JPH03500415A - interleukin 2 analogue - Google Patents

interleukin 2 analogue

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JPH03500415A
JPH03500415A JP1508038A JP50803889A JPH03500415A JP H03500415 A JPH03500415 A JP H03500415A JP 1508038 A JP1508038 A JP 1508038A JP 50803889 A JP50803889 A JP 50803889A JP H03500415 A JPH03500415 A JP H03500415A
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JP1508038A
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アルトロツク，ブルース・ダブリユ
ブーン，トーマス・シー
ゴールドマン，ロバート・エイ
ケニー，ウイリアム・シー
スタビンスキー，イツアーク
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アムジエン・インコーポレーテツド
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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 インターロイキン■類似体 本発明は、−ｍ的には遺伝子材料の操作、より特定的には、インターロイキン■ 類似体の発現を達成する組換え手順で有用な特異的ＤＮＡ配列の製造に係る。 １１へ１１ 分子量約１５，０００の糖タンパク質であるインターロイキンＩＩ　（ＩＬ−２ ）は、体内免疫応答をコントロールするリンフ才力インと呼ばれるタンパク質の グループに属する。　ＩＬ−２はある種の白血球、レクチン−または抗原−活性 化Ｔ細胞によって産生され、体内免疫系においてリンパ球調節分子として中心的 な役割を果たす。 ＩＬ−２は、胸腺細胞分裂誘発を促進し、活性化ＴＭｉ胞クワクローン期国ツ工 ■−増殖を刺激し、細胞障害性Ｔ細胞反応性を誘発し、活性化Ｂ細胞及びリンフ 才力イン活性化細胞に対する免疫作用を調節し、ヌードマウス牌細胞の培養物中 のプラーク形成性細胞応答を誘発し、γインターフェロンの産生を調節すると報 告されてきた。　ＩＬ−２はまた、天然キラー細胞活性を増加させ、選択された 免疫不全状態のリンパ球の免疫機能の回復を媒介する。 更に実験室では、機能的モノクローナルＴ細胞の培養物を維持してＴ細胞分化の 分子的性質を研究するため、及び、分化したＴ細胞の機能メカニズムの解明を助 けるためにＩＬ−２が使用されている。従って、ＩＬ−２は、悪性新生物及び免 疫不全疾患の研究及び治療の双方に有用である。 ＩＬ−２は、標的細胞の表面の特異的高親和性レセプターに結合することによっ てその効果を発揮する。従って、ＩＬ−２分子は、免疫応答における細胞増殖を 調節するレセプター−エフェクター相互作用の研究の焦点となる。 標的細胞に対するＴＬ−２の作用を媒介する主体となる高親和性（ＫＤ〜１０− １１Ｍ＞レセプターは、サイズ５５ｋＤ（ｐ５５またはＴａｅ）及び７５ｋＤ（ ｐ７５）の異なる２つの膜結合タンパク質から成る。これらの２つのタンパク質 の各々は、単独ではＩＬ−２に対する見掛は親和性の低い（ＫＤ〜１０−＠Ｍ） レセプターとして作用し、ＩＬ−２活性には両方のタンパク質が必要である。 このことは、ＩＬ−２が活性を発揮するためにはｐ５５及びｐ７５の双方と結合 して三量体の複合体を形成する必要があること、従って、ＩＬ−２が異なる２つ のレセプター結合部位を有していなければならないことを示唆する。 末梢血液リンパ球及び腫瘍細胞系から得られる精製された天然ＩＬ−２の量は少 ないので、組換えＩＬ−２の産生ができるようになるまではこのリンフ才力イン の生物学的役割を十分に研究することができなかった。 Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、　Ｔ、等はＮａｔｕｒｅ、　３０２：３０５〜３１０（１ ９８３）に、Ｊｕｒｋａｔ白血病細胞系に由来の部分精製ＩＬ−２ｍＲＮ＾から 調製されたｃＤＮ＾ライブラリィからクローニングされたヒトＩＬ−２をコード する相補的ＤＮＡの配列解析、クローニング及び発現を記載した。ＩＬ−２は１ ３３個のアミノ酸残基を含み、計算分子量約１５，４２０であると発表された。 　Ｔａｎｉｇｕｃｈｉは、培養サルｃｏｓｓ胞中でのＩＬ−２のｃＤＮ＾のクロ ーニング平原及び発現を記載している。この文献には、大腸菌中でのＩＬ−２ｅ ＤＮ＾の発現はまだ成功していないと記載されている。　１９８４年９月１９日 付けの欧州特許出願第１１８，６１７号、１９８４年９月１９日付けの同１１８ ，９７７号、及び１９８４年９月２６日付けの同第１１９，６２１号、並びに米 国特許第４，７３８，９２７号も参照されたい。 ＲｏｓｅｎｂｅｒＨ等は５ｃｉｅｎｃｅ、２２３：１４１２’−１４１５（１９ ８４）に、Ｊｕｒｋａｔ腫瘍細胞系及び正常ヒト末梢血液リンパ球に由来のＩＬ −２遺伝子の別のｃＤＮ＾クローンの単離を報告している。彼等は、大腸菌に遺 伝子を挿入し、ポリペプチド産物を精製し、その生物学的活性を検定した。ヒト ＩＬ−２遺伝子の部位特異的突然変異誘発に関しては、Ｈａｎｇ等、　５ｃｉｅ ｎｃｅ、　２２４：１４３１〜１４３３（１９８４）及び１９８４年５月３０日 付けの欧州特許出願第１０９゜７４８号を参照されたい。 ＩＬ−２の変形（ｍｏｄｉｒ　１ｅａｔｉｏｎ）に関する文献としては、Ｊｕ等 。 Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６２：５７２３（１９８７）；Ｌｉａｎｇ等 、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、。 競上：３３４（１９８６）及びＭｉｙａｊｉ等、＾ｇｒ’＋ｃ、　Ｂｉｏｌ、　 Ｃｈｅｍ、　５１：１１３５（１９８７）がある。 免疫療法の研究で現在使用されているＩＬ−２含有調製物に代替して使用できる 精製ＩＬ−２類似体を量産する方法及び材料の開発は極めて重要な課題である。 本発明の目的は、改良された形態のＩＬ−２を提供することである。 本発明の目的はまた、現在使用されているＩＬ−２調製物よりも毒性の少ないＩ Ｌ−２類似体を提供することである。 生物学的活性に影響を与えることなくリガンドを結合し得るＴＬ−２類似体を提 供することも本発明の目的の１つである。 更に、本発明の目的は、ＩＬ−２の精製方法を提供することである。 本発明のその他の目的及び諸特徴は、以下の記載及び請求の範囲より十分に理解 されよう。 光１１ケＪＬＬ 本発明は、変形されたレセプタードメインを有するＩＬ−２類似体及び安定なＩ Ｌ−２構造を有する類似体に係る９本発明はまた、リガンドを結合し得るように 改変されたＩＬ−２類似体に係る。より特定的には本発明は、宿主細胞による人 工遺伝子（イａｎｕｆａｃｔｕｒｅｄ　ｇｅｎｅ）の発現産物であるポリペプチ ドに係る。該ポリペプチドは以下の式［１］、Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ 　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　ＴｈｒＧｌｎ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　 Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　ＡｓｐＬｅｕ　Ｇｌｎ　Ｍ ｅｔ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　ＡｓｎＴｙｒ　Ｌｙ ｓ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　ＬｅｕＴｈｒ 　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａ Ｔｈｒ　Ｃ１ｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　 Ｇｌｕ　［１コＧｌｕ　にＩｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｃ１ｕ　に ｌｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ＾ｓｎ　Ｌｅｕ＾Ｉａ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ 　Ｐｈｅ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ＾ｒｇ　Ｐｒｏ＾ｒｇ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｓ ｅｒ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　ＡｓｎＶａｌ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅ ｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　ＧｌｕＴｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ 　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｃ１ｕＴｈｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　 Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　ＡｒｇＴｒｐ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｐ ｈｅ　Ｘ　にＩｎ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　５ｅｒＴｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ で示されるアミノ酸配列を有しており、式中の４７．５１．８０．８１．１０６ ．１０９．１１２．１１９．１２０．１２３．１２７．１３１及び１３３番目の 出発アミノ酸残基の少なくとも１つが置換アミノ酸残基によって置換されるか、 または、８．４７．４８．５１．５４．８０．８１．１０６．１０９．１１２． １１９．１２０．１２１．１２３．１２７．１２９．１３０．１３１．１３２及 び１３３番目の出発アミノ酸残基の少なくとも２つが置換アミノ酸残基によって 置換され、及び／または、カルボキシ末端に１つの付加的残基が結合し、ＸはＣ ｙｓ、Ａｌａ及びＳｅｒから成るグループから選択されている。 本発明はまた、以下のＩＬ−２類似体を包含する：ＩＬ、＝２の１つまたは複数 の任意のへリックス（好ましくはへリックスＡ及び／またはへリックスＦ）中の １つ、２つ、３つまたはそれ以上の出発アミノ酸が該ヘリックスの両親媒性を維 持または弱める置換アミノ酸によって置換されたＩＬ−２類似体；ヘソックスＡ 、Ｂ、Ｂ’及び／またはＥ中の１つ、２つ、３つまたはそれ以上の出発アミノ酸 が出発アミノ酸とは異なる電荷を有する置換アミノ酸によって置換された顕似体 ；ヘソックスＡ、Ｂ、Ｂ’、Ｃ，Ｄ、Ｅ及び／またはＦ中の１つ、２つ、３つま たはそれ以上の出発アミノ酸が、αへリックス椹造に対して出発アミノ酸よりも 優先性の置換アミノ酸によって置換された類似体０本発明はまた、かかるポリペ プチドをコードする人工（ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｄ）ＤＮＡ配列に係る。 更に、本発明はかかるペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体、並びに ＩＬ−２及びＩＬ−２類似体の精製方法に係る。 ・′　の、ｔ；Ｂ 第１（＾）図はＩＬ−２のα炭素主鎖の説明図である。第１（Ｂ）図はへソック スを円筒で示すＩＬ−２の立体構造の説明図である。 第２図はＩＬ−２とそのレセプターとの可能な相互作用モードを示す概略図であ る。 第３図はＩＬ−２ｉ造及び対応するアミノ酸の位置を示す説明図である。 １ｉｒＩ監 インターロイキンＩＩ　（’ＩＬ−２Ｊ）の新規なポリペプチド類似体が知見さ れた０本発明の第１の実施態様では、天然ＩＬ−２の推定された（ｐｒｏｐｏｓ ｅｄ）レセプター結合ドメインの部位特異的変形（ｓｉｔｅ　５ｐｅｃｉｆｉｃ 　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、及び、Ｉし２螺旋構造及びＩＬ−２全体構造を 安定させる改変（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）が得られる。第２の実施態様では、推 定されたレセプター結合ドメインからは遠く隔たっているが別の分子との化学反 応は容易なＩＬ−２の部位に異常（ｏｄｄ）システィンのごときアミノ酸を組み 込む。 本発明はまた、選択された微生物宿主（例えば、細菌、酵母及び培養哺乳類細胞 ）中で前記ＩＬ−２類似体の合成を指令し得る人工遺伝子を提供する。好ましい 形態の人工遺伝子においては、塩基配列が、予定の宿主微生物例えば大腸菌中で のコドンの発現優先性に基づいて、同じアミノ酸を特定する複数の代替可能コド ンから選択された１つまたはそれ以上のコドンを含む（＾］　ｔｏｎ等、国際出 願ＷＯ３３１０４０５３）　。 別の好ましい形態の人工遺伝子は、コードされるポリペプチドの付加的アミノ酸 残基（例えば開始Ｍｅｔ残基）を特定するコドンのヌクレオチド塩基を含む、こ れは、大腸菌中での直接発現を容易にする。更に別の好ましい形態の人工遺伝子 においては、所望のポリペプチドを特定するコドンの塩基配列の上流及び／また は下流及び／または内部に、発現ベクターの形成またはポリペプチド類似体の新 しい構造遺伝子の発生を容易にする１つ以上の塩基配列が存在する。 即ち、構造遺伝子の一端または両端または中間位置に、選択された制限エンドヌ クレアーゼ開裂部位を与える塩基配列と、リポソーム結合部位を与える配列、例 えばＣ＾＾ＣＧ八〇ＧＴへ存在する。 本発明はまた、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の種類及び／または位置が天 然ポリペプチドとは異なるようなＩＬ−２類似体の微生物発現を指令し得る人工 遺伝子を提供する。 本発明の実施では、人よりＮＡ配列をウィルス性または環状プラスミドＤＮＡベ クターに挿入してハイブリッドベクターを形成し、ハイブリッドベクターを使用 して細菌（例えば大腸菌）、酵母細胞のごとき微生物宿主細胞、または培１ｉ１ ｉ乳類細胞を形質転換する０次に、形質転換された微生物を適当な栄養条件下に 増殖させ、本発明のポリペプチド産物を発現させる。 本発明はまた、有効量の本発明のポリペプチド産物をＩＬ−２療法に有用な適当 な希釈剤、アジュバント及び／または担体と共に含有する医薬組成物を提供する 。 本文中でＤＮＡ配列または遺伝子の形容に使用される「人工」なる用語は、ヌク レオチド塩基の集合によって化学的に合成された産物、特定部位の突然変異誘発 によって合成された産物、または、上記のごとく合成された産物の生物学的複製 によって得られた産物を意味する。従ってこの用語は、ｃＤＮＡ法または生物学 的起源の材料を使用する遺伝子クローニング法によって「合成された」産物を除 外する。 本文中で使用される「置換アミノ酸」なる用語は、天然（「出発」）アミノ酸を 置換したアミノ酸、即ち出発アミノ酸とは異なるアミノ酸を意味する。 本発明の別の実施態様によれば、本発明のポリペプチドに特異的に結合するが天 然ＩＬ−２とは交差反応しない抗体が提供される。これらの抗体は当業者に公知 の方法で標識され得る。 本文中ではアミノ酸を以下の略号で示す、アラニン＾１ａ、アルギニン＾ｒｇ、 アスパラギン＾ｓｎ、アスパラギン酸＾ｓｐ、システィンＣｙｓ、グルタミンＧ ｌｎ、グルタミン１１　Ｇ　ｌ　ｕ、グリシンＧ１ｙ、ヒスチジンＨｉｓ、イン ロイシンｌｉｅ、ロイシンＬｅｕ、リジンＬｙｓ、メチオニンＮｅｔ、フェニル アラニンＰｈｅ、プロリンＰｒｏ、セリンＳｅｒ、トレオニンＴｈｒ、トリプト ファン丁ｒｐ、チロシンＴｙｒ、バリンＶａｌ、ヌクレオチド塩基には以下の略 号を使用する。アデニン＾、グアニンＧ、チミンＴ、ウラシルＵ及びシトシンＣ ０ 本発明を以下に詳細に記載するが、本発明を特定の操作理論に固定する意図はな い。 ＩＬ−２がαヘリックスタンパク質（第１図）であることは確認されている（Ｂ ｒａｎｄｈｕｂｅｒ等、５ｃｉｅｎｃｅ、　２３８：１７０７（１９８７）、該 文献の記載内容は本明細書に含まれるものとする）。このタンパク質は、アミノ 末端の近傍に短い螺旋セグメント（第１図の残基１１〜１９；ヘリックスＡ）を 有し、該セグメントに延長ループが続いている。残基３３〜５６は中央近傍でＰ ｒｏ４７によって道断即ち「ベントコされたヘリックスを形成している（従って ２つのセグメントＢ及びＢｏが形成される）。 ジスルフィドのＣｙｓ５８に続いてヘリックスＣを形成する残基６６〜７８、ヘ リックスＤを形成する残基８３〜１０１が存在し、Ｃｙｓ１０５の後に短い見掛 は螺旋状のストレッチＥを形成する残基１０６〜１１３が存在し、その次にカル ボキシ末端へソックスＦを形成する残基１１７〜１３３が存在する。分子中にβ 二次構造の見掛はセグメントは全く存在しない、総螺旋含量約６５％は、円二色 性に基づく算定値と良く一致する。Ｃｙｓ５８とＣｙｓ１０５との間のジスルフ ィドは、（第１図の配向の）分子の「頂部」のへソックスを接続する２つの延長 ループを結合する。 ヘリックスＢ、Ｃ，Ｄ及びＦは、シトクロムＣ′、シトクロムｂ、６．及びミオ ヘムエリトリンによって示される従来の４へソックスバンドルとはかなり異なっ た逆平行のαへソックスバンドルを形成する。ヘリックスの充填領域はより短く 、螺旋巻き数を３つまたは４つしか含まない、対照的に従来の４ヘリツクスバン ドルは通常、５つ以上の螺旋巻き数を含む、更に、充填角度はすべて２５度〜３ ０度の範囲である。従って、従来の４へソックスバンドルの平均約１８度よりも 幾分大きい。 マウスＩＬ−２は組換えヒトＩＬ−２と同様の構造、即ちヘリックスＡから始ま ってヘリックスＢ＋Ｂ’中にプロリン誘発ベントを含むと予想される０組換えヒ トＩＬ−２がヒト及びマウスの両方のＴ細胞に活性を示し、組換えマウスＩＬ− ２がヒトＴ細胞に対して低いが測定可能な活性を示すと報告されているのでこれ は極めて重要である。マウス及びヒトのＩＬ−２配列は全体として６４％相同で ある。成熟マウスタンパク質のアミノ酸配列は最初の７つの残基がヒト配列に等 しい。 次に、ヒトＩＬ−２のＬｅｕ１４の上流の１２残基のポリ（Ｇｌｙ）ストレッチ を含む１つ以上の挿入があり、結局、ヒトに比較して合計１５のアミノ酸が挿入 されている。従ってマウスのタンパク質のアミノ末端領域は、恐らくはヘリック スＡの第１螺旋巻きを含むヘリックスＡまではヒトタンパク質に比較してかなり の構造的差異を示す、マウスの配列中の唯一の付加的な挿入は、ヒトＩＬ−２残 基８０と８１との間のへソックスＣとＤとを結合するループ中に存在する。 ＩＬ−２レセプター結合に関する現在のデータは、分子が高親和性レセプターに 結合されたときは、該分子が独立の２つの結合部位で２つのレセプター分子、Ｐ ５５及びｐ７５、を「架橋」することを示唆する。それ以前の文献では２つのレ セプター分子の存在は予想されていなかった。従って、ＩＬ−２レセプター結合 に影響を与える種々の変形が、ｐ５５−（Ｉ　Ｌ−２）相互作用に影響を与える のか、ｐ７５−　（ＩＬ−２）相互作用に影響を与えるのかまたはその両方に影 響を与えるのかは判別できなかった。 レセプター結合で重要であると推定されるＩＬ−２配列中の領域全体の地図作成 のために、ＩＬ−２と交差反応するペプチドに対する抗体が使用された。特に、 Ｋｕｏ及びＲｏｂｂは、結合した残基８〜２７及び３３〜５４内部の領域がレセ プター結合に直接関与することを示唆する証拠を提示した。　Ｌ、　Ｋｕｏ　＆ Ｒ，Ｊ、　Ｒｏｂｂ、　Ｊ、　Ｉｍｍｎｏｌ、　１３７：１５３８（１９８６） 、他方、＾ｌ　Ｌ＋ｍａｎとその共同研究者は、残基５９〜７２．９１〜１０５ 及び１１９〜１３３のペプチドに対する抗体がＴＬ−２レセプター結合を阻害し ないことを知見した。＾、Ａｌｔｍｓ＋ｎ等、Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ 、　Ｓｃｉ。 υ、Ｓ、＾、　８１：２１７６（１９８４）。 Ｊｕ等（□）は、ヒトＩＬ−２の残基１〜１０（ヘリックスＡの初端までのアミ ノ末端）の欠失はマウスＣＴＬＬ−２細胞の増殖の誘発を３０〜５０％しか減少 させないが、残基１〜２０（ヘリックスＡを含むアミノ末端）の欠失は活性を完 全に喪失させることを証明した。Ｊｕ等１．ｕＬ、マウスＩＬ−２の欠失分析に よれば、マウスＨＴ２　Ｔ細胞の増殖活性に対する効果も同様のパターンを示す 、　Ｓ、　Ｍ、　Ｚｕｒａｗｓｋｉ等、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３７゜３ ３５４（１９８６）、マウスの残基１〜１１または１〜１３（マウスＩＬ−２が ヒトＩＬ−２に構造的に類似であると想定したときにこれらはへソックスＡの上 流に存在する）の欠失は、活性を最高で５０％減少させる。配列中の最初の３７ 個のアミノ酸の種々の変更（ｃｈａｎｇｅ）に関連したマウスのポリ（Ｇｌｎ） セクション、残基１５〜２６の欠失は、突然変異タンパク質の比活性を天然タン パクの１７３に減少させた。しかしながら、マウスの残基３０（ヘリックスＡの 中央のヒトの残基１６に対応する）を通る欠失は活性を天然タンパク質の約０． ４％に減少させ、残基４１（ヒト残基２７に対応する）を通る欠失は活性を完全 に喪失させる。 活性を喪失させると報告されたその他の欠失の多くは、ＩＬ−２の三次構造全体 を破壊するような欠失である（多くは、構造中の内部へソックスまたは結合ペプ チドの重要な部分の欠失である）。 部位特異的アミノ酸置換に関するデータでは、ＩＬ−２楕遺を不安定にすること によって活性に影響を与える突然変異とレセプター結合に直接影響を与える突然 変異との識別ができない、　ＩＬ−２のジスルフィドを破壊するかまたはＴｒｐ １２１（この側鎖は構造に内蔵される）を変形する改変以外のヒトＩＬ−２の活 性低下を生じるすべての突然変異は、配列領域３〜１７及び３６〜５４に存在す る。　Ｊｕ等、！先。これは抗体競合研究によって示唆されたレセプター結合領 域の確証となる。 「ダウン」点突然変異は、ＩＬ−２モデルに配置されたときに特異的レセプター 結合表面を認識しない。 ヘリックスＢ、Ｃ，Ｄ及びＦは構造骨格を形成し、ヘリッスクＡ、Ｂ’、Ｂの一 部及びＥはＩＬ−２のレセプター結合部位を形成する（第２図）、ヘリックスＥ の関与は主として、レセプター相互作用に関与すると推定される分子の領域に対 するヘリックスＥの空間的な接近容易性及び近接性によって示唆される。 ＩＬ−２は高親和性レセプターを介してＴ細胞に結合するが、低親和性レセプタ ーを介してその他の免疫系細胞にも結合しこれらの細胞を活性化するであろう、 観察されたＩＬ−２の毒性副作用の一因は、これらの他の細胞の活性化にあると 考えられる。 ヒトＩＬ−２の　造的亦種（ｖａｒｉａｎｔ）ＩＬ−２のレセプター結合ドメイ ンの改変、及びＴＬ−２構造を安定させる改変が、Ｔ細胞に対する特異性の変化 したＩＬ−２類似体を産生じ、活性及び／または毒性が変性された改良ＩＬ−２ 分子を生じる。アミノ酸、好ましくはレセプター結合ドメインのへソックスの親 水性アミノ酸が、異なる電荷を有するアミノ酸で置換されたＩＬ−２類似体は本 発明に包含される（例えば正荷電側鎖をもつアミノ酸が負荷電側鎖または非荷電 側鎖をもつアミノ酸で置換される。後記参照）。 また、ヘリックスの構造を安定させ類似体全体を安定させるために、αヘリック ス構造に優先性を有する１つ以上のアミノ酸が、ＩＬ−２の１つ以上のへソック ス、特にヘリックスＡ、Ｂ’、Ｂ、Ｅ及びＦを置換した類似体も本発明に包含さ れる（Ｃｈｏｕ　＆　Ｆａｓｍａｎ、＾ｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ４７：２５１（１９７８）。 本発明の理解を助けるためにＣｈｏｕ及びＦａｓｍａｎのヒエチルキーを以下に 示す。 αへソックス多　に　る Ｇ！ｕ（−）　１．５１ Ｍｅｔ　１．４５　Ｈ，＝強いα形成物質Ｌｙｓ（＋）　１．１６ Ｐｈｅ　１．１３ Ｇｌｎ　１．１１　ｈ、＝　ａ形成物質Ｔｒｐ　１．０８ １１ｅ　１．０８ ＶＪＩＩ　１．０６ ＾５ｐ（−）　１．０１　！。−弱いα形成物質）１ｉｓ（＋　）　１．００ ＾ｒｇ（十）　０．９８ Ｔｈｒ　Ｏ，８３ｉａ＝　ａに影響無しＳｅｒ　０．７７ Ｃｙｓ　Ｏ，７０ Ｔｙｒ　Ｏ，６９１）ａ＝　ａ破壊物質へｓｎ　０．