JPH03503772A - ヌクレオシドのリン脂質性グリコシル誘導体及び医薬としてのその適用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヌクレ　シトの１ン　　　　１コシル・　　　び　・とし１匹主座］」 本発明は特に抗レトロウイルス特性を有するヌクレオシド（より具体的にはチミ ジン及びウリジン）のリン脂質性グリコジル誘導体に係る。

周知のように、ヌクレオシドの誘導体は旧Ｖ−１及び旧Ｖ−２のようなレトロウ ィルスにより誘発される感染の予防及び治療に有効であることが判明した。

特に有利な生成物の１種は、３°−アジドチミジン（＾ＺＴ）により構成される 。ピリミジン塩基の他の有効な誘導体は、２°、３゛−ジデオキシチミジン（ｄ ｄＴ）及び２°−デオキシ−５−フルオロウリジン（ｄＵＦ）により構成される 。

本願と同一出願人名義の１９８８年５月３１日付は仏国特許出願第８８１０７２ ５２号、発明の名称「レトロウィルスに対する活性を有するチミジン誘導体のグ ルコシルホスホトリエステル（Ｇｌｕｃｏｓｙｒ　ｐｈｏｓｐｈｏｔｒｉｅｓｔ ｅｒｓ　ｄｅ　ｄｅｒｉｖ＆ｓ　ｄｅ　ｔｈｙｍｉｄｉｎｅａｙａｎｔ　ｕｎｅ 　ａｃｔｉｖｉｔｌ　ｅｏｎｔｒｅ　Ｉｅｓ　ｒＩ！ｔｒｏｖｉｒｕｓ）」には 、特にレトロウィルスに対する活性を有するチミジンの誘導体のグルコシル化ホ スホジエステル及びホスホトリエステルが記載されている。

これらの研究を更に進めた結果、グルコース以外の糖単位（特にマンノース単位 ）を有するピリミジン塩基の他の誘導体が特に有利な医薬特性を有することが判 明した。

これらの誘導体は実際に特に、細胞又はウィルス膜を透過することが可能な親油 性輸送体、ヌクレオチド（即ちヌクレオシドの生物学的に活性な部分）のプロド ラッグ類、及びマクロファージに優先的に向けられるベクターを構成する。

したがって、本発明の目的は、特に抗レトロウイルス特性を有するチミジン及び ウリジンから誘導されるホスホジエステル及びホスホトリエステルを提供するこ とである。

本発明の別の目的はこれらの誘導体の製造方法を提供することである。

本発明の更に別の目的は、これらの誘導体を有効成分として含有する医薬を提供 することである。

本発明の誘導体は、式Ｉ： （式中、Ｒ１は基： （式中、ｏｓｅはＣ，スはＣ６のＤ又はＬ−糖単位を表し、但しＸが１に等しい グルコースの場合を除いて、ホスホリル置換鎖は該鎖が結合される単糖単位の１ 位又は６位に固定され、×は１〜１２の数であり、 ｙは１〜４の数であり、 ２はＯ又はｌであり、 ＾は水素原子、又は場合により置換基を有する炭素原子数５〜３０の飽和もしく は不飽和炭化水素基であるａｌｅ基を表す）を表し、 Ｒ３はＮ、基、水素原子、炭素原子数１〜４のアルキル基、ハロゲン原子、ニト リル基又はヒドロキシル基を表し、８□は炭素原子数１〜４のアルキル基、ハロ ゲン原子又はニトリル基を表す）に対応するグリコジル化誘導体であることを特 徴とする。

上記式中、単糖単位はＣ，又はＣ，のＤ又はＬ−糖から選択される糖である。

ヘキソースの具体例としてはマンノース、ガラクトース、フルクトース、フコー ス、アミノヘキソース及び２−デオキシグルコースを挙げることができ、ペント ースの具体例としてはアラビノース、キシロース、リボース及び２−デオキシリ ボースを挙げることができる。

マンノシル化誘導体が特に好適である。該誘導体は膜透過性輸送品質に加えて、 Ｄ−マンノース分子に対するレセプターを有するマクロファージにヌクレオシド を優先的に向かわせることができる。

しｌ〜ロウイルスは好ましくはこれらのマクロファージに固定されここで複製さ れるので、標的のベクターを構成する誘導体なマクロファージに配置することが 重要である。

生物学的に活性な分子のこのような選択的配向により、実際にこれらの誘導体の 二次効果又は他の型の細胞に対する毒性を減少することができる。

本発明の１誘導体群において、Ｘは２〜１２の数であり、このときこれらの誘導 体は、糖単位３〜１２の二糖又はオリゴ糖鎖により置換され、これらの単位は同 −又は異なる。

本発明の他の誘導体群は単一の単糖単位を含む。

マンノースにより置換される誘導体が特に好適である。

特に有利なホスホトリエステルのマンノシル化誘導体は、マンノース単位の６位 をホスホリル化され、式■：（式中、ａｌｅ、　Ｒ，及びＲ２は上記と同義であ る）に対応する。

ホスホトリエステルの他の好適群はマンノース単位の１位をホスホリル化された 誘導体から形成され、式■：（式中、Ｒ１、Ｒ２、ｙ及びａｌｃは上記と同義で ある）に対応する。

式■及び■中、ａｌｃ基は有利には炭素原子数５〜２０のアルキル又はアルコキ シ鎖を表す、この鎖は場合により−ＮＨ２、−Ｎ）ＩＲ’又は−ＮＣＲ’、Ｒ” ）基により末端を置換され、ここでＲ゛及びＲ”は同−又は異なり、炭素原子数 １〜４のアルキル基を表す。

同様に本発明の範囲に含まれる上記ホスホトリエステルの前駆物質であるホスホ ジエステルは、有利には式■：（式中、Ｒ，及びＲ２は上記と同義であり、Ｒ４ は基：（式中、ｏｓｅ、　Ｘ、　’１及びＺは式Ｉに定義した意味を有する）を 表す）に対応する。

好適なヌクレオシドのホスホジエステルは６位を置換されたマンノース単位を含 み、より具体的には式Ｖ：（式中、Ｒ１及びＲ２は上記と同義である）に対応す る。

他の好適なヌクレオシドのホスホジエステルは１位をホスホリル化されたマンノ ースの誘導体であり、式■：（式中、Ｒ１、Ｒ２及びｙは上記と同義である）に 対応する。

上記式１〜■に対応する特に有利な誘導体は３′−アジドチミジン（＾ＺＴ）、 ２’　、３’−ジデオキシチミジン（ｄｄＴ）又！ｉ　２’　−デオキシ−５− フルオロウリジン（ｄＵＦ）である。

本発明の式Ｉの誘導体は式■： （式中、ホスホリル化置換鎖は該鎖が固定された単糖単位の１位又は６位を占め 、１個もしくは複数の単糖単位の他のヒドロキシル基はヒドロキシル基の保護基 により保護され、これらの基は同−又は異なり、 ｘ、ｙ及び２は上記と同義である）のグリコシド誘導体を、式■： （式中、Ｒ３及びＲ２は上記と同義である）のヌクレオシド誘導体と縮合させ、 単糖単位が保護された式■：のホスホジエステルを生成する段階と、ホスホジエ ステルの１個もしくは複数の単糖単位から保護基を脱離させて−ＯＨ基を遊離さ せる段階と、ホスホトリエステルを生成したい場合には、その後、ホスホジエス テルを式Ｘ　：　Ｂ−ａｌｅ（式中、Ｂはリンに結合した一ＯＨ基と反応し得る 基を示す）の反応性誘導体と反応させ、ａｌｅ基をＰ原子に結合させ且つ化合物 ８Ｂを形成させ、化合物をＢ）Ｉを除去し、八がａｌｅ基な表すような上記式Ｉ のホスホトリエステルを形成・する段階とを実施することにより得られる。

