JPH03502282A

JPH03502282A - 発現ベクター類

Info

Publication number: JPH03502282A
Application number: JP89502474A
Authority: JP
Inventors: オルソン，エリック・アール; ワトソン，エドワード・ビイ，ザ・サード
Original assignee: ジ・アップジョン・カンパニー
Priority date: 1988-01-27
Filing date: 1988-12-23
Publication date: 1991-05-30
Also published as: AU3183289A; WO1989007141A1; EP0398983A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発現ベクター類本発明は改良された発現ベクターに関する。本発明の発現ベクターは、部位特異的突然変異の結果として、挿入された異種遺伝子の発現の増加によって特徴付けられる。

発明の背景異種遺伝子で形質転換した宿主における当該遺伝子の発現を最大化しようとする多数のアプローチが採られてきた。用いられたアプローチは注目する異なる遺伝子の発現について種々あり得るが、一般に、それらは、異種遺伝子の発現を調節する発現制御配列、異種遺伝子自体のＤＮＡ配列、発現ベクター、および宿主を操作することを含む。関与する発現制御配列は転写（プロモーター、オペレーターおよびターミネータ−）ならびに翻訳開始および停止領域を共に包含する。クローン化異種遺伝子における変化は、コドン使用法を最適化し、ａ＋ＲＮＡの安定性を促進し、効果的な翻訳に干渉する可能性のある二次構造を破壊し、および蛋白産物の安定性または活性を促進するためのコーディング配列の変更を包含する（例えば、小さな不安定蛋白は、しばしば、産物安定性の難点を軽減するためにタンデムリピートとしてクローン化される）。通常、発現ベクターの操作は小さな安定したプラスミドを構築することを目的とし、プラスミドコピー数の増加によって異種遺伝子量を増加させることを含む。例えば、宿主における変化は、該宿主によって産生される細胞質プロテアーゼ類の量を減少させる突然変異を含む。

情報の開示その小さなサイズ、遺伝的安定性および比較的高いコピー数（細胞当たり約１０〜１５）のため、イー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）における外来遺伝子の発現にはＣｏ１Ｅｌ−タイプのプラスミドに関係する発現ベクターが広く用いられてきた。１のかかるプラスミドｐＢ　Ｒ３２２は最も広く使用されているイー・コリ・ベクター類の１つである。

ｐＢ　Ｒ３２２はＣｏ１Ｅ１プラスミド類縁のｐＭＢｌから得られたＣｏ１Ｅ１ −タイプの複製系を有する（ポリバー・エフら（Ｂｏｌｉｖａｒ、　Ｆ、。

ｅｔ　ａｌＸｌ　９７７）ジーン（Ｇｅｎｅ）、　　２．　７５〜９３　；ポリバー・エフら（Ｂｏｌｉｖａｒ、　Ｆ、、　ｅｔ　ａｌＸｌ　９７７）ジーン（Ｇｅｎｅ）、　　２．　９５〜Ｃｏ１Ｅｌ−タイプの複製系の制御についてのモデルが存在する（総説ニラいては、ダビソン・ジュニア（Ｄａｖｉｓｏｎ、　Ｊ、　Ｘ　１９８４　）ジーン（Ｇｅｎｅ）、　　２８　、　１〜１５およびレズニフフ・ダブりニーおよびゴールド・エル（Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ、　Ｗ、　ａｎｄ　Ｇｏｌｄ、　Ｌ、８編）におけるポリスキー・ビイ（Ｐｏｌｉｓｋｙ、　Ｂ、　）Ｊ遺伝子発現の最大化（Ｍａｘｉ＠ｉｚｉｎｇ　ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）Ｊ（１９８６）、バターワース（Ｂｕｔｔｅｒｖｏｒｔｈ）出版社、ストネハム（Ｓｔｏｎｅｈａｍ）、マサチューセッツ州、１４３〜１７０を参照）。

要約すれば、（「プライマー」またはｒＲＮＡ　　ＩＩＪと呼ばれる）ＲＮＡブライマー転写体がＲＮＡポリメラーゼによってＣｏ１Ｅ１−タイプのプラスミドの複製開始点から約５５５塩基対上流で開始される。

転写が開始点に向けて進行するにつれて、このＲＮＡは、該開始点に隣接しそれから下流に伸びる対向ＤＮＡ鎖と７１イブリツドを形成する。首尾よい複製開始には、次いで、該ハイブリッド化ブライマーをリボヌクレアーゼＨによって該開始点で切断しなければならない。次いで、このプロセッシング化−ＲＮＡＩ［転写体はプラスミドの複製用ブライマーとして働く。複製に導くブライマーの相互作用は２種のプラスミドでコード付けした分子類によってｉｎ　ｔｒａｎｓ制御されているようである。これらの分子の１種であるＲＮＡ　　１はＲＮＡ　　ｎの初期物（ｂｅｇｉｎｎｉｎｇ）として同−ＤＮＡから転写されるが、反対の向きにある１０８ないし１１０塩基対のＲＮＡ分子である。かくして、ＲＮＡ　　ＩはＲＮＡ　　Ｉ［の５′末端に対して相補的である。一連の塩基対形成相互作用を通じて、ＲＮＡ　　Ｉは該ブライマーにハイブリダイズでき、その結果、ＲＮＡ５ｅＨによってプロセッシングされず、かくしてもはや複製用のブライマーとして働かないＲＮＡ　　ｎが生じる。ＲＮＡ　　Ｉと該ブライマー間の相互作用は複製を抑制し、Ｃｏ１Ｅ１−タイプのプラスミド類で観察されるコピー数制御および不適合挙動の原因らしい。このプロセスに関与する他のプラスミドがコード付けする分子はアミノ酸６３個の蛋白である。該蛋白をコード付けする遺伝子は、複製開始点より５００塩基対下流にある。ｒｏｐまたはｒｏｏｔと呼ばれるこの蛋白はＲＮＡ　　Ｉおよびブライマーの相互作用を容易とし、さらに複製の抑制に寄与することがｉｎ　ｖｉｔｒｏにて示されている。

Ｃｏ１Ｅ１−タイプの複製系制御の知識および制御領域における特異的突然変異の使用により多数の高コピー数の（ある場合は調節可能な）発現ベクターの構築が可能となった（ボロス・アイ（Ｂｏｒｏｓ、　！、１ｅｔ　ａｌ）（１９８４）ジーン（Ｇｅｎｅ）、　３０．　２５７〜２６０　：ガイシｍ−アール・ビイら（ＧａｙｌｅｌＩ［、Ｒ，Ｂ、、　ｅｔ　ａｌＸｌ　９８６）ジーン（Ｇｅｎｅ）。

４１．２８１〜２８８；ＥＩｉＡ　　Ｏ０１３８３０；英国特許出願２１３６８１４Ａ号；ｐｃ’ｒ出願ＰＣＴ／ＵＳ８２１００２４６号；ＥＰＡ　　Ｏ０９６５８６号、ＰＣＴ／ＧＢ８５１００１１０号）。

