JPH03505482A - 合成マトリックス及び得られる検定キャリブレーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 合成マトリックス及び得られる検定キャリブレータ−発明の背景 本発明は、免疫検定法又は臨床化学的手法に関するキャリブレータ−又は標準物 質の調製においてマトリックスとして使用するための無タンパク質ポリビニルピ ロリドン系調合物に関する。

ヒトの血清又は血漿のようなヒト或いは哺乳類の血液産生物が、インビトロ（ｉ ｎ　ｙｉＨｏ）キャリブレータ−又は対照標準用のマトリックスとして一般に受 は入れられ、広く使用されている。例えば、免疫検定法において用量−反応曲線 （標準曲線）を作成するために２乃至８種類の特定濃度の検体を含有するキャリ ブレータ−が使用されており、それによって対照標準並びに未知試料の応答シグ ナルが所定の検体の濃度又は質量単位として計算できる。その他の臨床化学的手 法における検定作業にも同様の対照標準又はキャリブレータ−が利用されている 。

理想的な検量用溶液もしくはマトリックスは、組成が完全に明らかでしかも未知 検体濃度以外は未知試料の組成と完全に一致するものである。ただし、正常及び 異常な生理的血液又は尿試料の組成が非常に変化に富んでいるため、かかるの条 件が実際に満足されるのは稀である。

二番目に優れた検量用溶液は典型的な試料の組成とほぼ一致するマトリックスで あり、例えばヒト血清試料検定用のプールした無検体ヒト血清から作製した同種 ヒト血清系キャリブレータ−等である。しかし、内在性検体の除去（「ストリッ ピング」）に用いられる技術の中には、往々にして脂質及び／又はタンパク質の 組成に大きな変化をもたらして試料とキャリブレータ−の間のずれを増大させる ものがある。一方、アフィニティークロマトグラフィーはマトリックスをさほど 変化させずに検体を選択的に除去する。しかしながら、アフィニティークロマト グラフィーは費用のかかる方法であって、著しく低い濃度で存在する内在性検体 の除去にのみ使用されるのが一般的である。

やや劣る別法は、異種動物由来の血清又はヒトもしくはウシ由来のアルブミン画 分を含有する適当な緩衝液中のキャリブレータ−マトリックスを使用することで ある。

ヒト及び動物の血液又は尿試料の分析用市販免疫検定キットに現在使用されてい るキャリブレータ−調合物は実質上すべてかかるタンパク質系マトリックス（米 国特許第４．３７９．８４１号に記載の如きゼラチン系マトリックスも含む）に 包含される。高価な「精製Ｊタンパク質画分から得られるマトリックスを含めて 、血液系又は尿系タンパク質マトリックスはその性質が不確定で均質性に欠ける ため、市販用キャリブレータ−の大量生産が開始できるようになるまでに、高価 で時間のかかるスクリーニング並びに起源の異なる幾つかのマトリックスの評価 を必要とすることが多々ある。タンパク質系キャリブレータ−のその他の欠点を 以下に列挙する：ａ、　ロフト毎の変化が大きいために大量生産が面倒となる； ｂ、　タンパク質もしくはタンパク質溶液固有の不安定性のため、冷蔵又は冷凍 温度での保存を必要とする；Ｃ１スクリーニング費用を最低限に押さえるために 大量かつ高価な在庫品を維持する必要がある；ｄ、　許容水準以上の内在性検体 がタンパク質マトリックスに混入している可能性があるために、実験室内での処 理或いはより高価な「ストリップト」タンパク質マトリックスの購入を余儀なく させる； Ｃ１肝炎ウィルス又はＨＩＶを含めた病原性又は非病原性微生物による汚染の可 能性、並びにそれらに関する試験の必要性； ｆ、　タンパク質マトリックスは優れた生育培地であり、無菌もしくは滅菌操作 及び／又は効果的な抗菌剤の使用を必要とする； ｇ、　現在の試験法の限界のため、許可されたロット中にウィルス又は感染性病 原体が存在する可能性；ｈ、　濃度が変化しやすく往々にして減少する内在性酵 素の存在、並びにそれらが検体の安定性と効力に及ぼす予測不可能な効果、； ｉ、　ヒト並びに動物の産生物、特に精製血液画分が比較的高価であること； ｊ、　供血者の減少化、高い供血者不適格率、血液全体の利用性の向上に起因す る旧来の血液単位及び不測の医療緊急性の減少化のため、ヒトの血液産生物の供 給が大きく不足する可能性があること。