誘導体■及び■の縮合段階は有利には、有機溶媒中で室温よりも高い温度で実施 される。

適当な溶媒はピリジン及びアセトニトリルを含む。

ピリジンを反応溶媒として使用する場合、６０〜８０°Ｃ１特に約７０℃の温度 で操作することにより所望の結合が得られる０反応は窒素又はアルゴンのような 不活性ガス雰囲気下で実施される。

式■のヌクレオシドに対して過剰量の式■の誘導体を使用すると有利である。１ ．５〜２倍モル量を使用すると、満足な条件で結合を実施することができる。

縮合反応を助長するためには、トリクロロアセトニトリルのようなアクチベータ 化合物を加える（Ｃｒａ＋ｍｅｒ　Ｆ、及びＷｅｉ＋５ａｎｎ　Ｇ、　（１９６ １）　Ｃｈｅ＋１１．　Ｂｅｒ、　９４９９６−１００７）。

使用されるホスホモノエステルはピリジニウム、モルホリン、テトラエチルアン モニウムの塩形悪である。

保護基はアルキル鎖の固定以前に脱離される。

本発明分実施するために適当な基としては、アシル（特にアセチル）基、ベンゾ イル基、又は種々に置換されたこれらの基を挙げることができる。

これらの基の脱離は、ホスホジエステル■又はＸの構造及びその置換基を変更し ないような条件下で操作することにより、慣用有機化学技術にしたがって実施さ れる。

アシル基は例えばナトリウム、Ｎｌ（、／Ｃ）１．ＣＨＩ混金物又はナトリウム メチレートの溶液を用いて脱離される。

ａｌｅ基の固定段階には、反応性誘導体Ｂ−ａｌｅ（式中、Ｂは有利にはハロゲ ン化物（特に臭化物又はヨウ化物）、トシレート又はスルホニウム塩である）を 使用する。

反応は有利には室温より高い温度（特に５０〜１００℃）で有機溶媒中で実施さ れる。使用可能な有機溶媒としては、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド及 びニトロメタンを挙げることができる。

反応性誘導体Ｂ−ａｌｅは、好ましくは高反応性の塩の形態でホスホジエステル に対して少なくとも約１０倍モル量の割合で使用される。

他の合成方法によると、単糖単位が６位又は１位をシアノエチルホスフェート基 により置換され、式ＸＩ：０−ＣＨ，−ＣＨ，−ＣＮ （式中、×、ｙ及び２は式Ｉに定義した意味を有する）に対応し、有利には塩形 態であるグリコシド誘導体を、上記式■のヌクレオシド誘導体と反応させ、その 後、ヒドロキシル官能基の保護基を脱離させる。

結合反応は、有利には有機溶媒中で好ましくはＴＰＳＮＴの存在下に室温で実施 される。

弐■の誘導体は有利には、合成すべき誘導体に導入することが所望される単糖又 はオリゴ糖を反応性基形態のシアンエチルホスフェートと反応させることにより 得られる。

本発明の生成物の抗レトロウイルス特性は、より具体的にはレトロウィルスの細 胞変性効果及びこれらのレトロウィルスの複製に対する抑制作用をｉｎ　ｖｉｔ ｒｏで調査することにより立証された。

最も有利な態様によると、これらの抑制作用はヒトＴリンパ球に非毒性の用量で 得られ、したがって本発明の誘導体を抗レトロウイルス組成物の製造に使用する ことができる。

したがって、本発明は医薬上許容可能な賦形剤と組み合わせて式■の少なくとも １種の誘導体の有効量を含有することを特徴とする医薬組成物にも係る。

本発明は特に、マンノシル化誘導体から製造される医薬組成物に係る。

これらの組成物はＡＩＤＳ及び関連疾患の治療に特に有用である。

これらの組成物は経口、経鼻腔、局所、経直腸、経膣、皮下、静脈内、筋肉内又 は皮内投与に適した形態をとる。

経口投与可能な組成物はタブレット、錠剤、顆粒、水性又は非水性媒体中の溶液 又は懸濁液を含む、経直腸投与としては半開、経膣投与としてはクリーム又はム ースを使用する。

非経口投与に使用される調製物は有利には無菌又は非水性溶液又は懸濁液により 形成される。

本発明を説明するために、以下、チミジン誘導体の調製例及びこれらの誘導体の 活性を示す薬理試験の結果について報告する。

火］１烈」−二式二。

Ｘ　　　　−ζへ　　−シル　　六　　゛　　れる＾ＺＴの；　　　　の　　告 Ｄ−マンノース−６−ホスフェートから以下の５段階からなる合成を実施した。

１、Ｄ−マンノース−６−ホスフェートの−ＯＨ基の保護２、保護された誘導体 と３′−アジドチミジンとの縮合３、マンノース要素（ｍｏｔｉｆ）の−ＯＨ基 の脱保護４、ピリジニウム塩のテトラブチルアンモニウム塩への置換、及び ５、ホスフェート要素の遊ｗｉ−ＯＨ基へのへキサデシル鎖の固定によるホスホ トリエステルの生成 これらの段階を以下の如〈実施した。

１：Ｄ−マンノース−６−ホスフェート１の一〇Ｈの　ラ　び１２３４−−トー ー０−アセ　ルＤ−マンノースー６−ホスフエ二上 ２のビｌジニウム　の　告 Ｄ−マンノース−６−ホスフェート（１）のナトリウム塩１ｇ（３，２９ｍｍｏ ｌ）及び４ＩＩＩ！の無水ピリジン中で蒸留した無水酢酸（４２，３＋＊ｍｏｌ ）３．６ｍｌを１６時間室温で撹拌した。白色沈澱物が形成された。薄層クロマ トグラフィー（ＴＬＣ）で反応を検査した（ＣＨ２ＣＩ□：ＣＨ：ＩＯＨ：８２ ０６０／３５１５．出発時Ｒｆ：０；アセチル化生成物Ｒｆ：０．５３）。

沈澱物を濾過し、−逸物を冷却した。約３０ｍ１の氷をゆっくり加えて、過剰無 水物を加水分解した。加水分解を３０分間継続し、次いで混合物を真空下で蒸発 乾固し、その後トルエンで数度共蒸発＜ｃｏａｖａｐｏｒｅ）させて、総ての痕 跡ピリジンを除去した。次いで水により回収し、水性相をジクロロメタンで数置 洗浄した。次いで、水性相の容量を低減させた後、あらかじめピリジニウム形態 に置換したＤｏｗｅｘ　５０ＷＸＢ　Ｈ″ＰＰ樹脂ラムに水性相を通した。

カラムからの溶出物をＴＬＣにより検査して、凍結乾燥した：　ｍ：１．２０３ ｇ　；　Ｒｄｔ４３％。

２：１２３４−テトーー〇−アセ　ル６−マンノシルー５′−（３°−アジド） 　ミジニルホスフェート（３のピリジニウム塩の縮１１グ１１ （ＣａＨ＝、次いでパラトルエンスルホン酸クロライド（ｃｈｌｏｒｕｒｅ　ｐ ａｒａ−ｔｏｌｕａｎｅ　５ｕｌｆｏｎｉｑｕｅ）で蒸留した）無水ピリジンで 、１００ｍｇ（０，３７５ｍｍ＋ｏｌ）の３°−アジドチミジン（４）及びピリ ジニウム形態の３３０＋＊ｇ（０，３７５ｘ１．５ｍｍｏｌ）の１．２，３．４ −テトラー○−アセチルー６−Ｄ−マンノースホスフェート（≦）を３度共蒸発 サセタ、　約１０ｗｒ１ノ無水ヒ！Ｊ　シン）ニー、１．２７５ｍ１（０，３７ ５ｘ３４過剰）のトリクロロアセトニトリルとを加えた。翌日まで窒素雰囲気下 でよく撹拌しながら７０”Ｃに加熱した０反応ヲＴＬＣ４：　ヨ’）　［Ｅ　Ｌ 　、”：　（ＣＨ２Ｃ＋２　：ＣＰ３０Ｈ：Ｈ，０１３１５／１）、真空下で蒸 発乾固し、次いで混合物を最小限のジクロロメタンにより回収し、石油エーテル により沈澱させた。溶媒をデカンテーションし、メタノールを徐々に増したジク ロロメタンで溶離したシリカ７７３４Ｍｅｒｃｋ’カラムによるクロマトグラフ ィーで沈澱物を処理した。化合物を６％メタノール混合物により溶離した：　ｍ ・２０２ｎ＋ｇ；Ｒｄｔニア１％、Ｒｆ＝０．６２（ＣＨ２Ｃ１，二Ｃ）！、Ｏ Ｈ：Ｈ，０１３１５／１）。