６７ Ｐｒｏ　０．５７　Ｂ、＝強いα破壊物質Ｇｌｙ　Ｏ，５７ ＩＬ−２のへソックスは両親媒性ヘリックスである（Ｋａｉｓｅｒ等、　ＰＮＡ Ｓ、　８０：１１３７〜１１４３（１９８３）及びＫａｉｓｅｒ等、　５ｃｉｅ ｎｃｅ。 砒＝２４９〜２５５（１９８４））。 この両親媒性相互作用はメリチン、パルトキシン（ｐａｒ−ｄｏｘｉｎ）及びマ ガエン（ｍａｇａｎｉｎ）のごときいくつかの細胞障害性ペプチドに共通である 。より詳細には、Ｆヘリックスは極めて両親媒性で、Ｆヘリックス中のアミノ酸 のいくつかはαへソックス構造に高い優先性を有していない、従って、Ｆヘリッ クスの疎水性表面とＣヘリックス及びＤヘリックスとの相互作用は、Ｆヘリック ス配列を螺旋形態に維持するために必要なエネルギーを供給すると考えられる。 αヘリックス構造に高い優先性をもつ残基を含むように選択されたアミノ酸置換 （例えば、＾５ｎ−ｄｌ：Ｉｎ、Ｔｒｐ−＋Ｐｈｅ、５ｅｔ−＋Ｇｉｎ）を含む 改変へソックス配列を含むＩＬ−２類似体を構築した。その結果として得られる ヘリックスは、螺旋構造を維持するために強い両親媒性相互作用を必要とせず、 従ってアミノ酸置換によって、ヘリックスの両親媒性は維持されてもよく（例え ば親水性ｇ！Ｉ鎖を有するアミノ酸が親水性側鎖な有する別のアミノ酸で置換さ れると、上記の３つの置換は両親媒性を維持する）、または変性されてもよい（ 例えば親水性側鎖を有するアミノ酸が疎水性側鎖を有するアミノ酸で置換される ）。 活性を損なうことなく別の分子と共有結合し得る類似体を横築した。これらの類 似体は、毒素、リポータ−基または抗ウイルス性もしくはその他の治療用化合物 に結合され、治療的に重要なＩＬ−２複合体（ｃｏｎ　ｊｕｇａｔｅ）の開発、 及び高感度生物学的アッセイ開発のための特異的標１１Ｌ−２の産生に使用され る。これらの部位特異的結合（ｓｉｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｃｏｎｊｕｇａｔｉ ｏｎ）を得る最も便利な方法は、特有の反応性スルフヒドリル基を有する異常シ スティン残基の導入を介した方法である。天然異常システィン（Ｃｙｓ１２５） は、埋没しており未反応になり易いので、戦略の焦点は、化学的に接近容易なシ スティンを（＾Ｉａ”５）ＴＬ−２に組み込むことにある。 本発明は、既存アミノ酸の置換の変形として、付加アミノ酸が既存アミノ酸間に 挿入された改変を含む。 １、ＩＬ−２のレセプター結ムドメインの　六　びＬｊ］！ｊ告を支叉」にＬ配 炊ヌ− 高親和性レセプター相互作用に関与するαへワックス領域の親水性アミノ酸（第 １図、第２図及び第３図のＡ、Ｂ、Ｂ′及びＥ）は有望なアミノ酸置換部位であ る。これらの部位が別のアミノ酸（特にレセプターと相互作用するヘリックス表 面の電荷を変えるアミノ酸）でＷ換されると、レセプター結合特性が影響を受け て分子の活性スペクトルが変化する。かかる変化はまた、種々の細胞型のレセプ ターと相互作用する分子の能力を変化させる。これらの細胞は夫になる０例えば 、ＩＬ−２レセプターのｐ７５成分だけを保有する細胞は、ｐ７５ドメインが改 変されたＩＬ−２種に応答しないので、分子が生物学的に有意なレセプター結合 を生じることはもはやできない、　ＩＬ−２細胞刺激方法にかかる選択性を導入 すると、材料の治療指数を向上させることができる（例えば、１つの細胞型の刺 激に起因する好ましくない副作用を減少させ同時に適当なエフェクター細胞型を 刺激するＩＬ−２の能力を維持し、結局病気を抑える）０例えば、レセプター結 合ドメインのへソックスのある種の改変は、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−１及びＴＮＦの ごときリンフ才力イン誘発能力が減少しているが（＾ｌａ’　”）ＩＬ−２また は天然ＩＬ−２に比較して均等（ｅｑｕｉ−ｖａｌｅｎｔ）の生物学的活性を有 するＩＬ−２類似体を産生させ得る。 本発明を理解し易くするために、アミノ酸１１ｅ、Ｌｅｕ、　Ｎｅｔ、Ｐｈｅ、 　Ｐｒｏ、　Ｔｒｐ、　Ｔｙｒ及びＶａｌの側鎖が通常は非極性（疎水性）、ア ミノ酸＾Ｉａ、＾ｓｎ、　Ｃｙｓ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ及びＴｈｒの側鎖が 極性（親水性）で非荷電、アミノ酸＾ｒｇ、Ｈｉｓ及びＬｙｓ の側鎖が親水性で正荷電、アミノ酸 ＾ｓｐ及びＧｌｕ の側鎖が親水性で負荷電と考える。 Ｈｏｐｐ　＆　Ｗｏｏｄｓ、　ＰＮＡＳ″７８　Ｎｏ、６：３８２４〜３８２８ （１９８１）；Ｋｙｔｅ　＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、　Ｊ、　Ｍｏ１ｅｅ、　Ｂｉ ｏｌ、　１５７：１０５〜１３２（１９８２）；Ｐａｒｋｅｒ等、　Ｂｉｏｃｈ ｅ＋ａｉｓｔｒｙ、　２５：５４２５〜５４３２（１９８６）も参照されたい。 Ａ、Ｅへ１・・　スの　１ 短いＥヘリックスがレセプター結合に関与する。従って、Ｅへソックスはレセプ ター結合を改変する突然変異の好適な標的である。３つのアミノ酸側基Ｇｌｕ１ ０６、＾５ｐ１０９及び＾１ａｌ１２はレセプターと相互作用できるようにＥへ ソックスから突出している。第３図はＩＬ−２の構造、推定されたレセプター結 合ドメイン及び対応するアミノ酸の位置を示す。 レセプター−エフェクター（例えばＩＬ−２）相互作用の一部はレセプターの荷 電基と反対電荷のエフェクターの荷電基との静電相互作用によって媒介される。 Ｅヘリックスは、正荷電アミノ酸側鎖を有さす、３つの負荷電アミノ酸側鎖を有 する（１；Ｉｕ１０６、＾５ｐ１０９及びＧｌｕｌｌＯ）　、従ってＩＬ−２の Ｅへソックスの電荷型の改変によって結合効率が変化する。＾５ｐ１０９→Ｌｙ ｓ１０９の置換は１つの突然変異でレセプター結合を改変する。＾５ｐ１０９は Ｅヘリックスの中心から突出した保存（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）アミノ酸である。 　ＧＩｕ１０６、＾５ｐ１０９、＾１ａｌ１２−　Ｌｙｓ１０６、Ｌｙｓ１０９ 、Ｌｙｓｌ１２の置換はＥヘリックスを負荷電表面から正荷電表面に完全に転換 させる。ＣＩｕ１０６または＾５ｐ１０９（酸残基）がＬｙｓで置換されるとＥ ヘリックスの電荷が正味＋２変化する。中性残基（＾Ｉａｌ１２）がＬｙｓで置 換されると電荷が＋１変化する。３つの残基全部がＬｙｓで置換されると電荷が ＋５変化する。これらの変更を、個別に行なってもよくまたは一緒に行なっても よい、更に、αヘリックス構造に対してより高い優先性を有するアミノ酸で置換 してもよい。 Ｂ、Ｂ　びＢ′へソックスの アミノ酸Ｌｙｓ４８、Ｔｈｒ５１及びＬｙｓ５４はレセプターと相互作用できる ようにＢ°ヘリックスから突出している。Ｂ′ヘリ・ンクスは１つの負荷電アミ ノ酸側鎖（ＧＩｕ５２）と４つの正荷電アミノ酸側鎖（Ｌｙｓ４８、Ｌｙｓ４９ 、Ｌｙｓ５４及び旧５５５）とを含む。 Ｌｙｓ４８、Ｔｈｒ５１、Ｌｙｓ５４−＋　ＣＬｕ４８、＾５ｐ５１、ＣＩｕ５ ４置換は、Ｂ’へソックスを正荷電表面から負荷電表面に完全に転換する。 Ｂヘリックスと同様の電荷の変化が生じる。Ｅヘリ・ンクス改変の場合と同様に 、これらの変更を個別に行なってもよく一緒に行なってもよい、　ＩＬ−２の別 のヘリ・ンクスと同様に、αヘリックス構造に対してより高い優先性を有するア ミノ酸で置換してもよい。 Ｃ、Ｐｒｏ４７→Ｇｌ　４７ ＢへソックスがＢヘリックスとＢｏへソックスとに分裂することがＩＬ−２の独 特の構造的特徴である。　Ｐｒｏ４７は、Ｂ′残基をレセプターと適切に相互作 用させる最適角度でＢヘリ・ンクス及びＢｏへソックスを固定的に保持すると考 えられてり）る、　Ｐｒｏ４７→ＣＩｙ４７置換はＢヘリックスとＢ“へソック スとの間のヒンジ部（ｈｉｎｇｅ　ｊｏｉｎｔ）の可撓性を増し、重要なり′残 基の位置を調節し、結局ＩＬ−２−レセプター相互作用を変性する。別のアミノ 酸による４７位の置換も本発明に包含される。 Ｄ、Ａへ１ツクスの改１ Ａヘリックスはレセプター結合に関与する。Ａヘリ・／クスは１つの負荷電アミ ノ酸側鎖（Ｃ，ｆｕｌ１５）と１つの正荷電側鎖（Ｈｉｓ１６）とを有する。Ｔ Ｌ−２の別のへソックスと同様に、αへソックス構造に優先性を有するアミノ酸 で置換することによってＡヘリックスの構造を強化し得る。Ｅ、Ｂ及びＢｏへソ ックスと同様のへソックスＡにおける電荷の変化も本発明に包含される。Ｉ！Ｌ 後に、Ａへソックスの両親媒性を維持または減少させるアミノ酸置換も本発明に 包含される。 Ｅ、旦ヱΣ艮二二り一乙！と改変 Ｆヘリックスは両親媒性ヘリックスである。Ｆへソックスのいくつかのアミノ酸 はαへソックス構造に高い優先性をもたない、従って、Ｆへソックスの疎水性表 面とＣ及びＤへソックスとの相互作用はＦヘリックスを螺旋形態に維持するため に必要なエネルギーを供給すると考えられる。 αヘリックス構造に対してより高い優先性を有する残基を含むように選択してア ミノ酸置換（例えば、＾ｓｎ→Ｇｌｎ、Ｔｒｐ→Ｐｈｅ、５ｅ−Ｇｌｎ）を行な って、改ン（ソックス配列を含むＩＬ−２類似体を構築した。その結果、Ｆヘリ ックスが螺旋構造を維持するために強力な両親媒性相互作用を必要とせず、従っ てヘリックスの両親媒性を維持または減少させ得る。 １１、Ｉ　ンドと茅七ムしマるＩＬ−２の改亦リガンドと結合と得る置換部位は 、カルボキシル末端及び活性ＩＬ−２の構造を極力乱さないように選択された表 面露出分子部分である。例えば、システィン残基の付加、挿入または置換によっ て、以下の部分に化学的に結合し得るスルフヒドリル基が得られる。 （ａ）放射性標識部分（アッセイ用、イメージング用）。リポータ−基をＩＬ− ２に結合すると、得られた活性ＩＬ−２類似体を高速かつ高感度で検出できる。 これらの結合体は、高感度ＩＬ−２生物学的アッセイの開発で鍵成分（ｋｅｙ　 ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）として使用される。 （ｂ）酵素的部分（アッセイ、治療薬の指向性デリバリ−用）。 （ｅ）毒素（ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏにおける選択的細胞傷害用 ）、細胞障害剤とＩＬ−２との複合体は、ＩＬ−２レセプターを有する細胞に毒 素を案内する。これらの複合体はある種の白血病、移植拒絶反応、自己免疫また は免疫異常状態（ａｌｔｅｒｅｄ　ｉｍｍｕｎｅ　５ｔａｔｅ）またはその他の 病理的に有意な細胞鶏口の治療に有用である。 （ｄ）薬剤（治療薬の指向性デリバリ−用０例えばＡＩＤＳ用＾ＺＴ）。 ）１１Ｖ感染し易い細胞の殆どはＩＬ−２レセプターを保有する細胞である。　 ＴＬ−２とレトロウィルスインヒビター例えば＾ＺＴ（逆転写酵素インヒビター ）との複合体は、インヒビターを感染細胞に案内し、ＩＬ−２レセプターを介し てインヒビターのインターナリゼーションメカニズムを与える。これらの複合体 はエイズ及びその他の関連疾患の治療に有用である。 （ｅ）抗体またはマイトジェン（選択的細胞標的化例えば、０ＫＴ４または均等 物を使用するヘルパーＴ細胞の標的化及び／またはＴＬ−２応答状態への選択的 細胞の活性化）等。 ＩＬ−２のＸ線構造観察によれば、ＩＬ−２分子のレセプター結合ドメインを妨 害することなく別の分子をＩＬ−２のカルボキシ末端またはアミノ酸７９〜８２ にわたる領域に結合させることが可能である（第３図参照）、遊離システィン残 基をＩＬ−２のカルボキシ末端及び／または７９〜８２領域で（Δ１ｍ’　”） ＩＬ−２（１つのジスルフィド結合を含むが遊離システィンを含まないＩＬ−２ 類似体）に組み込んだ、これらの位置への遊離システィン残基の組込みが、組換 えＩＬ−２遺伝子の改変によって得られた場合には、ＩＬ−２と細胞表面レセプ ターとの結合に影響を与えることなく別の分子が（１つ以上の）遊離スルフヒド リル基との反応によってＩＬ−２に特異的に化学結合し得る。 ＩＬ−２のカルボキシ末端領域はレセプター結合に関与せず異常システィンの組 込みに好適な部位である。　Ｌｅｕ１３２を選択した。その理由はこのアミノ酸 がＣ末端に近接して（最終アミノ酸の直後に）位置するため、及びヒト、ウシ及 びマウスのＩＬ−２配列を比較したときに保存されない残基であるためである。 システィンがＩＬ−２のカルボキシ末端に単に付加された類似体（（Ｃｙｓ”’ ）ＩＬ−２）は、Ｃ末端に異常システィンを組み込むという目的を達成している 。 Ｂ、Ｃへ１・・　スとＤへ１ツクス　のＢの　−の　１ヒト、ウシ及びマウスの ＩＬ−２の配列を並列させると、ヒト配列に比較してウシ及びマウスの配列がア ミノ酸８ｏと８１との間に挿入を含む、該アミノ酸は、ＩＬ−２のＣヘリックス とＤへソックスとを連結する４つのアミノ酸（アミノＭ７９〜８２）のループの 一部である。