける不一致があるにもかかわらず、これら２種類の腫瘍には共通な腫瘍形成 機構があることを示唆している。反対に、腎細胞芽腫及び誼芽腫は共に網膜芽腫 に密接な関係があるが、これらには明らかにＲＢの変化は関与していない。

ＲＢＢ伝子の研究がさらに続（と、腫瘍形成に関与する共通な機構の解明につな がると考えられる。

網膜芽腫との類推から、他の遺伝性癌や腫瘍特性染色体欠失を説明するために、 あるクラスの“癌抑制遺伝子”というものが仮定されている。網膜芽腫と骨肉腫 はしばしば同じ患者に発症していた。ぞして（網膜芽腫に罹患した、及び罹患し ていない患者の）幾つかの骨肉腫には染色体１３異型接合性の特異的欠損が認め られた。また、数例の乳癌にも染色体１３異型接合性の特異的欠損があった。異 型接合性の欠損はウィルム腫瘍（既知欠失に一致する）、ベックウィズ＝ヴイー デマン症候群腫瘍、膀胱の移行性細胞癌における、そして同様に乳癌における染 色体１．１　ｐにも認められている。同様に他の抑制遺伝子座も線緒芽肝、小細 胞肺癌、腎細胞癌、聴神経腫や結腸直腸癌に関与している。

ＲＢ遺伝子が最初に同定された基準は、正常な組織に比較した場合、網膜芽腫の ＲＢ遺伝子発現に変化があるということであった。これ以外の多数の腫瘍及び新 生細胞系統を調べたところ、そのうちにＤＮＡ転移やＲ８ｍＲＮＡ変化が生して いるもの、あるいはＲＢ蛋白質のないものが認めら九だ。例えば、８種類の骨肉 肝細胞系統のうち、３種類（Ｇ２９２、Ｓ　Ａ　ＯＳ　２及び０Ｈ８）が蛋白質 レベルで異常を示した。即ち、Ｇ２９２は分子量が高くなったＲＢ蛋白質を発現 し、一方５ＡＯ８２及びＯＨ３にはＲＢｆｆｉ白竹が全くみられなかった。ＲＢ Ｗ白質のない、いずれの骨肉腫細胞系統もＲＢｍＲＡＮ転写が短く、そしてＧ２ ９２についてはＲＢｍＲＮＡは短くかつ正常でありだ。細胞系統５ＡＯ８２につ いてはＲＢ遺伝子の３′末端の同型欠失がみられ、内部７．５ｋｂＨｉｎｄｌＩ Ｉにエキラン含有Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉフラグメントをもっていた。ところが、Ｇ ２９２についてはＲＢ遺伝子は全体的に正常な構造であった。

また、正常サイズのＲＢｍＲＮＡが存在する一部の滑液肉腫細胞系統（ＧＨＭ） にもＲＢ蛋白質は認められなかった。Ｒ，Ｂ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａプローブを使用す るＤＮＡプロッティング分析はＧＨＭＤＮＡは全体的に正常であることを示した 。この細胞系統が、蛋白質１ノベルでのみ明らかに認められたＲ　Ｂ　３！ｉ伝 子不活化の最初の実例である。また、滑液肉腫から新たに試料を採取し、これに ついても分析した。正常サイズＲＢｍＲＮＡ転写と長すイズＲＢｍＲＮＡ転写（ ６，５ｋｂ）の両者がプロッティング分析により観察され、そして正常サイズ転 写は全腫瘍と混合された非新生細胞から誘導できることが明らかになった。ＲＢ ｃＤＮＡプローブを使用する５ＤＳＹＩＤＡＮ分析により、Ｈ４ｎｄｌＩ１１Ｅ ｃｏＲＩ及びＰｓｔＩエンドヌクレアーゼダイジェッシ式ン処理後、全正常フラ グメントに加えて過剰な制限フラグメントが認められた。これは内部ＲＢ遺伝子 複製を示唆するものである。

これらフラグメント内におけるエキラン複製はＲ８ｍＲＮＡ転写にほぼ１．ｌｋ ｂを付加するもので、実質的に観察されたｍＲＮＡサイズ（６，５ｋｂ）を占め るものである。別な研究により、新生骨肉腫にＲＢ遺伝子突然変異の存在、そし て網膜芽腫病歴をもたない患者にも多様な軟組織肉腫が存在することが確認でき た。

最近、９種類の乳癌細胞系統のうち２つにＲＢ遺伝子不活化が認められた。ひと つの細胞系統のＲＢ遺伝子では、エキラン５及び６を含む５ｋｂ部位の同型接合 性内部複製が生じていた。これに対応して、Ｒ８ｍＲＮＡ転写が長くなった。こ れから、その翻訳がリーディングフレームシフトにより早いうちに終了したと考 えられる。

他の細胞系統にはＲＢ遺伝子の同型接合性欠失が生じたため、全遺伝子がエキラ ン２より排除された。特異的抗体を使用する免疫沈降によっては、いずれの細胞 系統からもＲＢ遺伝子産生体ｐｐＲＢ１１０が検出できなかった。

肺小細胞癌から採取した一部の細胞系統にＲＢ遺伝子発現欠損があることにつ（ １ても最近報告があった。

これら結果は網膜芽腫以外の癌の形成におけるＲＢ遺伝子突然変異の役割を支持 している。ところが、各ｐＨ瘍のタイプについては、ご（一部の症例のみで突然 変異が認められているにすぎない。これに対して考えられる説明は次の２つであ る。即ち、ｌ）これらｌ１１ｉ瘍には遺伝的突然発生性のものがあるため、ＲＢ 遺伝子が関与するのは各８１４タイプのごく一部であり、及び／又は２）ＲＢ遺 伝子の一部の不活化突然変異については検出できないからである。

Ｃ５，ＲＢ遺伝子のクローン化 ＲＢ遺伝子の正確なヌクレオチド配列の同定、単離、決定及び該遺伝子のクロー ン化には多（の使い道がある。

第１の使い方は対応するｍＲＮＡに配列転写である。

このｍＲＮＡは次にＲＢ遺伝子蛋白質産生体の翻訳する。

次に、この蛋白質産生体を抗原として使用すると、特異性抗−ＲＢＷ白質抗体を 得ることができる。そしてこの抗体を診断免疫標識として使用すると、被検査組 織におけるＲＢ遺伝子蛋白質の育無を調べることができる。ＲＢ蛋白質が存在す る場合には、ＲＢ遺伝子には欠損がなく、従って網膜芽腫は認められないと診断 する。一方蛋白質が存在しなかったり、変質している場合には、欠損ＲＢ遺伝子 があり、この結果、網膜芽腫又はその他の癌があると診断する。あるいは、これ を発症しやすいと診断する。

また、ＲＢ遺伝子の配列は特異的ＲＢ遺伝子ｃ　ＤＮＡクローンを産生ずるのに 使用できる。このクローンは他の関連遺伝子や機能がまだ知られていないＲＢ遺 伝子に近接している遺伝子の単離、同定及び配列決定を行うさい遺伝標識やプロ ーブとして使用できる。

ＲＢ遺伝子の制御及び調節機能が発揮するのは、他の遺伝子のＩｌ［形成活性を 抑制し、そして悪性！！瘍細胞の成長を阻止するのに役立つＲＢ蛋白質を通じて である。

Ｃ６，突然変異体ＲＢ遺伝子の１！瘍形成性網膜芽腫細胞に抗原により検出でき るＲＢＩ白質が存在していないことは、突然変異体ＲＢ遺伝子によるＩｌ！瘍形 酸形成じるのは短ＲＢｍＲＮＡを含む細胞系統における遺伝子座生体機能の完全 な欠損を通じてであるという考えを支持するものである。

ヌクレオチド配列から推定される仮説的蛋白質はＭＷが約１０６ｋＤであると考 えられていた。免疫沈降蛋白質のＭＷは約１１０〜１１４ｋＤである。表１に完 全なＲＢ蛋白質アミノ酸配列を示す。この完全配列は新たに再構成したクローン から得た配列であり、このクローンは元のｃＤＮＡクローンにはない最末端５９ を含むクローンであるｏ　５ｃｉｅｎｃｅ２３５：１３９４−１３９９　（１， ９８７）。

（表１の）アミノ酸配列は常法通り略記号で示す。ア表　１ が一致していないことは２次的な蛋白質変質により説明ミノ酸残基の略記号の意 味は次の通りである。Ａ＝アラすることができる。推定アミノ酸配列にはい（っ かの潜Ｄ、癌抑制遺伝子産生体を用いる診断方法所望癌抑制遺伝子の定位及びク ローン化後は、癌抑制遺伝子に関係する癌を診断するに役立つ遺伝子産生体を得 るためにこのクローン化遺伝子を使用できる。

この方法ではまづ最初に、患者の組織サンプルの癌抑制遺伝子産生体と反応でき る産生体を得る。この点に関して、産生体間の反応を観察して、組織サンプルの 癌抑制遺伝子の正常の表現型発現の有無を決定する。

詳しくは、クローン化した癌抑制遺伝子を使用して抗体を形成する。この癌抑制 遺伝子蛋白質産生体に特異的な抗体を使用して、患者の組織サンプルの癌抑制遺 伝子蛋白質産生体と反応させ、癌抑制遺伝子が適正に機能しているか否かを決定 する。代表例についていえば、抗体と癌抑制遺伝子匿白質産生体との間に免疫複 合体が形成した時に、癌抑制遺伝子が適正に機能していると診断する。免疫複合 体が形成しない場合には、癌抑制遺伝子蛋白質産生体が欠損状態にあるか、異常 であると診断するか、あるいはそれがないと診断する。即ち、患者の組織サンプ ルと免疫複合体を形成する抗体がない場合、患者の癌抑制遺伝子は欠損状態にあ るか、存在しないと診断する。

特異性抗体は、一般に正常の癌抑制遺伝子蛋白質産生体を公知方法に従い抗原と して使用すると産生ずる。所望抗体を産生ずるには勿論他の公知方法も使用する ことができる。

ここに開示する方法の特定な例として、ＲＢｉｌＩ伝子の蛋白質産生体を同定し た。米国特許出願第０９８，６１２号明細書に記載されている方法により、前免 疫ウサギ抗血清を使用してリンタンパク質を免疫沈降処理し、同明細書に記載さ れているように、抗−ｐ　ｐ　ＲＢ１１ＣＩＩ　ｇＧを用いて分子量が１１０〜 １１４ｋＤの　蛋白質を免疫沈降処理した。

Ｄｌ、癌素因の決定診断方法 癌抑制遺伝子を同定し、クローン化して得たクローンを診断上有効である。この 点に関して、患者から採取した組織サンプルの癌抑制遺伝子の表現型発現を検査 することによって、患者が癌に罹患しやすい素因をもっているかについてスクリ ーニングできる。

Ｄ２．ＲＢｆｆｉＢ質の同定及び特性化網膜芽腫癌抑制遺伝子に関する特定な例 として、網膜芽腫感受性遺伝子のリンタンパク質産生体をＤＮＡ結合活性をもつ 細胞核に主に定位した。そのアミノ酸配列を同定した。ｐ　Ｉ）　ＲＢ　ｉｉｏ と同定されたリンタンパク質は網膜芽腫や網膜芽腫遺伝子が関与する他の癌の診 断に、そしである程度はこれら癌の治療及び他の遺伝子の腫瘍形成性の判定に使 用できる。

