JPH03505606A - ポリマー電気泳動媒質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリマー電気泳動媒質 この発明は電気泳動用媒質または要素に関し、そして発明の名称［電気泳動ゲル 媒質用キット（ｌｉｔ　ｆｏｒ　ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＧｅｌ　Ｍｅ ｄｉｕｍ）　Ｊで１９８９年４月２８日付にて出願したＥＰ−＾−８９１０７７ ２９、９に開示したもののような一定のアクリルモノマー類から製造されるアク リルアミドを基材としたコポリマー類に関する。より具体的には、タンパク質類 およびポリ核酸類（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびこれらの誘導体またはフラグメント） の電気泳動分離に適するアクリルアミドを基材としたコポリマー類から製造した 改良ポリマーゲル媒質に関する。

電気泳動用媒質としてビニルスルホニル基またはクロロエチルスルホニル基を有 するアクリルアミド基材コポリマー類は、数多くの特許公報、例えば、米国特許 第４，５８２，８６８号に記載されている。このような材料は、フィルムフォー マットのバインダーとしてまたは他の用途に有用なゼラチン硬化剤および架橋性 ポリマー類であることも知られている。

米国特許第３．６２５．６９４号は、ポリマー媒染剤をゼラチンマトリックス定 着（架橋）するための活性アルデヒド基、クロロアルカノイル（例えば、クロロ アセチルおよびクロロプロピオニル）基、クロロアルキル（例えば、クロロメチ ル）基およびビニルスルホニル基などを有するポリマー媒染剤を記載する。米国 特許第４．１９３．７９５号および同４，２０１，８４０号は、染料を共有結合 するためのビニルスルホニル基およびクロロエチルスルホニル基を有するポリマ ー媒染剤を記載する。

実際問題として、各種支持媒質が対流や拡散を極小化し、そして分子サイズおよ び正味荷電の両方に基づく分離を行うために使用されてきた。最も一般的な支持 媒質は、紙製のシート、酢酸セルロース、アガロース、澱粉およびポリアクリル アミドである。紙、酢酸セルロースおよび同様な多孔質材料は、比較的不活性で あり、そして主に支持体および対流の極小化に役立つ。これらの材料を用いるタ ンパク質類の分離は、設定されたｐＨにおけるそれらのタンパク質の荷電濃度に 主として依存している。

しかしながら、澱粉、アガロースおよびポリアクリルアミドゲルの使用は、対流 や拡散の極小化だけでなく、ポリマー網状構造開口部の平均サイズ（または平均 細孔サイズ）の制御により、望ましい分子サイズ範囲における分子分別を達成で きる限定された媒質を提供する材料によって分離工程にもげでなく荷電濃度と分 子サイズの両方による分離を示す。

５％より高い濃度の溶液は非常に粘性であり流れ難いのでアガロースがそれらに 希に使用されている。従って、アガロースは大きな分子、例えば、高分子のタン パク質およびポリヌクレオチド類について５　（ｗ／ｖ）％以下の濃度で広く使 用されている。

広範囲なポリマー濃度（すなわち、ゲル網状構造開口部はポリマー濃度の上昇に つれ縮小するので、平均細孔サイズを広範囲に制御する）のゲルを提供し、さら にポリマー濃度勾配によってゲル内に細孔サイズ勾配を付与する性能は、電気泳 動ゲル媒質としてのポリアクリルアミドの付加的な利点である。全般的な細孔サ イズの制御は、混合物の分子サイズの差による篩分けを可能にし、そして分子量 の測定の実施を可能にする。タンパク質類を固有の分子荷電を中和するドデシル 硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のような洗剤で処理する場合には、これらの測定は、 すべてのＳＤＳ処理分子が、そのサイズ如何にかかわらずほぼ同一の荷電密度値 を有するので特に正確になる。この技法は、５Ｏ５−ＰＡＧＥ　（ドデシル硫酸 ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）と称されている。

ポリアクリルアミドを基材とした電気泳動のゲル系の人気は、ポリマー含量およ びそれらによって達成できる緩衝組成物のかなり広い自由度に由来するだけでな く、印加電圧および分離される溶媒の双方に対するゲルの高度の不活性さ、分離 されたタンパク質が容易に検出されそして慎重に調製したゲルの良好な再現性に も由来する。

さらに、低粘性、容易な流動性および高純度の利点を存したまま大きな分子の分 離に低濃度で使用することができるアクリルアミド基材ゲル（すなわち、アクリ ルアミドおよびＮ−置換アクリルアミドまたはメタクリルアミド類から選ばれる モノマ一単位を少なくとも５０重量％を含んでなる架橋とニルポリマーから構成 されるゲル）を入手することが望ましい。

さらに電気泳動ゲル媒質としてポリアクリルアミド使用の利点は、ポリマー濃度 範囲の広範さ、制御された平均細孔サイズ範囲の広範さおよびポリマー濃度勾配 によるゲル内に細孔サイズ勾配を形成できる性質にある。全般的な細孔サイズの 制御は、混合物を分子サイズに応じて篩分けすることを可能にし、分子量測定の 実施を可能にする。これらの測定は、すると、すべてのドデシル硫酸ナトリウム 処理分子がサイズの如何にかかわらず、はぼ同一の荷電濃度値を有するので、特 に正確になる。この技法は、（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動、本明細書では以下、ＰＡＧＥと特定する）と称されている。

ポリアクリルアミドを基材とした電気泳動のゲル系の人気は、ポリマー含量およ びそれらによって達成できる緩衝組成物のかなり広範な自由度に由来するだけで なく、印加電圧および分離される溶媒の双方に対するゲルの高度の不活性さ、分 離されたタンパク質が容易に検出されそして慎重に調製したゲルの良好な再現性 にも由来する。

一般に、ドデシル硫酸ナトリウム−ＰＡＧＥ電気泳動に使用するポリアクリルア ミドゲル媒質は、アクリルアミドのようなモノマーと架橋剤、最も普通にはＮ、 Ｎ’　−メチレンビスアクリルアミドを水、緩衝剤、重合開始剤および重合触媒 の存在する酸素を含まない条件下でフリーラジカル誘導重合によって、現場で調 製されてきた。

ゲルを得るには、通常実施に際し、アクリルアミドと適当なビスモノマー、例え ば、Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（時には、単に「ビス」と称する） のフリーラジカル重合を生じせしめる。このようなゲル形成は、い（っがの注意 、すなわち、（ａ）非常に高純度の出発原料を使用しなければならないこと、（ ｂ）モノマーと緩衝剤の溶液は脱気して酸素を除去しなければならないこと、（ Ｃ）フリーラジカル開始剤および触媒を前記脱気した溶液へ迅速に混合しなけれ ばならないこと、（ｄ）この溶液の漏れを防ぐように下端を密封した２枚のガラ ス板間またはガラス管中に迅速に流し込まねばならないこと、ならびに（ｅ）ゲ ル化を、（ｉ）酸素が大部分排気されそして（ｉｉ）過剰な加熱がゲルの不均一 化をもたらさないように熱を放散する適当な手段を存在させて進行しなければな らないこ°と、にょって前記のようなゲル形成が成功裏に行われる。

従って、所定の寸法およびコンシスチンシーを有する電気泳動用ポリアクリルア ミドゲル媒質の調製には、高度の熟練と十分な慎重さならびに溶液が酸素を含ま ないように保存することが必要である。

また、アクリルアミドとビスのどちらも神経毒として知られそして発癌物質と考 えられているのでこれらのモノマー類の取り扱いにも注意を要する。

使用者が現場でフリーラジカル重合および架橋によって電気泳動ゲルを調製する ので前記方法に対する数多くの変法が存在する。これらは、（ａ）カセット中で 予備形成されたゲルの使用および（ｂ）柔軟性支持体上で予備形成されたゲルの 使用を含む、しかしながら、これらの別法は、ゲルサイズに関する操作性の自由 度または柔軟性がある程度失われ、ゲル中のポリマー含有物および緩衝剤含有物 が失われる。また、−特に、フリーラジカル重合および架橋法によって調製した カセット中のプレキャストゲルでは一一般に、ゲル形成反応終了後にある程度の 未反応モノマー類、開始剤副生成物および触媒が残存する。このような種の存在 は、使用者に対しある程度毒物による危険性を及ぼし、そして実施される電気泳 動分離を妨害するかも知れない。また、このようなプレキャストゲルは限定され た保存寿命が見い出されている。

米国特許第４．５８２．８６８号明細書は、酸素の排気を必要としない非フリー ラジカル誘導による電気泳動ゲル媒質を形成するためのアクリルアミドに冨むコ ポリマー類の架橋を記載する。典型的には、アクリルアミドと架橋剤、例えば、 Ｎ−（３−（２−クロロエチルスルホニル）プロピオンアミドメチルコアクリル アミド、 のようなアクリルアミド誘導体、２−　［３−（２−クロロエチルスルホニル） プロピオニルオキシュエチルアクリレ−１・、のようなアクリレート誘導体、ま たはＮ−（２−（エトキシカルボニルメトキシカルボニル）エチルコアクリルア ミド：ＣＨ２＝ＣＨＣ０ＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｃ０ｏＣＨ２ＣｏＯＣ２Ｈ５のような 活性エステルで処理して、後に非フリーラジカル的に開始する架橋用の部位を付 与するモノマーとのコポリマー類が、米国特許第４，５８２．８６８号に準じて 酸素不存在下でフリーラジカル的に開始する重合によって調製されている。その 後、酸素の存在下で安全に実施できる別の工程では、前記ポリマーに含有される クロロエチルスルホニル基または他のペンダント反応性基がビス求抗性架橋剤、 例えばジアミンまたはジチオールと適切なｐＨにおける反応によって架橋されて いる。これに関しては、電気泳動はしばしばクロロエチルスルホニル基の脱ハロ ゲン化を促進するようなｐＨ値で行われていることに注意が必要である。こうし て形成されるビニルスルホニル基と意図する架橋剤とがすべて反応しない場合に は、それらは電気泳動中の溶解したタンパク賃上のアミノ基と反応する可能性が ある。このような反応は、タンパク質の電気泳動を人工的に遅延させるである− ５し、その結果として、アクリルアミドとビスのみのフリーラジカル重合によっ て形成された電気泳動ゲルで得られた結果に関する電気泳動結果に誤読をもたら すであろう、従って、これらの基の反応を完全に終了させるのに必要なだけの架 橋剤を使用しなければならない。