キャリブレータ−マトリックスからタンパク質を完全に除去（即ち、緩衝液を使 用）するとこれらの問題の多くは解決するが、試料−キャリプレーター間のずれ が大きすぎて適用できるのは稀である。インビトロ検定用の臨床試薬の処方中の タンパク質をある種の合成又は高分子物質で置き換えることによってこれらの欠 点の幾つかを解決しようとする幾つかの試みが先行技術においてなされてきた。

マスト（Ｍ！ｓｌ）は、乾燥試薬試験片による血液又は血清中グルコースの酵素 分析用の、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコ ール、デキストラン等の合成高分子を含有する対照標準を調製した（米国特許第 ３．９２０．５８０号）。米国特許第４．５［１６，０１８号には、エトキシル 化ポリプロピレン濃縮物を含有する血液稀釈剤が提案されている。米国特許第３ ．８７６、３７５号では、診断分析における対照標準としての用途をもつ生物学 的組成物中にアルキレンポリオールを利用している。

米国特許第３．９３７．８２１号には、血漿代替物としてヒドロキシエチルデン プンが提案されているが、インビトロで使用するためだけのものである。同様に 、１９４０年代から血漿増補液としてポリビニルピロリドンがインビトロで盛ん に使用されている（ハンドブック・オブ・ウォーター−ソルブル・ガムズ・アン ド・レジンズ（（Ｈ■ｄｂｏｏｋｏｆ　Ｗａｔｅｒ−３ｏｌｕｂｌｅ　Ｇｕｍｓ 　ａｎｄ　Ｒｅ５ｉｎｓ）　Ｒ，Ｌ、Ｄ！ｖｉｄｓｏｎ。

ＭｃＧｒｘｖ−Ｈｉｌ１社、１９８０年）中のブレッチ＋　−（Ｂｌｅｃｈｅｒ 。

Ｌ、）他のポリビニルピロリドン、第２１章）。免疫検定又は臨床化学的プロト コル用の液体能タンパク質キャリブレータ−又は標準物質中にポリビニルピロリ ドンを使用することに関する公知の先行技術は全くない。

従って、本発明の目的は、臨床及び免疫検定実験室で一般に定量される既知量の 種々の検体を単独或いは組合わせて導入するのに適した最適キャリブレータ−マ トリックスを提供することである。本発明の別の目的は、血清又は血漿とその物 理的又は免疫学的特性のみならず検定条件下での反応においても匹敵する、組成 の明確な合成調合物を提供することである。本発明のまた別の目的は、室温又は 冷蔵温度で長期間安定なキャリブレータ−溶液を提供することである。

発明の概要 本発明は、検定用対照−率及びキャリブレータ−として有用な無タンパク質液体 マトリックスにして、水、緩衝剤及び約０．１重量％から１０重量％の間のポリ ビニルピロリドンを含んでなるマトリックスを供する。本発明はまた、本発明の マトリックスと検体を含んでなる免疫検定及び化学分析用対照標準又はキャリブ レータ−１並びに未知の生物活性天然物質の免疫検定又は化学分析におけるこの 対照標準又はキャリブレータ−の使用に関する。

図面の簡単な説明 第１図は、Ｔ、（トリョードチロニン）の酵素免疫測定法（エンザイムイムノア ッセイ、ＥＩＡと略す）において、本発明の３種類の合成血清調合物をアルブミ ン系マトリックスと比較した結果を示したものである。

第２図は、フエノバルビタール酵素免疫測定法において、本発明の合成マトリッ クスとアルブミン系マトリックスとを比較したものである。

発明の詳細な説明 本発明は、検定用対照標準及びキャリブレータ−の調製に有用な無タンパク質液 体マトリックスにして、水、緩衝剤及び約０．１重量％から１０重量％の間のポ リビニルピロリドンを含んでなるマトリックスを供する。