ｐ　ｐ　Ｒ８１１０の同定についてはその要約を示したが、完全な記載について は米　国特許出願第０９８．８１２号明細書を参照すべきである。

米国特許出願第０９８．’６１２号明細書に記載されているように、実験により 得られた証拠によれば、腫瘍形成にはＲＢＢ伝子の完全な不活化が必要であり、 またＲＢＢ伝子については新しい機能モードが癌表現型の抑制として存在してい る。

一般に遺伝子作用にはその蛋白質産生体が介在するので、ＲＢ遺伝子窟白質産生 体が遺伝子調部活性をもっていると考えられる。

従って、ＲＢＢ伝子調節活性及び腫瘍形成活性を調べるためには、ＲＢ遺伝子蛋 白質産生体の完全なアミノ酸配列の決定、特異的な抗−網膜芽Ｉ！！蛋白質抗体 、その生化学的な特性化、細胞上局在化及びそのＤＮＡ結合活性が重要である。

ある蛋白質のアミノ酸配列は、この蛋白質に応答する特定遺伝子の遺伝コードに よって決定できる。従って、該蛋白質を単離し、その正確なアミノ酸配列を決定 し、そしてその生体における生理学的機能を決定するためには、該応答遺伝子を 単離・局在化し、これをクローン化し、そして遺伝子の特異的蛋白質産生体の同 定に作用なｃ　ＤＮＡの配列を決定しなければならない。

他の染色体１３標識から染色体ウオーキング方法を使用して、網膜芽腫遺伝子及 びアミノ酸配列のコード化を１３染色体、即ち１３ｑＬ４：１１で同定した。エ ストラーゼＤｃＤＮＡクローンの使用及びスクリーニングによって、それぞれり 、６ｋｂのゲノム及びｃ　ＤＮＡ重複クロりンＲＢ−１及びＲＢ−２をヒトｃＤ ＮＡライブラリーにおいて同定した。引き続き、別なりローンＲＢ−５について も同定した。

最初に、胎９１Ｑ膜芽腫及び胎盤における４、８ｋｂｍＲＮＡ転写を用いて、Ｒ Ｂ−１クローンをノ翫イブリダイゼーシ日ンした。網膜芽腫サンプルには、異常 ｍＲＮＡ転写やｍＲＮＡ転写のいずれも全く認められなかった。

引き続き同定されたＲＢ−５クローンを３．５ｋｂ挿入したところ、ｍ　ＲＮ　 Ａハイブリダイゼーシｌンと同じ結果が得られた。制限酵素分析したところ、Ｒ Ｂ−５及びＲＢ−１クローンは０．４ｋｂ部位で重複し、正常なＲ８ｍＲＮＡ転 写に近いサイズである約４．６ｋｂのＤＮＡ区分を与えた。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、７４：５４６３−５４６７　（１９７ ７）に記載されているジデオキシ終止方法によってクローンＲＢ−１及びＲＢ− ５ヌクレオチド配列を分析し、完全なｃ　ＤＮＡ配列を再構成した。′サイクロ ン法により異なる欠失鋳型を一本ａＭ１３ファージクローンに作り、９５％以上 の配列を決定した。残りのシーフェンスギャップを両鎖のブライマー伸長により 決定した。このようにして同定した完全な配列には４，５２３のヌクレオチドが 含まれていた。

さらに行った分析はＲＢ遺遺伝子牛生体核酸結合蛋白質であるという考えを支持 するものであった。さらに、ＲＢｃＤＮＡＢローンのヌクレオチド配列分析はＤ ＮＡ結合機能を示唆する特徴で仮説的蛋白質をコード化するロングオープンリー ディングフレームを証明した。これを確認し、特異性抗体を得、そしてその推定 ＤＮＡ結合を決定するための抗原として使用した。

ＲＢ蛋白質に対して特異的なウサギポリクローン性抗体を調製した後、ＲＢ！白 質の免疫沈降、免疫染色及び局在化を行うために、精製抗−ＲＢ　Ｉ　ｇＧ抗体 を使用した。この抗体はヒト組織サンプルのＲＢ蛋白質な妙所同定するのに宵月 である。

ＲＢＭ白質を同定するために、ＲＢ発現が正常か変化していることが知られてい る幾つかのヒト細胞系統を選択した。

正常なＲＢｍＲＮＡを含む陽性コントロールとしてＬＡＮ−１神経芽Ｈ■胞系統 の正常なヒト線維芽腫、ヒト肝癌アレキサングー細胞系統及び骨肉腫Ｕ２Ｏ５細 胞系統を使用した。これら細胞はいずれもＡＴＣＣから入手したものである。陰 性コントロールとしてＰ、　Ｂ　ｍ　ＲＮ　Ａが短いか、あるいはこれが欠損し ている細胞系統、例えば網膜芽腫細胞系統Ｙ７９　（ＡＴＣＣ）　、ＲＢ３５５ 　（カナダ、トロントのＲｏｂｅｒｔ　　Ｐｈｌｌｉｐｓ社から譲り受けた）、 ＷＥＲＩ−１、ＷＥＲＩ−２４及びＷＥＲＩ−２７（いずれもフィラデルフィア のＴ、５ｅｒｙ　　Ｗｉｌｌｓ’眼科医院から譲り受けた）を使用した。

上記の正常なヒト細胞系統及び５種類の網膜芽腫からの細胞はすべて３５３−メ チオニンで標識化し、前免疫ウサギ抗体１ｇＧ又はウサギ抗−ＲＢ　Ｉ　ｇＧで 免疫沈降処理した。

すべてのヒト細胞系統からの細胞を代謝的に３５Ｓ−メチオニンで標識化した。

Ｊ、Ｖｉｒｏ１３８：１０６４−１０７６　（１９８１）に記載されている方法 を適用して、抗−ＲＢ抗体１ｇＧの５０ｕｇ〜２００ｕｇ／ｍｌ。

好適には１１００ｕ／ｍ＋の１〜２０ｕｌ、好適には１０ｕｌで標識化細胞混合 物を免疫沈降処理した。

すべてのコントロール細胞系統では、見掛は分子量が１００〜１１４ｋＤの蛋白 質ダブリットが検出された。

網膜芽腫細胞系統、又は前免疫血清で免疫沈降処理した細胞では、蛋白質ダブリ ントは認められなかった。

ウサギ抗−ＲＢ　Ｉ　ｇＧの免疫沈降処理したＲＢ蛋白質をＳＤＳ／ＰＡＧＥに より分析し、オートラジオグラフィー法により分析した結果は、正常な陽性蛋白 質、即ち３５Ｓ−メチオニン標識化細胞系統を含むＲＢ蛋白質の免疫沈降が認め られた。

Ｂ２．ｐｐＲＢｌｌｏの局在化及び機能数種類のを椎動物種からの細胞、例えば ＱＴ８　（ウズラ）　、ＮＩＨ／３Ｔ３　（？ウス）、Ｒａｔ−２（ラット）や Ｃ０５（サル）の細胞を３２ｐ−リン酸で標識化し、そして蛋白質を抗−ＲＢ　 Ｉ　ｇＧで免疫沈降処理した。細胞すべてに抗原的に関連のある蛋白質が認めら れ、これらの見掛は分子量はヒトの細胞の場合とほぼ同様で、ウズラについては １０８ｋＤ、マウスにつ〜）ては１２０ｋＤ。

ラットについては１２８ｋＤ、’ｔルについては１０８〜１１０ｋＤであった。

ｐ　ｐ　ＲＢ　１１０の推定全アミノ酸配列の幾つかの特性は他の腫瘍遺伝子と 同様で　ある。従って、ｐ　ｐ　ＲＢ　ｉ　１０の細胞下局在化について細胞分 画法により調べて、核、細胞質や細胞膜分画におけるｐ　ｐ　ＲＢ　１１０の分 布を同定した。

この結果、８５％のｐｐＲＢｌｌｏは核分画に存在し、少量のＩ）　Ｉ）　ＲＢ １１Ｑが細胞膜に認められた。細胞質分画には検出できるＩ）　ｐＲＢ　１１０ は存在していなかった。

ｐ　ｐ　ＲＢ　１１０が主に核に局在化することをさらに証明するために、免疫 組織化　学染色に有利な細胞形状をもつことが知られている骨肉腫細胞系統Ｕ２ Ｏ８を使用した。実験群として、Ｕ２Ｏ５細胞を抗−ｐ　ｐ　ＲＢ　１１０で免 疫沈降処理した。対照群として、Ｕ２Ｏ８細胞を前免疫ＩｇＧで免疫沈降処理し た。次にＳ　ｉ　ｇｍａ社の製品であるローダミン結合ヤギ抗−ウサギＩｇＧを 用いて、両群をインキュベーションした。抗−ｐｐＲＢ１１０１ｇＧ反応細胞、 即ち細胞核には免疫蛍光　が認められた。

前免疫詳反応細胞には蛍光は全く認められなかった。

核分画におけるＩ）ｐＲＢｌｌ、Ｑの細胞下局在化は、ＲＢ蛋白質が他の遺伝子 を調　節するさい重要な調節機能を発揮すると共に、ＤＮＡ結合活性をもつこと を示唆するものである。

ある種の細胞系統、特に神経芽１ｕＬＡＮ−１細胞等の網膜芽腫以外の腫瘍細胞 系統を３２ｐ−リン酸で放射線標識化した。Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、６： ４４５０−４４５７　（１９８６）に記載されている方法に従ってこれら標識化 細胞の細胞溶解産物を一本鎖又は二本鎖子ウシ胸腺ＤＮＡ−セルロースカラムに より分離した。

得られた結果は、ｐ　Ｉ）　ＲＢ　１１０は容易に飽和する限られた数のＤＮ　 　Ａ位置にのみ結合することを示唆している。

従来から知られているように、Ｃ−ｒｎ　ｙＣｓ　ｎ　−ｍ　ｙＣ％ｃ−ｍｙｂ ｔ　ｃ−ｆｏｓ等の他の原腫瘍遺伝子はＤＮＡ結合活性をもつ核リンタンパク質 である。Ｍｏ１．Ｃｅ１１、Ｂｉ　Ｉ　１．８：４４５０−４４５８　（１９８ ７）。

これら原腫瘍遺伝子の腫瘍形成活性は遺伝子発現の脱調節作用や構造的変化によ り生じる。そして遺伝子産生体は腫瘍形成に本質的なものである。

なお、放射線免疫検定法を使用したが、酵素免疫検定法（ウェスタンブロッティ ング分析）や免疫細胞化学検定法等の方法も好適に使用できる。

Ｂ４．１）ｐＲ１３１１０の１１面機能ＲＢ遺伝子の部分的不活化や完全不活化 により腫瘍形従って、ｐｐＲＢｌｌｏが存在すると、他の遺伝子の！！瘍影形成 活性幾分か抑制され、悪性！！瘍細胞の成長を阻止できる。このように、ｐ　Ｉ ）　ＲＢ　１１０は重要なｒＡ節蛋白質であり、これが存在すると悪性８１瘍の 成長　を阻止０抑制でき、また存在しないと、悪性ｌ！瘍成長の引金となる。