構成的高コピー数突然変異体（優性および劣性）が単離され、ＲＮＡＴおよびＲＮＡ　　ｎ構造遺伝子において特異的塩基変化にマツプされている（ムエシング・エムら（Ｍｕｅｓｉｎｇ、　Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ）（１９８１）。

セル（Ｃｅｌｌ）、２４，２３５〜２４２）。これらの突然変異体はＲＮＡＩおよびブライマーの構造的相互作用に影響し、かくして、複製制御に干渉する。

ｒｏｐ構造遺伝子における点突然変異は報告されていないが、ｒｏｐ遺伝子を除去するかまたは不活性化し、それによりコピー数増加をもたらす欠失および挿入突然変異体が得られている（ライラグ・エイ・ジェイおよびシェラート・ディー（Ｔｖｉｇｇ、　Ａ、　Ｊ、　ａｎｄ　５ｃｈｅｒｒａｔｔ。

Ｄ、Ｘｌ　９８０）ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）、　　２８３．　２１８〜２１８　；セサレニイ・シイら（ＣｅｓａｒｅｎＬ　Ｇ、、　ｅｔ　ａｌ）（１９８２）プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ。

？１ａｔ１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ、　７９．　６３１３−６３１７　；ツム・ティーおよびトミザワ・ジェイ（Ｓｏｗ、　Ｔ、　ａｎｄ　Ｔｏｍｉｚａｗａ、　Ｊ、）プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オプ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）８０．　３２３２〜３２３６　；ルブス牛−・ジェイ・アールら（Ｌｕｐｓｋｉ、　Ｊ、　Ｒ，、ｅｔ　ａｌｏｌ　９８６）プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ、　８３．７３８１〜７３８５　；ヌジェント・エム・イーら（Ｎｕｇｅｎｔ、　ｔ　Ｅ、、ａｔ　ａｌＸｌ　９８６）、ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）。

１３２．１０２１−１０２６）。

成熟ウシ成長ホルモン（ｂＧ　Ｈ；ウシ・ソマトトロピンｂｓｔも本明細書中にて時々用いる）についてコード付けするｃＤＮＡは、典型的なｐＢＲ３２２由来のプラスミドにては、イー・コリで発現は乏しい。かかる系におけるｂＧＨの発現は種々の方法によって促進された。シーブルグら（Ｓｅｅｂｕｒｇ、　ｅｔ　ａｌ）、　（１９８３）、　　テ゛イ・エヌ・エイ（ＤＮＡ）、２．３７〜４５、およびジコージら（Ｇｅｏｒｇｅ、　ｅｔ　ａｌ）は。

（１９８５）ディ・エヌ・エイ（ＤＮＡ）、４，２７３〜２８１、ｂＧＨの最初の２４アミノ酸に対応する天然コーディング配列を置き換えることによってかかる系においてｂＧＨの発現を増加させている。これらの変化のうちいくつかは、イー・コリ・コドン使用方法偏りを反映させるためになされ、一方、他のものはＲＮＡに形成される可能性がある二次構造を破壊するためになされた。

もう１つのアプローチにおいて、遺伝子の「２−シストロン」構築がなされた（シコーナー・ビイ・イーら（Ｓｃｈｏｎｅｒ＋　Ｂ、　Ｅ、、　ｅｔ　ａｌ）（１９８４）プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ、　８１　、　５４０３〜５４０７；ショーナー・ビイ・イーら（Ｓｃｈｏｎｅｒ、　Ｂ、　Ｅ、、　ｅｔ　ａｌ）（１９８６）プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、　ａｓ、　　８５０６〜８５１０）。この場合、最初の３１塩基対長のシストロンはＡＴＧスタートコドン、続いての２つのクローニング部位を含有する短いＡ−Ｔ豊富領域、シャイン−ダルガノ配列、もう１つの小さなＡ−Ｔ豊富スペーサー、ＴＡＡ停止コドン、およびｂＧＨｃＤＮＡに連結したもう１つのＡＴＧスタートコドンよりなる。この構築により、熱誘導可能なランナウェイレブリフンをもつプラスミドからの高いｂＧＨ発現が生じた。シ１−ナーら（Ｓｃｈｏｎｅｒ、　ａｔ　ａｌ）は、発現の増加は、ｍＲＮＡの５°末端近くの二次構造問題を克服したことによる翻訳の増大に帰せられるとした（ＥＰＡ１１１８１４号も参照）。

本発明は、ｂＧＨおよびＣｏ１Ｅ１−タイプ複製系を有する発現ベクターからの他の異種ｃＤＮＡのイー・コリおよび他の類縁宿主における乏しい発現の問題を扱う。これらの問題を解決するために、本発明者らは、天然ｂＧＨｃＤＮＡによってコード付けされ、作動可能に連結した１のアミノ酸変化を含有するｂＧＨｃＤＮＡの上流に良好なイー・コリ・プロモーターおよび翻訳開始領域を含むｐＢＲ３２２由来のプラスミドにおいてランダム点突然変異を創出した。

本発明者らは、ｂＧＨｃＤＮＡ構築体を含有する発現ベクターからの精製した閉環プラスミドＤＮＡおよびｂＧＨ発現増加用のこのＤＮＡで形質転換しスクリーニングしたイー・コリを化学的に突然変異させた。また、これらのベクターは他のソマトトロピン（例えば、ブタおよびウシ）ならびに他の異種ポリペプチド（例えば、インターロイキン−１）を発現するのに有用である。

本発明は、イー・コリおよび他の類縁宿主における異種ポリペプチドの発現用新規発現ベクターを提供するものである。高発現は生理学的温度にて実質的にコピー数を増大させることなく（例えば、３倍未満の増加）速成される。発現の増加は、複製の制御に影響することが知られている領域におけるベクターのｐＢ　Ｒ３２２−特異的部分の新規突然変異による。本発明者らがｐＭｂｓｔ３０と命名した特異的発現ベクターにおける点突然変異は、ＲＮＡ　　Ｉのプロモータ一部位領域にあり、従って、カウンター転写体（ｃｏｕｎｔｅｒｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）、ＲＮＡ　　ＩＩ、複製のブライマーについての構造遺伝子にある。ＲＮＡ　　Ｉプロモーターにおける報告された唯一の先行の公知突然変異（ウォング・イーーｘムら（ｌｏｎｇ、　Ｅ、　Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ。

（１９８２）、プロシーディングズ・オプ・ナシェナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　ＵＳＡｓ　７９＋　　３’５７０〜３５７４）により、ＲＮＡＩ［構造における変化に帰せられた温度感受性コピー数表現形が得られた。本発明者らのｐＭｂｓｔ３１発現ベクターにおける点突然変異はｒｏｐ遺伝子のシャイン−ダルガノ領域にある。この突然変異は新規で独特であり：現在のところまで、ｒｏｐ遺伝子またはその調節配列における点突然変異は報告されていない。また、本発明者らは、これらの両突然変異よりなる第３の発現ベクターｐＭｂｓ　ｔ　Ｉを作成した。