上記の別法の利用可能性にかかわらず、一般に電気泳動媒質はいまなお使用時に ビニル七ツマー類の重合によって調製されている。このことは、使用前にはモノ マー類にそして使用中には残存モノマー類に実施者が必然的にさらされることを 意味する。このようなモノマー類は、発癌物質と考えられており、少なくともあ るものは神経毒を示すことが知られている。

ビスは、アクリルアミド基材電気泳動ゲル用の架橋剤として最も広範に使用され ているが、一般にビス架橋したゲルは再度可溶化できない。電気泳動を行った後 にそのゲルを可溶化できることは、溶解した種をゲルから回収できる点で有利で ある。別法のジアリル酒石酸ジアミド（ＤＡＴＤ）のような開裂性架橋剤の使用 は、研究者にこのような回収を行うことを可能にする。電気泳動後、可溶化され るべきゲルの各部分が過ヨウ素酸の希薄な溶液で切断処理される。前記架橋剤の 中心の−ＣＨ０ＩＩ　−Ｃｌｌ０Ｉ＋−結合は、過ヨウ素酸溶液で開裂されるの で、このような溶液が可溶化ポリマーを生成する。

この溶液からさらなる実験用として溶解した種が容易に回収できる。明らかに、 電気泳動後にゲルの可溶化の選択の自由を研究者に提供することは有益であろう 。

また、電気泳動がゲル化直後に行われる場合には、ゲル化をもたらす化学反応（ すなわち、架橋）は電気泳動用として存在する緩衝剤と適合しなければならない 。ゲル電気泳動は、しばしば５〜９の範囲のｐＨ値で行われている。

電気泳動によるタンパク質の分子量測定について特に有名な系は、Ｌａｅｍｍｌ ｉによってＮａｔｕｒｅ、　２２７　　：　６８０（１９７０）に記載された。

この系では、一種がもう一方の上に置かれる２種のゲルが使用されており、多相 緩衝剤系を伴う。上部（または堆積）ゲルは、より低いｐＨにはＨＣＩが添加さ れるトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンで達成されるｐＨ６，８で存在す る。この堆積ゲル（ｓｔａｃｋｉｎｇ　ｇｅｌ）は低いポリマー濃度（一般に、 ４〜６（ｗ／ｖ）％）を有する。その目的は、（ａ）媒質上に試料を別々のレー ンにのせることができる媒質を提供すること、および（ｂ）堆積ゲルと下部の（ または分離）ゲル間の境面で特定の試料中のすべての種を濃縮することにある。

目的（ｂ）に合致すると、一般にドデシル硫酸ナトリウムで変性されたタンパク 質類である溶質類が、共に（または非常に近傍に）「積み重なる」。すなわち、 溶質類は分離ゲル（ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ　ｇｅｌ）に入る直前に２種のゲルの境 面で濃縮される。タンパク質の効率的な積み重ねを起こすには、緩衝剤よりむし ろタンパク質が電流の殆どを運びそして殆ど分子サイズ分離が存在してはいけな い。

緩衝剤が電流の殆どを運び１、そして溶質が電位傾度および架橋されたポリマー ゲルの細孔サイズ分布による減速によって決定される速度において移動する場合 、分子サイズ分離は分離ゲル中で生ずる。この分離ゲル中のｐＨは、一般に８． ８であり、ポリマー濃度は、通常少なくとも１０（ｗ／ｖ）％である。

まとめると、有名なＬａｅＩＩｎ＋＋Ｉ　ｉ法は２種のゲルを要し、それらの下 部（分離ゲル）は大きく　（従って、通過する溶質にとってより長い進路を提供 する）、そして高濃度のゲル化ポリマーを含むため、上部のまたは堆積ゲルの平 均細孔サイズよりさらに小さなそれを有する。　Ｌａｅｎ＋ｍｌｉによって推奨 されている条件は次のとおりである。

一堆一積−ゲー四−−分一郡二ゲー四−ｐＨ６，８８，８ Ｌａｅｏ＋ｎ＋１　ｔの教示は堆積ゲルの使用に関しては従来技術を陵駕すると はいえ、酸素の存在下でゲル化せしめる溶液が容易にそして安全に注入でき、ゲ ルを迅速に形成することができ、しかも電気泳動後に試料を回収する目的でゲル またはそれらの一部を可溶化できるようにその溶液をコートできることがさらに 望ましい。

しかしながら、大きい分子、例えば高分子タンパク質類およびポリヌクレオチド 類の電気泳動分離には、一般に、単一の（分離）ゲルが使用されるにすぎない。

このゲル（従来技術では、一般にアガロース）は、大きな分子の電気泳動分離に 適する特性の大きな細孔サイズを有するためにＬａｅｍｍｌｉ法で使用される分 離ゲルより高分子ポリマー材料の低濃度から一般に形成されている。

前述の課題は、下記構造を有することを特徴とする水溶性コポリマーによって解 決される。

上式中、Ｌはアルキレン、アリーレン、二価のへテロ原子、有する二価の複素環 式基である）またはこれらの２つ以上の組み合わさった基であり、 −Ａ−は１つ以上の重合されたアクリルアミドモノマーから誘導される反復単位 を表わし、Ｒ１は水素またはメチルであり、Ｒ２′はハロアセタミド基であり、 −Ｂ−はいずれか他の重合されたビニルの七ツマ−から誘導される反復単位を表 わし、そしてｘ、ｙおよび２は前記反復単位の重量％を表わしており、Ｘが約５ ０〜９０重量％であり、ｙが約１〜５０重量％であり、そして２が約０〜４５重 量％である。

さらにもう一つの本発明のＢ様における電気泳動用要素は、架橋剤で架橋する前 のポリマーが前述のコポリマーである架橋ポリマーを含むことに特徴がある。

さらなる本発明の態様では、電気泳動要素が、前述の方法によって架橋されたゲ ルとしてコポリマーが調製される記載したようなコポリマーを含むことに特徴が ある。

さらに、架橋剤で架橋後の前述のコポリマーは分離ゲルまたは堆積ゲルのいずれ かに使用することができる。

この発明はまた、分離ゲルおよび堆積ゲルの両方を含んでなる電気泳動要素であ って、分離ゲルが前述のような第一コポリマーであり、そして重量平均分子１− が約１００，０００未満で数平均分子量Ｋｎが少なくとも約７，０００を示すコ ポリマーを含み、かつ堆積ゲルが前述のような第二コポリマーであり、そして重 量平均分子量■鰐がｉｏｏ、ｏｏｏを超え、数平均分子量Ｍｎが５０，０００を 超えるコポリマーを含み、これらのコポリマーが前述のような方法により架橋さ れたゲルとして調製されたものであることを特徴とする前記要素を提供する。

この発明の最後の態様では、電気泳動用キットが、前述のようなコポリマーまた は前述のようなコポリマーの変種の組み合わされたものと、そのコポリマーと分 離したコンテナー中のフリーラジカルビニル付加機構を伴わない反応により前記 コポリマーを架橋する架橋剤を含んでなることを特徴とする。

この発明の長所は、酸素の存在下でゲル化する溶液であって、容易にそして安全 に注入でき、ゲルを迅速に形成でき、しかも電気泳動後試料を回収する目的でそ のゲルまたはゲルの一部を可溶化できるような溶液を塗布できることである。

本発明のコポリマー類は、架橋前には次の構造で特定される架橋ポリマー類を含 んでなる電気泳動媒質に関する。

上式中、Ｌは、一般に、主鎖中に炭素原子とへテロ原子を１〜２０個有する置換 もしくは未置換アルキレンである。アルキレンのこの定義は、アルキレン基類が 、オキシ、チオ、−ＮＲ″−（ここで、Ｒ３は水素、炭素原子１〜６個の置換も しくは未置換アルキル（例えば、メチル、クロロメチルもしくは２−ヒドロキシ エチル）、または炭素原子６〜１０個の置換もしくは未置換アリール（例えば、 フェニル、ナフチルもしくはキシリル）　）、−Ｚ　（後述するような）、エス テル（−ＣＯＯ−）　、アミド（−ＣＯＮＨ−）　、ウリシン（−ＮＩＣ０Ｎ１ １−　）、ウレタン（−ＮＨＣＯＯ−）　、スルホニル（ＳＯり、カーボネート 、スルホナミド、アゾ、ホスホンあるいは他の類似の基によって中断されている か、あるいは末端が形成されたアルキレン基を包含することを意味する。代表的 なアルキレン基としては、メチレン、エチレン、イソブチレン、ヘキサメチレン 、カルボニルオキシエトキシカルボニル、メチレンビス（イミノカルボニル）、 カルボニルオキシドデシレンカルボニルオキシエチレン、カルボニルイミノメチ レンイミノカルボニルイミノエチレン、カルボニルイミノメチレンイミノカルボ ニルエチレン、カルボニルイミノトリメチレンイミノカルボニル、カルボニルオ キシエチレンイミノカルボニルならびに米国特許第４，１６１．４０７号および 同４．５４８，８７０号明細書によって記載または示唆される他の基が挙げられ る。