即ち、ｐｐＲＢｌｌｏの重要性は他の遺伝子をｙＡｅする点にある。換言すれば 、ｐｐＲＢｌｌｏの不在や欠損は腫瘍形成性を仲介するものである。

Ｄ５．診断手段トＬテ（７）ｐｐＲ１３１１０ｐＩ）　ＲＢ　１１０はＩＩ！！ 瘍形成の媒介体として働くので、これには幾つかの実際的な　用途がある。

第１に、ｐｐＲＢｌｌｏの存在又は不在は、動物胎児や胎芽に１１１Ｍ芽腫やそ の他　のＲＢ遺伝子関与！！瘍が存在しているか、あるいはそれらが該ＵＳにか がりゃすい素因をもっているかを判別する診断手段になる。即ち、早期診断によ り網膜芽腫やその他の腫瘍について早期に注意を向けることができ、また早期に 治療できるので、２次性のな腫瘍形成の発症を未然に防止できる可能性が出て来 る。

網膜芽腫の存在やそれにががりゃすい素因があるが否かを診断するためにｐ　ｐ 　ＲＢ　１１０を実際に使用する場合は、特異的な抗−１）Ｉ）ＲＢ１１０抗体 を用いて組織生検材料を免疫スクリーニングする。このためには、生検組織を放 射線標識化・免疫スクリーニングする。あるいは、ウェスタンブロッティングと して知られている方法により生検組織抽出蛋白質をニトロセルロースフィルター でプロッティングし、標識化抗体を用いてプローブ処理する。

この容易に利用できる診断方法は遺伝網膜芽腫の履歴をもつ家族構成員なスクリ ーニングにするのに特に好適である。また、この方法は網膜芽腫に関連があるが どぅかには関係なく、骨肉腫、線維芽腫、グリア芽腫や乳癌等の２次性癌発症の 予測に有効である。

さらに、腫瘍形成抑制に使用でき、この場合はｐｐＲＢｌｌｏを必要とする個体 にＲＢｃＤＮＡを分子誘導及び遺伝子組み込みによりｐｌ）ＲＢ１１Ｃ＋を与え る。

またさらに、欠損のないＲＢ遺伝子をＩ！！瘍細胞に直接与えることによって発 癌性成長を抑制するのにも使用できる。この細胞はｐｐＲＢｌｌｏを産生し、こ れが　他の腫瘍性細胞に作用する。

Ｅ、遺伝子療法及び予防 既に記載したように、本発明による診断方法は個体が癌に罹患しやすいかどうか を判別するのに官用である。

しかし、治療及び／又は予防するためには、クローン化層抑制遺伝子それ自体を 生体に投与して、癌の抑制を制御する必要がある。クローン化遺伝子投与は通常 のベクターによって行う。場合によっては、このクローン化遺伝子は局部投与に 向いている。

好ましい投与方法では、ウィルスリポソーム、その他のベクターを利用する。適 当なベクターによって投与されたクローン化層抑制遺伝子は欠損癌抑制遺伝子を もつ、あるいは癌抑制遺伝子をもたない患者に予防及び／又は治療効果を与える が、正常な遺伝補体をもつ患者には副作用は生じない。例えば調査診断により癌 になりゃすい素因があると診断された場合等のように、予防措置が必要であると 診断された場合には、クローン化層抑制遺伝子を患者に投与する。指摘したよう に、このクローン化遺伝子の投与により、正常な遺伝補体が個体に副作用するこ とはない。

一例として、ＲＢ遺伝子を治療・予防作用についてテストした。ＲＢ遺伝子の仮 説的癌抑制活性を所与のものとして、不活化内因性ＲＢ遺伝子を含む培養腫瘍細 胞に遺伝子を組み込みことによってＲＢ遺伝子機能についての検定体を調製した 。この簡単な検定体で効果がなくても、癌の遺伝抑制という考えが必ずしも無効 になるわけではない。しかし、陽性結果（新生物表現型の抑制）が出たなら、そ れはこの考えを強く補強するものである。

ＲＢ遺伝子突然変異の直接的検出は次の理由から臨床上意味がある。即ち、１） 散発的な一方的遺伝及び非遺伝症例は患者の綿維芽細胞を検査し、２次性の原発 性癌や子孫への伝達の恐れについて正確に評価することによって判別できる。２ ）遺伝診断はＲＦＬＰに関する知識がなくても、あるいは他の家族構成員を検査 しなくても可能である。既に指摘したよ・５に、このためにはイントロンｌプロ ーブが「効である。ただし、この部位において突然変異体ＲＢ遺伝子のどの部分 が転移しているかによることに注意すべきである。ＲＢ遺伝子突然変異のその他 の共通位ｆｉｂ同定でき、プローブをその方向について特異的に設計できる。ま た、ＲＢ遺伝子プロモーターをこの共通位置に存在させることも可能である。

ＲＢ蛋白質に対する抗体は臨床上診断及び／又は予防に利用することができる。

例えば、ｌｉ！切片が免疫ペルオキシド染色できないことによりＲＢ遺伝子突然 変異を推定でき、この場合非新生支質が内部陽性コントロールになる。ＲＢ抗体 を使用すると、骨や軟組織新生物の組織妙所における多義性をなくすことができ る。また、ＲＢ遺伝子関与を基準にすれば、乳癌をさらに厳密に分類でき、これ は有効な手段になるはずである。

最後に、ＲＢ　ｉｉｌ伝子の不活化が網膜芽腫やその他の癌の原発性原因ならば 、遺伝子転移により正常なＲＢ遺伝子活性の回復が将来の癌治療の新しいアプロ ーチになると考えれる。

細胞レベルでＲＢ遺伝子機能を試験するために、Ｒｂ及びＬｕｘウィルスを利用 する検定体を作り、不活化内因性ＲＢ遺伝子を合作する培１！腫瘍細胞に遺伝子 を組み込んだ。

Ｅｌ、腫瘍細胞系統のＲｂ及び Ｌ　Ｕ　Ｘウィルス感染の発生 遺伝子療法を利用する一例として、クローン化ＲＢ遺伝子をインビボ及びインビ トロ研究に利用した。この場合、クローン化ＲＢ遺伝子を組織培養物に注入した 。別な例としで、クローン化ＲＢ遺伝子を予防を目的として脱毛マウスの１側部 に投与した。次に、脱毛マウスの両側部に発癌物質を注入した。一方の側にはｗ Ａ瘍影形成認められたが、クローン化ＲＢ遺伝子で予防治療した側には１１１１ は形成していなかった。

Ｒｈ及びＬｕｘウィルスの構成。第１図に示すように、２種類の異なるアンホト ロピック（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）レトロウィルスを構成した。一方のＲｂウ ィルスはＭｕＬＶＬＴＲ（モｏ二−ネズミのＲＢｃＤＮＡ）と、Ｒ５Ｖ　（ラウ ス肉腫ウィルス）プロモーターに融合したｎｅｃとからなるものであった（ＬＴ Ｒ−ＲＢ−Ｒ８Ｖ−Ｎｎｅ−ＬＴＲ）ａＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、８０二４７０９（１９８３）、ＮｅｏはＴｎ５ネオマイシンホスホトラ ンスフェラーゼをコード化し、ネオマイシン類似体０４１８に耐性を与えるもの である。これを使用して、非感染細胞に対して選択を行った。

Ｊ、Ｍｏ１．Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　１：３２７（１９８２）。

他方のＬｕｘウィルスはＲＢをルシフェラーゼ遺伝子で置換した点を除けば、同 じであった。Ｍｏ１．Ｃｅ１１、Ｂｉｏｉ、　、７：７２５　（１９８７）、こ のルシフェラーゼ遺伝子はＲＢ遺伝子の特異作用に対するコントロールとしてだ けでなく、異なる細胞型におけるウィルス構成の発現効率を検査する手段として も作用する。プロウィルスＤＮＡを含むこれら２種類のプラスミドを次にＰＡ１ ２細胞にトランスフェクシ１ンした。これら細胞は詰み込み欠損（ｐａｃｋａｇ ｉｎｇ−ｄｅｆｆｃｉｅｎｔ）プロウィルスを保有し、アンホトロビックエンベ ロープＭ蛋白質を含むウィルス増殖に必要な成分をすべてを発現する。Ｍｏ１． Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ−１５：４３１　（１９８５）（第１Ｂ図）。

この工程ではご（僅かの感染ウィルスが増殖するだけでなり、トランフェクシｄ ンしＰＡ１２細胞から採取し上澄みを使用して、エコトロピック（ｅｃｏｔｒｏ ｌ）ｉＣ）ヘルパー系統ｐｓｉ−２を感染処理した。Ｃｅ１１３３　：１５３　 （１９８３）　、及び１ｂｉｄ３７：１０５３（１９８４）。個々の０４１８− 耐性コロニーを単離しウィルス増殖及びＲＢ蛋白質発現についてスクリーニング した。　スクリーニングした１０のコロニーにうち８コロニーが、指標細胞とし て２０８Ｆラツト線維芽細胞を使用して検定したところ、１０３−１０５Ｇ４１ ８−耐性ｃ　ｆ　ｕ／ｍ　ｌを産生じた。

３２ｐ−オルトホスフェートで標識化し、そしてポリクローン性抗−ＲＢ抗体（ 抗−ｆＲＢ）を用いて免疫沈降処理したところ、親クローン及び感染ラット２０ ８Ｆ細胞をともにロープントＲＢ蛋白質（１２５ｋＤ）に加えて正常サイズのヒ トＲＢ蛋白質（１１０ｋＤ）を発現した。Ｎａｔｕｒｅ、３２９：’８４２　（ １９８７）、最後に、内斜視ウィルスを使用して、ＰＡ１２細胞を感染処理した 。ウィルス増殖及びヒトＲＢ蛋白質の発現について多数のＧ４１８−耐性クロー ンをスクリーニングした。

１０クローンのうち５クローンが８８Ｍ白質を発現し、最高力値は４ｘ１０４ｃ ｆｕ／ｍ！であった。ルシフェラーゼ発現についてコロニ　−をスクリーニング した以外は同一手法でＬｕｘウィルスを得た。（第１ＢＩｍ）。

最高力値は１ｘ１０５ｃｆｕ／ｍｌであった。以下に記載する研究すべてにお　 〜）でこれら２種類のウィルス株を使用した。

腫瘍形成系統の感染；ＲＢ遺伝子の発現。正常な８８Ｍ白質がないことから　わ かるように、網膜芽腫細胞系統ＷＥＲＩ−Ｒｂ２７及び骨肉腫細胞系統５ａｏｓ −２は不活化ＲＢ遺伝子を保育している。Ｎａｔｕｒｅ３２９：６４２　（１９ ８７）、及びＪ−Ｙ　　Ｓｈｅｗ等の論文（未公刊）。いずれの細胞系統にもＲ Ｂ遺伝子の部分的な欠損が認められた。Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｅ ｔ、８５：２２ｆＯ（１９８８）、及び１ｂｉｄ８５：６０１７　（１９８７） 。これら細胞はＲＢ−細胞と呼ばれていた。別な骨肉腫細胞系統Ｕ−２Ｏ３は正 常サイズのＲＢＷ白質を発現し、明らかに正常なＲＢ対立遺伝子をもっていた。