３、マンノースの一〇Ｈの　　二６−Ｄ−マンノシル−５゜（３′−アジド　　 ミジニルホスフェート　５のと１ジニウム甘α１１ アセチル基を除去するために、２０２ｍｇの（旦）を含む１％ナトリウムメチレ ートをメタノール中で１ｍ分間室温で反応させた６僅かな混濁が生じた。反応が 完全であることをＴＬＣにより検査した。

Ｄｏｗｅｘ　５０　ＷＸ８　Ｈ″′′樹脂えて中和した。ｐＨ＝７で樹脂と沈澱 物とを一過して、メタノール相を蒸発乾固した。

Ｘ　　　　最小限の水により回収し、水で溶離したＢｉｏｇｅｌ　Ｐ２”　２０ ０／４００メツシユのカラムに通した。

カラム出口を２５４ｎｍのＵ、Ｖ、で検出した。　ＴＬＣによる検査後に探求す べき化合物を含んでいる両分を凍結乾燥させ、その後水で溶離したＣ１８８カラ ムに再度通したニー・７８．５ｍｇ；Ｒｄｔ＝５０％；Ｒｔ＝０．５４４（イ’ ／　７”　ｏ　ハ／−ル：ＮＨ，ＯＨ：８２０；７／１／２）　。

４：ビ１ジニウム　の−トープ　ル　ンモニウム　６Ｃ７７６２６への 濃縮テトラブチルアンモニウムヒドロキシド中でｔＭ　ＩＩＷ　ヲ撹拌し、洗浄 水のｐＨが中性になるまで洗浄することにより、あらかじめテトラブチルアンモ ニウムの形態に平衡化しなりｏｗｅｘ　５０〆χ８　ＩＩ”樹脂カラムを製造し た。

先に得られた７８．５ｍｇの生成物（臣）を水で溶離したこのカラムに通した。

２５４ｎ−で吸収する両分を回収し、凍結乾燥させた：　ｍ＝９８ｍｇ；Ｒｄｔ ＝９８％；Ｒｆ＝不変；ＦＡＢ−ｍ−’質量＝５０８（Ｎ（Ｂｕ）”−なし）； ＨＰＬＣ保持時間１０．４８９分（２／２５）　。

５：ヘ　　−シル　の　　　　６−Ｄ−マンノシル−５゛−ヘーシル３′−アジ ド　−　ミジニルホスフェート７即二阻■力医設置 テトラブチルアンモニウム形態のジエステル＜６）７０ｏ＋ｇ（０，０９３ｍｍ ｏｌ）と、１−ヨードヘキサデカン（８）０．５２８ｍ１（０，０９３ｘ１８ｍ ｇ＋ｏｌ）とを、無水アセトニトリルにより真空下で共蒸発させた０次いで、約 １Ｏｎ＋１の無水アセトニトリルを加えて、１６〜２０時間撹拌しながら８０℃ に加熱した。反応をＴＬＣにより検査し、反応混合物を蒸発乾固した。そこで、 この反応混合物をシリカＭｅｒｅｋ　７７３４’カラムに沈着させた。

過剰ヘキサデカンを除去するためにまず純粋ジクロロメタンで溶離し、次いで溶 離液をメタノールを徐々に増した。

ホスホトリエステルを含む両分を６％メタノール溶離液で溶離して、蒸発乾固さ せると、以下の結果が得られた。

ｎ＋＝３８ｍｇ；Ｒｄｔ；５６％、Ｒｆ＝０．６７４（インプロパツール：Ｎ［ Ｉ４０Ｈ：ｌＩ２０７／１／２）＝０．７１（Ｃ１１２ＣＩ２：Ｃｌ（、ＯＨ： Ｉ２０１３１５／１；質量：ＦＡＢ”″・７３４（１１）；ＨＰＬＣ保持時間： ２１．８７分（５／９５−９５）　：ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）　：ＣＨ。

鎖（０，８７）、（ＣＨ２）　　（１，２５）、ＣＨ２−Ｃ１，−０Ｐ（１，６ ３）、ＣＩ（２−叶２−ＯＰ＜４．０１）；ｃｒ−マン／−スＨ１（４，９０） 、Ｈｚ（３，５８＞、Ｆｌｓ（３，５７）、ｆｌ−（３，４５）　、Ｈ，、（３ ７２）　、Ｈ，（４，２３＞　、Ｈ，’　（４，０９）　；ヌクレオチドＨ６（ ７，５１及び７．４９４１１５９）　、ＣＦＩ３（１，８２）　；［（、、＜６ ．１４）　、Ｈ２’　（２，４４＞　。

Ｈ２”（２，３６）　、Ｉ（３’　（４，４６）　、Ｈ，’　（４，０２）　、 Ｈ６’　５°“（４，２０＞。

Ｋ進に氏二 Ｘ　″　ｆ−’−−れ ｃｌｄＴの　　　　　　゛ 実施例１に記載の如く処理した０段Ｉｖ２については、５゜麟ｇ（０，２２１ｍ ｍｏ１）のｄｄＴ（９）及び１９５ｍｇ＜０．２２１ｘ１．５ｍ−ｏｌ）のアセ ＋　）’ｖ　化６−　！Ｊ　７酸？　’／　／　−ス（２）　ヲ０．７５ｍ１（ ０，２２１ｘ３４ｍｍｏｌ）（７）トリクロロアセトニトリルを含む無水ピリジ ンにより処理した。クロマトグラフィーでの処理後に保護された１１１＋ｇのホ スホジエステル（１０）　：　Ｒｄｔ＝７０％；Ｒｆ＝０．６３（ＣＨ２Ｃ１２ ：Ｃ）ｌｓＯＨ：Ｈｚ０１３１５／１）が得られた。

前述した如く段階３を実施した。

１１１ｍｇ（７）生成物（括）をＢｉｏｇｅｌ　Ｐ２”　２００／４００）（ッ シｓ及びＣ１ｌ”のカラムに通した後に、脱保護された４８ｍｇのホスポジエス テルｍ）：Ｒｄｔ＝５７’Ｘ　；Ｒｆ＝０．５（イ’／　７ｏハ／−ル：ＮＨ＜ ＯＨ：ＬＯ７／１／２）が得られた。

４８ｎｇのホスホジエステル（１１）から段１ｌＳｔ４を実施して、テトラブチ ルアンモニウム塩の形態のホスホジエステル（■）（生成物ＣＴ　７３８９）６ ２ａｇが得られた：　Ｒｄｔ＝９９％、Ｒｆ＝不変、ＦＡＢ−質量＝４６８（Ｍ −１）　；ＨＰＬＣ保持時間：１０．６５９（０／２５）。

５５ｍｇ　（０，０７５ｎｍｏ　ｌ　）のホスホジエステル（１２）及び０．４ ４ｍＮ（０，０７７５ｘ１８）の１−ヨードヘキサデカン（旦）に段階５の手順 を適用した。クロマトグラフィーによる処理後に、１７ｍｇの６−Ｄ−マンノシ ル−５°−ヘキサデシル−２°、３°−ジデオキシチミジニルホスフェー）（１ ３）（生成物ＣＴ　７３９０）：Ｒｄｔ＝３２％、Ｒｆ＝０．６３１（イソプロ パツール：ＮＨ４ＯＨ：ＨＪ　７／１／２）、Ｒｆ＝０．８２（Ｃ）１ｚＣｌｚ ：Ｃ）ＩｓＯＨ：Ｉ（ｔｏ　１３１５／１）；ＦＡＢ”　ｔ＊”質量＝６９３　 ；ＨＰＬＣ保持時間：１２．９３３（５０／９５）が得られた。