Ｌはまた、二価のへテロ原子（またはへテロ原子含有基）、例えばオキシ、チオ 、−ＮＲ３（ここで、Ｒ３は前記定義と同じである）、エステル（−ＣＯＯ−） 、アミド（−ＣＯＮＨ−）　、ウリシン（−ＮＨＣＯＮＨ−）　、ウレタン（− ＮＨＣＯＯ＝’ｌ　、スルホニル（ＳＯｔ）、カーボネートおよびスルホナミド であってもよい。

また、このしの定義中には、前記二価のへテロ原子類、−Ｃ−Ｚ−（ここで、２ は、アルキレンを有する二価の複素環式基である）、ならびに前述のアリーレン 基、例えば、フェニレン、アリーレンアルキレン、アルキレン−アリーレンアル キレン、フェニレンイミノカルボニルおよび当業者によって容易に決定される他 の基いずれか２つ以上から組み合わされた二価の基も包含される。

Ｌは、さらに、核皮素原子を一般に６〜１２個有する置換もしくは未置換アリー レンであってもよい。代表的なアリーレン基としては、フェニレン、トリレン、 ナフチレンおよび前記各特許に記載された他の基が挙げられる。

好ましくは、Ｌは、定義したようなヘテロ原子含有基またはフェニレン基とアル キレン基の組み合わさったもので中断されそして／または末端基が形成されてい る置換もしくは未置換のアルキレン基、あるいはアルキレン、アリーレン、二で ある）またはそれらの２つ以上が組み合わさった基である。

より好ましくは、Ｌは、式＝（Ｒ’）ｋ−（ＣＯＸＲ’）、−（ＮＨＣＯ）、− で示される基であって、式中、Ｒ３はアリーレンまたはアリーレン−Ｒ４−（こ こで、Ｒ４は炭素原子１〜６個のアルキレンである）であり、Ｘは一〇−または −ＮＮ−であり、そしてに、ｍおよびｎはそれぞれ０または１を表わす基であり 、これらのうちフェニレンまたはフェニレンメチレンが最も好ましい。

前記のコポリマー構造において、−Ａ−は重合性アクリルアミドモノマー類、例 えば、アクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、２−アクリルアミド −２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、Ｎ−イソプロピルアクリ ルアミド、Ｎ−ヒドロキシメチルアクリルアミド、Ｎ−（１，エージメチル−３ −オキソ−ブチル）アクリルアミド、Ｎ−メチルメタクリルアミド、２−アクリ ルアミド−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、メタクリルアミ ド、３−（３−ジメチルアミノプロピル）アクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルア クリルアミド、Ｎ　、　Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタク リルアミドおよび３−（２−ジメチルアミノエチル）アクリルアミドの１種以上 がら誘導される反復単位を表わす。特に好ましくは（未置換）アクリルアミドお よび好ましくはアクリルアミドである。Ｒ１は水素またはメチルであり、Ｒ２／ はハロアセタミド基であり、−Ｂ−はスチレンもしくはスチレン誘導体類、ある いはジビニルモノマー類、シアクリリックモノマー類およびジアクリルアミドモ ノマー類（例えば、ジビニルベンゼン、エチレンジアクリレート、エチレンジメ タクリレート、Ｎ、Ｎ’−メチレン−ビスアクリルアミド）であり、そしてχ、 ｙおよび２は反復単位の重量％を表わすものであって、Ｘは約５０〜９０重量％ であり、ｙは約１〜５０重量％であり、そして２は約０〜４５重量％である。

前記ポリマー類は、アミノ基、メルカプト基、スルフィン酸またはフェノール系 水酸基の２個以上有する架橋剤、例えば、エチレンジアミン、１，３−プロパン ジアミン、１．３−プロパンジチオール、ジチオスレイトール、ジチオエリスリ トール、１，５−ペンタンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ジエチレントリ アミン、トリエチレンテトラミン、プロピレンジアミン、ジ（アミノメチル）エ ーテル、１．８−ジアミノ−４−（アミノメチル）オクタン、キシリレンジアミ ン、ハイドロキノン、ビスフェノールＡ、ビスフェノールスルホン、１，４−ブ タンジスルフィン酸、ヘンゼンジスルフィン酸、チオエタノールアミン、ｐ−ア ミノチオフェノールおよびブチレンジアミンで架橋することができる。

ＯＨＯＨ するビスメルカプト類である。

これらのより好ましい架橋剤は、ジチオスレイトールおよびジチオエリスリトー ルであり、ジチオエリスリトールが最も好ましいものである。

好ましい態様では、反応性ＲＺ／がクロロアセチル、具体的にはクロロアセタミ ド基の形状をしている。この基は求電子性であり、アミンまたはチオールのよう な求核剤と反応することが予期されるであろう。われわれは、電気泳動にとって 最も興味深いｐＨ値（７〜１０）においてアミンとよりも温かに迅速にチオール と反応を起こすことを見い出した。従って、われわれは好ましい態様の一つでは 、ジチオスレイトールがこのクラスのポリマー類に対する非常に有効な架橋剤で あることを見い出した。ジチオスレイトールの利点は、第一アミン（ヒドロキシ メチルアミンメタン緩衝剤）の存在下でさえも迅速な架橋反応をすること以外に 、（ａ）水溶性、（ｂ）低毒性および（Ｃ）そのゲルまたはそれらの選ばれた部 分を可溶化するような過ヨウ素酸による後電気泳動反応を受は易いことが挙げら れる。

このクロロアセタミドとチオールの反応は、ｐＨ感受性でありそして反応の副生 成物としてＨＣＩを生成する。

従って、堆積ゲル緩衝液および分離ゲル緩衝液中で使用されるヒドロキシメチル アミノメタン・ＨＣ４溶液のｐＨを、それぞれ７．８および９．４に調節するこ とが有利である。これらの調節は反応速度を高め、ＨＣＩの発生を補う。ジチオ スレイトール架橋ポリ〔アクリルアミド／ビスＮ−（３−クロロアセタミドプロ ピル）メタクリルアミドココポリマー類によるドデシル硫酸ナトリウム複合化タ ンパク質類の電気泳動分離は、アクリルアミド／ビス　ゲルによって得られた分 離に比し非常に順調である。

適切な緩衝剤の選択および組み合わせは、殆ど当業者の知識内にあり、本発明の 媒質を使用する電気泳動法で分離すべき物質に依存する。このような緩衝剤およ びそれらを選択するベースは、例えば、Ａｎｄｒｅａｓ　Ｃｈｒａｍｂａｃｈの 「定量的電気泳動の実際（Ｔｈｅ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｑｕａｎｔｉｔａ ｔｉｖｅ　Ｇｅｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏ−ｐｈｏｒｅｓｉｓ）　Ｊ　、　ＶＣＨＰｕ ｂｌｉｓｈｅｒｓ、　Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ　Ｂｅａｃｈ、　Ｆｌｏｒｔｄａ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、　（１９８５）およびＵ、に、Ｌａｅｎ＋ｍｌｉ　のＮａｔｕｒｅ 、　２２７　　：６８０（１９７０）に記載されている。

クロロアセタミド基を担う重合単位は、ポリマーゲルにおいて所定の大きさの架 橋密度を提供するのにちょうど必要な範囲でコポリマー中に存在させねばならな い。必要量未満では、架橋密度が低くすぎるゲルをもたらし、逆に必要量を超え る場合にはわれわれが求めているアクリルアミド様の特性を損ねるであろう。架 橋密度と分子量の要件は、このコポリマーが重量基準でＮ−（３−クロロアセタ ミドプロピル）メタクリルアミドモノマーから誘導される単位を１０％（モル基 準では、これはモノマーの３．５％である）を含む場合に満たされる。

重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｔｏは、予備形成ポリマーをフリーラジカル ビニル付加機構を伴うことなく化学架橋剤でその後架橋する目的で適正に選ばれ ねばならない重要なパラメーターである。すなわち、まず第一に、分離電気泳動 ゲルを形成するためのゲル化可能なポリマー溶液が、（１）０．１５ｃｍの厚さ を超えないスロット（型、管またはガラス板の間）に容易に流し込まれ、（２） 短いゲル時間（すなわち、約４〜１０分、「ゲル時間」とは、架橋剤の添加から その溶液が容易に流れなくなるまでの時間を意味する）を存するが、（３）前記 スロットに流し込んで１４　Ｘ　１４　Ｘ　Ｏ，１５ｃｍの電気泳動の型を満た すのに十分な時間（約４〜６分かかる）そのままであることである。第二に、架 橋剤の添加後約１０分〜２時間以内に、（１）電気泳動中に良好な分子篩特性を 提供するのに十分な架橋密度、（２）電気泳動中の良好な分離能、および（３） 電気泳動直後に型から硬化したゲルを手動で取り出すことを可能にすると同時に 、ゲルの有害な流動、圧縮、破損、伸張、破断または崩壊を伴うことなく取り扱 うことができる十分な物理特性を有する堅いゲルを生ずることである。