Ｎａｔｕｒｅ３２９：８４２　（１９８７）。これら細胞系統をＲＢ及びＬｕｘ ウィルス感染受容体として使用した。アンホトロピックレトロウィルス感染の力 値及び効率が低かったため、検定すべてにおいて０４１８による選択を行い、未 感染細胞を除いた。ＲＢウィルス感染及び０４１８選択後、３２Ｐ−オルトホス フェートで標識化したところ、ＲＢ−細胞系統は正常サイズのＲＢＷ白質を発現 した（第２Ａ図経路２＆４）。また、Ｌ　ｕ　ｘ−感染ＲＢ−細胞についてはＲ Ｂ蛋白質を発現しなかった。予想通り、内因性ＲＢ蛋白質が存在していたため、 Ｒｂウィルス感染後、Ｕ−２０Ｓ細胞におけるＲＢＷ白質発現は検出できる種変 化していなかった。ところが、選択クローンの０４１８耐性から、ウィルス感染 が発生したのは事実であった。

さらに！癌細胞に新たに発現した８８Ｍ白質を証明するために、その細胞局在化 について調べた。内因性ＲＢ蛋白質の多（は、細膓分画法及び免疫染色から判明 したように、Ｕ−２Ｏ３細胞核に局在化していた。抗−ｆＲＢ抗体を使用して、 Ｒｂウィルス感染５ａｏｓ−２細胞を免疫染色した。ＲＢ蛋白質位置を反映して 、細胞核は茶色発色団に強い陽性を呈した。同じ条件でも、Ｌｕｘウィルス感染 細胞には染色は全く認められなかった。従って、新たに発現した８８Ｍ白質は３ つの主要な生化学的指標（分子１１細胞局在化及びホスホリル化）によっては判 別できなかった。続いて実験を行う前に、抗−ｆＲＢ抗体で免疫沈降処理するこ とによって細胞におけるＲＢ遺伝子発現をモニターした。

ＲＢ細胞におけるＲＢｉｆ白質発現の回復が細胞形態に影響し、かつ成長を抑制 することを確定するために、ＲＢ遺伝子発現のインビトロ効果をテストした。第 ３Ａ〜第３Ｆ図に示すように、０４１８Ｓ選択後、ＲＢ及びＬＵＸウィルス感染 ｆｌｆｆｉ［細胞の培養物を比較した。単層として成長した、Ｕ−２Ｏ３細胞の 形態はいずれのウィルスで感染した後も変わらなかった。５ａｏｓ−２の単層培 養物はＬｕｘウィルス感染によっても変化しなかったが、Ｒｂウィルス感染後、 明瞭な形態変化を呈した。感染２週間後から、０４１８−耐性細胞からなる２つ の明瞭に異なる細胞集団が再現するのが認められた。細胞の大部分は平坦に潰れ 、Ｌｕｘ！染又は非感染細胞に比べて直径が大きくなった（３〜１０倍）（第３ Ａ〜第３Ｂ図）。残りの細胞は小さく、非感染親細胞に似ていた。

４週間培養してから、さらに継代培養した後、親細胞又はＬｕｘ感染５ａｏｓ− ２細胞に似た小さな細胞によって大きな細胞を置換した。ＷＥＲＩ−Ｒｂ２７細 胞の懸濁培養物もＬｕｘウィルス感染によっては変化を受けなかった。ところが 、Ｒｂｇ染４週間後、中程度の大きさの細胞が現れ、８週間まで数が増え続けた 。また、６週間後から死滅した細胞の大きな塊が認められた（第３Ａ図〜・第３ Ｆ図）。（１０週間以上もの）長期間培養後、親細胞又はＬ　ｕ　ｙ、ウィルス 感染細胞に似た小さな細胞が優勢な細胞型になった。

これら形態上明瞭に異なる集団数の変化は２つの細胞型の、培養における細胞分 裂率及び／又は生存率が異なっていたこと示唆するものであった。コロニー成長 検定を使用して、単心骨肉腫細胞について定量化した。感染５ａｏｓ−２及びＵ −２Ｏ３細胞を低密度で平板培養し、これら細胞が形成する個々のコロニーを同 定した（第４Ａ図〜第４Ｂ図）。この後、５日間にわたり顕微鏡により各コロニ ーの細胞数を数えた。５ａｏｓ−２細胞の場合、Ｒｂ−ウィルス感染細胞により 形成したコロニーの大部分はその成長速度がＬ　ｕ　Ｘ感染細胞のコロニーより もかなり遅かった。あるいは、成長は数日のうちに完全に止まった。（第４Ａ図 ）。しかし、幾つかの成長の速いコロニーは常に存在していた。〜１ずｉかのウ ィルスを感染させたＵ−２Ｏ８のコロニーは成長速度に変化はなかった（第４Ｂ 図）。ＷＥＲＩ−Ｒｂ２７細胞の亜集団は懸濁培養のため、個別に追跡できなか った。しかし、Ｒｂウィルス感染後、ＷＥＲＩ−Ｒｂ２７培養物の集団成長は著 しく遅かった。これら結果はＲＢ細胞におけるＲＢｉ白質発現の回復が細胞形態 に影響し、そして成長を抑制したことを示している。

０４１８選択にもかかわらず直ちに分裂したＲｂウィルス感染５ａｏｓ−２１１ ！瘍細胞には欠損ウィルスＲＢ遺伝子により抑制が生じなかったと考えられた。

こわをテストするために、５ａｏｓ−２細胞の成長の速いコロニーをクローン化 し、成長させて、培養塊にした。そして免疫沈降によりＲＢｉ白質の発現を調べ た。第５図に示すように、９コロニーのすべてが、Ｇ４１８選択を続けたにもか かわらず、ＲＢｉ白質発現を完全に失った。培養初期ではＲｂウィルス感染５ａ ｏｓ−２細胞はＲＢ蛋白質を発現したので（第１図）、小さな成長の早い細胞は ＲＢＭ白質を含んでいなかったのではないがと考えるのが合理的であった。プロ ウィルスＲＢ遺伝子の不活化は予想されないことではながうた。というのは、自 然又は組換え体レトロウィルスはしばしば突然変異を発現するか、遺伝子発現の 浸酸的抑制を示す傾向があるからである。Ｖｉｒｏｌ、４６：９３９　（１９７ １）、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　　１７：７４（１９８６）、　１ｂｉｄ５０：４２（ １９８４）、及びＭｏ１．Ｃｅ１ｌ　　Ｂｉｏｌ、６：１１４１　　（１９８６ ）　　。

ここで添付図面について説明すると、第１図にはＲｂウィルスの構成を示す。図 示のように、プラスミドｐＬＬＲＮＬ及びｐＧｅｍｌ　：Ｒｂ４．７を制限ｙ− ７ドヌクレアーゼでダイジェスシぽン処理し、適当なフラグメントを配位子結合 し、ｐＬＲｂＲＮＬを形成した。選択した制限位置のみを示せば次の通りである 。Ｈ１Ｈｊｎ　ｄｌｌｌ：Ｃ，Ｃ１ａｌ；Ｓ、Ｓｍａｌ；Ｓｃ、５ｃａｒ；　Ｒ Ｎ　Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ　；　Ｌ　Ｔ　ＲＮモロニーネズミ白血球ウィルスの長末 端反復単位；　Ｌ　ＬＩ　Ｘ　Ｎルシフェラーゼ遺伝子：Ｒ３Ｖ、ラウス肉腫ウ ィルスプロモーター；Ｎｅｏ、Ｔｎ５ネオマイシン−耐性遺伝子；　Ａ　ｍ　’ 　％　アンピシリン耐性遺伝子；Ｒｂ、ＲＢｃ　　ＤＮＡ（４７５７ｂｐ）：　 ＴＧＡ、停止コドン。

第１Ｂ図はアンホトロピックＲｂ及びＬｕｘウィルスの増殖に関する。リン酸カ ルシウム沈降法によりプラスミドｐＬＲｂＲＮＬ又はｐＬＬＲＮＬをアンホトロ ビック詰め込み細胞系統ＰＡ１２にトランスフェクションした。４８時間後に、 ウィルス上澄みを採取し、これを用いてエコトロピック詰め込み細胞系統ｐｓｉ −２を感染処理した。０４１８遭択３〜４週間後に、２０８Ｆラツト線維芽細胞 に感染させることによりウィルス増殖にっいて耐性コロニーを検定した。ＲＢウ ィルスについては抗−ＦＲＢ抗体を用いる免疫沈降法により、あるいはＬＵＸウ ィルスについてはルシフェラーゼ活性の検出によりＧ４１８−耐性２０８Ｆコロ ニーを分析した。エコトロピック株系統としてウィルス中及びＲｂ士或はＬ　Ｉ Ｉ　Ｘ　十を選択した。ウィルス上澄みなＰＡ１２細胞に感染させ、アンホトロ ピック株　系統を６４１８選択方法を繰り返すことにより単酸し、そしてウィル ス増殖及びＲＢについて、あるいはＬｕｘ遺伝子発現についてｎｅｏ’コロニー を分析した。

第２Ｂａ図及び第２Ｂｂ図は、Ｒｂウィルス感染Ｉ！Ｉ膜芽腫及び骨肉腫細胞系 統におけるＲＢ蛋白質の発現を示す図である。第２Ａ図に示すように、ＷＥＲＴ ＝Ｒｂ２７（経路１＆２）　、５ａｏｓ−２（経路３＆４）及びＵ−２０Ｓ　（ 経路５＆６）細胞をＲｂウィルス（経路２．４＆６）又はＬｕｘウィルス（経路 ｌ、３＆、５）で感染処理し、０４１８　（Ｓ　ａ　ｏ　ｓ　−２及びＵ−２Ｏ ３については８００ｕｇ／ｍｌ、ＷＥＲＩ−Ｒｈ２７については１．０ｒｒ＋ｇ ／ｍｌ）の存在下で２週間（Ｓａｏｓ−２及びＵ−２Ｏ３の場合）あるいは４週 間（ＷＥＲＩ−Ｒｂ２７の場合）成長させた。細胞を次に３２ｐ−リン酸（０゜ ２５ｍＣ４／ｍりで３時間標識化した。ウサギ抗−ｆＲＢ　Ｉ　ｇＧ　（１４） で細胞溶解産物を免疫沈降処理し、説明に従って、７．５％５ＤＳ−ポリアクリ ルアミドゲルで分析した。ＲＢ蛋白質（ｐｐＨ０ＲＢ）が認められ第２Ｂａ図拳 第２Ｂｂ図に示すように、５ａｏｓ−２細胞をＬｕｘウィルス（パネルａ）又は Ｒｂウィルス（パネルｂ）で感染処理し、そして３週間６０ｍｍ培養皿上で０４ １８含有培地で成長させた。次の工程のそれぞれの合間にＰＢＳで培養皿を洗浄 した。４％ホルムアルデヒドを使用して０．０４Ｍリン酸緩衝液に細胞を２０分 間固定してから、０．０４Ｍリン酸緩衝液中１％Ｈ２Ｏ２に１０分間浸漬した。