発明の要約本発明は、ＲＮＡｎ遺伝子、またはｒｏｐ遺伝子の翻訳開始領域、あるいは双方における突然変異ならびに制限部位よりなり、異種ポリペプチドをコード付けするＤＮＡ配列がベクターに挿入され得、かつ発現制御配列に作動可能に連結し、該突然変異は実質的に発現ベクターのコピー数を増加させないことを特徴とするＣｏ１Ｅ１−タイプ複製系を有する発現ベクターに関する。

より特別には、該ベクターはｐＢＲ３２２由来ベクターである。

より特別には、該異種ポリペプチドはｂＧＨである。

なおさらに特別には、該発現ベクターはｐＭｂＳ　ｔ　３０　、ｐＭｂＳ　ｔ３１、ｐＭｂＳ　ｔ　１　、およびその誘導体から選択される。

また、該ベクターで形質転換した宿主および該形質転換宿主を培養することを特徴とする異種ポリペプチドを発現する方法も提供される。

発明の詳細な説明に連結した場合に、該遺伝子の発現を制御および調節するヌクレオチドの配列をいう。それは、プロモーター、翻訳開始領域（例えば、リポソーム結合部位）およびそれらの発現制御配列に作動可能に連結した遺伝子の発現に有用な他の配列も包含する。「作動可能に連結」なる語は、所望の産物をコード付けする遺伝子の前方に適当なスタートシグナルを有すること、および正しいリーディングフレームを維持して発現制御配列の制御下で挿入遺伝子の発現およびその遺伝子によってコード付けされる所望の産物の合成を可能とすることを包含する。「翻訳開始領域」は、所望の産物をフード付けする遺伝子の上流に位置し、翻訳開始の効率に影響するＤＮＡ分子の部分であり、例えば、シャイン−ダルガノ配列を包含する。

ソマトトロピン（成長ホルモン）は当業者によく知られており、ブタ、ヒツジおよびウシ・ソマトトロピンを包含する。天然に生じるソマトトロピンのいくつかの同族体も知られている。ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８８１００３２８号はこれらの同族体の多くを記載しており、ここに参照のために挙げる（シーブルグら（Ｓｅｅｂｕｒｇ、　ｅｔａｌ）、前掲、およびジ目−ジら（Ｇｅｏｒｇｅ、　ｅｔ　ａｌ）、前掲、も参照）。他の異種ポリペプチドは宿主生物によって天然では発現されないものを含む。

いずれの大多数の入手可能なおよびよく知られた宿主細胞も本発明の宿主−発現ベクター組み合わせで用いることができる。具体的な宿主の選択は、当該分野で認識された多数の因子に依存する。これらは、例えば、選択された発現ベクターに関する適合性、ハイブリッドプラスミドによってコード付けされる蛋白の毒性、所望の蛋白の回収の容易さ、発現の特徴、生物安全性およびコストを包含する。これらの因子のバランスは、すべての宿主が本発明の発現ベクターおよび方法において特別のＤＮＡ配列の発現に同等に効果的ではないと理解して注意しなければならない。

これらの一般的な指針において、有用な宿主は、その中でベクターが複製できるイー・コリ、サルモネラの株のごとき細菌および他の宿主を包含し得る。

野性型イー・コリ株に１２は好ましい細菌宿主株であり、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから購入した。

プラスミドは以下のごとくに構築した：ｂＧＨについてのクローン化ｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＬＧ２３をフリツク・ロッタマン（Ｆｒｉｔｚ　Ｒｏｔｔｍａｎ）（ケイス・ウェスタン・リハ゛−ス（Ｃａｓｅ　ＷｅｓｔｅｒｎＲｅｖｅｒｓｅ）大学）より得た。このプラスミドは１９８１年５月１２日にイリノイ州、ベオリア、（Ｐｅｏｒｉａ）、ノーザン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリ−に寄託され、受託番号ＮＲＲＬ　　Ｂ１２４３６が与えられている。プラスミドの構築は１９８２年１２月１５日に公開された欧州特許出願６７０２６号に詳細に記載されている。

ｔｒｐプロモーター領域を含有する発現ベクターｐＳＫ４は以前に記載されている（カイテス・ビイ・ニスら（Ｋａｙｔｅｓ、　Ｐ、　Ｓ、、　ｅｔ　ａｌＸｌ　９８６）ジャーナル・オブ・バイオテクノロジー（Ｊ、　Ｂｉｏｔｅｃｈ、）＋　４＋２０５〜２１８）。プラスミドｐｓＫ＋０６（チャートＡ参照）は、（重複するＴＡＡ停止コドン、ヌクレオチド偏り最大化「スペーサー」領域、およびＣａｌｆ部位を生成させるためのヌクレオチドと共にＡＴＧスタートコドンを含有する）合成リンカ−を、ｐＬＧ２３からのｂＧＨｃＤＮＡを含有するクレノー処理したＨａｅＩ［／Ｂｇｌ　ＩＩ断片と一緒にｐＳＫ４のＣｌａｌ部位にクローン化することによって構築した。該合成リンカ−はｂＧＨｃＤＮＡにおける最初のアミノ酸についてａｌａ（Ｇ　ＣＣ）コドンの代わりにｐｈｅ（Ｔ　Ｔ　Ｃ）を生じさせる。同様のＣｏ１Ｅ１−タイプ複製系を有する他のものを用いることができるごと（、他のｐＢＲ３２２由来のプラスミドを用いることもできる。

（例えば、ｐ１５Ａ、チャン・エイ・シイ・ワイおよびコーヘン・ニスーエヌ（Ｃｈａｎｇ、　Ａ、　Ｃ，Ｙ、　ａｎｄ　Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ、　Ｎ、　（１９７８）、ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ、　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、　　１３４＋１１４１〜１１５６；ゼルザー・シイら（Ｓｅｌｚｅｒ、　Ｇ、、　ｅｔ　ａｌＸｌ　９８３）セル（Ｃｅｌｌ）、３２，１１９〜１２９）。

形質転換体をａｍｐプレート（５０μｇ／ｍＱアンピシリンを含有する抗生物質培地＃２（ディフコ（Ｄｉｒｃｏ））上で選択した。ＬＢ（ルリアーバータニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ））培地およびＭ９培地は記載されている（マニアティス・ティーら（Ｉｉａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、　ｅｔ　ａｌ）（１９８２）＋分子クローニング：実験室的マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド１スブリイグ０ハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）、二ニーヨーク；ディビス・アール・ダブリ１−ら（Ｄａｖｉｓ、　Ｒ，Ｌ、　ｅｔ　ａｌ）（１９８０）先端細菌遺伝学（Ａｄ−ｖａｎｃｅｄ　　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、コールド・スプリング・バーバー−ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）、二ニーヨーク）。ｔｒｐ欠乏プレートは０．２％グルコース、１Ｈｇ／ｍ（ｌチアミンおよび５０μｇ／ＩＩＱアンピシリンを補足したＭ９培地を含有していた。ｔｒｐ誘導培地は０．２％グルコース、１−μｇ／１ａ（ｌチアミン、０．０５％カザミノ酸（酸加水分解物：ディフコ（Ｄｉｒｃｏ））、および５０μｇ／ＩＩＩＱアンピシリンを含有する液体Ｍ９であった。