この観察及び分子のこの領域が推定されたレセプター結合ドメイン 及び分子中の別のＣｙｓ残基から離間している事実から、この部位が異常システ ィン残基の理想的な挿入部位であると結論できる。Ｌｅｕ８０→Ｃｙｓ８０のご とき置換も本発明に包含される。 Ｃ，アミン末端　域の改１ 非保存残基におけるＬｙｓ８→Ｃｙｓ８？！換はアミノ末端の近傍に反応性基を 与える。 ■、′　またけ５ム　ＩＬ−２フラグメントＩＬ−２のある種の構造用成分また はその組み合わせは、本来の（ｉｎｔａｃｔ）ＩＬ−２の生物学的特性を、（１ つまたは複数の）ＩＬ−２レセプターに結合する能力と共に保持または喪失して いる。かかるペプチドは本来のＩＬ−２の代わりにまたはその作用拮抗物質とし て有用である。この用途に適したペプチドは、Ａ、Ｂ、Ｂ’及びＥヘリックスの 少なくとも１つを含む０例えば本発明は、本来の親分子の立体構造的制約（ｃｏ ｎ−ｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ　ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔｓ）にかかわりなく、別の 種としてそれ自体の内部対称性（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｓｙ＋ｎｍｅｔｒｙ）を維 持するＡ及びＢへソックス領域を含む、かかる別の構造はＩ’Ｌ　−２レセプタ ーの成分に結合し、ＩＬ−２の生物学的活性を有していたりまたは有していなか ったりする。かかる構造はＩＬ−２応答性細胞のサブセットのみに活性を維持し ており、従ってＩＬ−２応答をより高い精度で操作できる。かかる別の構造は生 物学的活性を喪失しているが、ＩＬ−２結合の競合的インヒビターとして機能し 、ＩＬ−２の刺激作用が関与する生理学的状態に拮抗するために有用である。か がる構造は、ＩＬ−２レセプターをを亢進または減退させるべく調節し、その結 果としてＩＬ−２に対する細胞受容性（ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｒｅｃｅｐｔｉｖｉ ｔｙ）に影響を与える。 Ｖ−Ｌ些１へ臭え 本発明に包含されるその他の類似体は、天然ＩＬ−２のアミノ酸配列に以下の改 変が１つ以上存在することを特徴とする前記のごときＩＬ−２類似体を包含する 。 （ａ）分子内折り畳み部位を与えるアミノ酸残基の欠失及び／または置換、 （ｂ）末端アミノ酸残基の欠失、 （ｃ）末端アミノ酸残基へのアミノ酸残基の付加、（ｄ）強酸性条件下で加水分 解に不安定な部位を与えるアミノ酸残基の欠失及び／または置換、 （ｅ）グルタミン残基によるアミノ酸残基の置換、（ｆ）フェニルアラニン残基 によるアミノ酸残基の置換、（ｇ）トリプトファン残基の欠失及び／または置換 、（ｈ）アスパラギン残基の欠失及び／または置換、（ｉ）システィン残基の欠 失及び／または置換、（ｊ）セリン残基によるアミノ酸残基の置換、及び、（ｋ ）アラニン残基によるアミノ酸残基の置換。 ＴＬ−２制　び　九　２、 ＩＬ−２及びＩＬ−２類似体は極めて疎水性のタンパク質であり、従って、同じ く疎水性の発熱物質に結合する傾向がある。 これらのペプチドは酸性ｐＨ値で安定な単量体形態とし得る。 これらの条件下に発熱物質は、発熱物質の単量体分子量がＩＬ−２の分子量と同 等である場合にも、より高い分子量の集塊を形成し易い。従って、集塊形態の発 熱物質から単量体ＩＬ−２を分離するために、サイズに基づいてタンパク質を分 別する処理手順が使用される。この段階を行なう適当な手順はＹＭ−３０膜（八 ｍ１ｃｏｎ）による限外濾過である。　ＩＬ−２の収量を増加するために希釈と 限外濾過とを繰返し行なってもよい、グルコース、マンニトールまたはその他の 賦形剤（ｂｕｌｋｉＢ　ａｇｅｎｔ）は毒性調節剤として添加され得る。また、 限外濾過で濃縮するかまたは適当な緩衝剤で希釈することによって所望濃度のＩ Ｌ−２が得られる。また、例えばセファデックスＧ−７５を使用したサイズ排除 クロマトグラフィーによって単量体ＩＬ−２から発熱物質を分離してもよい、界 面活性剤（例えばラウレート、サルコシン、ドデシル硫酸ナトリウム）はこの方 法を無効にする。その理由は、界面活性剤の存在下では発熱物質が低分子量形態 に分解され、ＩＬ−２と同等の見掛は分子量になるからである。イオン交換クロ マトグラフィー及び疎水性クロマトグラフィーのごときＩＬ−２溶液から発熱物 質を除去すると期待された手１１Ｎは試験条件下で無効であることが判明した０ 本発明の方法は大規模化が容易であり従って経済効率がよい。 以下の実施例は、本発明に従ってＩＬ−２及びそのポリペプチド類似体の微生物 発現をコードするＤＮＡ配列の製造を示す、また、所望のポリペプチドの微生物 発現のための発現ベクターの構築を示す。 支り九Ｌ オリゴヌクレオチド配列の構築 この実施例は、本発明に従ってＩＬ−２類似体遺伝子を製造するために使用され るオリゴヌクレオチド配列の合成手順を示す。 いくつかの中間洗浄を含む４段階手順でオリゴヌクレオチド配列を合成した。＾ ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（八Ｂｌ）　Ｍｏｄｅｌ　３８０自動シン セサイザーを使用し八Ｂｌかち得られた試薬を用いて合成を行なった。支持カラ ム中のポリマー結合ジメトキシトリチル保護ヌクレオシドを、まずジクロロメタ ン中の３％トリクロロ酢酸で１分間処理して、その５°保護基（ジメトキシトリ チル）を除去した０次にポリマーをアセトニトリルで洗浄した。洗浄したポリマ ーを次に無水アセトニトリルですすぎ、アルゴン下に維持し、次いでアセトニト リル中のテトラゾールを用いアセトニトリル中の保護ヌクレオシドホスホラミジ ット＜ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）と縮合させた。 この反応を２．０分間継続させた。次に一過によって反応体を除去した０次いで 、無水酢酸、２．６−ルチジン及びテトラヒドロフラン（１：１：８）の混合物 を１部とテトラヒドロフラン中の６．５％ジメチルアミノピリジン１部とを混合 して調製した溶液を用い、未反応の５゛−ヒドロキシル基をキャッピングした。 １分後、キャッピング溶液を除去し、酸化溶液（Ｈ２０／２．６−ルチジン／Ｔ ＨＦ、１：１０：４０中の０．ＩＮのＬ）で１．５分間処理した０次にアセトニ トリルですすいだ、トリクロロ酢酸／メチレンクロリド脱保護のサイクルを再開 し、所望のオリゴヌクレオチド配列が得られるまで繰り返した。 最終オリゴヌクレオチド鎖を室温にて新しい濃アンモニアで２．０時間処理した 。ポリマーから溶液を傾瀉し、濃アンモニア溶液を密封管で６０℃で１６時間加 熱した。 各オリゴヌクレオチド溶液を１−ブタノール及びエチルエーテルで抽出し、分光 光度計（２６０ｎｍ）で各溶液の濃度を測定した０分取電気泳動用に５．０吐単 位の各オリゴヌクレオチドを乾燥し、１５％ポリアクリルアミド、７モル尿素ゲ ルに充填した。を気泳動後に得られたバンドをＵＶシャドウィングによって可視 化し、ゲルから切断し、抽出し、に−５０セファデックスカラムで脱塩すると精 製オリゴヌクレオチドが得られた。 えＩ隨よ オリゴヌクレオチドの特定部位の突然変異誘発によるＩＬ−２類似体の構築 この実施例では組換え法を使用したＩＬ−２類似体の製造を説明する。　１９８ ５年２月２８日付けの５ｏｕｚａ等のＰＣＴ出願第１１１０８５７００８１７号 に記載の特定部位の突然変異誘発手順を用い、（大腸菌優先性コドンを有する） 表１のＤＮＡ配列に表２のオリゴヌクレオチドを使用した。 ４５　（ｕ　（ＩＪ　ロ　。　ロ　ロ　−Ｈに　＜−ト＜　口　２　８　≧　巳 　＝旨　口　に　旨　ｉ　５　ミ　暑　ヨ　葺ジ　ミ　ジ　匡　リ　審　己　ご 　ジ　厘オリゴヌクレオチドの特定部位の突然変異誘発のために、発現ベクター ｐｃＦＭ　５３６　ＩＬ−２に由来のＩＬ−２のＸｂａ　Ｉ　〜ＢａｍＨＩ領域 を、Ｍ１３ｍｐｌＯ及びＭ１３ｍｐＨの双方にクローニングし、単鎖ファージＤ ＮＡを単離してＤＮＡ配列を決定した。ここではｐｃＦ８５３６　（米国特許第 ４，７１０，４７３号参照、該特許は本発明に含まれるものとする）を使用した が、任意の適当な発現ベクターを使用することが可能である。このＤＮＡを表２ の合成デオキシヌクレオチドと混合した。これらの混合物中のＤＮＡを６５℃に 加熱してアニーリングし、次に室温まで徐冷した。 オリゴマーは配列の中央に天然の組換えＩＬ−２配列とは異なる適当な塩基変化 を生じていた。アニーリングしたＤＮＡに＾ＴＰ−ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、　ｃｌ ＧＴＰ、　ＴＴＰ、　Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ及び大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのＫ Ｉｅｎｏｕ＋フラグメントを付加した。この反応で、単鎖プライマーをもつファ ージＤＮＡが、共有結合によって閉鎖された二重鎖環状ＤＮＡに変換された。ｉ ｎ　ｖｉｔｒ。 合成した二重鎖ＤＮＡを、最初にアルカリ性ショ糖濃度勾配で精製しないで、大 腸菌ＪＭ１０３株に直接トランスフェクトした。トランスフェクションに由来す る多くのプラークは、ファージＤＮＡを出発組換えＩＬ−２配列と共に含んでい たが、いくつかのプラークは所望の塩基変化を有するＩＬ−２配列を含んでいた 。これらのプラークを同定するために、プラークをニトロセルロースフィルター にのせ、フィルターを＾ＴＰ（γ−３２Ｐ）で末端標識した合成デオキシヌクレ オチドとハイブリダイズした。ハイブリダイズ後、フィルターを合成デオキシヌ クレオチド及びその相補的ＤＮＡ配列の融点より低温の０〜３℃で洗浄した。こ れらの洗浄条件では、突然変異した配列を含むファージのプラークに対応する強 いオートラジオグラフィー信号が選択的に残存した。各類似体陽性のクローンを ＤＮＡ配列決定によって確認し、これらのクローンをｐｃＦＭ　５３６のＸｂａ 　Ｉ　〜ＢａｍＨＩにバッククローニングした。 組換えＩＬ−２類似体の培養物を、１１あたり１０ｇのトリプトンと５．の酵母 抽出物と５ｇのＮａＣ１とを含む３０℃の培地で＾、。。 が０．５になるまで震盪しながら増殖させ、次いで４２℃に急激に加熱した。フ ラスコの震盪を４２℃で３時闇続げた。 １υ、ｏｏｏｘａで４℃で２０分間遠心して細胞を採集した。細胞ベレットを０ ．４．湿潤重量、′・ｐの割合でＩＩａＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）に再 度懸濁させ、１０，０００ｐｓｉ、４℃のフレンチ圧力槽（Ｆｒｅｎｃｈ　Ｐｒ ｅｓｓｕｒｅ　Ｃｅ１ｌ）に１５分ずつ２回通し、破壊された細胞の上滑を廃棄 した。５ｏＩＩＩＭのＴｒｉｓ、５ｍＭのＥＤＴ＾、５ｍＭのＤＴＴ、０．５Ｍ のＮａＣ１，１％のデオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）、ｐＨ９，０に出発 ベレットを湿潤重量で０．２５ｇ／凝ｌの割合で再懸濁させ、室温で３０分間混 合させた。これらの混合物を１４℃で１０，０００ｘ　Ｇで１５分間遠心し、上 清を廃棄した。湿潤重量０．１５１？／ｉｉ’の割合で出発ベレットをＨ２Ｏに 再懸濁させ、４℃で１０，０ＯＯＸ　Ｇで１５分間遠心した。上清を廃棄し、ベ レットを室温で４％のラウリル酸ナトリウム、５０ｍＭのＴｒｉｓ、５％エタノ ール、５０ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８，７にタンパク質的２０〜３０ｚｇ／ｍｌの割 合で可溶化した。可溶化したタンパク質を、２％ラウリル酸ナトリウム、５０ｍ ＭのＴｒｉｓ及び５％エタノール、ｐＨ８，７を用いたセファデックスＧ−７５ でクロマトグラフィー処理した。　５ＤＳ−ＰＡにＥで分画を分析し、９５％以 上の純度のＩＬ−２含有分画をプールした。 いくつかの場合には、発熱物質及び内毒素を実質的に含有しないＩＬ−２類似体 を得るのが望ましい、このためには分子を更に精製する。タンパク質を、Ｃｕ” の存在下に酸化し、濃縮し、１％ラウレート／２５＋ｅＭ　Ｔｒｉｓ１５％エタ ノール、ｐＨ８，７で平衡させたセファデックスＧ−７５でクロマトグラフィー 処理した。単量体の形態のＩＬ−２を含有する分画をプールし、等容のエタノー ルを添加してタンパク質を沈降させた。