予め正常なりギの血清をもちいて固定細胞をインキュベージ１ン処理してから、 ０゜０２％トリトンｘ−ｉｏｏで希釈したウサギの抗−ｆＲＢＩｇＧを用いて一 夜インキュベーシ四ン処理した。洗浄後、培養皿にビオチニル化したヤギの抗− ウサギ１ｇＧ　（ＴＡＧＯ社、カナダ、バーリンゲーム）を加えた。

１時間後、セイヨウワサビのペルオキシダーゼ（Ｖｅｃｔｏｒ　　Ｌａｂｓ社、 カナダ、バーリンゲーム）で結合したＡＢ複合体で３０分間細胞をインキュベー ション処理してから、基質（０，０５Ｍ）リス−ＨＣｌ中０．０５％３．３′− ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド及び０．０１％Ｈ２Ｏ２−ｐＨ７，６ ）（Ｐｏ　ｌ　ｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いてインキュベーンロン処理した。

３〜５分後細胞をＰＢＳで洗浄することによって反応を停止した。Ｎｉ　ｋｏｎ 製のダイアフォトマイクロスコープを用いて細胞の写真を撮影した。

第３Ａ〜３Ｆ図は網膜芽腫及び骨肉腫細胞系統におけるＲｂ又はＬ　ｕ　ｘウィ ルスの形態効果を説明するものである。ＷＥＲＩ−Ｒｈ２７　（ａ＆ｄ）　、５ ａｏｓ−２（ｂ＆ｅ）及びＵ−２Ｏ３（ｃ＆ｆ）でＬｕｘウィルス（ａ−Ｃ）又 はＲｂウィルス（ｄ−ｆ）細胞を感染処理し、（第２Ａ図に示す濃度の）Ｇ−４ １８含育培地で（ＷＥＲｌ−Ｒｂ２７の場合は）８週間又は（Ｓａｏｓ−２及び Ｕ−２０Ｓの場合は）４週間培養した。Ｎ１ｋｏｎ製位相差ダイアフォトマイク ロスコープを用いて細胞の写真を撮影した（倍率はすべのパネルで３２０倍）。

矢印は大きなＷＥＲＩ−Ｒｂ２７細胞を指し、一方矢じり印は正常サイズのＷＥ ＲＩ−Ｒｂ２７細胞を指す。

第４Ａ図及び第４Ｂ図は網膜芽腫及び骨肉腫細胞はのＲｂ及びＬｕｘウィルス感 染の成長作用を説明するグラフである。ＷＥＲＮ−Ｒｂ２７細胞（Ａ）の懸濁培 養物を２日間Ｒｂウィルス（熱印）又はＬｕｘウィスル（白丸印）で感染処理、 ０４１８の存在下で８週間成長させた。９６の孔をもつ微四滴定板各孔中の２０ ０ｕ　Ｉの培養培地に１　ｘ　１０５細胞を次に接種した（０日）、１〜５日間 の間毎日３つの孔から細胞を採取し、血球計で細胞数を数えた。平均細胞数／孔 （＋ＩＳ、Ｄ、　）で示す。Ｒｂウィルス（熱印）又はＬｕｘウィルス（白丸印 ）で５ａｏＳ−２（Ｂ）及びＵ−２０３（Ｃ）細胞を２日間感染処理してから、 ６０　ｍ　ｍの培養皿で平板培養し、Ｇ４１８含育培地で７日間の成長させた。

各培養皿に同数のネオマイシン−耐性コロニーが認められた。約５０のランダム 選択したコロニーに印を付け、各コロニーの細胞数を顕微鏡により求めた（１日 ）。次の４０間同じコロニーの細胞数を測定した。平均細胞数／コロニー（＋Ｉ Ｓ、Ｄ、）で示す。Ｒｂウィルス感染５ａｏｓ−２細胞の培養皿では、２つの明 瞭に区別できるコロニーの亜集団が認められた。即ち、成長の遅いコロニー（ｎ ＝４１、黒印）と成長の速いコロニー（ｎ　＝　６．０印）であった。これらを 別々にプロットした。

第５図に、Ｒｂウィルス感染処理した、成長の速い５ａｏｓ−２コロニーにおけ るＲＢ遺伝子発現を示す。成長の速い各５ａｏｓ−２（経路１〜９）を単離し、 ０４１８含有培地で成長させ、塊培養物にした。これら細胞及びＵ−２Ｏ８細胞 （経路Ｃ）を３２ｐ−リン酸標識化し、第２Ａ図について説明したように、細胞 溶解産物を免疫沈降処理した。ＲＢＷ白質（ｐ　ｐ　ＲＢ　１１０）で示す。

固定独立性成長へのＲＢ蛋白質の影響をテストするために、Ｒｂ又はＬｕｘウィ ルスのいずれかを用いて能力について感染処理し、軟寒天培養した骨肉肝細胞を 検定した。Ｊ、Ｖｉ　ｒｏ　１．３８　：　１０６４　（１９８１）。

まづ、異なる密度の細胞を接種し、生成したコロニー数を数えた。表２に示すよ うに、非感染又はＬｕｘウィルス感染細胞に比べた場合、Ｒｂウィルス感染５ａ ｏｓ−２細胞によるコロニー生成は著しく少ながった。対照的に、Ｕ−２Ｏ３細 胞によるコロニー生成は感染型に関係無く意味のある程度化しなかった（表２） 。これらデータは軟寒天培ＩＩ　Ｓ　ａ　ｏ　ｓ　−２コロニーは成長の速い細 胞から誘導できたことを示している。従って、固定独立性成長の遅さは内因性Ｒ Ｂ蛋白質欠損骨肉腫細胞の外因性ＲＢｉ白質によるものであった。

表２ Ｒｂ又はＬｕｘウィルス感染細胞を０４１８含有培地で１０８間培養した。

記載（２）に従って、生存している０４１８−耐性及び親細胞（−）を０．３５ ％軟寒天中各種濃度で２回接種した。培養２０日後に全コロニー数を計数した。

個々の５ａｏｓ−２コｏニーは５０以上の細胞を、そしてＵ−２Ｏ８は約３０の 細胞を含んでいた。ＴＭＴＣ：多過ぎて計数不可能新生物形成性振る舞いの重要 な実験テストは注入細胞の脱毛マウスに腫瘍を形成する能力に関している。逆に 、ＲＢ遺伝子による新生物形成発現の抑制について最も重要な証拠はＩ！ｉ瘍形 酸形成損である。考えられる優れた腫瘍形成性検定の候補は、１〜２ｘ１０７細 胞注入３週間で脱毛マウスに一様に腫瘍を形成したＷ　　ＥＲＩ−Ｒｂ２７であ った。

一方、５ａｏｓ−２及びＵ−２Ｏ３はＩ！！瘍形酸形成いてはその程度が非常に 低かった。ＷＥＲＩ−ＲＢ２７細胞を用いて２皿類の実験を実施した。即ち、各 ウィルス感染処理の、一方では３週間後、他方では５週間後に、２ｘｌＯ７の生 存　している感染ＷＥＲＩ−Ｒｂ２７細胞を脱毛マウスの両側腹部に注入した。

そして右腹部にはＲｂウィルス感染細胞を使用した。一方、同じマウスの左腹部 はＬｕｘウィルス感染！！瘍細胞と共にコントロールとして使用した６７匹のマ ウスすべてが左腹部にのみに（Ｌｕｘウィルス感染細胞により）Ｉ！！瘍を形成 した。

一方、右腹部には（Ｒｂウィルス感染細胞による）ｍ瘍は全く認められなかった 。このように、外因性ＲＢ蛋白質は一つのｍ瘍形成性の高い網膜芽腫細胞系統に おいて腫瘍形成を抑制できることが証明された。５ａｏｓ−２培養物については 、その成長速度がＲｂウィルス感染により非常に遅（なったので、検定に必要な 数の感染細胞を採取できなかった。

これらインビトロ及びインビボ結果はＲＢ！！！細胞の置換はその新生物形成発 現る舞いを抑制するが、見掛けは正常なＲＢ遺伝子のもつ！！瘍細胞にはこのよ うな抑制を示さないという結論を支持するものである。

表５ ＲＢ又は：［、ｕ　ｘウィルス感染ＷＥＲＩ−ＲＢ２７の腫瘍形成 腫瘍をもつマウス数）注射マウス数 ０４１８含有培地で５週間（実験１）又は５週間（実験２）Ｒｈ又はＬｕｘウィ ルス感染細胞を生長させた。細胞生存率をトリバンプルー圧排法により求めた。

そして２×１０　生存ウィルス感染細胞を同一の脱毛マウスの両側腹部に皮下注 射した。同数の非感染親細胞を他のマウスに注射した。腫瘍形成を２ケ月後に触 知可能な腫瘍体として計数した。

−計数せず。

Ｅ６．癌抑制へのＲＢ遺伝子の使用 用語“癌抑制”には２つの異なる意味があるので、これについて以下説明する。

ヒトの自然腫瘍にＲＢ遺伝子の突然変異を不活化することが認められた場合、こ れは通常ＲＢ遺伝子が感受性前駆体細胞におけるＩＩｆｉ瘍形成音形成制”又は “阻止”する機能をもつと〜）う考えを支持するものであるが、これは、新生物 形成性細胞を“抑制”するとか、あるいはその発生過程の後期で正常な振る舞い に“戻す”ということを必ずしも意味するわけではない。例えば、ＲＢｉｉｌ！ 伝子はＲＢ！瘍細胞を抑制しないが、これは腫瘍形成中に別な重複変化を獲得す ることによると考えられる。このような可能性をテストするために、媒介実験を 行った。この初期研究では、内因性ＲＢＭ白質を欠いたヒトの培ｗｉｇ細胞にウ ィルス媒介遺伝子転移により正常なＲＢ迫伝子を導入した。脱毛マウスの腫瘍形 成性に関する軟寒天コロニー形成等のインビトロ指標及びインビトロ検定にいず れによっても新生物形成表現型の抑制が認められた。従って、クローン化網膜芽 腫遺伝子は実際にヒト癌抑制遺伝子のひとつの定義を満足した。即ち、これはあ る種の腫瘍細胞の新生物形成性振る舞いを抑制する機能を示した。予想どおり、 欠損のない内因性ＲＢｉｌｌｌ伝子をもつ腫瘍細胞には外因性ＲＢ蛋白質の抑制 が認められなかった。　テストによりＲＢ遺伝子が重複型のヒト癌を抑制する役 割もつことは確立されている。ＲＢ　ｉｆｆ伝子は元来遺伝網膜芽肝に感受性を 与える遺伝要素として定義されて〜）た。この型の網膜芽腫をクリアした子供は 長するに及んで２次性の原発性腫瘍を発症する素因が非常に高く、他の癌におい てＲＢ遺伝子が大きな役割をもつことを示唆するものである。Ｊ、Ｃｅ　ｌ　１ ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、（１９８８）ｏ　ＲＢ遺伝子の突然変異はしばしば網膜芽腫 に見られる。その最も顕著な指標はＲＢｉ白質の不在である。この蛋白質は現在 までにテストされた網膜芽腫すべてに認められている。Ｎａｔｕｒｅ３２９：６ ４２　（１９８７）。同様な方法により、多種多様な非網膜芽腫、例えば骨肉腫 、滑膜肉腫、その他の軟組織肉腫、乳癌や小細胞肺癌等にもＲＢ遺伝子の不活化 が認められている。Ｃａｎｃｅｒ　　Ｒｅｓ。