Ｃ，ａｎｄ　Ｄｏｌｙ、　Ｊ、）（１９７９）ヌクレイツク・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、）、　　７．　１５１３〜１５２３、の方法によってプラスミドＤＮＡ　ミニプレプを調製した。形質転換はモリソン・ディ・エイ（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、　Ｄ、　Ａ、）（１９７７）ジャーナル・オブφバクテリオロジ−（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）、　　１３２．　３４９ −３５１に従うか、あるいは製造業者の指示に従って行った。Ｃ５（Ｊ！グラジェントでのプラスミドＤＮＡの精製、制限エンドヌクレアーゼ消化、アガロースゲル電気泳動、断片の精製および溶出、および他のＤＮＡ組換技術はマニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ）、前掲、に従って行った。

制限エンドヌクレアーゼ、ＨｉｎｄＩ［ＩラムダＤＮＡマーカー、Ｔ４ＤＮＡリガーゼおよびクレノー断片はニー−イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）から入手し、その推奨法に従って用いた。子ウシ腸アルカリホｉファターゼ（触媒番号７１３０２３）はベーリンガーーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）から購入した。鳥骨髄芽球症（ＡＭＶ）逆転写酵素はセイカガク・アメリカン・インコーポレーシロン（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ　Ａｍｅｒｉｃａｎ、　Ｉｎｃ、）から入手した。蛋白分子量マーカー、超純粋（酵素グレード）尿素、ニックトランスレージ１ン試薬、ならびにデオキシ−およびジデオキシヌクレオチドはベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ）からのものであった。塩化セシウム、アクリルアミド、Ｎ、Ｎ’−シアツルタルタルジイミド、および抗体スクリーニング試薬（７ｖｅｅｎ２０、およびＨＲＰ発色試薬）はバイオラド（ＢｉｏＲａｄ）から購入した。

亜硝酸ナトリウムはマリンフロート（Ｍａｌ　１ｉｎｋｒｏｄｔ）から入手した。

ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ゼラチン、アガロース、プロテイナーゼに１リボヌクレアーゼＡ１およびリゾチウムはシグマ、（Ｓｉｇｍａ）から購入した。

（ウシ膵臓からの）デオキシリボヌクレアーゼ■はファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）からのものであった。αおよびγ５ａｐ−デオキシシチジントリホスフェートおよび５’、−５Ｈ−チミジンはアメルスハム（Ａｍｅｒｓｈａ＋ａ）からのもめであった。ｓｓ３　　Ｌ−メチオニンはＮＥＮリサーチ・プロダクツ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（デュポン）から入手した。精製したｂＧＨおよび抗−ｂＧＨ多クローン・ウサギ・抗体はよく知られた方法によってアップ・２１２社で作成した。

ｂＧＨ発現についての免疫学的スクリーニングはＢＲＬフを一カス（Ｆｏｃｕｓ）　（６巻、１号、１〜５頁、１９８４）およびパイオーラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）免疫プロット・ヤギ抗−ウサギ（ＧＡＲ）またはヤギ抗−マウス（ＣＡＭ）ホースラディツシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の修正した組合せに従って行った。同様の手法はワンプ・ニス・ゼットおよびエセンｅｘイ（ｆａｎｇ、　Ｓ、　Ｚ、　ａｎｄ　Ｅｓｅｎ、　Ａ、Ｘｌ　９８５）、　　ジーン（Ｇｅｎｅ）、　　３７．　２６７〜２６９によって発表されている。コンピテント細胞を突然変異誘発プラスミドＤＮＡ（実施例１）で形質転換し、１００＋ａｍプレート当たり数百ないし数十個の形質転換体コロニーが得られる濃度にてａｍｐｍｐ−レート上板培養した。３７℃における一晩のインキ１ベーシゴンの後、アンピシリン耐性形質転換体コロニーをニトロセルロース・フィルター（ミリホア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、タイプＨＡ）に乗せ、３７℃にて６時間から一晩ｔｒｐ欠乏平板に移してｔｒｐプロモーターからの発現を誘導した。該フィルターを平板から取り出し、クロロホルム約１．１開上の小さな結合クランプを用いてピペットからヒユームフード中の密閉容器に１時間ないし一晩注意深く吊して細胞を殺し溶解させた。次いで、フィルターを、新たに調製した５０ａＭ）リス−ＨＣ１２、ｐＨ７，５，１５０ｍＭ　Ｎａ（Ｊ’。

５ｓＭ　ＭｇＯム、３％ＢＳＡ、１μｇ／励Ｑデオキシリボヌクレアーゼ１１および４０μｇ／　ｒｎＱリゾチウムを含有する溶解洗液および遮断（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）溶液数百ｍｆｆに移し、室温で１時間ないし一晩振盪しながらインキュベートした。遮断溶液を捨て、該フィルターを、２０ｍＭトリス−ＨＣＱ、ｐＨ７，５，５００ｍＭ　ＮａＣＱ、０．０５％（Ｔｖｅｅｎ）２０よりなるＴ　Ｔ　Ｂ　Ｓ　（Ｔｖｅｅｎ−Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水）数百ＩＩＩＱ中、室温にて、振盪しながら５分間２回洗浄した。洗浄したフィルターを、抗ｂＧＨ抗体（イー・フリ株に３７抽出物をあらかじめ吸着させた抗−ｂＧＨの１％ゼラチンを含有するＴＴＢＳで１１５００希釈）数百ｍＱと共に、室温にて、振盪しながら４時間ないし一晩インキユベートした。該抗体溶液を取り出し、フィルターを前記したごと＜ＴＴＢＳで５分間２回洗浄した。次いで、該フィルターをバイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）蛋白Ａ−ホースラディツシュ・ペルオキシダーゼ複合体の１％ゼラチンを含有するＴＴＢＳでの１／１００００希釈物数百１１１１２と共に、室温にて、振盪しながら１時間インキュベートした。次に、該フィルターを前記したごと（にＴＴＢＳ中で２回洗浄し、次いで、ＴＢＳ（２０ＩＩＩＭトリスーＨＣＱ、ｐＨ７，５，５００ｍＭ　　ＮａＣＱ）中で１回洗浄した。この最後の洗浄溶液を該フィルターから十分に切った。パイオーラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）ＨＲＰ発色試薬１８０ｍｇを水冷無水メタノール６０ｍρに溶解することによって、発色溶液を氷上で新たに調製した。過酸化水素１８０μｇを３００ｍ（！の室温のＴＢＳに添加し、混合した。最初の溶液を第二の溶液に素早く添加し、混合し、合した溶液を該フィルターに添加し、十分に発色するまで室温でインキュベートした（３０〜４５分）。紫色の強度は特定のクローンのｂＧＨ発現のレベルを示すものであった。

ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウェスタンプロットは以下のごと（に行った一一晩の培養物を（株を含有するプラスミド用の５０μｇ／ｍ（ｌアンピシリンを含有する）ＬＢ中、３７℃にて、振盪じながら増殖させ、液体ｔｒｐ誘導培地（２０ｍ１２）中で１／２００希釈してｔｒｐプロモーターからのｂＧＨの発現を誘導した。培養物を中期ないし後期対数相（Ａ、６゜＝０．６〜１．０）まで増殖させ、次いで、高ｂＧ′Ｈ生産制御株中で封入体がはっきりと見えるようになると収穫した（封入体形成は細胞中における高レベルのｂＧＨ発現と蓄積を示す）。遠心によって細胞を収穫し、得られたペレットをＴＥ緩衝液（１０ｍＭ）リス−ＨＣ１２、ｐＨ８，０，１ｍＭ　　Ｎａ＊ＥＤＴＡ）１ｍ１２当たり２５．ｏのＡ６．。まで懸濁し、ＴＥ緩衝液および５Ｘ蛋白ゲル試料緩衝液（レムリイ（Ｌａｅｍｍｌ　ｉ）、英国（１９７０）、ネイチャー（Ｎａ−ｔｕｒｅ）、　　２２７．　６８０〜６８５）中で希釈して２０ｔｔ（ｌ当たり０．２のＡ、８゜を得た。試料を３分間煮沸し、５ＤＳ−ホペリアクリルアミドゲルに乗せた。ポリアクリロアミドゲル（５％スタック層、１７％分離層）の調製は、実質的に、従前に記載されているごとくに（モース、エルーｘスら（Ｍｏｒｓｅ、Ｌ、Ｓ、　ｅｔ　ａｌ）（１９７８）ジャーナル・オブ・パイロロジ−（Ｊ、− Ｖｉｒｏｌ、）、　　２６．　３８９〜４１０）行った。ＢＰＢ染色マーカーが底から約２ｃｍ＋となるまで３０ＩＩ＋Ａの一定電流をかけてゲル中で泳動を行った。すべての試料について２連のゲルで行った。そのうちの１つをコーマジーブリリアントブルーＲ−２５０染色の標準法に付し、走査型デンシトメトリーによってｂＧＨ発現をモニターし、合計蛋白のパーセントとして定量した。

該２連のゲルをウェスタンプロット（トウビン・エイチら（Ｔｏｗｂｉｎ。

Ｈ，ｅｔ　ａｌ）、（１９７８）、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ、７６．４３５０〜４３５４）および前記したごとき抗−ｂＧＨ抗体免疫スクリーニングに付した。

Ｄ　Ｎ　Ａ　配列決定は、マキサムおよびギルバートの化学分解法（マキサム・エイ・エムおよびギルバート・ダブりニー（Ｍａｘａｍ、　Ａ、　Ｍ、　ａｎｄＧｉｌｂｅｒｔｊ）、　（１９７７）、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ１７４．５６０〜５６４；マキサム・エイ・エムおよびギルバート・ダブりニー（１９８０）、　メレソズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ −ｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、）、　　６５．　４９９〜５６０）および二重鎖プラスミドＤＮＡおよびＡＭＶ逆転写酵素を用いるザグルフスキー、アール・エルら（Ｚａｇｕｒｓｋｙ、　Ｒ，Ｌ、Ｘｌ　９８５）、　　ジーン・アナリシス・テクニックス（Ｇｅｎｅ　Ａｎａｌ、　Ｔｅｃｈ、）、　　２＋　　８９〜９４によって修正されたサンガーらのジデオキシ鎖停止法（サンガー・エフら（Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ、　ｅｔ　ａｌ）。

（１９７７）、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ％　７４１　５４６３〜５４６７：サンガー・エフおよびコルソン・エイ・アール（Ｓａｎｇｅｒ。

Ｆ、　ａｎｄ　Ｃｏｕｌｓｏｎ＋Ａ、　Ｒ，）＋　　（１９７８）エフ・イー・ビイ・ニス・レターズ（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）、　　８７．　　ｌ　Ｏ７〜１１０）によって行った。

マキサムおよびギルバート配列決定反応産物をスリブトン・ジェイ・エルら（Ｓｌｉｇｈｔｏｍｊ、Ｌ、　ｅｔ　ａｌ）（１９８７）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、）、　　２６２．　７４７２〜７４８３、によって記載されている尿素−ポリアクリルアミドゲル系変性法によって分析した。

プラスミド・コピー数は２種の方法によって決定した。ｌの方法は、以前報告されている手法（ラッセル、ディ・アールら（Ｒｕｓｓｅｌｌ。

Ｄ、Ｒ，、ｅｔ　ａｌ）、　　（１９８４）、　　ジーン（Ｇｅｎｅ）、　　３２．　３３７〜３４８　；ニジ・ティおよびイト−・ニス（Ｎｉｓｈｉ、Ｔ、　ａｎｄ　Ｉｔｏｈ、Ｓ）、　（１９８６）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、４４．２９〜６３；ルプスキー・ジェイ・アールら（Ｌｕｐｓｋｉ、Ｊ、Ｒ，、ｅｔ　ａｌ）、　（１９８６）＋　ブロシーディングズ・オプ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ、　８３．　７３８１〜７３８５；リンーチアオーｚスおよびブレマー・エイチ（Ｌｉｎ−Ｃｈａｏ、Ｓ、　ａｎｄ　Ｂｒｅｗｅｒ、Ｈ，）、（１９８６）＋モレキユラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏ１．　Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、）、２０３，１４３〜１４９；スチューバー・ディおよびブヤードーｘイチ（Ｓｔｅｕｂｅｒ、　Ｄ、　ａｎｄ、　Ｂｕｊａｒｄ、＋Ｈ，）、　（１９８２）、イー・エム・ビー・オー・ジャーナル（ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ）、　　１　、　１３９９〜１４０４）に類似した方法にて、アガロースゲル上で行ったＤＮＡ調製物の走査型デンシトメトリー法を含む。培養物を前記したごとくに液体ｔｒｐ誘導培地で増殖させ、収穫の直前に、ｐＢＲ３２２を含有するイー・コリに１２の等容量でスパイク（ｓｐｉｋｅ）　した。これをＤＮＡ回収の標準化についての内部対照として供した。プラスミドＤＮＡミニブレラは前記したごとくに調製した。一部をＲＮＡ５ｅ（ＤＮＡｓｅフリー）およびＥｃｏＲＩで消化して（直線化し）、希釈物の組を１％アガロースゲルでの電気泳動に付した。ＥｔＢｒ染色し、紫外線を照射したゲルをポラロイド型５５ポジ／ネガフイルムで写真にとり、ネガを島津二波長クロマトグラムスキャナー（モデルＣＳ− ９３０）で走査した。各レーンにおけるプラスミドピーク値を内部ｐＢＲ３２２対照プラスミドに対して標準化し、突然変異体プラスミドの相対的モル比を非突然変異誘発プラスミドのそれで除することによってコピー数比を決定した。