夾ｆｉｌｌ上ヌ」− Ｘ番　　　　　″′″′ｔパ　　　・　　　・ｄｌＪＦの畳　　　の詐゛告 ＾ＺＴ又はｄｄＴの誘導体の製造で使用したのと同一の処理方法を適用しな。

２５０ｍｇの２′−デオキシ−５−フルオロウリジン（１、Ｏ１５ｍｍｏ　ｌ　 ）（１４）及び３．５５ｓｆｆｉ（１，０１５ｘ３４過剰）のトリクロロアセト ニトリルを含む無水ピリジンにより処理した８９２ｍｇ（１，０１５ｘ１．５ｍ ｍｏ１）の１．２，３．４−テトラ−０−アセチル６−Ｄ−マンノースホスフェ ート（３）から段階２を実施した。クロマトグラフィーによる処理後に、５４０ １の保護されたホスホジエステル（じ）　：Ｒｄｔ＝７２％；Ｒｆ＝０．４４（ ＣＨ２Ｃ１２：ＣＨ，ＯＨ：Ｉ２０１３１５／１）が得られた。

段階３では、５４０１のホスホジエステル（１５）をＢｉｏｇｅｌ’及びＣＨ８ のカラムに通した後に、脱保護された２００■のホスホジエステル（匹）　：Ｒ ｄｔ＝４８％、Ｒｆ＝０．５４４（インプロパツール：ＮＨ，ＯＨ：）１２０７ ／１／２）が得られた。

段階４では、２００ｍｇの前記ホスホジエステル（Ｌ２）からテトラブチルアン モニウム塩の形態のホスホジエステル（Ｌ７）（生成物ＣＴ　７０８８）２３８ ｍｇが得られた：　Ｒｄｔ＝９２％、Ｒｆ＝不変；ＦＡＢ−質量＝７２９（ｍｌ ）；ＨＰＬＣ保持時間、ピーク２本：２．０７７分、２．３８６分（５／２５） 。

段階５では、２１８Ｂ（０，２９８ｍｍｏｌ）のジエステル（１７）及び１．６ ８９ａｉ’（０，２９８ｘ１８ｍｍｏｌ）の１−ヨードヘキサデカン〈鞄を使用 した。　６３．４ｍｇのホスホトリエステル（１８）、即ちＣＴ　７３２５が得 られり：Ｒｄｔ：３０％　；Ｒｆ：０．６２８　（イＶ　７　ロバ／　−ル：Ｎ Ｈ４０１１：Ｉ２０７／１／２）＝０．８４（ＣＨ，ＣＩ２：ＣＨ，ＯＨ：Ｈ， ０１３１５／１）；ＦＡＢ”質量・７３５（ｍ　＋　Ｎｕ”）；ＨＰＬＣ保持時 間＝１２．８２９（５０／９５）　、ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ、）　：ＣＬ鎖（０ ，８５）　、（ＣＨ２）。（１，２４＞　、ＣＩ（、−ＣＩ、−０Ｐ（１，５８ ）　、ＣＨ２−ＣＨ２−０Ｐ（３，９９）　、α−マンノースｌＩ、　（４，９ ０＞　、Ｈ，（３，５７）　、Ｈ，（３，５３）、Ｈｌ（３，４１）、Ｈｌ（３ ，７１）　、Ｈ！（４，０６）、ＦＩＧ、（４，１４）　；ヌクレオチドＨ。

（７，８８及び７．８５４５１５５）、Ｉ（、、（６，１５）、８２’　、ｚ” （２，１４）、　Ｌ’（４，２４）　、）＋４’　（３，９５）　、Ｉｓ’　、 ｓ”　（４，１９）　−衷１」「Ｌニヌ」− Ｘ番　　　　１”　　　、ｆ−’　　でｌ　　・　　れ＾ＺＴの・　　　の　１ ゛告 炭素アノマーと除いて−ＯＨ基が保護されているＤ−マンノースの誘導体、即ち ｌ−ブロモー２．３，４．６−チトラーＯ−ベンゾイルーα〜Ｄ−マンノース（ 堕）から、以下の段階からなる合成を実施した。

ａ）ベンジルオキシエチル鎖の１位への固定ｂ）１位に固定された鎖のベンジル 基の除去Ｃ）シアンエチルホスフェート鎖の固定ｄ）＾ＺＴと縮合 ｅ）ベンゾイル基及びシアノエチル基の除去ｆ）テトラブチルアンモニウム塩へ の置換ｇ）ヘキサデシル鎖の固定によるホスホトリエステルの生成 ａ）ベンジル　　シエ　ル　の１１への　　　　１−２−ペンジルオ　シエ　ル ー２３４６−−）ラーＯ−ベン゛イルーＤマンノース２０の　告 １００＋＊１のフラスコにおいて、０．７ｍ１（５ｎ＋ｎｏｌ）の２ベンジルオ キシエタノール（２Ｘ）に、１５ｍ１の無水ニトロメタンと１５ｍ１の無水トル エンとを加えて反応混合物を製造した。　２．２８２ｇ（５Ｘ１．２６６Ｍ１１ ０１）の臭化第二水銀ＨｇＢｒ２及び１．６ｇ（５ｘ１．２６６ｍ１＋ｏｌ）の シアン化第二水銀ＨｇｃＮ２並びに５ｇのモレキュラーシーブ４＾を加えた。密 閉状態で１時間撹拌した。次いで、３．２９５ｇ（５ｍｍｏ　Ｉ　）の１−ブロ モ−２，３，４，６−チトラー○−ベンゾイル−ａ−Ｄ−マンノース（す）を加 えた。完全に反応するまで窒素下で１時間撹拌した。　ＴＬＣにより検査すると 、以下の結果が得られた（酢酸エチル：ヘキサン１／２：出発時Ｒｆ・０．３８ ．所望の生成物Ｒｆ：０．２８）。

沈澱物を濾過し、−逸物をトルエンで希釈した。次いで、有機相を氷水及び冷飽 和重炭酸ナトリウムで洗浄し、それから再度氷水で洗浄した。硫酸ナトリウムで の乾燥・濾過後に有機相を蒸発乾固した。

ヘキサン／１０％酢酸エチル混合物で平衡化したシリカＭｅｒｃｋ　７７３４’ カラムによるクロマトグラフィーで得られた油を処理した。次いで、徐々に酢酸 エチルを増した。探求すべき生成物を３０％酢酸エチル混合物で溶離した。淡黄 色油形態の生成物（２０）　：ｍ・３．０７９ｇ；Ｒｄｔ・８０％、Ｒｆ＝０． ２８（酢酸エチル：ヘキサン１／２）が得られた。

ｂ）１１　のベンジル　の、　　び１−２−ヒドロ　シェル＞２３．４６−−　 トラー〇−ベンゾイルーＤ−マンノース（２２の先に得られた油（創）を６０ｍ Ｎの無水エタノールに溶解し、１０％炭素を含む５０ｎ＋Ｈのパラジウムの存在 下で水素化した。

１時間後に几Ｃによる最初の検査を実施した（ＡｃＯＥｔ二ヘキサン２／１；出 発時Ｒｆ：０．６５；所望の生成物Ｒｆ：０．４４＞　Ａｃ：ＣＨｓＣＯ−及び Ｅｔ＝ＣＨｉＣＨ２−６必要に応じて、２５輸ｇのＰｄ／Ｃｔ加えて更にもう少 し放置した０反応がほぼ終了すると、ＣＮ１ｔｅ’で濾過して、乾燥酢酸エチル で速やかに濯いだ。濾過物を蒸発させて、ヘキサン／１０％酢酸エチル混合物で 平衡化したシリカ７７３４Ｍｅｒｃｋ’カラムでのクロマトグラフィーにより得 られた油を処理した。徐々に酢酸エチルで［ｉした。化合物を３０％酢酸エチル 混合物で溶離し、ＴＬＣにより検査した。