４８：３９３９　（１９８８）、Ｈｕｍ、Ｐａｔｈｏｌ。

１９：４８７（１９８８）、Ｐｒｏｃ、Ａｎｔｏｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８４： ９０５９（１９８７）、５ｅｔｅｎｃｅ２４１　＋２１８　（１９８８）、１ｂ ｉｄ２４２：３６３　（１９８８）、及びＪ、Ｙ、Ｓｈｅｗ等の論文（未公刊） 。従って、正常なＲＢ遺伝子癌網膜芽腫細胞だけでなく、ＲＢ−骨肉腫細胞にお いても癌抑制活性を示すことは証明されている。また、同様な効果はＲＢ−乳癌 細胞にも認められている。Ｅ、Ｙ、−Ｈ，Ｐ、Ｌｅｅ＆Ｗ、−Ｈ，（未公刊）。

ヒトの自然腫瘍においてＲＢ突然変異が見られることに関連して、これら結果は この遺伝子の欠損は何種類かのヒト癌の発生における決定的な段階、恐らくは初 期段階であるという結論を支持するものである。

米国特許出願第１０８．７４８号明細書には、ＲＢ遺伝子及びそのクローンが開 示され、特許請求されている。

このＲＢ遺伝子及びのそのクローンのヌクレオチド配列は表４に示すとおりであ る。

表４ Ｅ３．ＲＢ遺伝子によるインビトロ及びインビボｌ！瘍形成の抑制 （ａ）　機能性ＲＢｃＤＡＮクローンを含む発現ベクターを次のようにして調製 した。全長４．７ｋｂのＲＢｃＤＮＡを３つの重複ｃＤＮＡ配列、ＲＢ−１、Ｒ Ｂ−５及びＹ７９ＲＢがら構成した。ＳＶ４０初期遺伝子プロモーターかモロニ ーネズミ白血球ウィルスのＬＴＲのいずれかの制御の下にこのｃＤＮＡをおき、 レトロウィルスベクター（ＭｕＬＶ−ＬＴＲ−ｎ　ｅ　ｏ）に挿入する。

（ｂ）ＲＢウィルスの産生：ポリベンの存在下でウィルスＤＮＡ−リン酸カルシ ウムの共沈降処理後、ＲＢ遺伝子を含む感染性ウィルスを詰め込み細胞系統２が ら作る。４８時間後、エコトロピックＲＢ−ｎｅｏウィルスを含む上澄みを採取 する。これを使用して、アンホトロピックエンベロープ蛋白質を含む別なヘルパ ー系統であるｐＡ１２細胞を感染処理する。エコトロピックＲＢ−ｎｅｏウィル スでｐＡ１２細胞のご（一部分を感染処理する一方でＮ　ｎｅｏ−耐性表現型に ついて０４１８選択しながら、陽性感染ｐＡ１２細胞を富化処理する。感染ｐＡ １２細胞が放出したウィルス粒子はアンボトロビックエンベローブ蛋白質に対し てプソイド型であり、これを使用すると、ロープント以外の種を感染処理できる 。ＲＢプローブを用いるハイプリダイゼーシｅン処理が、ＲＢ蛋白質を発現でき る能力のいずれにかによってＲＢ遺伝子の存在についてこのウィルスをチェック できる。

（ｃ）ＲＢ遺伝子による網膜芽腫の表現型変化。Ｙ７９やＷＥＲＩ　−１等の網 膜芽腫細胞の幾つかの系統は４週間以内で脱毛マウスに触知可能な！！瘍を産生 できる。

機能性ＲＢ遺伝子含合作染性ウィルスでこれら細胞を感染処理してから、その腫 瘍形成性について検定した。一方、これら感染細胞におけるＲＢ遺伝子の発現を チェックした。ｎｅｏ遺伝子のみを保育するＬＴＲ−ｎｅｏウィルスをコントロ ールにした。さらに、脱毛マウスに形成した網膜芽腫に感染性ＲＢ−ウィルスを 直接接種し、ｍ１ｆｓ成長の抑制をチェックした。

Ｅ４．不活化　によるＲＢ遺伝子の形質転換（ａ）前と同様な手法で欠損Ｒ’Ｂ 配列をもつ感染性ウィルスを構成した。これを内因性ＲＢ遺伝子の目標とする突 然変異発生性に使用した。

（ｂ）機能性ＲＢ遺伝子の単一コピーのみを含む０Ｍ１１４２やＳ−３６２等の 網膜芽腫患者からの線維芽細胞を、相同性組み換えによってＲＢ遺伝子を不活化 する標的細胞として使用した。以下のパラメーターに従い０４１８耐性コロニー を特性化する。（１）挿入位置、（２）ＲＢ蛋白質の発現、及び（３）インビト ロ及びインビボにおける表現型の形質転換。ＲＢ遺伝子の癌抑制特性及び該遺伝 子やそのクローンを薬剤としての使用については、既に確立されている。さらに 、このＲＢ遺伝子は網膜芽腫に関連があるどうかに関係無く、骨肉腫、線維肉腫 、グリア芽腫、乳癌やその他の２次性癌について胎児時期か出生後に予防的スク リーニングするために、またこれら癌の発症を予測するために使用できる。

なお、ＲＢｃＤＮＡを直接腫瘍細胞に与えることによって層成長抑制にも使用で きる。これら細胞はｐｐＲＢ１！０を産生し、他の腫瘍性細胞に作用する。

ＲＢ遺伝子による診断方法や予防方法について説明してきたが、本発明は痛症状 を呈しているか、あるいは不活性、突然変異又は欠損癌抑制遺伝子を保有するヒ トを始めとする動物を治療する薬剤として百換遺伝子を使用することもその範囲 に含むものである。すなわち、注入、治療やその他の手段で、欠損遺伝子と共に それと同じかほぼ同じ欠損遺伝子又は遺伝子フラグメントをもつ動物を処理して 癌を治療及び／又は予防することも本発明が意図していることである。

Ｆ１発癌性の疑いがある環境要因を評価する動物モデル 疑いがある環境要因の発癌性を決定するためには、動物モデルの癌抑制遺伝子を 遺伝学的手法によりこれを発癌性要因感受性にすることにより制御する。この場 合には、動物モデルの一対の癌抑制遺伝子の一方を不活化して、その動物の子孫 を予想される環境発癌物質に暴露し、テストする。

このように器露した動物に腫瘍が形成すると、それは試験環境要因が発癌性につ いて陽性であることを示す。

発癌性の疑いがある環境要因の発癌性を調べるマウスモデルを構成する一例では 、ＲＢ遺伝子の突然発生性をもつ系統のマウスを発育させた。このマウスに発癌 物質を暴露すると、優性Ｒ，Ｂ遺伝子が変化し、この結果腫瘍形成を伴う同型接 合性劣性状態が発生する。　正常細胞を腫瘍細胞に形質転換する分子的基礎を理 解することはＨＩＩＩ形成性を研究する科学者にと９で大きな挑戦である。

多くの実験的腫瘍については、発癌現象の多段階が証明されている。Ｎａｔｕｒ ｅ３１５：１９０　（１９８５）。

最近の研究によれば、腫瘍遺伝子の活性化が発癌開始に関与し、多くのＦＭ瘍遺 伝子が正常細胞の不滅化過程及び表現型の形質転換発現に必要であるかも知れな いとされている。Ｎａ　ｔ　ｕ　ｒ　ｅ３０４　：　５９６　（１９８３）、一 般に、これらＩＩ！！ｉ瘍遺伝子は優性遺伝子であり、悪性ｍ瘍形質転換にはこ れら遺伝子が過剰量でか変性状態で発現することが必要である。

癌生物学の大きなパラドックスが生じるのは正常細胞と悪性Ｍ癌細胞との間にあ る細胞ハイブリダイゼーションに関する研究からである。悪性ｍ瘍の腫瘍形成活 性は正常細胞からの遺伝子又は染色体によって抑制でき、また正常細胞からＤＮ Ａが失われると、ハイブリッド細胞の悪性度が戻ることが判明している。Ａｄｖ 、Ｃａｎｅｅｒ　　Ｒｅｓ、４４：４３（１９８５）、これはＩｌ！ｉＷｋ形成 性は本質的に劣性であり、これら“腫瘍抑制遺伝子”の不活化もヒ）Ｍｆｆｉｆ ｆ間始に関与しているかも知れないことを示唆するものである。５ｃｉｅｎｃｅ ２３８：１　５３９　　（１９８７）　　。

遺伝網膜芽腫患者体性細胞（線維芽細胞）の核型検査から、染色体１３の長腕に 顕著な欠失が認められる場合があることが判明している。Ｂｉｒｔｈ　　Ｄｅｆ ｅｃｔｓ１２：　１３１　（１９７６）。同様な欠失については、網膜芽腫細胞 にも認められていた。Ｃａｎｃｅｒ　　Ｇｅｎｅｔ、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ、８： ２１３　（１９８２）。

すべての欠失に共通な部位ｑ１４は恐らく遺伝網膜芽腫に対する感受性を決定す る仮説的遺伝子（ＲＢ）を含んでいる。臨床Ｏ１察は、少な（でも２つの突然変 異があれば腫瘍形成開始が生じ、同一遺伝子座における両対立遺伝子の欠損によ って網膜芽腫が発症することを示唆している。Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ。

Ａ、６８：８２０　（１９７１）、及びＣ−ａｎｃｅｒ３５：　１０２２　（１ ９７５）。従って、仮説的遺伝子産生体の存在がＵＳ形成を阻止又は抑制し、そ の遺伝子機能が欠損すると、悪性腫瘍が成長すると考えられる。

染色体１３のｊコ伝子はＲＢＢ伝子として同定されている。５ｃｉｅｎｃｅ２３ ５：１３９４（１９８７）、及びＮａｔｕｒｅ３２３：６４３　（１９８６）、 これは４゜７　ｋ　ｂｍＲＡＮＥ写をコード化し、胎児網膜を始めとする多くの 正常細胞に発現していた。調べた網膜芽腫６つのうち２つがこの遺伝子を部分的 か完全に欠失していたが、４つについては見掛は上は欠損がなかった。ところが 、検査した６つの網膜芽腫全部にＲＢｍＲＮＡの変化が認められ、これら変化に は短いｍＲＮＡメツセージ（４，７ｋｂではなく４．０ｋｂ）の発現、あるいは 発現不在が含まれていた。さらに、網膜芽腫におけるＲＢＢ伝子機能の完全な欠 損については、蛋白質翻訳レベルでも確認された。Ｎａｔｕｒｅ３２９：８４２ 　（１９８７）ＲＢＢ伝子産生体のセグメントに対する抗体は正常細胞やその他 の多くの非網膜芽腫細胞に１１０ｋｄの蛋白質を免疫沈降できる。ところが、１ １０ｋｄ蛋白質は検査した５つのｗＪＭ芽腫にはいずれも認められなかった。