遠心によってペレットを採集し、５０％ エタノールで洗浄し、次に５０％酢酸で可溶化した。ＩＬ−２類似体を再生させ るように溶液を５０倍に希釈し、：ｄＡｔａシ、次に採集濃度及びｐＨが１０ｍ Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４となるように酢酸ナトリウムバッファに対して透析− 過した。 割１１１ １Ｌ−２類似体の活性 この実施例は実施例２で製造した類似体の活性に関する。 ＩＬ−２の天然配列とは異なる２つのアミノ酸配列を含む多数のＩＬ−２類似体 を製造した。試験した全部の類似体が、１２５位に＾ｌａを有していた。これら の実験の陽性対照として、（天然配列とは異なる１つのアミノ酸を含む）（＾１ ａＩ２５）ＩＬ−２を使用した。（Ａｓｐ”）ＩＬ−２及び（Ｇ　ｌ　ｕ”　） ＩＬ−２は、ＩＬ−２の推定されたレセプター結合Ｂ“ドメインにアミノ酸変化 を有する分子である。より詳細には、（Ａｓｐ”　）　ＩＬ−２においては、５ １位の中性トレオニンが負荷電アスパラギン酸によって置換され、（にＩＬＬ” ）ＩＬ−２においては、正荷電リジンが負荷電グルタミン酸によって置換されて いる。　（にＩＦ”）ＩＬ−２においては、ＢドメインとＢ′ドメインとの間の プロリンがグリシンによって置換されている。この変化は分子の有意な精造的結 果を有すると予測され、生物学的活性のかなりの低下を予想させた９これらの類 似体をＩＬ−２活性に関するいくつかのｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイで試験した。 ３Ｈ−チミジンをマウスＴ細胞系ＣＴＴＬ−１またはヒト末梢血液白血球（ｈＰ ＢＬ）に組み込んでｈＰＢＬ培養物から産生されるリンフ才力イン活性キラー細 胞（ＬＡＫ細胞）を測定した。また、ｈＰＢＬ培養物中でＩＦＮ−γ、ＩＬ−１ 及びＴＮＦ産生が誘発される能力を測定した０部分的に精製した材料によってこ れらの実験を行なった。高度に精製した材料を使用した別のＣＴＬＬ−１アツセ イでは、（＾１ａ１２５）ＩＬ−２の比活性は７．８Ｘ　１０’Ｌｌ／ｍｙであ り、（Ｇｌｕ”）ＩＬ−２の比活性は７．９ｘ　１０’Ｕ／肩ｇであり、（Ａｓ ｐ”）ＩＬ−２の比活性は６．６Ｘ　１０’Ｕ／ｒｇであることが判明した。い くつかの実験の結果を以下の表３に示す。 ＤＮＡ配列の所望の変化をコードする以下のプライマーを使用した特定部位の突 然変異誘発を利用した。 ＥＣ０Ｒ）　の１然１　；　プーイマーＥｃｏＲ１部位が存在するので、Ｆへソ ックスをコードするＩＬ−２遺伝子の部分をＥｃｏＲｌ及びＢａｍＨＪ消化によ って切除できる。第２段階では、切除された遺伝子の部分を改変Ｆへソックスの アミノ酸配列をコードする合成りＮＡ配列で置換する。この方法を使用し、以下 のＩＬ−２類似体Ｃ４及びＣ５を構築した。 及髭【１ Ｃ＾＾　ＴＴＴ　ＣＴに　＾へＴ　ＣＣＴ　Ｔにに　ＡＴＣＡＣＴ　ＴＴＣＴＧ Ｔ　ＣＡに　ＴＣＣＡＴＣにＩｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　 Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　ＩｌｅＡＴＣＡＧＣＡＣＴ 　ＣＴＣＡＣＣ ｌｌｅ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ匁り肩先イ本Ｊ≧４（に１ｎ１１１１ ｙｓ１２０＾１ａ１２コ＾１ａ１２）ｌｅｕ１２督＾１ａ’　コ１）ＩＬ−２Ｃ ＾＾ＴＴＣＣＴＣＣＡＧ＾＾＾ＴＧＧ　ＡＴＣＧＣＴ　ＴＴＣＣＣＡ　ＣＡＧ　 ＧＣＴ　ＡＴＣＧｌｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ＾ｌ ａ　Ｐｈｅ＾Ｉａ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　ｌ１ｅＣＴに　ＡＧＣＧＣＡ　ＣＴ［；　 ＡＣＣＬｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒｌ俳し付仁ｑΣ（［；　Ｉｎ　 ”　”Ｌｙｓ　”　’Ｐｈｅ　”　’＾１ａ１２りＧｉｎ”）Ｌｅｕ”’Ｇｌｎ ’コＯ＾１ａ’コ１＾１ａ”’）ＩＬ−２ Ｇ＾＾　ＴＴＣＣＴＧ　ＣＡＧ　＾＾＾　ＴＴＣＡＴＣＧＣＴ　ＴＴＣにＣＡ　 ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＡＴＣＧｌｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｉ ｌｅ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　ｌ１ｅＣＴＧ　ＣＡＣＧＣＡ 　ＣＴＧ　［；ＣＴＬｅｕ　（：ｌｎ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ綽　１’ａ（＾ ：αヘリックス、Ｂ・βシート、Ｔ・ターン）（：Ｉｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｓ ｐ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　にＩｎ　Ｓｅｒ　ｌ１ ｅＴ　ＴＴＴＢＢＢＢＢ ｌｌｅ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　ＴｈｒＢＢＢＢ 矩ｍす」Ｕ【 Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｔｉｅ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　 Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　ｌ１ｅＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　ＴｈｒＡＡＡＡ 胆ＪＵ（ゆ」１１ Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　＾Ｉｔ　Ｐｈｅ　 Ａｌａ　Ｇｉｎ　にＩｎ　１ｉｅＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　ＡｌａＡＡＡＡ 本発明を好適実施例に基づいて上記に説明したが、記載の変更及び変形が可能で あることは当業者に容易に理解されよう、従って、請求の範囲は、本発明の範囲 内のかかる変更をすべて包含すると理解されたい。 国際調査報告 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Interleukin Analogs The present invention relates to specific DNA sequences useful in the manipulation of genetic material, and more particularly in recombinant procedures to achieve the expression of interleukin analogs. related to the manufacture of 11 to 11 Interleukin II (IL-2), a glycoprotein with a molecular weight of approximately 15,000, belongs to a group of proteins called lymphocytes that control the body's immune response. IL-2 is produced by certain leukocytes, lectin- or antigen-activated T cells, and plays a central role as a lymphocyte regulatory molecule in the body's immune system. IL-2 promotes thymocyte mitogenesis, stimulates activated TMi cell proliferation during the clonal stage, induces cytotoxic T cell reactivity, and induces activation of activated B cells and lymphocytes. reported to modulate immune effects on immune cells, induce plaque-forming cellular responses in nude mouse tile cell cultures, and modulate gamma interferon production. I have been warned. IL-2 also increases natural killer cell activity and mediates restoration of immune function in selected immunocompromised lymphocytes. Additionally, in the laboratory, we maintain cultures of functional monoclonal T cells to study the molecular nature of T cell differentiation and to help elucidate the functional mechanisms of differentiated T cells. IL-2 has been used to Therefore, IL-2 is important in malignant neoplasms and immunology. It is useful for both research and treatment of epidemic diseases. IL-2 works by binding to specific high-affinity receptors on the surface of target cells. to achieve its effect. Therefore, the IL-2 molecule is the focus of research on receptor-effector interactions that regulate cell proliferation in immune responses. The high-affinity (KD~10-11M) receptor, which is the main mediator of the action of TL-2 on target cells, is composed of two different membrane-bound proteins of size 55 kD (p55 or Tae) and 75 kD (p75). Each of the two proteins acts alone as an apparently low-affinity (KD~10-@M) receptor for IL-2, and both proteins are required for IL-2 activity. In order for IL-2 to exert its activity, it must bind to both p55 and p75 to form a trimeric complex, and therefore, IL-2 has two different types. This suggests that the protein must have a receptor binding site. The amount of purified native IL-2 obtained from peripheral blood lymphocytes and tumor cell lines is small. Therefore, the biological role of this lymph protein could not be fully investigated until recombinant IL-2 production became possible. Taniguchi, T., et al. Nature, 302:305-310 (1 (983) described the sequence analysis, cloning, and expression of complementary DNA encoding human IL-2 cloned from a cDN^ library prepared from partially purified IL-2 mRN^ derived from the Jurkat leukemia cell line. It was announced that IL-2 contains 133 amino acid residues and has a calculated molecular weight of approximately 15,420. Taniguchi cloned the cDNA of IL-2 in cultured monkey coss vesicles. - ning plains and expression are described. This document states that the expression of IL-2e DN^ in E. coli has not yet been successful. European Patent Application No. 118,617 of September 19, 1984, European Patent Application No. 118,977 of September 19, 1984, and European Patent Application No. 119,621 of September 26, 1984; See also National Patent No. 4,738,927. Rosenber H et al., 5science, 223:1412'-1415 (1984), report the isolation of another cDN^ clone of the IL-2 gene from the Jurkat tumor cell line and normal human peripheral blood lymphocytes. They are left behind in E. coli. The gene was inserted, the polypeptide product was purified, and its biological activity was assayed. Regarding site-directed mutagenesis of the human IL-2 gene, see Hang et al., 5science, 224:1431-1433 (1984) and European Patent Application No. 109°748, filed May 30, 1984. . As for the literature regarding the modification of IL-2, see Ju et al. J, Biol, Chem, 262:5723 (1987); Liang et al., J, Biol, Chem. Kyojo: 334 (1986) and Miyaji et al., ^gr'+c, Biol, Chem, 51: 1135 (1987). The development of methods and materials for the mass production of purified IL-2 analogs that can be used to replace the IL-2-containing preparations currently used in immunotherapy research is of critical importance. It is an object of the present invention to provide an improved form of IL-2. It is also an object of the present invention to provide IL-2 analogs that are less toxic than currently used IL-2 preparations. Provides TL-2 analogs that can bind ligands without affecting biological activity It is also one of the objectives of the present invention to provide. Furthermore, it is an object of the present invention to provide a method for purifying IL-2. Other objects and features of the invention will be more fully understood from the following description and claims. The present invention relates to IL-2 analogs with modified receptor domains and analogs with stable IL-2 structures.9 The present invention also relates to IL-2 analogs with modified receptor domains and analogs with stable IL-2 structures modified to be capable of binding ligands. Concerning IL-2 analogs. More specifically, the present invention provides A polypeptide that is an expression product of an engineered gene related to de. The polypeptide has the following formula [1], Ala Pro Thr Ser Ser Ser Ser Thr Lys Lys ThrGln Leu Gin Leu Glu His Leu Leu Leu AspLeu Gln M et Ile Leu Leu Asn Gly Ile Asn AsnTyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met LeuThr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr C1u Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu [1 Glu ni Iu Leu Lys Pro Leu C1u ni lu Val Leu ^sn Leu^Ia Gln Ser Lys Asn Phe His Leu^rg Pro^ rg Asp Leu Ile Ser Asn Ile AsnVal Ile Val Leu Glu Le u Lys Gly Ser GluThr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp C1uThr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn ArgTrp Ile Thr P he X ni In Ser Ile Ile 5erThr Leu Thr It has the amino acid sequence shown by 47.51.80.81.106 in the formula. At least one of the starting amino acid residues at positions 109.112.119.120.123.127.131 and 133 is replaced by a substituted amino acid residue, or 8.47.48.51.54.80.81 .106.109.112.119.120.121.123.127.129.130.131.132 and and at least two of the starting amino acid residues at positions 133 and 133 are replaced by substitute amino acid residues, and/or one additional residue is attached to the carboxy terminus, and X is selected from the group consisting of Cys, Ala, and Ser. has been done. The present invention also encompasses the following IL-2 analogs: IL, = 2 in any one or more helices (preferably helix A and/or helix F). , three or more starting amino acids maintain the amphipathic character of the helix. IL-2 analogs substituted with substituted amino acids that retain or weaken; one, two, three or more starting amino acids in Hesox A, B, B' and/or E carry a different charge than the starting amino acids; one, two, three of Hesox A, B, B', C, D, E and/or F; The present invention also relates to analogs in which one or more of the starting amino acids are substituted by substituted amino acids that have a preference over the starting amino acids for α-helix formation. It relates to a manufactured DNA sequence encoding a peptide. Additionally, the present invention relates to monoclonal antibodies that specifically bind to such peptides, and methods for purifying IL-2 and IL-2 analogs.