分離ケル（Ｇｉ　）中Ｎ−（３−クロロアセタミドプロピル）メタクリルアミド １０重量％では、１グラム当たりの架橋剤部位の当量数（ｙ）は次のように計算 することができる。

既知のｙおよび所定の架橋剤類間の分子量は、求める架橋密度を達成するのに適 する出発コポリマーに関する一Ｍｎの最小値の推定を可能にする。

Ｈｎ　＝　１．７　（１０−’） 好ましい重量平均分子量■−は、このように直接に推定されない。それにもかか わらず、われわれは本発明に従うポリマーの水性溶液に架橋剤の架橋の添加後ゲ ルを形成するであろう必要な経過時間は、（予測されるように）π−の増大につ れて減少することならびに分離ゲル中ポリマー濃度１２（Ｗ／Ｖ）％では、Ｍｗ がほぼ４．６　（１０−’）である場合にはゲル化時間（架橋剤添加とゲル化の 間の時間）６分で目的が達成できることを見い出した。

分離ゲルと同様に使用される電気泳動媒質の前記−のコポリマー成分におけるπ −およびＭｎの要件は次のとおりである。

１）Ｈｗは、選ばれた架橋剤の化学量論量の１．２５〜１．５倍の添加がその架 橋剤の添加後前記媒質を約４〜１０、好ましくは約６〜８分以内に０．１５　Ｘ 　１４　Ｘ　１４Ｃ［Ｏモールド中に流し込むことができないほど混合物の粘度 が高まらないように十分小さい。

２）Ｋｎは、選ばれた架橋剤の化学量論量の１．２５〜１．５倍の添加後、約１ ０分後にゲルを形成するのに十分な架橋密度を提供するのに十分な大きさであり 、最終的に前記ゲルはモールドから取り出されそして破断または崩壊を伴わない で優しく取り扱われるように流し込んだ後約２時間以内に十分な堅さを有するこ とである。

３）ポリマー１ｇ当たり架橋部位の当量数は０．４５　（１０”’）〜１４　（ １０−’）　、好ましくは少なくとも２　／　Ｍ”ｎ　、より好ましくは約２． ２５　（１０−’）〜１０　（１０−’）　、そして最も好ましくは約４　（１ ０−’）〜７　　（１０−’）の範囲内にある。

より具体的には、電気泳動用分離ゲルを調製するのに使用される本発明のコポリ マーに関する水溶性コポリマーは、少なくとも約７，０００の数平均分子量を有 し、かつ約１００．０００未満の重量平均分子量を有さねばならない。

数平均分子量および重量平均分子量は、当業者に既知の方法によって変動しうる 。例えば、これらの分子量は使用される開始剤の増加、使用される連鎖移動剤の 増加、モノマー濃度の低下および反応温度の上昇によって低下することができる 。それらはまた、特殊な連鎖移動剤および／または開始剤を選ぶことによっても 変動することができる。

また、分離ゲルおよび堆積ゲルの両方を含んでなる電気泳動要素も好ましい、こ の分離ゲルは分子量■−が約１００，０００未満でＴｎが少なくとも約７，００ ０で挑る前記のような第一コポリマーを含んでなり、そして堆積ゲルは分子量− Ｍ−が１００、０００を超え、Ｕｎが５０，０００を超える前記のような第二コ ポリマーを含んでなる。

適合性のためには、堆積ゲルコポリマーが製造されるモノマー類は、分離ゲル用 に使用されるものと同一または類僚でなければならない。好ましくは、アクリル アミドはモノマー混合物の少なくとも９０モル％を占める。従って、堆積ゲルコ ポリマー類の分子量（ＫｎおよびＭｗ）は、前記のような対応する分離ゲルコポ リマー類より相当太き（なければならない。

ゲル化速度は、（ａ）ゲル中のコポリマー濃度、（ｂ）出発コポリマーの分子量 （特に、Ｈｗ　）、（Ｃ）コポリマー１ｇ当たりに存在する架橋性部位の数、お よび（ｄ）溶液のｐＨの増大につれて増大することが予測できる。

堆積ゲルとして有用な本発明のポリマーは、少なくともｓｏ、ｏｏｏのπｎと少 なくとも１００．０００のＭｗ　、好ましくは少なくとも１５０．０００のＶｗ 　、より好ましくは少なくとも２００．０００または３００．０００のＭｗを有 する。

好ましいポリマー、ポリ　〔アクリルアミドーコーＮ−（３−クロロアセタミド プロピル）メタクリルアミド〕　（アクリルアミド対コモノマーの比は、９０／ １０；モル比は、９６．５／３．５）　、好ましくはそれぞれの目的に使用され る場合、下記の分子量を有する。

先に示したように、これらの分子量は同様に架橋される前記構造のいずれか他の コポリマー類についても同様であらねばならない、これは、１）ポリマー組成物 の本体がアクリルアミドまたは適度に置換されたアクリルアミド類に由来し、２ ）１分子当たりの架橋性部位の関数が類僚であり、そして３）架橋間のポリマー 主鎖も類であるからである。従って、分離ゲルを形成する本発明の好ましいポリ マー類は、約７．０００〜３０，０００のＫｎと約２５，０００〜１００，００ ０のπ−を示さねばならず、堆積ゲルを形成するのに好ましいものは、約５０． ０００〜３００．０００のＫｎで約１００．０００−１．０００．０００の閣− を示さねばならない。

架橋性（する）部位の数に関して、架橋反応は、反応性架橋剤とポリマー上の部 位の同当量（すなわち、化学量論量）を使用して行うことが理想的である。しか しながら、われわれは化学当量基準で依存する架橋性部より２５〜５０％多いジ チオスレイトール（または他の適当な架橋剤）を使用することが有利であること を見い出した。ちょうど必要とする化学量測量の架橋剤の１．２５〜１．５倍使 用することの利点は、（ａ）（全部でない場合）が反応してしまったことの確信 がもてることである。潜在する架橋性部位の未反応親電子性基は、タンパク質重 の、求核性基と反応できるので電気泳動工程を混乱させる。

ポリマー１ｇ当たりの架橋性部位の数は、前記コポリマー構造に示される反応性 Ｒ”基を含有するモノマー類濃度を調整することによって変動できる。

本発明のさらに別の態様では、本発明のコポリマーが、先に詳細に記載したその コポリマーまたは前記のようなコポリマー１種より多くの組み合わされたもの、 ならびにそのコポリマー類と別のコンテナー中のフリーラジカルビニル付加機構 を伴わない反応によって前記コポリマーを架橋するための適当な架橋剤（より詳 細には前記して、いる）を含んでなる電気泳動用キットの構成要素である。場合 によって、このキットは電気泳動媒質に組み入れるのに適する選択された緩衝剤 および他の成分を含んでもよい。

本発明のさらにもう一つの態様では、前記のようなコポリマーの水性溶液をフリ ーラジカルビニル付加機構を伴うことなく選択された架橋剤と反応することによ って前記コポリマー上の架橋性部位と反応しうる前記のような架橋剤を混合する ことを含んでなる大きな分子の分離用電気泳動ゲルの現場調製方法が提供される 。

ゲル化速度は、（ａ）ゲル中のコポリマー濃度、（ｂ）出発コポリマーの分子！ （特に、Ｈｗ　）、（Ｃ）コポリマー１ｇ当たりに存在する架橋性部位の数、お よび（ｄ）溶液ｐＨの増大につれて高まることが予測できる。

一般に、分離ゲルについて予備形成ポリマー濃度は、約８〜約１４（ｗ／ｖ）％ 、好ましくは１０〜１２　（ｗ　／　ｖ　）％であり、堆積ゲルについてのそれ は約１．５〜約５　（ｗ／ｖ）％、好ましくは２〜５（ｗ／ｖ）％、より好まし くは２．５〜４（ｗ／Ｖ）％であろう０例えば、好ましいポリマー、ポリ〔アク リルアミドーコーＮ−（３−クロロアセタミドプロピル）メタクリルアミド〕　 （アクリルアミド対コモノマーの比：　９０／１０　ｉモル比：　９６．５／３ ．５　’）は、分離ゲルを調製するには約１２％の濃度で、堆積ゲルを調製する には約４％の濃度で使用される。

しかしながら、ゲル形成を確実にするには、分子量ＴｎとＶ−のどちらも分離ゲ ルポリマーよりも堆積ゲルポリマーの方が大きい。

この発明の実施に際して有用な好ましいモノマーＮ−（３−クロロアセタミドプ ロピル）メタクリルアミドの製造：冷却器、撹拌器および２個の滴下漏斗を固定 した３ｊ２の４つロフラスコに、メタノール（１，２１）中Ｎ−（３−アミノプ ロピル）メタクリルアミド塩酸塩（１５７ｇ　、　０．８８モル）および２．６ −ジーｔｅｒ　ｔ−ブチル−ｐ−クレゾール（１，０ｇ）を入れた。第一の漏斗 にクロロアセチルクロライド（１００ｇ　。