これは網膜芽腫の腫瘍形成性におけるその重要性を示唆するものである。さらに 、この蛋白質はＤＮＡ結合活性をもつリンタンパク質にもみられ、また核内にも 認められた。これは遺伝子の発現においてそれが１１面的役割を果すことを示唆 するものであった。上述したように、リンタンパク質はｐ　ｐ　ＲＢ　１１０と して同定されている。

ＲＢＢ伝子の遺伝学的同定については、その予想される生物学的機能によって確 認できる。この場合、２つの基本的な問題がある。即ち、１）網膜芽腫細胞の腫 瘍形成性が機能性ＲＢＢ伝子産生体の存在によって抑制されるかどうかの間、そ して２）機能性ＲＢＢ伝子の不在が悪性ｌ！瘍表現型を結果としてもたらすかど うかの問題である。ウィルム腫瘍細胞に染色体１１を注入した結果、脱毛マウス の腫瘍形成性を抑制できた。但し、これら細胞は組織培養では形態的に変換した 状態にあった。５ｃｉｅｎｃｅ２３６：１７５（１９８７）　　。

また、単ＲＢ遺伝子が網膜芽腫細胞のＵ瘍形成性を抑制できるかどうかも重要で ある。ジクチオステリム・ジス＝＋イデウム（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅ’ｌｉｙｍ　 　ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）のミオシン重鎮遺伝子を不活化するには同型接合性組 換えによる標的真正世代交代を使用すると成功するという報告がある。５ｃｉｅ ｎｃｅ２３６：１０８６　（１９８７）。同型接合性組換えによる標的真正世代 交代については倍数細胞だけでな（、マウスの胚幹細胞にも認められている。Ｃ ａｌ　１５１　：５０３　（１９８７）。従って、ＲＢＢ伝子を標的真正世代交 代によって不活化すると、細胞成長におけるその役割及びその腫瘍形成性に関す る重要な情報を得ることができる。さらに、これら方法によって、Ｉ２ＩＭ芽腫 患者の２次性の原発性腫瘍の！！瘍影形成性おけるＲＢＢ伝子の役割も研究でき る。

ＲＢ遺遺伝子能能調べるために動物モデルを作成した。

レッシューナイハン症候群については２つの可能性のある動物モデルを作成した 。Ｎａｔｕｒｅ３２６：２９２（１９８７）。これら２つのマウスモデルについ ては、キメラ中に胚芽細胞を発生できるＨＰＲＴ−突然変異誘発マウス胎芽癌（ ＥＣ）細胞又は胎芽幹（ＥＳ）癌細胞を用いてキメラマウスから誘導した。これ らキメラによってレッシューナイハン症候群患者と同じ生化学的作用をもつ系統 の突然変異体マウスを誘導できる。この実験の目的はマウスＥＳかＥＣ細胞のい ずれがを使用して、ＲＢＢ伝子のその一方の対立遺伝子が不活性なキメラマウス を確立することである。

マウスＥＳ細胞かＥＣ細胞のいずれかを使用して、ＲＢＢ伝子の一方の対立遺伝 子が不活性なキメラマウスを確立し、その生化学的な意味を調べた。マウスＥＳ 細胞（ｒ　ｂ　／　ｒ　ｂ　）のＲＢＢ伝子の一方の対立遺伝子については、欠 損ＲＢ配列をもつウィルスベクターを使用する標的真正世代交代により不活化し た。フレームにおいてはＲＢＢ伝子に配列するが欠損ＲＢウィルス中では不活性 な別な選択標識を組み込んで選択を行った。

内因性ＲＢを用いた同型接合性組換え後、内因性ＲＢＢ節配列の制御下で標識が 発現し、これをｎｅｏ−耐性と共に選択した。さらに、ＲＢプローブを使用した ＤＮＡハイプリダイゼーシ鱈ンによってｒ　ｂ　／　−）遺伝子型についてネオ マイシン−耐性ＥＳ細胞を検査し、これをマウス未分化胚芽細胞に注入して、キ メラ動物を構成した。Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ。

Ａ、８３　：　９０８５　（１９８８）。

得られたキメラマウスを飼育し、コロニーを維持し、と殺してから、１次性線維 芽細胞のｒｂ／−遺伝子型について調べた。

本発明による癌抑制遺伝子機能を調べる動物モデルについて以下詳しく説明する 。レフシューナイハン症候群については２つの可能性のある動物モデルを作成し た。

これら２つのマウスモデルについては、キメラ中に胚芽細胞を発生できるＨＰＲ Ｔ−突然変異誘発マウス胎芽癌（ＥＣ）細胞又は胎芽幹（Ｅ　Ｓ）癌細胞を用い てキメラ７ウスから誘導した。これらキメラによってレッシューナイハン症候ｎ 患者と同じ生化学的作用をもつ系統の突然変異体マウスを誘導できる。本発明で は、同型接続性組換えによるＲＢｉｉ伝子不活化標的としてマウスＥＳ細胞を使 用した。

マウスＤＮＡプローブを使用するポリ（Ａ）ＲＮＡのノーザンブロッティング法 がＲＢＢ異性抗体を使用するマウスＲＢｊ７ｆ白質の免疫沈降法のいずれかによ ってマウスの異なる組繊におけるＲＢＢ伝子発現を調べた。対象とした主標的は ＥＳ細胞だけでなく、胎児網膜細胞におけるＲＢＢ伝子の発現であった。

欠損ＲＢ配列をもつＤＮＡフラグメントを使用する標的真正世代交代によってマ ウスＥＳ細胞（ｒ　ｂ　／　ｒ　ｂ　）のＲＢＢ伝子の一つの対立遺伝子を不活 化した。マウスＤＮＡプローブを使用するスクリーニングによってマウスゲノム ライブラリーから数種のマウスゲノムＤＮＡクローンを単怨した。これらマウス ゲノムクローンを使用して、不活化ＲＢコード配列をもつＤＮＡフラグメントを 構成した。

基本的には、選択に使用したネオマイシン及び／又はＧ４１８を用いて５．６及 び１０ｋｂのマウスゲノムＤＮＡフラグメントにＴｎ５がら誘導したネオマイシ ン耐性遺伝子を注入した。一般に、同型組換え作用モードに基づき２つの型のベ クターを使用することができる。第１のものはベクター各末端で同じ配向を示す 相同体配列を保育する置換ベクターで、これは内部ｎｅｏｒ遺伝子を正確にコ　 ピーできる。第２のものはベクター各末端で逆配向を示す相同体配列を保有する 挿入ベクターである。しかし、このＤＮＡフラグメントがサークライゼーシコン する限り、最初のＤＮＡリーディングフレームが継続する。このベクターを内因 性ＲＢＢ伝子の正確な位置に挿入すると、Ｒ８部分が内的に複製でき、従って不 活性ＲＢが産生じた。このように、両方の型のベクターを構成し、ＥＳ細胞にお けるＲＢＢ伝子の不活化を両方法により達成できた。

ＥＳ細胞に導入したベクターは染色体にランダムに組み込まれているか、あるい は特異的にＲＢＢ伝子座に組み込まれていた。この事実は正確な相同体組換えの 選択やネオマイシン耐性表現型選択について困難が生じることを示す。従って、 別な選択標識を使用して、選択を行った。

研究によれば、上記の標的真正世代交代ベクターへのヘルペスシンプレックスウ ィルスｔｋ遺伝子の組み込みは育利であった。基本的には、Ｈ３Ｖｔｋ遺伝子は 線状ベクターの末端に結合していた。ｔｋベクターのランダム組み込みが生じた 場合には、ｔｋ遺伝子は組み込み位置に運び込まれていることになる。ところが 、位置特異性相同体組換えは末端ｔｋｎ列の欠損後になって始めて生じるもので ある。

アシクロヴイール（ａｃｙｃ　１ｏｖｉ　ｒ）やガンシクロヴイール（ｇａｎｃ ｉｃｌｏｖｉｒ）等の化合物の最近の開発により、ｔｋ遺伝子をもつ、あるいは もたない細胞にとって硬３た選択システムが得られるようになってきた。Ａｎｔ ｉｍｉｃｒｏｂ、ａｎｄ　　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、３１　：　８４４−９４９　 （１９８７）、従って、それぞれＧ４１８及びガンシクロヴイールを加えること によってｎｅｏ（＋）及びｔｋ（−）のＥＳ細胞を選択した。ｔ、　ｋ遺伝子を もつ、及び／又はもたないベクターを使用して、それらの標的真正世代交代率に ついてテストした。さらに、ＲＢプローブを使用するＤＮＡハイプリダイゼーシ ぼンによって（ｒｂ／−）遺伝子型についてネオマインンー耐性ＥＳ細胞を調べ た。

ＰＦＬＰ分析だけでなく、ポリメラーゼ鎖反応分析によって上記突然変異マウス ＥＳ細胞をスクリーニングして、一つの不活性ＲＢＢ立遺伝子及び一つのＲＢＢ 性対立遺伝子について調べた。過剰排卵雌マウスから得た胚盤胞（初期胎芽）に 微量注入により得られたＲＢ　（＋／−）ＥＳ細胞を再注入した。ＲＢ　（＋／ −）ＥＳ細胞を保有する胚盤胞を次に疑似妊娠雌マウスに移植した。Ｐｒｏｅ、 Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８３　：９０６５　（１９８６） 。里子の母マウスが出産した後、突然変異による不活化対立遺伝子の遺伝につい て子孫を調べた。

本発明による動物モデルは発癌性に疑１．％のある環境物質の発癌性を調べるの に作用である。所定遺伝子座の癌抑制遺伝子の少なくとも一つが欠損状態、突然 変異状態や不在状態にある場合にのみ、腫瘍形成性が認められるので、環境物質 に暴露後動物に腫瘍が形成した場合に、該物質が発癌性について陽性とみなす。

物質の発癌性を調べるのに有効であるだけでなく、このキメラ動物はＲＢＢ伝子 及び／又はＲＢ遺遺伝子牛生体薬効を調べるのにも有効である。なお、ＲＢＢ伝 子及び／又はＲＢ遺遺伝子牛生体健全な細胞に投与しても、顕著な副作用はない 。このように、ＲＢＢ伝子及び／又はその産生体は、望ましくない反応の恐れが ない状態で、生体に投与して、遺伝子欠損を矯正できる。

本明細書で、遺伝子についてそれが“欠損”及び“不活性”と表現する場合、該 遺伝子が以上表現型を発現するか、それを発現しない状態を示すと理解すべきで ある。

本発明の特定実施態様を説明したきたが、異なる各種の変更が可能で、いずれも 添付請求の範囲に記載する精神及び範囲内にある。従って、これら実施態様は本 発明にいかなる意味においても制限を加えるものではない。