・', t;B Figure 1 (^) is an explanatory diagram of the α carbon main chain of IL-2. Figure 1 (B) shows Hesock. FIG. 2 is an explanatory diagram of the three-dimensional structure of IL-2 in which the base is shown as a cylinder. FIG. 2 is a schematic diagram showing possible modes of interaction between IL-2 and its receptors. Ru. FIG. 3 is an explanatory diagram showing the structure of IL-2i and the positions of the corresponding amino acids. A novel polypeptide analogue of interleukin II ('IL-2J) has been discovered. In a first embodiment of the invention, site specific modifications of the putative receptor binding domain of native IL-2 and the helical structure and IL-2 Alteration is obtained that stabilizes the overall structure. In a second embodiment, the A chemical reaction with another molecule, but far away from the defined receptor-binding domain. The response is to insert amino acids such as odd cysteine into the IL-2 site, which is easy to respond to. It's crowded. The present invention also provides artificial genes capable of directing the synthesis of said IL-2 analogs in selected microbial hosts (e.g., bacteria, yeast, and cultured mammalian cells). In a preferred form of an artificial gene, the base sequence may contain multiple alternative codons specifying the same amino acid, based on codon expression preferences in the intended host microorganism, such as E. coli. containing one or more codons selected from Request WO33104053). Another preferred form of artificial genes includes nucleotide bases of codons that specify additional amino acid residues (e.g., the initiation Met residue) of the encoded polypeptide. This facilitates direct expression in E. coli. In yet another preferable form of the artificial gene, the base sequence upstream of the codon specifying the desired polypeptide and/or downstream and/or internally for the formation of expression vectors or new polypeptide analogues. There is one or more base sequences that facilitate the generation of new structural genes. That is, at one or both ends or in an intermediate position of the structural gene, selected restriction endonucleases are present. Base sequences providing clease cleavage sites and sequences providing liposome binding sites, e.g. For example, it exists in C^^CG 80GT. The invention also provides that the type and/or position of one or more amino acid residues is An artificial gene is provided that can direct the microbial expression of an IL-2 analog that is different from the natural polypeptide. In the practice of the present invention, human-generated NA sequences are transferred to viral or circular plasmid DNA vectors. Next, the transformed vector is inserted into a vector to form a hybrid vector, and the hybrid vector is used to transform microbial host cells such as bacteria (e.g., E. coli), yeast cells, or mammalian cells. Microorganisms are grown under appropriate nutritional conditions to express the polypeptide products of the invention. The invention also provides pharmaceutical compositions containing an effective amount of a polypeptide product of the invention together with suitable diluents, adjuvants and/or carriers useful in IL-2 therapy. The term "artificial" used in the text to describe DNA sequences or genes refers to It means a product chemically synthesized by aggregation of leotide bases, a product synthesized by site-specific mutagenesis, or a product obtained by biological replication of a product synthesized as described above. The term therefore excludes products ``synthesized'' by cDNA methods or gene cloning methods using material of biological origin. Remove. As used herein, the term "substituted amino acid" refers to an amino acid that replaces a naturally occurring ("starting") amino acid, ie, an amino acid that is different from the starting amino acid. According to another embodiment of the invention, a polypeptide that specifically binds to a polypeptide of the invention but naturally Antibodies that do not cross-react with natural IL-2 are provided. These antibodies can be labeled by methods known to those skilled in the art. In the text, amino acids are indicated by the following abbreviations: alanine^1a, arginine^rg, asparagine^sn, aspartic acid^sp, cysteine Cys, glutamine Gln, glutamine 11 Glu, glycine G1y, histidine His, inleucine lie. , Leucine Leu, Lysine Lys, Methionine Net, Phenyl Alanine Phe, Proline Pro, Serine Ser, Threonine Thr, Trypto Fan Ding rp, tyrosine Tyr, valine Val, nucleotide bases have the following abbreviations: use the number. Adenine^, Guanine G, Thymine T, Uracil U and Cytosine C0 The present invention is described in detail below, but there is no intention to fix the invention to any particular theory of operation. stomach. It has been confirmed that IL-2 is an α-helical protein (Figure 1) (Brandhuber et al., 5science, 238:1707 (1987), the contents of which are incorporated herein). . The protein has a short helical segment near the amino terminus (residues 11-19 in Figure 1; helix A) followed by an extended loop. Residues 33-56 form a helix that is interrupted or "bent-coated" by Pro47 near the center (thus forming two segments B and Bo). The disulfide Cys58 is followed by the residue forming helix C. Groups 66-78, F There are residues 83-101 forming the lix D, and after Cys105 there are residues 106-113 forming a short apparently helical stretch E; There are residues 117-133 forming a sock F to the boxy terminus. There are no apparent segments of β secondary structure in the molecule, and the total helical content of about 65% is in good agreement with the calculated value based on circular dichroism. Disulfur between Cys58 and Cys105 The rod joins two extended loops that connect the hexagons of the "top" of the molecule (in the orientation of FIG. 1). Helices B, C, D and F are cytochrome C', cytochrome b, 6. and myohemerythrin form antiparallel α-hesock bundles, which are quite different from the conventional 4-hesock bundles exhibited by hemeerythrin. The filling region of the helix is shorter and contains only three or four helical turns, in contrast to traditional four-helix buns. Dollars typically