意外なことに、１種類もしくはそれ以上の既知濃度の検体を含有するある種の緩 衝液にポリビニルピロリドンを添加することによって種々の検体の分析に有効な キャリブレータ−溶液ができることが判明した。かかる溶液にポリビニルピロリ ドンを添加して無タンパク質キャリブレータ−を作ると、ヒト又は動物由来のマ トリックスをベースとしたキャリブレータ−溶液で観察される結果と同一もしく はそれに匹敵する結果が種々の検定において得られる。

本発明の調合物中においてポリビニルピロリドンがキャリブレータ−溶液を改良 するメカニズムは十分には解明されていないが、ポリビニルピロリドンが有益な 効果を発揮するのは、そのポリアミド構造、分子量、粘性並びに浸透圧のような 物理化学的パラメーター面でのタンパク質との類似性によるものであると考えら れる。ポリビニルピロリドンはまた、アルブミンやプレアルブミンと同様に、あ る種の親油性及び親水性分子と可逆的に結合するので、これらのタンパク質と同 様に検定インキュベーション前又はその間の防腐剤もしくは担体としても作用し 得る。免疫検定において、かかる結合能はインキュベーション時にキャリブレー タ−溶液並びに試料溶液中で起こる抗原−抗体反応速度の律速因子となるものと 思われる。免疫反応において確かな検定結果を得るために、かかる反応速度は、 インキュベーション期間の終了時にある共通の終点又はプラトーに到達するよう なものかさもなくばそうなるように調整しなければならない。酵素化学的工程に おいて、例えばコレステロール等との検体−ポリビニルピロリドン複合体は酵素 反応速度を調節することができる。

さらに、本発明の如くキャリブレータ−溶液中にポリビニルピロリドンを使用す ると、０℃乃至約６０℃、好ましくは２℃乃至約４５℃の温度範囲内でインキュ ベーションを行う際、キャリプレーター−反応曲線と試料−反応曲線とが最もよ く一致するようにかかる溶液の組成上及び／又は物理化学的なパラメーター（浸 透性及びｐＨ等）を最適化できることが意外にも判明した。換言すると、所定温 度並びに経験に基づいて決定された最適インキュベーション時間で行う酵素アッ セイ又は免疫検定に関しては、本発明のキャリブレータ−の組成及び／又は物理 的パラメーターを調節することによってキャリブレータ−と試料とが検体を同一 濃度で含有する場合のこれらの応答を一致させることが可能であった。本発明の キャリブレータ−のこの特性によって、（真の濃度もしくは絶対濃度ではなくて ）呼称濃度単位もしくは検定毎に特異的な濃度単位を割り当てる（かかる操作は 試料を検定した際の応答がキャリブレータ−を検定した際の応答とかなりずれて いる場合に臨床検定において随時利用されている）必要がなくなる。

本発明の好ましい具体的態様においては、上記キャリブレータ−溶液は、１種類 もしくはそれ以上の検体の他に、０．１乃至１０％、好ましくは０．１乃至５％ のポリビニルピロリドンを含む。キャリブレータ−中のポリビニルピロリドンは 約１００００乃至約８００００ダルトン、好ましくは約４００００ダルトンの高 分子量を有するもので、好ましくは医薬品銘柄のものでもある。その代わりに又 はそれに加えて、ポリビニルピロリドンをさらに予備精製するのが往々にして有 利であって、特にポリビニルピロリドンが工業銘柄であったり古いものであった り外観が黄色い時は、ペルオキシド、ハイドロペルオキシド、エポキシド、アル デヒド及びケトンのような反応性官能基、或いは残留重合触媒（キャリブレータ −溶液中の検体の官能性又は安定性に悪影響を及ぼす恐れがある）を還元するた めに、貴金属触媒と水素ガス、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素カリウム 等のような適当な還元剤を用いることによって予備精製する。