！　！ 時間（日） 時間（日） １２３４Ｃ５６７８９ 第５図 平成　３年　８月３０日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．癌抑制遺伝子をもつ哺乳動物の癌抑制を制御する方法において、該遺伝子の 遺伝物質に対応し、かつクローン化癌抑制遺伝子、変質又は欠損癌抑制遺伝子、 その相同体、そのフラグメント及びその混合体からなる群から選択される実質的 な重複遺伝物質を作り出し、そして該重複遺伝物質と哺乳動物の癌抑制遺伝とを 交換することからなる癌抑制遺伝子をもつ哺乳動物の癌抑制を制御する方法。 ２．実質的な重複遺伝物質を作り出す前に、哺乳動物の該癌抑制遺伝子の染色体 位置を決定する請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．実質的な重複遺伝物質を作り出した後に、哺乳動物組織サンプルの不活性癌 抑制遺伝子の有無を調べて、組織サンプル癌抑制遺伝子が欠損しているか、ある いはそれが認められないかを判別する請求の範囲第１項に記載の方法。 ４．組織サンプル癌抑制遺伝子が欠損しているか、あるいはそれが認められない 場合、哺乳動物の癌抑制遺伝子をそのクローンにより置換する請求の範囲第３項 に記載の方法。 ５．組織サンプル癌抑制遺伝子が欠損しているか、あるいはそれが認められない かの判別を、組織サンプルの該癌抑制遺伝子の蛋白質産生体に対して特異的な抗 体に結合した該蛋白質産生体の量を測定することによって行う請求の範囲第３項 に記載の方法。 ６．組織サンプル癌抑制遺伝子が欠損しているか、あるいはそれが認められない かの判別を、 （ａ）該組織サンプルを放射性アイソトープで標識化し、 （ｂ）標識化組織を溶解処理し、 （ｃ）該癌抑制遺伝子の蛋白質産生体を該蛋白質に対して特異的な抗体と反応さ せ、これによって蛋白質／抗体免疫複合体を形成し、 （ｄ）工程（ｃ）で得た免疫複合体をオートラジオグラフィー処理し、そして （ｅ）工程（ｄ）のオートラジオグラムと標準蛋白質産生体のオートラジオグラ ムと比較することによって該蛋白質産生体の有無を判別することによって行う請 求の範囲第５項に記載の方法。 ７．組織サンプル癌抑制遺伝子が欠損しているか、あるいはそれが認められない かの判別を酵素免疫検定法によって行う請求の範囲第５項に記載の方法。 ８．組織サンプル癌抑制遺伝子が欠損しているか、あるいはそれが認められない かの判別を免疫細胞化学法によって行う請求の範囲第５項に記載の方法。 ９．該癌抑制遺伝子がＲＢ遺伝子で、該蛋白質産生体がｐｐＲＢ１１０である請 求の範囲第５項に記載の方法。 １０．治療を目的として該癌抑制遺伝子を、クローン化癌抑制遺伝子、変質又は 欠損癌抑制遺伝子、その相同体、そのフラグメント及びその混合体からなる群か ら選択される実質的な重複遺伝物質により置換する請求の範囲第１項に記載の方 法。 １１．環境要因の発癌性をテストするために該癌抑制遺伝子を、クローン化癌抑 制遺伝子、変質又は欠損癌抑制遺伝子、その相同体、そのフラグメント及びその 混合体からなる群から選択される実質的な重複遺伝物質により置換する請求の範 囲第１項に記載の方法。 １２．該癌抑制遺伝子を染色体ウォーキングによって決定する請求の範囲第２項 に記載の方法。 １３．該癌抑制遺伝子を有機遺伝標識によって決定する請求の範囲第２項に記載 の方法。 １４．該癌抑制遺伝子の染色体位置を表現型発現について染色体の遺伝子をテス トすることによって決定し、該染色体の遺伝子の一つを標識遺伝子と決定し、そ して 染色体ウォーキング法を使用して、癌抑制遺伝子の位置を決定する請求の範囲第 ２項に記載の方法。 １５．欠損対立遺伝子、その相同体、そのフラグメント及びその混合体からなる 群から選択される少なくとも１つの癌抑制遺伝子の対立遺伝子をもつように遺伝 変化させた動物。 １６．該欠損対立遺伝子をＲＢ遺伝子、乳癌抑制遺伝子、ウィルム腫瘍抑制遺伝 子、ベックウイズニヴィーデマン症候群抑制遺伝子、膀胱移行性細胞癌抑制遺伝 子、神経芽腫抑制遺伝子、小細胞肺癌抑制遺伝子、腎細胞癌抑制遺伝子、聴神経 芽腫抑制遺伝子、結腸直腸癌抑制遺伝子、これらの相同体、これらのフラグメン ト及びこれらの混合体からなる群から選択する請求の範囲第１５項に記載の動物 。 １７．該対立遺伝子が少なくとも１つの欠損ヌクレオチド配列をもつＤＮＡフラ グメントを含む請求の範囲第１５項に記載の動物。 １８．該欠損対立遺伝子が少なくとも１つの欠損ＲＢヌクレオチド配列をもつＤ ＮＡフラグメントを含む請求の範囲第１５項に記載の動物。 １９．該動物がマウスである請求の範囲第１５項に記載の動物。 ２０．請求の範囲第１４項に記載の動物を利用して、発癌性の疑いがある環境要 因の発癌性を調べる方法において、 該動物を発癌性の疑いがある環境要因に暴露し、該動物を癌の表現型発現につい て観察し、そして該動物の癌の表現型発現の観察結果に基づいて該環境要因の発 癌性を決定することからなる発癌性の疑いがある環境要因の発癌性を調べる方法 。 ２１．放射線源に暴露する請求の範囲第２０項に記載の方法。 ２２．タバコ燃焼生成物に暴露する請求の範囲第２０項に記載の方法。 ２３．食品添加物に暴露する請求の範囲第２０項に記載の方法。 ２４．人工物質に暴露する請求の範囲第２０項に記載の方法。 ２５．該動物を腫瘍形成について観察する請求の範囲第２０項に記載の方法。 ２６．該動物における腫瘍形成に基づいて癌細胞の存在について該腫瘍を分析す る請求の範囲第２５項に記載の方法。 ２７．欠損対立遺伝子、その相同体、そのフラグメント及びその混合体からなる 群から選択された動物癌抑制遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子を使用し、該 対立遺伝子を用いて少なくとも１つの動物細胞を突然変異させ、該突然変異細胞 を動物の胚盤胞に組み込み、 該対立遺伝子をその細胞に組み込むのに十分な時間該胚盤胞を成長させ、該細胞 内の遺伝子組換えを抑制し、該対立遺伝子をもつ胚盤胞を疑似妊娠動物の子宮に 転移して、該対立遺伝子をもつ動物を出産させ、該動物を飼育して、複数の動物 を繁殖させ、そして該対立遺伝子の有無を判別することによって該複数の動物か ら請求の範囲第１４項に記載の動物を選別する請求の範囲第１５項に記載の動物 を作り出す方法。 ２８．該対立遺伝子を組み込む前に、該胚盤胞を過剰排卵動物から取り出し、そ して該胚盤胞が未分化細胞である請求の範囲第２７項に記載の方法。 ２９．該組み込みをインビトロで行う請求の範囲第２７項に記載の方法。 ３０．活性成分を天然に存在する欠損のない癌抑制遺伝子、クローン化した欠損 のない癌抑制遺伝子、そのフラグメント、その相同体及びその混合体からなる群 から選択する薬剤組成物。 ３１．該天然に存在する及びクローン化癌抑制遺伝子をＲＢ遺伝子、乳癌抑制遺 伝子、ウィルム腫瘍抑制遺伝子、ベックウイズニヴィーデマン症候群抑制遺伝子 、膀胱移行性細胞癌抑制遺伝子、神経芽腫抑制遺伝子、小細胞肺癌抑制遺伝子、 腎細胞癌抑制遺伝子、聴神経芽腫抑制遺伝子、結腸直腸癌抑制遺伝子、これらの 相同体、これらのフラグメント及びこれらの混合体からなる群から選択する請求 の範囲第３０項に記載の薬剤組成物。 ３２．活性成分をＲＢｃＤＮＡ、変性ＲＢｃＤＮＡフラグメント、そのクローン 、その相同体及びその混合体からなる群から選択する請求の範囲第３０項に記載 の薬剤組成物。 ３３．該遺伝子それぞれについての活性成分を該遺伝子のｃＤＮＡ、該ｃＤＮＡ のフラグメント、その相同体及びその混合体からなる群から選択する請求の範囲 第３１項に記載の薬剤組成物。 ３４．該癌抑制遺伝子をヒト染色体部位ｑから単離する請求の範囲第３２項に記 載の薬剤組成物。 ３５．該癌抑制遺伝子及びそのクローンそれぞれのヌクレオチド配列が次の通り である請求の範囲第３１項に記載の薬剤組成物。 【配列があります】 ３６．該ＲＢｃＤＮＡフラグメントをＲＢ−１、ＲＢ−２、ＲＢ−５、ｙ７９Ｒ Ｂ及びその混合体から選択する請求の範囲第３２項に記載の薬剤組成物。 ３７．該ＲＢｃＤＮＡの合成ｍＲＮＡ転写が４．６ｋｂである請求の範囲第３２ 項に記載の薬剤組成物。 ３８．クローン化ゲノムＤＮＡが少なくとも２７のエキソンをもつ請求の範囲第 ３７項に記載の薬剤組成物。 ３９．該クローン化ＲＢｃＤＮＡをｍＲＮＡに転写し、これを次のアミノ酸配列 をもつ蛋白質中において翻訳する請求の範囲第３０項に記載の薬剤組成物。 【配列があります】 ４０．次の配列のＤＮＡヌクレオチド配列。 【配列があります】４１．不活性又は突然変異性癌抑制遺伝子、あるいは癌抑制 遺伝子の不在を治療する方法において、不活性又は突然変異性癌抑制遺伝子、あ るいは癌抑制遺伝子の不在を欠損のない癌抑制遺伝子の少なくとも一部を利用し て治療を行う上記方法。 ４２．該癌抑制遺伝子それぞれがＲＢ遺伝子、乳癌抑制遺伝子、ウィルム腫瘍抑 制遺伝子、ベックウイズニウィーデマン症候群抑制遺伝子、膀胱移行性細胞癌抑 制遺伝子、神経芽腫抑制遺伝子、小細胞肺癌抑制遺伝子、腎細胞癌抑制遺伝子、 聴神経芽腫抑制遺伝子、結腸直腸癌抑制遺伝子、これらの相同体、これらのフラ グメント及びこれらの混合体からなる群から選択される物質である請求の範囲第 ４１項に記載の方法。 ４３．不活性又は突然変異性癌抑制遺伝子、あるいは癌抑制遺伝子の不在をＲＢ 遺伝子、該遺伝子の一部及びその混合体からなる群から選択される物質で治療す る請求の範囲第４１項に記載の方法。 ４４．該ＲＢ遺伝子部分をＲＢｃＤＮＡ、ＲＢｃＤＮＡフラグメント、その相同 体及びその混合体からなる群から選択する請求の範囲第４３項に記載の方法。 ４５．欠損のない癌抑制遺伝子又はその一部をレトロウイルスによって腫瘍に運 びこむ請求の範囲第４１項に記載の方法。 ４６．欠損のない癌抑制遺伝子又はその一部をリボソームによって腫瘍に運びこ む請求の範囲第４１項に記載の方法。 ４７．該癌抑制遺伝子の位置を遺伝標識によって決定する請求の範囲第４１項に 記載の方法。