・０．８９モル）を入れ、そして第二の漏斗にはトリエチルアミン（１７８ｇ　 、　１．７６モル）を入れた。この溶液を０〜５℃に冷却（氷−メタノール）し 、次いでトリエチルアミンを３０分かけてゆっくり流加し、次いで１時間かけて クロロアセチルクロライドを添加した。添加後、温度を０℃で２時間維持し、水 浴を取り除き、次いで一夜室温で撹拌を続けた。溶媒を除去し、残渣に熱酢酸エ チル（５００ｄ）を加えた。この混合物を濾過してトリエチルアミン塩酸塩を除 去し、次いでその固体を熱酢酸エチル（５００ａｄ）で洗浄し、再度濾過し、濾 液を併わせそして溶媒をロータリーエバポレーターで留去した。この残渣を加熱 溶解した酢酸エチルから結晶化し、いずれかの固体を濾去し、次いで０℃に冷却 して結晶化した。この粗モノマーをシリカゲル充填カラムでクロマトグラフィー により精製した。生成物を、酢酸エチルとジクロロメタンの混合液１：１　（４ ｆ）を用いてカラムから溶離した。集めた溶媒を留去し、残漬を２．６−シーｔ ｅｒｔ−ブチル−ｐ−クレゾール（５００■）を含む酢酸エチル（３００Ｉｄ） から結晶化して、白色結晶化合物として得た。ｍｐ８５〜９０’Ｃ、８３ｇ　（ 収率４３％）。元素分析Ｃ９ＨＩ　５ｃＩＮｚｏｚとして、計算値：Ｃ，４９， ４；Ｈ，６，９、Ｎ。

１２．８　、　ＣＩｌ、　１６．２゜実験値：Ｃ，４９，０；Ｈ，７，６；Ｎ、 １３．２；Ｃｆ　、　１７．３゜ 以下の例は、この発明の実施例を具体的に説明する：五−上上 ポリ〔アクリルアミドーコーＮ−（３−クロロアセタミドプロピル）メタクリル アミド〕　（重量比９５１５）。

窒素雰囲気下で保持した、ｔｅｒ　ｔ−ブタノール（４００Ｊｄりとイソプロパ ツール（４０ｄ）中アクリルアミド（電気泳動縁）（３４，２ｇ　、　０．４８ モル）とＮ−（３−クロロアセタミドプロピル）メタクリルアミド（１，８ｇ　 、　　０．００８モル）の混合物に、２．２′−アゾビス（２−メチルプロピオ ニトリル）（１，０ｇ）を加えた。この溶液を６時間７０°Ｃで加熱した（１０ 分後に溶液からポリマーが沈殿する）。次に、ポリマーを濾取し、メタノール（ ２ｊ２Ｌアセトン（２１）で洗浄し、３５℃の真空乾燥器に入れ一夜真空乾燥し て白色粉末３６ｇ（収率１００％）を得た。このポリマーは、濃度０．２５ｇ／ ａで１．０モル濃度の塩化ナトリウム溶液における固有粘度０．４２ｄｌ！、／ ｇを示した。元素分析Ｃ３＋ｏｚ）ｌｓ＋ｔｏｃ１＋Ｊ＋ｏ＋ｔｏ＋ｏ＋ｔとし て、計算値：　Ｃ、５０，３５゜Ｈ，７，０４；Ｎ、１９゜５３　；　Ｃｊ２　 、０．７６゜実験値：　Ｃ，４８，３；　Ｈ。

７．１２　；　Ｎ　、　１８．１Ｂ　　、　Ｃｆｆｉ　　、　０．８５゜同族の 別のポリマーを、アクリルアミドと３−クロロアセタミドプロピルメタクリルア ミドの重量比を変えて製造した。

ｌエ ポリ〔アクリルアミドーコーＮ−（３−クロロアセタミドプロピル）メタクリル アミド〕　（重量比９５１５）の別法。

この製法は、ｔ−ブタノール／イソプロピルアルコール系の代わりに水／イソプ ロピルアルコール溶媒系を使用した。

１ｏｏｏ　ｚのフラスコに、アクリルアミド６８．４ｇ、、　Ｎ　−（３−クロ ロアセタミドプロピル）メタクリルアミド３．６ｇ、ミリ（Ｍｉｌｌｉ）Ｑ水６ ００ＪＩｄ！、イソプロパツール２００ｍおよび２．２′−アゾビス（２−メチ ルプロピオニトリル）４ｇを入れ、１０分間窒素ガスを充填し、次いで機械的に 撹拌しなから６３°Ｃの恒温浴中に置いた。約７時間２５分後、フラスコをその 浴から取り離し、−夜冷却した。撹拌しながらアセトン４２中に流し込んでポリ マー生成物を沈殿させた。濾過により溶媒を除去し、メタノール４２で固体を洗 浄し、アセトン４１．で再度洗浄し、フィルター上に再度集め、次いで真空下で 一夜乾燥した。

土二」［二 ＳＤＳ電気泳動用コポリマーの使用の説明。

１、貯蔵液 ａ、ポリ〔アクリルアミドーコーＮ−（３−クロロ−アセタミドプロピル）メタ クリルアミド］（９５：５）の２１．８％貯蔵液を、扁純度脱イオン水（Ｍｉｌ ｌｉ　Ｑ）に２１．８　ｇを溶解し、最終容量を１００ｄにすることにより調製 した。

ｂ８ポリ〔アクリルアミドーコーＮ−（３−クロロ−アセタミドプロピル）メタ クリルアミド）　　（８０：２０）の２２．５％貯蔵液を、高純度脱イオン水（ Ｍｉｌｌｉ　Ｑ）に２０ｇ溶解し、最終容量を１００１ｄにすることにより調製 した。

２．１５％分離ゲルの調製 １５％Ｔゲルをキャストする目的で、Ｎ−（３−クロロアセタミドプロピル）メ タクリルアミドの化学当量式（（］、、　５　’）（，０５）／２１８　）　０ ．０００３４４で示される貯蔵液Ａを、２０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ ）　０９０５ｄ、１×当量の架橋剤（ジチオスレイトール）および必要量の水と 混合し、総容量を７．５０Ｉｌｄｌにした。この溶液を十分に混合した後、トリ ス塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ）　（１，５モル濃度、ｐ）１８．８）２．５ｒｎｌ で最終容量１０．Ｏａｆにした。この緩衝液を最後に加えたのは、架橋はｐＨ依 存性であり、緩衝液が架橋剤の前に加えられた場合にはゲル化が早く起こりすぎ るからである。緩衝液を添加後、十分に混合し、この混合物を予め用意したゲル キャストスタンド上の０．０７５ｃｍ間隔のスロットの２枚のガラス板間に注い だ。この混合物は緩衝液添加後１．５分以内に注ぎ、そのゲルは５分以内に注ぎ 終った。約２０分後、デル化が始まり、ゲルが堅くなるまで継続した。

堆積ゲルが使用される場合には、工程３を続ける。堆積ゲルが使用されない場合 には、ゲル溶液を注ぎ、そのゲルが堅（なるまでそこに保持した後にガラス板間 にウェルを形成するためのテフロンコームを挿入した。

３．５％堆積ゲルの調製 １５％Ｔ分離ゲルが硬化した後、その上に５％堆積ゲルを積層した。５％堆積ゲ ルは、Ｎ−（３−クロロアセタミドプロピル）メタクリルアミドの化学当量式（ （，５）　（，２）　／２１８　）０．０００４５９で示される貯蔵液８２．２ 　ｄを添加することによって調製した。これに、２０％ドデシル硫酸ナトリウム ０．０５ｄ。

Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ６，８、１，５Ｍ）　０．８３１Ｒ１、ジチオスレイト ール１×当量および高純度脱イオン水（Ｍｉｌｌｉ　Ｑ）を加えて、最終容量１ ０ｔｄとした。よく撹拌した後、これを１５％分離ゲル上にオーバーレイし、次 いでテフロンコームを挿入して堆積ゲルを形成しそして試料用装填ウェルを形成 した。この堆積ゲルは約６時間後に堅くなった。

４、ゲル電気泳動条件 ゲルがバート２（および堆積ゲルが使用される場合にはバート３）から形成され た後、そのゲルをドデシル硫酸すｌ・リウＬおよび変性タンパク質の存在下でポ リ　（アクリルアミド）ゲル電気泳動（ＳＯ５−ＰＡＧＥ）に使用した。

実験条件は以下のとおりである： ａ　、　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　、　ｐＨ６，５（最終濃度０．０６３モル濃度） に溶解した高分子量標準および低分子量標準（それぞれ、Ｃ／ｎ　１６１−０３ ０３および１６１−０３０４）として特定されるＢｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓから購入したタンパク質標準、ドデシル硫酸ナトリウム、ブロモフェ ノールブルートラッキング色素およびグリセリンを含む２−メルカプトエタノー ル（それぞれ、最終濃度、０．２％、　　０．００１％および５％）を、秤量剤 として試料ウェルの底部に加えて溶解した試料の濃縮に役立てた。試料を装填す る前に、前記標準を５分間９５°Ｃで加熱してタンパク質を変性した。

ｂ、電極ラニング緩衝液は、［Ｊ、に、Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｎａｔｕｒｅ、　２２ ７　　：６８０、１９７０）に記載されるようなトリス／グリシン／ＳＤＳ、具 体的０．０２５モル濃度トリス（ｐＨ，０）　、０．１９９モル濃グリシンおよ び０．１％ＳＤＳであった。