溶液（７）ｐＨを５．０乃至１０．０．好ましくは７．０乃至９．５の範囲に調 節するためにキャリブレータ−溶液中に通常の緩衝剤を加えるのが有利であるこ とが判明した。好ましい緩衝剤には、リン酸塩、ホウ酸塩、トリス（ヒドロキシ メチル）アミノメタン（ＴＲＩ　Ｓ）　、グツドの緩衝剤（Ｎ、Ｊ−ビス（２− ヒドロキシエチル）グリシン等）、酢酸又はフタル酸の塩等の緩衝剤が含まれる 。ｐＨ及び浸透圧調整をもたらすだけでなく、ががる緩衝剤は、請求の範囲に記 載のｐＨ範囲内における適当なｐＨ変化によってキャリブレータ−の応答の調節 を可能にする。現在までのところ、最も好ましい緩衝剤はヒドロキシエチルピペ ラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯ ＰＳ）、又はＭＯＰＳＯである。

同様に、必須ではないが、キヤ“リプレーター溶液中にハロゲン類、リン酸又は 硫酸のアルカリ金属塩のような通常の塩を配合するのも有利である。好ましい塩 には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム等が含まれる。これらの 塩はキャリブレータ−溶液の浸透圧を調節して、キャリブレータ−溶液を血清又 は尿マトリックスの作用により類似したものにする。約０乃至３％の塩、好まし くは約０．１乃至２．０％の塩、並びに約１００乃至１１１１ａｍｃ＋ｓ／ｋｇ の浸透度で満足できるキャリブレータ−溶液が得られる。

本発明のキャリブレータ−溶液中に防腐剤を配合して該溶液中での微生物の増殖 を防ぐようにすることも有利である。かかる防腐剤は、かかる特性を有しかつ検 定に干渉しないことが知られている多数の物質の中から選択する。かかる機能を 有する組成物の代表的なものは、アジ化ナトリウム、チメロサール、サイアリッ ト（ＣｉｓｌＮ。

登録商標）、オフチリノン即ち２−オクチル−４−イソチアゾリン−３−オン（ ローム・アンド・ハース　（ｆｉｌｖ　＆ＨＩｘｓ）社からケイトン（Ｋｉｔｈ ｏｎ、登録商標）という商標名で販売されている）、安息香酸、ヘキサクロロフ ェン、ソルビン酸、第４アンモニウム化合物、ｐ−クロロートキシレノール及び ゲンタマイシンなどである。防腐剤は、防腐開側々の許容レベルに対応する量、 例えば０．００１乃至１．０で配合する。さらに、血清又は尿の色を模倣するた めの赤、橙又は黄色の色素のような、特定の色又は物理的外観を得るための補助 剤をキャリブレータ−溶液に配合してもよい。

２種類の代表的な検体、即ちＴ３とフェノバルビタールに関する第１図及び第２ 図並びに表１及び表２に示した結果は、本発明の合成マトリックスが従前の公知 タンパク質（ウシアルブミン）系マトリックスと実際上同一の挙動を呈すること を示している。各側のすべてのマトリックスに対して標準曲線のパラメーターは 類似しており、対照標準の値も同様によく一致している。

例えばジギトニン、Ｔ４、ゲンタマイシン、ＴＳＨ。

コレステロールを用いて、本発明の合成マトリックスから調製したその他のキャ リブレータ−も良好に挙動する。

正常及び異常な代謝産物、電解質、ビタミン、ステロイド、治療薬、濫用性薬剤 、ペプチド、ポリペプチド、ポリペプチドホルモン、タンパク質、糖タンパク質 、酵素、ポリヌクレオチド、多糖類、産業毒性物質等を包含した種々の化学又は 生物学的存在の適当な免疫検定法又は臨床化学的手法による分析において、これ らのキャリブレータ−の範囲並びに適用性に関してははっきりとした制限はない 。

本発明の新規なキャリブレータ−マトリックス並びにその調製法及び用途を、本 発明の特定の具体的態様を開示した以下の例で説明する。これらの例は、本発明 の理解を助けるために提示したものであって、請求の範囲に開示した発明を限定 するものではなく、またそのように解するべきではない。