プラスミドコピー数決定の他の方法は、色素を浮かせた密度勾配遠心法（ストガード・ビイおよびモリン・ニス（Ｓｔｏｕｇｇｒｄ、　Ｐ、　ａｎｄ　　　。

Ｍｏ１ｉｎ、　Ｓ、）、　（１９８１）、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）１１８．　１９１　１９３　；ウォンブル・ディ・ディ、ティラー・ディ・ビイおよびロウンド・アール・エイチ（ｆｏｉｂｌｅ。

Ｄ、　Ｄ、　、Ｔａｙｌｏｒ、Ｄ、　Ｐ、　ａｎｄ　Ｒｏｗｎｄ＋　Ｒ，Ｈ，）　（１９７７）ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　１３０．　１４８　１５３；カロ、エルら（Ｃａｒｏ、　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ）　（１９８４）メト・ミクロパイオル（Ｍｅｔｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ）、　　１７．　９７−１２２）による溶解物からのＤＮＡの定量であった。（ＤＮＡの標識を容易とするための；カロら（Ｃａｒｏ、　ｅｔ　ａｌ）前掲）０．０２％酸加水分解カザミノ酸および５０μｇ／ｍ１２ウリジン、１００μｇ／ｍＩ２アンピシリン、および２０μＣｉ／ｍＱ’Ｈ−チミジンを含有するｔｒｐ培地の培養物１０．０ｍ（２を前記した２５ｍ１２プロング・フラスコ中で増殖させた。細胞増殖および封入体形成をモニターするために、標識無しの培養を平行して行った。後期対数期に遠心によって細胞を収穫し、細胞ペレットを直ちにドライアイス上で冷凍し、−８０℃で一晩貯蔵した。冷凍した細胞ペレットを氷上でゆっ（りと解凍し、各々を１．０ｍ１２　１０ｍＭトリス−ＨＣｌ２、ｐＨ８，０，５０ｍＭ　　Ｎａ。

ＥＤＴＡに懸濁し、溶解物を以下のごとくに調製した。ｄＨ，ｏ中の５ｍｇ／ｍ（ｌリゾチーム１００μＱを各々に添加し、３７℃で１０分間セットした。２０％ＳＤ”８１２．５μＱを添加し、穏やかに混合し、２０ｍｇ／ｍ２プロテイナーゼＫ１００μＱを添加し、３７℃で１０分間、次いで６５℃で３０分間インキュベーションを行った。

試験管を室温に移行させ、各溶液を１．０ｍ１２プラスチツク製ピペツト中で２０回吸い上げたり下げたりすることによって染色体ＤＮＡに剪断力をかけた。（ＴＣＡ沈澱およびシンチレーション計数によって測定して２．　ＯＯ０，０００ないし３．ＯＯＯ，ＯＯＯｃｐｍがＤＮＡに取り込まれた）各溶解物０．５ｍＱを用いてベックマンのクイック−シール（ｑｕｉｃｋ−ｓｅａｌ）超遠心試験管中にＥｔＢｒ−Ｃ５ＣＱグラジェント５．５ｍＱを調製した。試料をＶＴｉ５５０−ター中、４８０００ｒｐｍで２０時間遠心した。オーツ７−　（Ｈｏｅｆｆｅｒ）密度勾配管分別機（ＦＳＩＯＩ）を用いて遠心管の底からグラジェント画分を収集した。全グラジェントが分別されるまで（グラジェント当たり約１２０ないし１５０の試料）連続した画分をワットマン３ＭＭフィルター・スクウェアーズ上に収集した。該フィルターを１０％ＴＣＡで３回、１００％ＥｔＯＨで１回洗浄し、加熱ランプ下で乾燥し、各々を６ｍ１２ナクアゾル（Ａｑｕａｓｏｌ）　（Ｄｕｐｏｎｔ／ＮＥＮ）中、トリチウムについて計数した。該計数値をプロットし、プラスミドＤＮＡおよび染色体ＤＮＡピークにおける全計数を決定した（バックグランドについて補正；負荷した計数１００％を各グラジェントで回収した）。これらの計数に基づき、染色体当たりの相対コピー数を決定した（プラスミドＤＮＡビークｃｐｍ／染色体ＤＮＡビークｃｐＩＩ＋）。次いで、ｌの染色体の分子量に対する１のプラスミドの分子量の比でこれらの値を除することによって染色体当たりのコピー数を計算した（本ケースでは、３．３３６ｘ　１０”／２．５ｘ　１０”＝０．００１３５）。次いで、相対モル比を前記したごとくに計算した。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写−翻訳実験については、ＤＮＡ発現系（原核生物、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ；　ＮＥＫＯ３８）をデュポン（Ｄｕｐｏｎｔ）社より購入し、製造業者の指示に従って用いた。各反応物（合計２０μｇ容量）は、２のＣ５ＣＱ− ＥｔＢｒ系の色素を浮かした密度勾配遠心で精製した３ｓＳ−メチオニン４０μ Ｃ１３ＳＳ−メチオニンおよびプラスミドＤＮＡ０．５μｇを含有していた。試料をドライアイス上で凍結することによって反応を停止した。５Ｘ蛋白ゲル試料緩衝液（レムリイ（Ｌａｅａｕ＋＋Ｉｉ）、前掲）　５．０μｆｆを各々に添加し、試料を３分間沸騰させた。各画分からの試料２．０μＱを５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、反応生成物を染色したゲルのオートラジオグラフィーによって可視化した。

本発明の詳細な記載で引用したすべての文献をここに参照のために挙げる。

実施例ＩＣ５ＣＱ精製した閉環状プラスミドｐｓＫ１０６ＤＮＡの亜硝酸でのｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異誘発は、従前に公表された手法（フリート・エム（Ｆｒｉｅｄ、　Ｍ、）　（１９６５）　、パイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）＋　　２５　＋６６９−６７１　；バオッーフリーゼ・イーおよびフリーダ・イー（Ｂａｕｔｚ −Ｆｒｅｅｓｅ、　Ｅ、　ａｎｄ　Ｆｒｅｅｓｅ、　Ｅ、　）　（１９６１）バイｏｏジー（Ｖｉ−ｒｏｌｏｇｙ）、　１３．　１９　３０：ウィリアムズ・ジェイ・エフら（Ｙｉｌｌｉａｍｓ。

Ｊ、　Ｆ、、ａｔ　ａｌ）　（１９７１）ジャーナル・オブ・ジェネティヵル・バイｏｏジー（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、）１１．　９５　１０１　；ボートシ二タイン・ディおよびショトル・ディ（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ、　Ｄ、　ａｎｄ　５ｈｏｒｔｌｅ、Ｄ、）（１９８５）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、　　２２９．　１１９３−１２０１）の変法によって行った。亜硝酸（亜硝酸ナトリウム）の新鮮な１．０Ｍストック溶液を水冷２回蒸留水中にて調製し、氷上にセットした。終濃度０．５Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４，６、ないし１００μ ｇＣ５ＣＱ精製プラスミドＤＮＡおよび新鮮な１．０Ｍ亜硝酸ストック溶液（最濃度０．２Ｍ）０．２ｍ＋４ならびに水を含有する１、０ｍ１２の反応試験管を氷上に調製した。突然変異誘発反応は該試験管を３７°Ｃの水浴に移すことによって開始した。