小薄片形状の探求すべき生成物（■）：ｍ・２．１３５ｇ；Ｒｄｔ・７９％がま ずシアンエチルホスフェートのバリウム塩をピリジニウム塩に置換した。このた めに、２．６８のバリウム塩（８，０４３ｍｍｏ　ｌ　）を１５ｍ１の水に加え て、よく撹拌した。塩が完全に溶解するまでＤｏｗｅｘ　５０　ＨＸ８　Ｈ”樹 脂を加えた。更に１時間撹拌し、次いで混合物をＤｏｕ＋ｅｘ　５０　ＷＸ８　 Ｈ−カラムに通して、ピリジン中で直接生成物を回収した。水で溶離し、溶離液 のｐＨが酸性である限り捕集を継続した。

次いで蒸発乾固し、得られた油をピリジンで３度共蒸発させた。

この時点で２．０５３ｇ（３，１７９１ｍｏｌ）の！（■）を加えて、新たに３ 度無水ピリジンで共蒸発させた。最後に、約４０ｍ１の無水ピリジンと２０ｒａ ｌの蒸留トリクロロアセトニトリルとを加えた。窒素化し、混合物を約１４時間 撹拌しながら７０℃に加熱した。オレンジ色の溶液が得られ、これをＴＬＣによ り検査すると、以下の結果が得られた。

Ｒｆ＝Ｏ（＾ｃＯＥｔ　：ヘキサン２／１）　；Ｒｆ＝０．７２（ＣＨ２Ｃｌ　 □：ＣＨｓＯＨ：Ｈ２Ｏ１３１５／１）。

混合物を蒸発乾固し、最小限のジクロロメタンで回収し、石油エタノールで沈澱 させた。ヘキサン：酢酸エチル１／１の混合物で平衡化し、純粋酢酸エチルが得 られるまで徐々に増したシリカ７７３４Ｍｅｒｃｋ’カラムで生成物を精製した 。

蒸発させた後に、白色粉末状の探求すべき生成物（４）：Ｉ・１．８０９ｇ　； Ｒｃｌｔ・６７％が得られた。

ｄ）＾ｚＴ４との　Δ　び１−Ｉ）　　シー２３４６−−トーー０−ベン゛イル Ｄ−マンノシル５°−３′−アジド　　ミジニルホスフェート（２４の１゛告 １００ｍｇ＜０．３７５ｍｍｏ１）の３゛−アジドチミジン及び５４０ｍｇ（０ ，３７５ｘ１．７ｍｍｏｌ）のベンゾイル化マンノース（翻）を、無水ピリジン で３度共蒸発させた６次いで、約１０ｍ１の無水ピリジンと、２８５ｍｇ（０， ３７５ｘ２ｍｍｏｌ）の２．４．６−　）リイソブロピルベンゼンスルホニル− ３−ニトロ−１，２，４−）リアゾール（ＴＰＳＮＴ）とを加えた。室温で十分 に密閉状態にして、１時間後にＴＬＣにより検査した。出発時の物質が残ってい る場合には、ＴＰＳＮＴを加えて、再度放置して、ＴＬＣにより検査した。次い で、ジクロロメタンで希釈した。飽和重炭酸ナトリウム及び水で洗浄し、次いで ＴａＢナトリウムで乾燥させた後に有機相を蒸発乾固した。最小限のジクロロメ タンにより回収し、石油エーテルで沈澱させた。ジクロロメタンで平衡化し、純 粋ＣＨ２Ｃｈで溶離したシリカ７７３４Ｍｅｒｃｋ’カラムによるクロマトグラ フィーで得られたゴムを処理した。次いで、生成物を１％メタノニルを含むＣ） Ｉ２Ｃ１２混合物で溶離した。

ベージュ色の粉末状のホスホジエステル（■）：ｍ・１９８ｍｇ　；Ｒｃｌｔ＝ ５２％；Ｒｆ＝０．４０（ＣＨ２ＣＩ□１０％ＣＨ，ＯＲ＞が得られた。

先に得られた１９８ｍｇ＜０．１９４Ｉ＊ｍｏ１）の（２４）を、２０ｍ１の１ ％ナトリウムメチレートを含むメタノールに溶解した。

１０分間撹拌し、もはや出発時の物質がないことをＴＬＣにより検査した。Ｄｏ ｗｅｘ　５０　ＷＸ８　Ｂ”により中和し、濾過して、蒸発乾固した。得られた 生成物をエチルエーテルで削り落とし、得られたベンゾエートを除去した。残留 物を水に溶解し、水で溶離したＣ１８”カラムに通した０画分を２５４ｎ＋ｍで 検出し、ＴＬＣにより検査した。凍結乾燥させた後に、白色粉末状の脱保護され たホスホジエステル（什）ニー・７８ｍｇ　；Ｒｄｔ＝７３％；Ｒｆ＝０．５２ ９（インプロパツール：ＮＨ，０１（：Ｈ，０７／１／２）が得られた。

ｆ）−−ブ　ル　ンモニ　ム２６　　　　　ＣＴ　７６２４へのロ チトラブチルアンモニウム形態に置換したＤｏｗｅｘ　５０　Ｈχ８Ｈ″樹脂カ ラムを製造した。

Ｈ，０で溶離して、このカラムに７８ｍｇのホスホジエステル（廷）を通した。

　２５４ｎ−で吸収する両分を回収し、凍結乾燥した：　ｍ・１００ｍｇ；Ｒｄ １８９％、Ｒｆ＝不変、ＦＡＢ−質量＝５５２（ｍ−１）；ＨＰＬＣ保持時間＝ ８．４７５分（５／２５）。

ｇ）ホス１、１エスール２７１−エ　　シーＤ−マンノシルへ　　−シル５′− ３′−ジ′　　ミジニルホスフェー別二遷μ状Δ翌１ ７０＋ｗｇ（０，０８８ｍａｏｌ）のホスホジエステル（廷）及び０　、４９８ ＋＊ｆの１−ヨードヘキサデカン（８）　（０，０８８ｘ１８ｍｍｏｌ）を無水 アセトニトリルで共蒸発させた８次いで、１０ｍ１の無水アセトニトリルを加え て、１６〜２０時間撹拌しながら８０℃に加熱した。そこで、もはや出発時の物 質がないことをＴＬＣにより検査しな、混合物を蒸発乾固し、シリカ７７３４Ｍ ｅｒｃｋ’″カラムに通した。カラムを純粋ジクロロメタンで溶離して、過剰ヨ ードヘキサデカンを除去した０次いで、メタノールで徐々に濃縮した。探求すべ き化合物を６％メタノール混合物で溶離した。白色粉末状の物質が得られた：ｍ ：４７ｍｇ　；Ｒｄｔ・６９％、Ｒｆ＝０．８９２（イソプロパツール：ＮＨ， ＯＨ：Ｈ２０）／１／２）　；ＦＡＢ−質量＝７７６（ｍ−１）；ＨＰＬＣビー ク２本の保持時間・１４．０９１分、１４．５分（５０／９５）；ＮＭＲ（ＤＭ Ｓ（ｌｄ６）　：ＣＨ３鎖（０，８５）　、（ＣＩＩ２）、（１，２５＞　、Ｃ ）１２−ＣＨ２−ＯＰ＜１．５９）　、Ｃ１１ｍ−ＣＨ２−０Ｆ（４，００）　 ；α−マンノース）Ｉ、　（４，６９）　、ｌ］２（３，６３）　＋８３　（３ ，４８）　、）１．　（３，３５）　、Ｈ６（３，４２）　、Ｈ，、、＋　（３ ，５０）　；ヌクレオチドＨ＠（７，４６）　、ＣＩ＋３（１，８０）　、Ｈ， 、（６，１３＞　、Ｈ２’　、２”（２，４０）　、Ｈａ’（４，４６）　、Ｈ ，（４，０２）　、ｔ（ｓ’　＋Ｓ”（４，１９）　：ＣＨ２−ＣＨ２−０Ｐ（ ３，５９及び３．７９）ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＰ（４，１８）。