諷、２．０％ポリビニルピロリドン−〇、　０５Ｍ　ＨＥＰＥＳ：８００ｍ１の 水に、２０．０ｇのポリビニルピロリドン（４０に１医薬品銘柄）、１１．９Ｈ のＨＥＰＥＳ及び６．０ｇの塩化ナトリウムを加えた。稀釈水酸化ナトリウムで この溶液のｐＨを７．３土（１，１に調節した。ａ、Ｈ２ｇのメチルレッド及び ０．００５ｇのタルドラジンを加えた後、この溶液を水で１、Ｏｌに稀釈しかつ ｐＨを７．４±０．０５に調節した。浸透度は３００　ｍｏｓ／ｋｇであった。

ｂ、　　Ｔ、キャリブレータ−の調製：正確に調製したＴ、保存溶液の適当量を Ｔ、投与濃度が０．０．５．２．０．４．　ＯＢ／ｍｌとなるように以下の溶液 に加えて４つのＴ、キャリブレータ−を調合した。

１、　　１．０％ウシ血清マトリックス２、　例１ａのマトリックス＋［０（１ ３％ゲンタマイシン ３、　例１ａのマトリックス＋０．０２％チメロサール４、　例１ａのマトリッ クス＋　０．００１％ケイトン（登録商標） ｃ、　　Ｔ、ＥＩＡ結果： ４組のＴ、キャリブレータ−を典型的なＴ、酵素免疫測定法（Ｅ　Ｉ　Ａ）のフ ォーマットで比較した。その結果を表１に示し、標準曲線を第１図に示す。

例　　２ 暑、２．０％ポリビニルピロリドン−０，０５Ｍ　ＭＯＰＳＯ：適当な容器の中 の水２００　ｍｌに、２０．０ｇのポリビニルピロリドン（４０Ｋ、市販銘柄） 及びｐＨ１１，０〜１１．５に調節するに足る稀釈水酸化ナトリウムを加えた。

水素化ホウ素ナトリウム（０，２１１ｇ）を添加して、混合物を３０分間撹拌し た。稀塩酸でｐＨ３，０〜４．０の範囲に注意深く酸性化した後、溶液を３０分 間撹拌した。ＭＯＰＳＯ（１１，３ｇ）及び５，５ｇの塩化ナトリウムを添加し 、稀釈水酸化ナトリウムでｐＨを７，３±１１．１に調節した。水で１．０１に 稀釈した後、ケイトン（１，５％溶液を１．０ｍ１）を加え、ｐｎを７．４±０ ．０５に再調節した。この溶液をカートリッジフィルター（０゜４５ｐｍ）を通 して濾過した。浸透度は２８５　ｍａｔ／ｋｇであった。

ｂ、　フエノバルビタール牛ヤリプレーターの調製：フェノバルビタール保存溶 液の適当量をフェノバルビタール投与濃度が０．５．２５．５Ｑ　Ｂ／ｍｌとな るように以下の溶液に加えて４つのフエノバルビタールキャリプレーターを調製 した。

１、　　１．０％ウシ血清マトリックス２、　例２ａのマトリックス＋　０．０ ０１％ケイトン（登録商標） Ｃ９フエノバルビタールＥＩＡ結果： ２組のキャリブレータ−を市販のフェノバルビタールＥＩＡで比較した。その結 果を表２に示し、標準曲線を第２図に示す。

例　　３ ｇ、　　１．０％ポリビニルピロリドン−０，０５Ｍ　ＨＥＰＥＳ：８００ｍ１ の水に、３．５５ｇのリン酸二ナトナウム（無水）　、ｌＯ，Ｏｇのポリビニル ピロリドン（４０Ｋ、医薬品銘柄）及び６．５ｇの塩化ナトリウムを加えた。混 合物のｐｉを稀塩酸で７．２２±０．１に調節した。硫酸ゲンタマイシン（０， ０２ｇ）及びのタルドラジン（０，００２ｇ）を加えた後、この溶液を水で１． ０１に稀釈しかつｐｉｆを７．２±０．０５に再調節した。浸透度は３１０　ｍ ａｓ／ｋｇであった。