３０分後、１．０ＭＸ）ス−ＨＣ（１、ｐＨ８，０（７）２．５倍容ｊＩ（２，５ｍｄ）を添加して亜硝酸を中和することによって突然変異誘発反応を停止した。次いで、該物質を、２回取り替えたＴＥＮ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｆ２、ｐＨ８，０，１００ｍＭ　ＮａＣｌ２．１　ｍＭ　Ｎ　ａ　ｔＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ）２−０リツトルに対し４℃で一晩透析した。

エタノール沈澱によって各反応からのＤＮＡを回収し、乾燥し、許容量１０μ（ｌのｌＱｍＭトリス−ＨＣ（１、ｐＨ８，０に溶解した。

通常、得られた突然変異誘発ＤＮＡｌ０μＱを用い、アンピシリン耐性について３７℃における選択にて、コンピテントなイー・コリ細胞２００μＱを形質転換させる。

本発明者らは、チャートＡに示したプラスミド特異的突然変異体を単離した。前記したごとき対ｂＧＨ抗体を用いる高いｂＧＨ発現を示スコロニーからのプラスミドにおける突然変異を、制限断片を未突然変異誘発プラスミドに逆に継代クローニングすることによってマツプした。ｐＭｂｓｔｌと命名した１の高ｂＧＨ発現突然変異体プラスミドは本分析によると２の突然変異を有しており、共にｂＧＨ遺伝子領域の外側にマツプされた。各々がｐＭｂＳｔからの突然変異の１つを有する、ｐＭｂＳｔ３ＱおよびｐＭｂＳ、ｔ３１と命名した２種の新しいプラスミドは継代クローニングによって得られた。これらの２の突然変異の正確な位置はジデオキシ配列決定法およびマサキムおよびギルバートの配列決定法の組合せによって決定した。塩基の変化および位置はチャートＢに示す。プラスミドｐＭｂｓｔ３０およびｐＭｂＳ　ｔ　３１における突然変異は、各々、ｐｓＫ１０６ｂＧＨ構築体と比較してｂＧＨを増加させることが判明した。これらの２の突然変異が同一のｂＧＨ発現プラスミド（すなわちｐＭｂＳ　ｔ　１）中に一緒に含有されている場合、ｂＧＨは高いレベルで発現された。本発明者らは、ｐｓＫ１０６についての約１％と比較して、誘導後に、２０％までの合計細胞蛋白のｐＭｂ　Ｓｔｌを有するイー・コリに１２株におけるｂＧＨ発現レベルを観察した。

プラスミドコピー数決定の２種の方法により、生理学的温度にて発現が誘導された細胞におけるプラスミドｐＭｂＳ　ｔ　１のコピー数は３倍未満の増加であることが明らかとなった（相対的コピー数、ｐＭｂＳｔ　１／ｐＳＫ１０６、はミニブレブゲル走査によると２．１０、Ｃ３Ｃ（２グラジエントの計数によると１．１５であった）。

また、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写−翻訳アッセイにおいてプラスミド突然変異体からのｂＧＨ発現の増加が観察された。さらに、これらのアッセイは、該プラスミド突然変異体からのｂＧＨ発現の増加はプラスミドコピー数には依存しないことを示唆する。

叉皇洒２本実施例では、前記実施例１のプラスミドにおけるランダムな突然変異および選択によって産生された塩基変化の部位特異的産生について記載する。

公表された手法に従い、以下のごとくにプラスミドｐＭｂＳｔ３０を構築する。

ショルドら（Ｓｃｈｏｌｄ、　ｅｔ　ａｌ）、　　（１９８４）ディ・エイ・エヌ（ＤＮＡ）、３，４６９−４７７の手法に従い、合成オリゴヌクレオチド（オリゴ１．５°ＧＧＣＴＡＣＡＣＴＡＡＡＡＧＧＡＣＡＧＴＡＴＴＴ３’　”）をｐｓＫ１０６にハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション工程に続き、逆転写酵素、遺伝子３２蛋白、ｄＮＴＰおよび前記した適当な緩衝液を含有する反応混合物中で該オリゴヌクレオチドを伸ばす。得られた反応混合物を用いてコンピテント・イー・コリ細胞（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からのＪ　Ｍ　１０１　）を形質転換し、アンピシリンを含有するＬＢプレート上で平板培養する。得られた形質転換コロニーをニトロ毛ルロースに乗せ、前記したごとくにハイブリダイゼーション用に調製する（グルンステイン・エムおよびホグネス・ディーｘス（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ、Ｍ、　ａｎｄ　Ｈｏｇｎｅｓｓ、Ｄ、　Ｓ、）　（１９７５）プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）、　　７２．３９６１−３９８５）。オリゴ１は前記したごと＜”Ｐ−ＡＴＡで５′末端を標識する（マニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　ｅｔ　ａｌ）、前掲）。次いで、ゲデル・ディ・ブイら（Ｇｏｅｄｄｅｌ、　Ｄ、　Ｖ、、　ｅｔ　ａｌ）　（１９８１）　、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、　　２９０．　２０　２６によって記載されているごと（に、ニトロセルロースフィルターをオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーシヨンの後、溶液を含有する該プローブを取り出し、次いで、該オリゴヌクレオチドがｐＳＫＳタルを０．１％ＳＤＳ、５ｘＳＳＣ中で洗浄する（ワレス・アール・ビイら（ｌａｌｌａｃｅ、　Ｒ，Ｂ、、ｅｔ　ａｌ）、　　（１９８１）　＋　ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ＋＋、）　、　９．８７９　８９４）。最強にハイブリダイズするコロニーからのプラスミドＤＮＡを調製し、配列決定して、ヌクレオチド番号３７０８ないし３７２０における変化した配列（５°ＣＡＣＴＡＡＡＡＧＧＡＣＡ：（’　”）を確認する。

オリゴ２　（５’ＣＣＣＣＴＡＣＡＣＧＧＡＡＧＣＡＴＣＡＡＧ３°）を突然変異誘発およびハイブリダイゼーション工程で用い、前記したのと同様の技術によりプラスミドｐＭｂｓｔ３１を構築することができる。

プラスミドｐＭｂｓｔｌは、ｐＭｂｓｔ３０からのｂｌａ遺伝子を含有する２０６４ｂｐＥｃｏＲＩ−Ｎｄｅ　Ｉ断片を精製し、それを、ｐＭｂｓｔ３１からのｂｓｔ遺伝子およびｒｏｐ遺伝子を含有する精製した３０３５ｂｐＥｃｏＲｒ− Ｎｄｅ　Ｉ断片に結ぶことによって構築することができる。得られた組換体プラスミドを配列決定して突然変異の存在を確認することができる。