Ｃ，テフロンコームをゲル（堆積ゲルが使用されている場合のゲル）から取り除 き、前記バラグラフ（４ａ）に由来する適当量の標準を、高分子量標準の最終タ ンパク’ｉｓ度が７．５■（または１．５■／タンパク質標準）となるように、 そして低分子量標準のタンパク質濃度が９．　Ｏｇ　（または１．５■／タンパ ク質標準）となるように加えた。この高分子量標準は、それぞれ相違する分子量 を有する５種のタンパク質類を含む、低分子量標準は、それぞれ相違する分子量 を有する６種のタンパク質類を含んでいた。使用した実際の装置は、ホイファー モデル（Ｈｏｅｆｅｒ　ｍｏｄｅｌ）ＳＥ２５０垂直スラブゲルセル（Ｓａｎ　 Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、　ＣＡ　９４１０７）であって、操作はミニプロティン■ デュアルスラブゲル（Ｍｉｎｉ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｉｆ　Ｄｕａｌ　５ｌａｂ　 Ｇｅ１）（電気泳動）セル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒ ｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ９４８０４　、販売）に付されているマニュアルに記載 されていた。

ｄ、実験の電気的パラメーターは１００ボルトであって、実験の間中一定であっ た。実験は、ブロモフェノールブルーのスクッキング色素がゲルの底部にきたと き中止し、それはこれらの条件下で約２．３時間後であった。

電気泳動が終了した後、ゲルをプレートから取り出し、酢酸（］、Ｏ％）、メタ ノール（４０％）および水（５０％）を含む０．０５％のコマ−シーブルーＣｏ ｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｌｕｅ）Ｒ２５０色素で染色した。この色素はタンパク質に 富んだ帯域に優先的に吸収し、良好な分解能で分子サイズに従って電気泳動の移 動が起ったことを明らかにする暗いタンパク質帯（１０％酢酸、４０％メタノー ルおよび５０％水で脱色後）を与えた。移動距離（脱色により膨潤が補正されて いる）を横座標にプロットしそして分子量の対数を縦座標にプロットしたグラフ は、はぼ直線であった。これは、一般的に５ＤＳ−ＰＡＧＥで観察されるもので ある。

従って、本発明のゲル媒質は、アクリルアミド／ビス重合から調製した５ＯＳ− ＰＡＧＥゲルで得られるものと非常に類僚した結果を示した。

五−土工 電気泳動ゲルの調製 電気泳動ゲルを、本明細書で開示したポリ〔アクリルアミドーコーＮ−（３−ク ロロアセタミドプロピル）メタクリルアミド〕　（アクリルアミド対コモノマー の重量比：　９０／１０　；モル比：　９６．５／３．５　）　Ｔ：調製した。

コノゲルは、Ｋｎ　＝１７．８（１０’）　とＴｗ　＝７８．２（１０３）のポ リ　〔アクリルアミドーコーＮ−（３−クロロアセタミドプロピル）メタクリル アミド〕（アクリルアミド対コモノマーの重量比：　９０／１０　；モル比＝９ ６．５／３．５　）から調製した下部の分離ゲルと、例２　（Ｔｗ　＞５００（ １０’）　）のポリ〔アクリルアミドーコーＮ−（３−クロロアセタミドプロピ ル）メタクリルアミド〕　（アクリルアミド対コモノマーの重量比：　９０／１ ０、モル比：　９６．５／３．５　＞由来の堆積ゲルを含めた。

アクリルアミド／Ｎ−（３−クロロアセタミドプロピル）メタクリルアミドコポ リマーの平均分子量は、（ａ）分画は４種のＴＳＫ−ＧＥＬ（Ｐ　Ｗ型）　６０ ００　、５０００　、３０００および２０００オングストローム限界濾過性のカ ラム（Ａｌｔｅｘ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、　１７８０Ｆｏｕｒｔｈ　Ｓｔ、、 Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、　ＣＡ　９４７１０）で行い、（ｂ）溶離は水中５（ｖ／ｖ ）％のエチレングリコールの０．０５Ｍ　ＮａｚＳＯｎであって、（ｃ）検量標 準は５ｈｏｄｅｘ　５ＴＡＮＤＡＲＤ　Ｐ−８２ポリサンカライドの８５３，３ ８０　．１８６　．１００　．４８．０，２３．７，１２．２および５、８　（ １０’）（Ｓｈｏｗａ　Ｄｅｎｋｏ　Ｋ、に、＋　２８０　Ｐａｒｋ　Ａｖｅ、 、　２７ｔｈ　ＦｌｏｏｒＷｅｓｔ　Ｂｕｉｌｄｉｎｇ、　Ｎｅ１ｍ　Ｙｏｒｋ 、　ＮＹ　１００１７）であって０．１（ｗ／ｖ）％の濃度で使用し、（ｄ）流 速は１．５ｄ／分であって、そして（ｅ）カラム溶離液中の溶質は屈折率測定を 行う水性ゲル濾過クロマトグラフィー系を使用して評価した。

各コポリマーは、存在する架橋性部位の数に基づく化学量論量の１２５％のジチ オスレイトールで架橋した。ゲルのｐＨ、ゲル中で使用した緩衝剤および電極チ ャンバー類は第１表にまとめる。

ＷＩ’＋８＋−ｉｆ？　　／　　　　　４１１１．ナー　ｔ４　　’／　　Ｋ　 ／７’ｌ　蛭全１５−ｋ　　ｉ、ａ　！　１．７　ＪＪＫ　■@　？　ＬＮ　ス 】−」ニー表 分離ゲル　　　　　９．４　　０．３７５モル濃度のＴｒｉｓ−ＨＣＩ（１２％ ポリマー） Ｔｒｉｓ　　ｍ）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン５ＯＳ−ドデシル硫酸 ナトリウム 第１表に示す緩衝剤組成を用いてＬａｅｍｍｌｉ法により行った電気泳動実験で は、本発明のジチオスレイトール架橋ポリ〔アクリルアミドーコーＮ−（３−ク ロロアセタミドプロピル）メタクリルアミド〕　（アクリルアミド対コモノマー の重量比：　９０／１０　；モル比：　９６．５／３．５　）コポリマーは、ア クリルアミドとＮ　、　Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドがら調製したゲルと 同等であった。特に、この発明のコポリマーから調製されたゲル類は、アクリル アミド／ビスゲル媒質の５ＯＳ−ＰＡＧＥ電気泳動について当業者が通常使用す る電圧および時間の条件下での電気泳動後、ゲルの負極端と正極端に約１４．４ （１０３）〜約２００（１０”）の分子量を有するタンパク質のＳＤＳ複合物が それぞれ現われ、良好な電気泳動分離をした。アクリルアミド／ビス基材ゲルで 達成される分離に比べた分離の程ｆＩＩＩ量ム１食１【ｅＯノ　Ｉ：ｔｙ　ｐＨ ６１宜Ｉ　Ｊ　ＣＱ／　　↓Ｊ４ａｃノイ封ヒＷＡ　）ｙ　Ｍ　−ｙ　Ｌ　／／ ニＡＩこり　Ｕ／Ａ　　＼　、　刀−丙１１　し／Ｉ：／％　　７　１　　Ｌ／ Ｊ　肝軌ｅ　　υ）Ｆ　＋％　ｋ−Ｗイし　ＬＶ’Ｑ＠これらの結果は、いわゆ る「ミニ」フォーマット（０，１５ｃｍＸ７ｃｍＸ８ｃｍ）（厚さ×高さ×幅） においても通常の大きなフォーマット（０，１５Ｃ１１Ｘ　１６Ｃ１１Ｘ　１４ Ｃ１１）においても達成できる。

約４分で分離ゲルを形成するための適当なレベルの架橋性部位を有する低分子量 コポリマーの調製。

窒素を通じたＭｉｌｌｉ　Ｑ水（すなわち、Ｍｉｌｌ　１ｐｏｒｅ　Ｃ／　ＮＺ ０４０１１５−８４ユニツトで精製した水）　（２００ｍ）中２．２′−アゾビ ス（メチルプロピオニトリル）（１，０ｇ）、イソプロパツール（２０ｄ）およ び濃硫酸（０，５ｇ）の溶液に、これも窒素を通した次の溶液を加えた：電気泳 動用のアクリルアミド（６４，８ｇ　、　０．９１モル）、Ｎ−（３−クロロア セタミドプロピル）メタクリルアミド（７，２ｇ　、　　０．０３３モル）、Ｍ ｉｌｌｉ　Ｑ水（６００ｄ）およびイソプロパツール（６０ｄ）　、連鎖移動剤 。これを窒素下で２時間かけて第一溶液に滴下した。添加が終了した後、得られ た溶液を６０°Ｃでさらに５時間持続し、次いで周囲温度で一夜静置した。次の 日、この溶液をロータリーエバポレーターで４０℃にて約５００ｄの容量まで濃 縮した。次にこの濃縮液を試薬用メタノール８２に加え、撹拌しながらコポリマ ーを沈殿させた。この沈殿を濾取し、さらに４！の試薬用メタノールで洗浄し、 次いで３０〜３５°Ｃにおける真空乾燥雑巾で窒素を抜きながら乾燥した。この ポリマーの固有粘度は、２５℃において水性１．０モル濃度ＮａＣ１のコポリマ ー０．２５％溶液測定したところ０．３５ｄｌ／ｇであった。Ｃ！の元素分析： フィーによる分子量分析はｕｎ　＝　１．５０１０’）でＭｔｓ　＝　９．４１ （１０’）を示した。

ｐＨ９，４においてこのポリマーの１２％溶液からキャストしたポリマー溶液は 、架橋剤（ジチオスレイトール−コポリマー１ｇ当たり４４．２ｍｇ）の添加後 、４分でゲル化し始めた（分離ゲル）。