ｂ、　例３ａのマトリックスは合成尿代替物として有用ｓ、　　１．５％ポリビ ニルピロリドン−〇、　０５Ｍ　ＨＥＰＥＳ：８００　ｍｌの水に、１５．０　 ｇのポリビニルピロリドン（４０に１医薬品銘柄）、＋１．９．のＨＥＰＥＳ及 び６．５ｇの塩化ナトリウムを加えた。ｐＨを稀釈水酸化ナトリウムで７．２± ０．０５に調節した後、溶液を水で１．　Ｏｆに稀釈した。

硫酸ゲンタマイシン（０，０２ｇ）を防腐剤として加えた。

浸透度は３１１５　ｍｅ客／ｋｇであった。

ｂ、　コレステロールキャリブレータ−の調製：水溶性コレステロール（ポリオ キシエチレンコレステロールセバシン酸塩、シグマ　（Ｓｉｇｍｓ）社、カタロ グ番号＃　Ｃ−１１４５）の保存溶液を調製して、その既知量をコレステロール 濃度が１８５及び２４５■７ｄｌ　となるように例４ａのマトリックスに加えた 。これらのキャリブレータ−は市販コレステロール検定において有用であった。

ｆ置皿ｎ 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　検定用対照標準及びキャリブレーターの調製に有用な、水、緩衝剤及び約０ ．１重量％乃至１０重量％のポリビニルピロリドンを含んでなる無タンパク質液 体マトリックス。 ２　請求項１記載のマトリックスにして、ポリビニルピロリドンの量が約０．１ 重量％乃至約５重量％であるマトリックス。 ３　請求項２記載のマトリックスにして、ポリビニルピロリドンの量が約２重量 ％であるマトリックス。 ４　請求項１記載のマトリックスにして、ポリビニルピロリドンが約１００００ 乃至約８００００ダルトンの範囲の分子量を有するマトリックス。 ５　請求項４記載のマトリックスにして、ポリビニルピロリドンが約４００００ ダルトンの範囲の分子量を有するマトリックス。 ６　請求項６記載のマトリックスにして、前記緩衝剤がリン酸のアルカリ金属塩 又はこれらの混合物、酢酸の塩、ホウ酸の塩又はフタル酸の塩であるマトリック ス。 ７　請求項６記載のマトリックスにして、前記緩衝剤がマトリックスのｐＨが約 ５．０乃至約１０．０となるような量で存在するマトリックス。 ８　請求項７記載のマトリックスにして、前記緩衝剤がヒドロキシエチルピペラ ジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰ Ｓ）又はＭＯＰＳＯであって、マトリックスのｐＨが約７．０乃至約８．０の範 囲内にあるマトリックス。 ９　請求項７記載のマトリックスにして、前記緩衝剤がリン酸塩であって、マト リックスのｐＨが約６．５乃至約８．０の範囲内にあるマトリックス。 １０　請求項７記載のマトリックスにして、前記緩衝剤がホウ酸塩であって、マ トリックスのｐＨが約８．０乃至約１０．０の範囲内にあるマトリックス。 １１　請求項１記載のマトリックスにして、さらにハロゲン、リン酸又は硫酸の アルカリ金属塩を含んでなるマトリックス。 １２　請求項１１記載のマトリックスにして、前記アルカリ金属塩が塩化ナトリ ウム又は塩化カリウムであるマトリックス。 １３　請求項１記載のマトリックスにして、さらに防腐剤を含んでなるマトリッ クス。 １４　請求項１３記載のマトリックスにして、前記防腐剤が安息香酸、安息香酸 ナトリウム、ジクロロフェン、ヘキサクロロフェン、第４アンモニウム化合物、 ソルビン酸、リン酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル、アジ化ナトリウム、 チメロサール、ゲンタマイシン、オクチリノン（登録商標ケイトン）及びｐ−ク ロロ−ｍ−キシレノールから成る群から選択したものであるマトリックス。 １５　請求項１４記載のマトリックスにして、前記防腐剤がオクチリノン（登録 商標ケイトン）であるマトリックス。 １６　請求項１記載のマトリックスにして、特定の色又は物理的外観を得るため の補助剤をさらに含んでなるマトリックス。 １７　請求項１６記載のマトリックスにして、前記補助剤が赤、橙又は黄色の色 素であるマトリックス。