尖嵐剥１本実施例では、ｐＭｂｓｔｌ（実施例１）におけるｂＧＨ同族体の発現を記載する。

プラスミドＩ）Ｔｒｉ）−ＢＳｔｍ４は従前に記載されているｂＧＨ発現ベクターである（米国特許出願０１６，２９４号）。それは、第４番目のアミノ酸（アラニン）についてのコドンがＧＣＣからＧＣＴに変化させたｂＧＨｃ　　ＤＮＡ遺伝子の同族体を含有する。発現制御要素および遺伝子の５°−コーディング領域を含有するｐＴｒｐ−ＢＳｔｍ４の小さなＥｃｏＲＩ−ＭｓｔｌＩ断片を用いてｐＭｂＳｔｌの類似断片を置き換えた（両突然変異をもつプラスミド突然変異体）。得られたプラスミドで形質転換したイー・コリ細胞は同族遺伝子からのｂＧＨ発現において５ないし１０倍の増加（０，１％未満から０．５％を超えるまで）を示した。

実施例４また、本明細書中に記載するプラスミド突然変異体は他の遺伝子およびその同族体の発現にも有用である。カーター・ディ・ビイら（Ｃａｒｔｅｒ＋　Ｄ、　Ｂ、、　ｅｔ　ａｌ）、（１９８８）、［蛋白；構造、機能および遺伝学（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ；５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ＧｅｎｅｔｉｃＩＩ）Ｊによって記載されているごとくに、ヒトＩＬ−１βについてのｃＤＮＡを含有するＤＮＡ断片をヒト肝癌細胞系５Ｋ−ｈｅｐ−１のＲＮＡから単離し、成熟ＩＬ−１βコーディング領域を含有するＨｇ　１ＡＩ−Ｐｓｔｌ断片を発現プラスミドｐＴｒｐ−ｃｏｎＳＤ　（米国特許出願０１６，２９４号）のＡｓｐ７１８部位にインフレーム・クローンした。この構築の結果、成熟ＩＬ−１β 蛋白のアミノ末端における３個の付加アミノ酸についてコード付けする成熟ＩＬ −１βｃＤＮＡ遺伝子の同族体が得られる（カーター・ディビイ（Ｃａｒｔｅｒ、　Ｄ。

Ｂ、、　ｅｔ　ａｌ）、前掲）。この遺伝子同族体をＩＬ−１β＋と命名する。

得られたプラスミド、ｐＴｒｐ−ｃｏｎＳＤ−ＩＬＬを含有するイー・コリ細胞におけるＩＬ−１β十蛋白の発現は合計細胞蛋白の１％よりかなり小さかった。

ＩＬ−１β十遺伝子を含有する小さなＥｃｏＲＩ−３ａ　Ｉ　Ｉ断片をｐＴｒｐ −ｃｏｎＳＤ−Ｉ　Ｌｌから単離し、それを用いて、ｐＭｂｓｔｌの（修飾されたｂＧＨ遺伝子を含有する）同族断片を置き換えた。得られたプラスミドで形質転換したイー・コリ細胞はｐＴｒｐ−ｃｏｎＳＤ−ＩＬＩを含有する細胞の５ないし１０倍高いレベルでＩＬ−１β十蛋白を発現した。

チャー）Ａ　　プラスミドｐｓＫ１０６および新規突然変異の位置ＥｃｏｉＩ　　　　　　　　　　　　ｐＫｂｓｔ３Ｌ　　　　　　ｐｌＧ＋５ｅ３０　　　　ＥｃｏＲＩ星印（＊）は、単一線が環状二本鎖ＤＮＡ分子を表すことを示す。

遺伝子、制限部位、制御要素、および突然変異の相対的位置のみを示す。

チイートＢ　プラスミドｐＭｂｓｔ３０およびｐＭｂＳ　ｔ　３１を産生するためのｐｓＫ１０６における特異的塩基変化の位置ｐＭｂｌｔ３１　　　　　　　　　　Ａ社徨１各場合において、垂直矢印は、ｐＭｂＳ　ｔ　３１およびｐＭｂＳｔ３０において点突然変異を生じた単一の塩基対変化の位置を示す。

ヌクレオチド番号はジェイ・シイ・ストクリフェ（Ｊ、　Ｇ、　５ｕｔｃｌｉｆｆｅ）、コールド・スプリング・ハーバ−・シンポジウム・ファント・パイオル（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、　Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ、）、４３頁、７７−９０　（１９７９）による。

請求の範囲補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成２年６月１９日

Claims

【特許請求の範囲】

１．ＲＮＡＩＩ遺伝子またはｒｏｐ遺伝子の翻訳開始領域、あるいは双方における突然変異、および制限部位よりなり、異種ポリペプチドをコード付けするＤＮＡ配列がベクターに挿入されかつ発現制御配列に作動可能に連結し、該突然変異が発現ベクターのコピー数を実質的に増加させないことを特徴とするＣｏｌＥ１ −タイプ複製系を有する発現ベクター。
２．該異種ポリペプチドがソマトトロピンである請求の範囲第１項記載のベクター。
３．該ソマトトロピンがプタ、ヒツジおよびウシのソマトトロピンよりなる群から選択される請求の範囲第２項記載のベクター。
４．該ソマトトロピンがウシのものである請求の範囲第３項記載のベクター。
５．コピー数における増加が３倍以下である請求の範囲第１項記載のベクター。
６．ＲＮＡＩＩ遺伝子における突然変異がＲＮＡＩプロモーターにおける突然変異でもある請求の範囲第１項記載のベクター。
７．翻訳開始領域における突然変異がシャイン−ダルガノ配列に存在する請求の範囲第１項記載のベクター。
８．該ベクターがｐＭＢ１由来のベクターである請求の範囲第１項記載のベクター。
９．該ベクターがｐＢＲ３２２由来のベクターである請求の範囲第８項記載のベクター。
１０．該ベクターがｐＳＫ１０６由来のベクターである請求の範囲第９項記載のベクター。
１１．該異種ポリペプチドがプタ、ヒツジおよびウシのソマトトロピンよりなる群から選択される請求の範囲第１０項記載のベクター。
１２．該ソマトトロピンがウシのものである請求の範囲第１１項記載のベクター。
１３．ｐＭｂＳｔ３０、ｐＭＢＳｔ３１、ｐＭｂＳｔ１およびその誘導体より選択される請求の範囲第１０項記載のベクター。
１４．請求の範囲第１項記載の発現ベクターで形質転換した宿主を培養することよりなる異種ポリペプチドの発現方法。
１５．請求の範囲第１項記載の発現ベクターで形質転換した宿主。
１６．エシェリヒア・コリおよびサルモネラよりなる群から選択される請求の範囲第１５項記載の宿主。
１７．エシェリヒア・コリである請求の範囲第１６項記載の宿主。