この例および以下の例では、アクリルアミド／Ｎ〜（３〜クロロアセタミドプロ ピル）メタクリルアミドコポリマー類の平均分子量は、（ａ）分画は４種のＴＳ Ｋ−ＧＥＬ（Ｔ　Ｗ型）　６０００　。

５０００　、３０００および２０００オングストローム限界濾過カラム（Ａｌｔ ｅｘＳｃｉｅｎｔｆｆｔｃ＋　１７８０　Ｆｏｕｒｔｈ　Ｓｔ、、Ｂｅｒｋｅｌ ｅｙ、　ＣＡ　９４７１０）で行い、（ｂ）！離は水中５　（ｖ／ｖ）％エチレ ングリコールの０．０５モル濃度ＮａｔＳｏａであって、（ｃ）検量標準は５ｈ ｏｄｅｘ　５ＴＡＮＤＡＲＤＰ−８２ポリサンカライドの８５３，３８０　．１ ８６　．１００　．４８．０゜２３．７　、１２．２および５．８　ＫＤａ（Ｓ ｈｏｗａ　Ｄｅｎｋｏ　Ｋ、に、、２８０Ｐａｒｋ　Ａｖｅ、。

２７ｔｈ　Ｆｌｏｏｒ　Ｗｅｓｔ　Ｂｕｉｌｄｉｎｇ、　Ｎｅｈ　Ｙｏｒｋ、　 ＮＹ　１００１７）であって０．１（ｗ／ｖ）％の濃度で使用し、（ｄ）流速は １．５ｍ／分であって、そして（ｅ）カラム溶離液中の溶質は屈折率測定をする 水性ゲル濾過クロマトグラフィー系を使用して評価した。

団−」Ｌ二 約４０分でゲルを形成するのに適する架橋性部位を有する高分子量コポリマーの 調製。

窒素により発泡さすことにより溶解した酸素を排除した脱イオン水中（ＮＨａ） 　ｚｓｔｏｓ　（０，７５ｇ　）およびＮａ）ＩｓＯｓ　（０，０３７５ｇ　） の５０“Ｃ溶液に、窒素雰囲気下で次の溶液を２時間かけて滴下した：脱イオン 水（３００ｄ）中電気泳動用アクリルアミド（６４，８ｇ　、　０．９１モル） 、Ｎ−（３−クロロアセタミドプロピル）メタクリルアミド（７，２ｇ　、　　 ０．０３３モル）およびＮａＨ３Ｏ１（０，２２５ｇ　）。モノマー含有溶液の 添加が終了した後、得られた溶液をさらに１時間５０゛Ｃに保持した。次に、撹 拌しながら脱イオン水２５０１１Ｉｉ以上を加えた。前記溶液を試薬用メタノー ル８２に加えることによってコポリマーを沈殿した。この沈殿を濾取し、洗浄し 次いで乾燥した（３０〜３５℃における乾燥器）、出発組成に基づく収率は１０ ０％であって、水性１．０モル濃度ＮａＣ１中コポリマーの０．２５％溶液の固 有粘度は１．１３ｄ／ｇであって、この値は非常に高分子量のコポリマーを指示 する。Ｃｌ分析：理論量、１．５５％、実験値、１．４０％。架橋剤（コポリマ ー１ｇ当たり４４．２■）としてジチオスレイトールを用いｐＨ７，８でこのコ ポリマーの４％溶液からゲルをキャストした場合、架橋剤添加後４０分でゲル化 が起った。

釧−エ工 ａ）非常に低いポリマー含量のゲル用高分子量コポリマーの合成 高純度水４０ｏＩｄ中に溶解した過硫酸アンモニウム１．５ｇの窒素を通気した 溶液を最初に含有する５０°Ｃに維持した反応器中に、（ｉ）（予め窒素を通気 した）電気泳動用アクリルアミド２５９．２ｇ、　Ｎ　−（３−クロロアセタミ ドプロピル）メタクリルアミド２８．８ｇおよび高純度水１２００ｄ溶液、なら びに（ｉｉ）亜硫酸水素ナトリウム０．５２５　ｇおよび高純度水１０ｄのもう 一つの（窒素を通気した）溶液をポンプ注入した。溶液（ｉ）および（ｉｉ　） は、反応器に４１分かけて加え、併わせた溶液を５０°Ｃに４時間保持し、その 後反応混合物を室温に冷却した。

さらに、使用前に、追加の高純度水５００ｄをこの溶液に添加し、十分混合して 高分子量ポリマー１２．５〜１３（Ｗ／Ｖ）％含む溶液を得た。

ｂ）ＤＮＡ電気泳動用ゲルの調製。

非常に低い濃度（２，５（ｗ／ｖ）％〕のポリマーゲルを形成する目的で、例７ ａ由来の最終溶液１．８８ｄ、濃厚緩衝液〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノ メタン（ヒドロキシメチルアミノメタン）０．２モル、ホウ酸０．０２２モル、 エチレンジアミン四酢酸０．００２モルおよび十分高純度水で溶液１００ｄに調 製〕０゜５威、高純度水７．５９ｍ、水溶液中エチジウムブロマイド５ｍ（溶液 １ｄ当たり色素１■）および水溶液中ジチオスレイトール２６．５＃　（０，５ ｇ　／ｄ　）をよく混合し、コポリマー溶液を含めるために端をテープ止めした 浅い、プラスチックトレイに流し込んだ。流し込んだ直後、複数の歯を付けたプ ラスチックウェル形成器をゲルの平面に垂直で電気泳動の方向に垂直にゲル中へ 挿入した。どのアセンブリーを３時間被われた（水の蒸発を阻止するように）コ ンテナー中に静置し、その後ゲルを前記濃厚緩衝液の２０倍希釈で調製した緩衝 液で覆った。次に、プラスチックレーン形成器を慎重に取り去り、次いでトレイ （トレイの各端からテープも取り去った）を水平電気泳動セル中に挿入し、それ に対して希釈した緩衝液を加え、ゲル表面が緩衝液表面下１ｍａ＋となるように した。次に、未変性ＤＮＡフラグメント（二本ｔｊ（ＤＮＡ）をウェル中に装填 した。１００Ｖ　（電位傾度１０■／Ω）で７３分間の電気泳動は、１２３から 少なくとも１４３４までの塩基対試料の良好な分離と分解能を提供した。

貫−主± ａ）非常に低いポリマー含量のゲル用高分子量コポリマーのスケールアップ合成 。

連続的に窒素を通気してきた、脱イオン（高純度）水２５、０００　ｇ中に溶解 した過硫酸アンモニウム６０．６４　ｇ溶液を最初に含ませた２０ガロン容量の 反応器を、５０“Ｃに温度調整しそして１１２〜１２０ｒｐｏ＋で撹拌し、次の 溶液をポンプ流加した。

（ｉ）脱イオン水４０４．３　ｇ中に亜硫酸水素ナトリウム２１．２２ｇを溶解 した溶液、０時に開始し７６分後に終了、（ｉｉ　）窒素を通気し窒素雰囲気下 に保持する脱イオン水３４，９５３ｇ中にアクリルアミド１０，４７９ｇおよび Ｎ−（３−クロロアセトアミドプロピル）メタクリルアミド１．１６４ｇを溶解 した溶液、１分の時に開始し７４分後に終了。溶液（ｉ）および（ｉｉ　）は反 応に加えられる前は周囲温度（約２５°Ｃ）に置かれるが、十分温度調整がされ た反応器への添加で５０°Ｃまで迅速に加温した。

これらの溶液が加えられると反応器溶液の粘度が上昇し、高分子量のポリマーの 形成を示す。２３５分後、２５°Ｃで撹拌しながら脱イオン水約１５．０００　 ｇ以上を反応器に加え、反応器を冷却した。高純度水の最終コポリマー溶液は、 １４．３　（Ｗ／Ｗ）％であり、この溶液の既知小量を例８ｂで調製するゲルの 貯蔵液とした。このコポリマーそれ自体の０２含量のアッセイは理論値１．５５ ％に対し１．４４％（重量基ｆＪ）であることが見られ、Ｎ−（３−クロロアセ タミドプロピル）メタクリルアミドがアクリルアミドに冨んだ鎖中によく組み込 まれていることを示す。

この特定のアクリルアミド／Ｎ−（３−クロロアセタミドプロピル）メタクリル アミドコポリマーの平均分子量は、水性ゲル濾過クロマトグラフィー系であって 、（ａ）分画をＢｉｏ　Ｇｅｌ　ＴＳＸ６０−ＸＬ　、　ＴＳＫ５０−ＸＬ　、 　ＴＳＫ３０−ＸＬおよび５ＥＣ２０−ＸＬカラム（Ｂｉｏ　Ｒａｄ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅｓ、　２２０　Ｍａｐｌｅ　Ａｖｅ、、　ＲｏｃｋｖｉｌｌｅＣ ｅｎｔｒｅ、　ＮＹ　１１５７１）で行い、（ｂ）溶離液が水中エチレングリ： ７−／Ｉ１５　（ｖ／ｖ）％の０．０５Ｍ　ＮａｚＳＯａであり、ＣＣ＞検量標 準は９５０ＫＤａから１．０６ＫＤａまで低下する既知の分子量を有するポリ（ エチレンオキシド）試料（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ＰｏｌｙｍｅｒＰｒｏｄｕｃ ｔｓ、　６２６５　Ｄｅａｎ　Ｐａｒｋｗａｙ、　０ｎｔａｒｉｏ＋　ＮＹ　１ ４５１９）であり、（ｄ）流速は１．０ｍ／分であり、そして（ｅ）溶出液中の 溶質の検出は屈折率の測定を行う系を用い、数平均分子量（Ｕｎ＝８．４７（１ ０’）　）および重量平均分子量（Ｔｗ　−２０，２（１０’）　）と概算され た。