罠ｍ二衣二 ・　　れ　ｄｄＴの萱　　　の１゛告 実施例４に記載の如く処理した。

１００■のｄｄＴ（９）　（０，４４２ｍｍｏ１）及び３３６ＨのＴＰＳＮＴ（ ０，４４２ｘ２ｍｎｏ　Ｉ　）の専在下で無水ピリジン中で縮合される６００ｎ ｇ（０，４４２ｘ１．５９過剰）のホスフェート（競）から縮合段階ｄ）を実施 した。シリカカラムでの精製後に、２４５ｍＦＩの保護されたホスホジエステル （廷）　；Ｒｄｔ＝５８％；Ｒｆ＝０．４３７（Ｃ）１２ｃｌ□：ＣＨ，ＯＨ： Ｈ，０１３１５／１）が得られた。

２５ｍ１の１％ナトリウムメチレートで処理した２４５Ｂの（覗）から脱ベンゾ イル化及び脱シアノエチル化の段Ｐａ　ｅ　）を実施した。精製後に、ピリジニ ウム塩の形態の９８　ａｇのホスホジエステル（銭）　：　Ｒｄｔ＝７０％、Ｒ ｆ＝０．６０５＜インプロパノール二ＮＨ４０）１：８２０７／１／２）が得ら れた。

段Ｐａ　ｆ　）では、ピリジニウム塩分テトラブチルアンモニウム塩に置換した 。テトラブチルアンモニウム塩の形態のホスホジエステル（３１）ＣＴ　７６２ ２が１１３ｍｇ得られた：　Ｒｄｔ＝８６％、Ｒｆ＝不変、ＦＡＢ−質量＝５１ １（ｍ−１）：ＨＰＬＣ保持時間＝５．３４８分（５／２５）　。

段Ｎ　ｇ　）に従って０．６３３ｒＡ１（０，１１ｘ１８ｎｕｓｏｌ）の１−ヨ ードヘキサデカン（船を含む乾燥アセトニトリルにより８３翰８（０，１１ｍｍ ｏｌ）のジエステル（３ｉ）を処理して、ホスホトリエステル（ジわが得られた 。カラムに通した後に、５４ＢのホスホトリエステルＣＴ　７６２３が得られた ：　Ｒｄｔ＝６７％、Ｒｆ＝０．６９＜イソプロパツール：Ｎ）１．ＯＨ：Ｈ２ ０７／１／２）＝０．７８（ＣＨ，Ｃ１，：ＣＨ，ＯＨ：Ｈ２Ｏ１３１５／１） ；ＦＡＢ’質量□７５９．４（ｍ＋Ｎａ’）；ＨＰＬＣビーク２本の保持時間＝ １３．５９７分、１４．０２８分（５０／９５）　。

栗１」Ｌ［１試ヨー て゛、されるｃｌＵＦのｉ　　の郡Ｐ告実施例４に記載の如く処理した。

１００ｍｇの２′−デオキシ−５−フルオロウリジン（尾）（０，４０６ｍｍｏ １）及び３０９ｍｇのＴＰＳＮＴ（０，４０６ｘ　２１１１＋ｌ０１）の存在下 において無水ピリジン中で縮合される５８８ｍｇ（０，４０６ｘ　１７過剰）の ホスフェート（翻）から縮合段階を実施した。クロマトグラフィーによる処理の 後に、ピリジニウム塩の形態の保護された１４１Ｂのホスホジエステル（挫）　 ：　Ｒｄｔ＝３５％；Ｒｆ・０．４６（ＣＨ２ＣＩ２：ＣＨ，０）１：ｌＴ２Ｏ １３１５／１）が得られた。

脱ベンゾイル化及び脱シアノエチル化は実施例４に記載したように段階ｅ）に従 って、１４１１Ｉ１ｇの（針）から実施した。

１％ナトリウムメチレート１５ｍ１で処理して、ピリジニウム塩の形態の脱保護 された５３Ｂのホスホジエステル（３４）　：Ｒｄｔ＝７１％、Ｒｆ＝０．５２ （イソプロパツール：ＮＨ４ＯＨ：ｔ１２０７／１／２）が得られた。

段階ｆ）に従ってテトラブチルアンモニウム塩に置換すると、６７■の生成物（ 亜）ＣＴ　７３８７　：　Ｒｄｔ＝８７％、Ｒｆ＝不変、ＦＡＢ−質量＝５３１ （ｍ４）；ＨＰＬＣ保持時間＝１０．５７４（０／２５）が得られた。

５５ｍｇ（０，０６７＋ｅ＋ａｏｌ）のジエステル（３Ａ）を含むアセトニトリ ルを０．３８ｍ１’（０，０６７ｘ　１８１ｏｌ）の１−ヨードヘキサデカン（ 旦）で慣用的に処理すると、ホスホトリエステル（陳）が得られた：　ｍ＝３５ ．３Ｂ　ＣＴ　７３８８；Ｒｄｔ＝６９．５％；Ｒｆ＝０．６６（イソプロパツ ール：ＮＨ４ＯＨ：［１２０７／１／２）；Ｒｆ＝０．７７（Ｃ１１２Ｃ１，： Ｃ）１．０）１：１１２０１３１５／１）、ＦＡＢ’質量＝７７９．８（＋ｓ＋ 　Ｎａ”）；ＨＰＬＣピーク２本の保持時間＝１０．４１４分、１０．８３４分 ＜５０／９５）　；ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ、）；Ｃ１，鎖（０，８９）　。

（ＣＨ２）Ｉ、（１，２５）、ＣＨ２−ＣＨ２−０Ｐ　１．６０．ＣＨ２−ＣＨ ２−０Ｐ（３，９５）；α−マンノースＨ１（４，６７）　、Ｉ２（３，６４＞ 　、Ｉ３　（３，４６）　、Ｈ−（３，３２）　、Ｈｓ　、Ｈｓ　、　−’（３ ，４５）、ヌクレオチドＨａ（７，９０及び７．８８４５１５５）、Ｈ，’　（ ６，１７）　。

Ｉ２“、２゛（２，１５）　、Ｈｉ’　（４，２４＞　、Ｈ，’　（３，９４） 　、Ｈ６’　５”　（４，００）　；ＣＨ２−ＣＨ２−０Ｐ（３，６１及び３． ７７）　、ＣＨ２−叶、−０Ｐ（４，１１）。

（以下余白） 夾１」１ム ・　　　　の　　ＨＩＶ　　　　の； 以下の試験、即ち、 一直系Ｔ４リンパ球細胞に対するＨＩＶウィルスの細胞変性効果（ＣＰＥ）が本 発明誘導体によって阻害されることを追跡するために、ウィルス腫瘍学研究所（ Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅｄ’Ｏｎｃｏｌｏｇｉｅ　Ｖｉｒａｌｅ）で開発された 技術であるＮＴＴを用ν）た比色定量試験（０，Ｓｃｈｗａｒｔｚ他、　１９８ Ｂ、＾ＩＤＳ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄＨｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ、 　ｖｏｌ　４．　Ｎｏ、６．　ｐ、４４１）、及び、−ウィルス複製が本発明誘 導体によって阻害されることを追跡するために、ウィルス逆転写酵素の活性の微 量定量試験と夫々行ない、得られた結果を示す。

扛１− 乱ｉ ＣＥＭ−Ｃ１１３株（ウィルスのＣＰＥに特に怒受性のクローン）を使用した。

皇Ａコにノー １９８３年７月１５日にパスツール研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ　Ｐａ５ｔｅｕｒ ）のＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｄｅｓ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅｓ 　ｄｅ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉ−ｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に受託番号１−２３２ で寄託されたし＾Ｖｌ−ＢＲＵウィルスの単離物を使用した。

増殖するＣＥＭ細胞の上清から得られたウィルス溶液を使用した。ウィルス溶液 を使用以前に滴定した。

１１似釦割 粉末の形態の化合物を水またはＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド これらのストック溶液を＋４℃で保存する。次１．１でこれらの溶液をＲＰ旧培 地に希釈して、所望の試験濃度にする（最終試験濃度は２５，ト０．２，Ｍであ る）。比較のためＧこ、＾ＺＴ、ジデオキシシチジン（ｄｄｅ）及びジデオキシ チミジン（ｄｄＴ）も同じ条件下に試験した。

ＭＴＴ　　　　いｔ・　　　　　　　に　　　官７Ｔ４１　ンノ（　・　　　　 （こ比色試験ではＮＴＴ（３−（４．５−ジメチルチア゛ｆールー２−イｌし） −２、５−ジフェニルテトラゾリウムプロミド）を使用する．これは、生存細胞 と共にインキュベートされると濃青色生成物を形成する黄色基質である．形成さ れた色の濃さ力（、被検サンプル中に存在する生存細胞の濃度Ｇこ正比例する。

０、　Ｓｃｈｗａｒｔｚ他の＾ＩＤＳ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ 　Ｒｅｔｏｖｉｒｕｓ（前出）に記載された手順〈１）を使用した。この手順を 以下に要約する。

−１００ｕ１のＣＥＭ−ＣＬ１３細胞（３，１０’／、ｗｌ）をマイクロタイタ ープレートに分配した。

一種々の希釈度の被検化合物５０１１１を添加する。

各濃度毎に６つのウェルを準備し、 −３つのウェルでは化合物の細胞毒性を試験し、−３つのウェルではウィルス産 生の阻害性を試験した。

５％の００２を含む３７℃の恒温器で２時間インキュベーション後、 −（細胞毒性試験のために＞１００ｕｆの培地、及び、−（抗ウイルス効果試験 のために）感染の多重度０．００８のウィルス溶液１００ｕｆ を夫々添加する。

７日間培養後に、逆転写酵素活性（＾Ｔｌ）を定量するために５０ｕ１の上清を 採取する０次いで攪拌によって細胞を再度懸濁させる。　ＮＴＴ試験のために１ ００μ！の細胞上清を採取する。

残りの細胞には、所望濃度の薬剤を含有した１５０ｕ１の新しい培地を添加する 。この細胞を３〜４日毎に継代培養する。

各継代毎に逆転写酵素活性及びＣＰＥを定量する。

ｂ）ＨｗＬＬ ＮＴＴを５ＩＩｆＩｌ履ｌでＰＢＳに溶解しＰ通する。１ｏｕ１のこのストック 溶液を、１００ｕ１の被検細胞サンプルを入れたマイクロタイタープレートのウ ェルに添加する。

プレートを３７℃で４時間インキュベートする０次いで上清を静かに除き、０． ０４ＮのＨＣｌを含む１５０，１のインプロパツール溶液を添加し、形成された 青色結晶を溶解させる０次いで、マイクロタイタープレート読取装置（Ｂｉｏｔ ｅｋ）の波長５４０ｎ論でプレートを読取る。

Δ　の４　　　の； 薬剤で処理したＨＩＶ非感染の細胞を使用して薬剤の細胞毒性を測定する。

−（ウィルス非含有及び薬剤非添加の）対照細胞をＮＴＴ試験の吸光度１００％ と定義する。

一対照に比較して５０％の吸光度減少を生じた薬用量を細胞毒性用量５０（ＣＤ ５０）と定義する。

ム　　の　　テ　； 以下の式を用いて抗ＨＩＶ活性を測定する。

但し、Ｄ、０．（薬剤子ｔｉｎは薬剤で処理したウィルス感染細胞の５４０ｎ論 の吸光度、 Ｄ、Ｏ，（Ｈｍは薬剤で処理しないウィルス感染細胞の５４０ｎｍの吸光度、 Ｄ、０．（薬剤）は薬剤で処理した非感染綿Ｍｌの５４０ｒ＋ｗ＋の吸光度 を夫々示す。

保護用量５０（ＥＤ５０）はＣＰＨに対する５０％保護を生じる薬用量を示す。

１乱ｌ順へ太Ｌ ＣＤ５０とＥＤ５０との間の差が大きｂ）はど化合物力（有効である。

この差を選択指数（ＣＤ５０／ＥＤ５０）として計算できる。

以下の表１ａ及びＴｂは、 一本発明のＡＺＴのマンノシル化誘導体くホスホジエステル７６２４及び７６２ ６、ホスホトリニス−ｒ　ｎ／　７６２５及び７６２７）、ＡＺＴ、ｄｃｌｃ及 びｄｄＴの培養７〜２２日後に得られた保護効果及び保護指数（ＣＤ５０／ＥＤ ５０）を示す。

表　　１ａ イ呆↓Ｊ（才４１較　　（１，Ｐ、１ ＾ＺＴは培養２２日後も選択指数５０以上を有することが理解されよう、有利な ことに、化合物７６２４及び７６２６は＾ＺＴと同等の選択指数を有する。

ウィルス　　　　　゛の　　　　に　　ウィルス　１５０−ｌの培養上清から以 下の方法で逆転写酵素活性を直接測定する。０．１％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ１００ と０．１ＭのＫＣＮと１０＋ＭのＤＴＴとを含有する１０μｌの反応混合物に、 ０．５ＨのＴｒｉｓ−ＨＣ１バッファと０．５ＭのＭｇＣｌ１２と１ｐＣｉのコ ＨＴＴＰと０．５ｇ／Ｎのポリ（ｒ＾）オリゴ（ｃｌＴ）との中に５ｍＭのＥＧ Ｔ＾を含む４０ｕ１の反応混合物を添加し、酵素活性を測定する。３７℃で１時 間インキュベーション後、６０％のＴＣＡ中に１２０ｍＭのＮ１１−Ｐ２Ｏ３を 含む溶液を添加して反応を停止させ、４℃で１５分間靜１する。沈降した物質を 、５％ＴＣＡ中の１２＋ｓＭのＮａ４Ｐ２０ｔで複数回洗浄した後に、５ｋａｔ ｒｏｎ？過システムで回収する。フィルターを乾燥し、βシンチレーションカウ ンター（Ｐａｃｋａｒｄ）で放射能を測定する。

以下の表■は７〜２６日後の培養上清中の逆転写酵素活性の定量を示す。

表　エエ モデル゛　ハ　に　　る　　　の＾ｚＴム　　の　透過　送・　　　ｔ・めの３ 　Ｉ　Ｐ−ＮＭＲ・　　びこれ　の　ム　、のマウスの′で　　され　＾ＺＴの ａ）ホスホト１エステル　モール　　の　の　　　　の３１Ｐ−制御 ＪＡＣＳ　１９８９１１上４２７０に記載の手順を使用する。この試験では、Ｃ Ｔ７６２７だけが単層小胞の脂質外層と相互作用し、ＣＴ７６２５は小胞内の水 相で検出されることが判明する。後者の化合物は、すべての合成ホスホトリエス テルのうちで最も有効な＾ＺＴの親脂性輸送体であると考えられる。

ｂ）マウスの′　の＾ＺＴのＨＰＬＣ Ｓｗｉｓｓマウスで試験する。定量試験した化合物は＾ＺＴ（対照）、６−マン ノシルホスホジエステルであるＣＴ　７６２６及び１−マンノシルホスホジエス テルであるＣＴ　７６２４、並びに、対応するホスホトリエステルＣＴ　７６２ ７及びＣＴ　７６２５である。