ｂ）ＤＮＡ電気泳動用ゲルの調製。

前記例７ｂに記載した化合物および工程によって、３　（Ｗ／Ｖ）％電気泳動ゲ ルを調製し、未変性ＤＮＡフラグメントの分離に使用した。塩基対７２〜２，６ ７４の全範囲において優れた分離と分解能が達成された。

国際調査報告 国際調査報告

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．次の構造 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔上式中、Ｌはアルキレン、アリーレン、二価のヘテロ原子、式▲数式、化学式 、表等があります▼（ここで、Ｚは核炭素およびヘテロ原子を５〜７個有する二 価の複索環式基である）またはこれらの２つ以上の組み合わさった基であり、 −Ａ−は１つ以上の重合されたアクリルアミドモノマーから誘導される反復単位 を表わし、Ｒ１は水素またはメチルであり、Ｒ２′はハロアセタミド基であり、 −Ｂ−はいずれか他の重合されたビニルモノマーから誘導される反復単位を表わ し、そしてＸ，ｙおよびＺは前記反復単位の重量％を表わしており、ｘが約５０ 〜９０重量％であり、ｙが約１〜５０重量％であり、そしてｚが約０〜４５重量 ％である〕を有することを特徴とする水溶性コポリマー。
2. ２．前記しが、基−（Ｒ３）ｎ−（ＣＯＸＲ４）ｍ−（ＮＨＣＯ）ｎ−で示され 、ここでＲ３はアリーレンまたはアリーレン−Ｒ４−（Ｒ４は炭素原子１〜６個 のアルキレンである）であり、Ｘはー〇−またはーＮＨ−であり、そしてｋ，ｍ およびｎはそれぞれ０または１であって、ｍが１のときｋは０でありそしてｋが １のときｍは０であることを示す請求項１で特許請求したようなコポリマー。
3. ３．前記しがフェニレンまたはフェニレンメチレンである請求項１および２のい ずれかで特許請求したようなコポリマ。
4. ４．前記−Ａ−が、アクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドおよび２ −アクリルアミド−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、Ｎ−イ ソプロピルアクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシメチルアクリルアミド、Ｎ−（１， １−ジメチル−３−オキソ−ブチル）アクリルアミド、Ｎ−メチルメタクリルア ミド、２−アクリルアミド−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール 、メタクリルアミド、３−（３−ジメチルアミノプロピル）アクリルアミド、Ｎ ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−イソプ ロピルメタクリルアミドおよび３−（２−ジメチルアミノエチル）アクリルアミ ドの１種以上から誘導される反復単位を表わす請求項１〜３のいずれかで特許請 求したようなコポリマー。
5. ５．前記−Ａ−が、アクリルアミドから誘導される反復単位を表わす請求項１〜 ４のいずれかで特許請求したようなコポリマー。
6. ６．前記−Ｂ−が、スチレンもしくはスチレン誘導体、ジビニルモノマー、ジア クリルモノマーおよびジアクリルアミドモノマー１種以上から誘導される反復単 位を表わす請求項１〜５のいずれかで特許請求したようなコポリマー。
7. ７．前記−Ｂ−が、ジビニルベンゼン、エチレンジアクリレート、エチレンジメ タクリレートまたはＮ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミドから誘導される反復 単位を表わす請求項１〜６のいずれかで特許請求したようなコポリマー。
8. ８．Ｎ−（３−クロロアセタミドプロピル）メタクリルアミドから誘導される反 復単位を含んでなる請求項１〜７のいずれかで特許請求したようなコポリマー。
9. ９．フリーラジカルビニル付加機構を伴わないように選ばれた架橋剤との反応に よる架橋で大きな分子の電気泳動分離のための電気泳動媒質を調製するのに有用 であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかで特許請求したようなコポリマ ーであって、前記選ばれた架橋剤による架橋反応のための部位を含む小さな割合 のコモノマーから誘導されるものであり、さらにＭｎが５０，０００を超えそし てＭｗが１００，０００を超えるコポリマー。
10. １０．フリーラジカルビニル付加機構を伴わないように選ばれた架橋剤との反応 による架橋で大きな分子の電気泳動分離のための電気泳動媒質を調製するのに有 用であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかで特許請求したようなコポリ マーであって、そのコポリマーが前記選ばれた架橋剤による架橋反応のための部 位を含む小さな割合のコモノマーから誘導されるものであり、さらに、予備形成 されたコポリマーが、１）Ｍｗが化学量論量の１．２５〜１．５倍の前記選ばれ た架橋剤の添加が、その架橋剤の添加後４〜１０分以内に０．１５×１４×１４ ｃｍの型に前記媒質を流し込むことができない程その混合物の粘度を大きく上昇 させないのに十分小さく、そして２）Ｍｎが化学量論量の１．２５〜１．５倍の 前記選ばれた架橋剤の添加後約１０分経過してゲルを形成するのに満足できる架 橋密度を提供するのに十分大きく、流し込んだ後２時間以内にその型から取り出 し、そしてばらばらに裂けるかまたは脱落を伴わないで優しく取り扱うのに十分 な保全性を最終的なゲルが有する、 特性をさらに具備する前記コポリマー。
11. １１．少なくとも約７，０００の数平均分子量（Ｍｎ）を有し、そして約１００ ，０００未満の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する請求項１０で特許請求したよう なコポリマー。
12. １２．Ｍｗが、前記架橋剤の添加がその添加後６〜８分以内に型へ媒質を流し込 むことができなくなる程粘度を大きく上昇させないような値である請求項１０と １１のいずれかで特許請求したようなコポリマー。
13. １３．前記コポリマー１ｇ当たりに架橋性部位の当量数が０．４５（１０−４） 〜１４（１０−４）の範囲内にある請求項１〜１２のいずれかで特許請求したよ うなコポリマー。
14. １４．請求項１〜１３のいずれかで特許請求したようなコポリマーの水性溶液を 、フリーラジカルビニル付加機構を伴わない選ばれた架橋剤との反応で前記コポ リマー上の架橋性部位と反応しうる選ばれた架橋剤と混合することを含んでなる 現場における電気泳動ゲルの調製方法。
15. １５．架橋剤と架橋する前は、請求項１〜１３のいずれかで特許請求したような コポリマーである架橋されたポリマーを含むことを特徴とする電気泳動用要素。
16. １６．請求項１〜１３のいずれかで特許請求したようなコポリマーを含んでなり 、そしてこのコポリマーを請求項１４で特許請求した方法によって架橋されたゲ ルとして調製することを特徴とする電気泳動要素。
17. １７．架橋剤による架橋後に分離ゲルとして、請求項１０および１１のいずれか で特許請求したようなコポリマーの使用。
18. １８．架橋剤による架橋後に堆積ゲルとして、請求項９で特許請求したようなコ ポリマーの使用。
19. １９．分離ゲルおよび堆積ゲルを含んでなる電気泳動要素であって、その分離ゲ ルが請求項１０および１１のいずれかで特許請求したような第一コポリマーを含 んでなり、そして堆積ゲルが請求項９で特許請求したような第二コポリマーを含 んでなり、各コポリマーが請求項１４で特許請求した方法によって架橋されたゲ ルとして調製されたものであることを特徴とする要素。
20. ２０．分離ゲルが８〜１４（ｗ／ｖ）％の濃度で存在する第一コポリマーの水性 溶液を用いて調製され、そして堆積ゲルが１．６〜６（ｗ／ｖ）％の濃度で存在 する第二コポリマーの水性溶液を用いて調製される請求項１９で特許請求したよ うな要素。
21. ２１．請求項１〜１３のいずれかで特許請求したようなコポリマーまたは請求項 １〜１３のいずれかで特許請求したようなコポリマーの組み合わされたものを含 んでおり、そして前記コポリマー（類）と別のコンテナー中にフリーラジカルビ ニル付加機構を伴なわない反応によって前記コポリマーを架橋するための架橋剤 を含んでなることを特徴とする電気泳動用キット。
22. ２２．前記コポリマーが２つ以上の反応性アミノ基、反応性メルカプト基または 反応性フェノール系水酸基を有する化合物である架橋剤で架橋されている請求項 １４および１６〜２１のいずれかで特許請求したような発明。
23. ２３．前記架橋剤が、その主鎖として▲数式、化学式、表等があります▼基有す るビスメルカプタンである請求項１４および１６〜２２のいずれかで特許請求し たような発明。
24. ２４．前記架橋剤が、エチレンジアミン、１，３−プロパンジアミン、１，３− プロパンジチオール、ジチオエリスリトール、ジチオスレイトール、１，５−ペ ンタンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレ ンテトラミン、プロピレンジアミン、ジ（アミノメチル）エーテル、１，８−ジ アミノ−４−（アミノメチル）オクタン、キシリレンジアミン、ハイドロキノン 、ビスフェノールＡ、ビスフェノールスルホン、１，４−ブタンジスルフィン酸 、ベンゼンジスルフィン酸、チオエタノールアミン、ｐ−アミノチオフェノール またはブチレンジアミンである請求項１４および１６〜２２のいずれかで特許請 求したような発明。
25. ２５．前記架橋剤がジチオスレイトールまたはジチオエリスリトールである請求 項１４および１６〜２４のいずれかで特許請求したような発明。