試験動物に２５ｚｙ／ｋＦＩの＾ＺＴまたはホスホジエステル及びトリエステル を経口投与する（約５００１ＪｆＩ／マウス）。強制栄養によって投与する前に 化合物を蒸留水に溶解（または蒸留水に懸濁化）する。試験では、各化合物を３ 匹のマウスに投与する。対照として３匹のマウスに、処理マウスに均等の賦形剤 、例えば処理マウスに等しい容量の蒸留水を投与する。強制栄養の１時開後に脳 を摘出し、アセトニトリル−水（３／１）混合物中でホモジナイズし、遠心分離 し、上清を採取してＨＰＬＣ定量する。

Ｃ１８シリカカラムのＨＰＬＣで上清（の１／２量）を定量する。上清の残りの １／２量に所定量の定量すべき化合物（＾ＺＴ、ホスホジエステル及びトリエス テル）を添加した内部標準に基づいて定量する。種々の化合物のＩＩＰＬＣ定量 法に有利な実験条件を予備実験で決定する。

次表では各行が一連の薬用量に対応する。第１列及び最終列は結果のまとめであ り、夫々、水溶液摂取によってマウスに与えられた＾ＺＴの量（ＩＪｏｏｌ）及 び脳ＩＦＩあたりの検出された＾ＺＴの総量（ｎｍｏ　ｌ　）を示す。例えば、 マウス１匹あたり１．８７Ｐｍｏ　ｌの＾ＺＴ（５０ｈｙ）を投与した場合、脳 １ｇあたり２．７％ｍｏｌの＾ＺＴが検出される。

これらの結果を、Ｔｏｒｒｅｎｃｅ　Ｐ、　Ｆ、他、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒ ｓ。

１９８８、２３３．１３４〜１４０に記載の中枢神経系向はベクターとして作製 された＾ＺＴのジヒドロピリジニル誘導体で得られた結果と比較する。　ＤＭＳ Ｏ（０，１〜０．２ｚＮ）に溶解した化合物ＨＰＡＺＴ（１ｕ＋ｏｌの＾ＺＴ含 有）を２０ｚｙ／ｋｇで静注すると、脳１ｇあなリ２．６〜７．７ｎｍｏｌ均等 量の＾ＺＴ濃度が与えられる。経口投与されたＡＺＴの体内利用効率（ｂｉｏｄ ｉｓｐｏｎｉｂｉｌｉｔｅ）がヒトで約６０％であること（Ｙａｒｃｈｏａｎ　 Ｒ，他、　Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ、　１９８６．５７６〜５８０〉を考慮すると 、ＡＺＴのホスホジエステル及びトリエステル（ＣＴ　７６２４〜７６２７）は 、これまでに合成されたＡＺＴ誘導体に比較して特に有効なＡＺＴの親脂性誘導 体であると考えられる。これらの化合物を経口投与した場合、ＡＺＴの摂取量を １７２〜１７３倍に減少させても脳内で実質的に３倍のＡＺＴが検出される。

国際調査報告 ｍ　−一層−ＩＮ、ＰＣＴ／Ｆ’Ｒ９０１０００７３”ｗａａ＋１１“−ＰＣＴ ／Ｆ’Ｒ９０１０００７３国際調査報告

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．式Ｉ： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）〔式中、 Ｒ３は基： ▲数式、化学式、表等があります▼ 但し、ｏｓｅはＣ５またはＣ６の単糖単位を示し（Ｄ体またはし体）、ｘが１に 等しいグルコースの場合を除いて、ホスホリル化置換鎖が結合すべき単糖単位の １位または６位に結合していることを示し、 ｘは１〜１２の数であり、 ｙは１〜４の数であり、 ｚは０または１に等しい数であり、 Ａは水素原子を示すか、または、飽和もしくは不飽和で置換もしくは未置換の炭 素原子数５〜３０の炭化水素基であるａｌｃ基を示し、 Ｒ１はＮ３基、水素原子、炭素原子数１〜４のアルキル基、ハロゲン原子、ニト リル基またはヒドロキシル基を示し、Ｒ２は炭素原子数１〜４のアルキル基、ハ ロゲン原子またはニトリル基を示す〕で示されるグリコシル誘導体であることを 特徴とするヌクレオシドのリン脂質性グリコシル誘導体。
2. ２．単糖単位が、Ｃ６の糖ではマンノース、ガラクトース、フルクトース、フコ ース、アミノヘキソース、２−デオキシグルコースから選択され、Ｃ５の糖では アラビノース、キシロース、リボース及び２−デオキシリボースから選択される ことを特徴とする請求項１に記載の誘導体。
3. ３．ｘが１に等しいことを特徴とする請求項１または２に記載の誘導体。
4. ４．式ＩＩ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩ）〔式中、ａｌｃ、Ｒ１及びＲ２は請 求項１と同義である〕で示されるホスホトリエステルであることを特徴とする請 求項１から３のいずれか一項に記載の誘導体。
5. ５．式ＩＩＩ： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ１、Ｒ２、ｙ及びａｌｃは請求項１と同義である〕で示されるホスホ トリエステルであることを特徴とする請求項１に記載の誘導体。
6. ６．ａｌｃ基が、−ＮＨ２、−ＮＨＲ′または−Ｈ（Ｒ′，Ｒ′′）〔但し、同 じまたは異なるＲ′及びＲ′′は炭素原子数１〜４のアルキル基を示す〕で末端 置換されるかまたは未置換の炭素原子数５〜２０のアルキル鎖またはアルコキシ 鎖を示すことを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の誘導体。
7. ７．式Ｖ： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、 Ｒ１及びＲ２は請求項１と同義、 Ｒ４は基 ▲数式、化学式、表等があります▼ 但し、ｏｓｅ、ｘ、ｙ及びｚは式Ｉに関する定義と同じ〕で示されるホスホジエ ステルであることを特徴とする請求項１に記載の誘導体。
8. ８．式ＶＩ： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ１、Ｒ２及びｙは請求項１と同義である〕で示されるホスホジエステ ルであることを特徴とする請求項７に記載の誘導体。
9. ９．３′−アジドチミジン（ＡＺＴ）、２′，３′−ジデオキシチミジン（ｄｄ Ｔ）または２′−デオキシ−５−フルオロウリジン（ｄＵＦ）の誘導体であるこ とを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載の誘導体。
10. １０．式ＶＩＩ： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ホスホリル化置換鎖は結合すべき単糖単位の１位または６位に存在し、 １つまたは複数の単糖単位のその他のヒドロキシル基は、同じまたは異なる基か ら成る保護基によってブロックされており、ｘ、ｙ及びｚは前記と同義である〕 で示されるグリコシド誘導体と、式ＶＩＩ：▲数式、化学式、表等があります▼ 〔Ｒ１及びＲ２は前記と同義〕で示されるヌクレオシド誘導体とを縮合させて、 １つまたは複数の保護された単糖単位を有する式ＩＸ： ▲数式、化学式、表等があります▼ のホスホジエステルを形成し、 ホスホジエステルの１つまたは複数の単糖単位の保護基を除去して−ＯＨ基を遊 離させる段階を含み、次いでホスホトリエステルを製造したい場合には任意に、 ホスホジエステルと式Ｘ：Ｂ−ａｌｃ〔式中、Ｂは、リンに結合した−ＯＨ基と 反応し得る基を示す〕の反応性誘導体とを反応させ、ａｌｃ基を元素Ｐに結合さ せ且つ化合物ＢＨを形成させ、化合物ＢＨを除去し、式中のＡがａｌｃ基を示す 式Ｉのホスホトリエステルを形成する段階を含む請求項１に記載の式Ｉの誘導体 の製造方法。
11. １１．医薬上許容される賦形剤と共に請求項１から９のいずれか一項に記載の誘 導体一種以上を有効量で含有することを特徴とする医薬組成物。