contain a number of helical turns of 5 or more, furthermore, the filling angles are all in the range of 25 degrees to 30 degrees. Therefore, it is somewhat larger than the average of about 18 degrees for conventional 4-toe sock bundles. Mouse IL-2 has a similar structure to recombinant human IL-2, starting from helix A. 0 recombinant human, which is predicted to contain a proline-induced vent in helix B+B'. This is extremely important because it has been reported that human IL-2 exhibits activity on both human and mouse T cells, and that recombinant mouse IL-2 exhibits low but measurable activity on human T cells. be. Mouse and human IL-2 sequences are overall 64% homologous. The amino acid sequence of the mature mouse protein has the first seven residues equivalent to the human sequence. Yes. Next, there are one or more insertions, including a 12-residue poly(Gly) stretch upstream of Leu14 in human IL-2, resulting in a total of 15 amino acid insertions compared to human. Therefore, the amino-terminal region of the mouse protein is probably helical. Up to helix A, which contains the first helix turn of helix A, the only additional insertions in the mouse sequence, which show significant structural differences compared to the human protein, are human IL-2 residues 80 and 81. It is present in the loop connecting hesocks C and D between. Current data on IL-2 receptor binding indicate that when a molecule binds to a high-affinity receptor, it "cross-links" two receptor molecules, P55 and p75, at two independent binding sites. suggests. In the earlier literature, there were two records. The presence of a receptor molecule was not expected. Therefore, various modifications that affect IL-2 receptor binding may affect either p55-(IL-2) interactions, p75-(IL-2) interactions, or both. Shadow I couldn't tell if it had any effect or not. Antibodies against peptides that cross-react with IL-2 were used to map entire regions in the IL-2 sequence putatively important for receptor binding. In particular, Kuo and Robb show that regions within bound residues 8-27 and 33-54 are receptor We present evidence suggesting a direct involvement in protein binding. L, Kuo & R, J, Robb, J, Immnol, 137:1538 (1986), while L+man and co-workers developed antibodies against peptides of residues 59-72, 91-105 and 119-133. inhibits TL-2 receptor binding. I found out that there is no. ^, Altms+n, etc., Proe, Natl, ^cad, Sci. υ, S, ^, 81:2176 (1984). Ju et al. () described residues 1 to 10 of human IL-2 (amino acids up to the beginning of helix A). Deletion of residues 1 to 20 (amino terminus containing helix A) completely abolishes activity, whereas deletion of residues 1 to 20 (amino terminus containing helix A) reduces induction of proliferation in murine CTLL-2 cells by only 30-50%. It proved to be a total loss. Ju et al. 1. uL, deletion analysis of mouse IL-2 shows a similar pattern of effects on the proliferative activity of mouse HT2 T cells, S. M. Zurawski et al., J. Immunol, 137°3. 354 (1986), murine residues 1-11 or 1-13 (assuming that murine IL-2 is structurally similar to human IL-2, these are on hesox A). Deletion of (present in the current) reduces activity by up to 50%. Deletion of the mouse poly(Gln) section, residues 15-26, associated with various changes in the first 37 amino acids in the sequence reduced the specific activity of the mutant protein to that of the native protein. Park's number was reduced to 173. However, a deletion through murine residue 30 (corresponding to human residue 16 in the middle of helix A) reduced activity to about 0.4% of the native protein, while a deletion through mouse residue 41 (corresponding to human residue 27) reduced the activity to about 0.4% of the native protein. Deletion through the corresponding ) results in complete loss of activity. Many of the other deletions reported to result in loss of activity are those that disrupt the entire tertiary structure of IL-2 (often with internal socks or binding peptides in the structure). This is a deletion of an important part of the tido). Data on site-specific amino acid substitutions do not allow us to distinguish between mutations that affect activity by destabilizing the IL-2 gene and those that directly affect receptor binding. Activities of human IL-2 other than modifications that disrupt or alter Trp 121 (this side chain is built into the structure) All mutations resulting in decreased sex are located in sequence regions 3-17 and 36-54. Ru. Ju et al! Ahead. This is a receptor-binding region suggested by antibody competition studies. It becomes confirmation of the area. A "down" point mutation does not recognize a specific receptor binding surface when placed in the IL-2 model. Helices B, C, D, and F form the structural skeleton, and helices A, B', part of B, and E form the receptor binding site for IL-2 (Fig. 2); the involvement of helix E is mainly , for regions of the molecule presumed to be involved in receptor interactions. suggested by the spatial accessibility and proximity of helix E to IL-2 binds to T cells through high-affinity receptors, but not through low-affinity receptors. It is thought that the observed toxic side effects of IL-2 may be due to the activation of these other cells. It will be done. Receptor-binding domain of a synthetic variant of human IL-2 IL-2 Modifications that stabilize the TL-2 structure, as well as modifications that stabilize the TL-2 structure, produce IL-2 analogs with altered specificity for T cells, resulting in improved IL-2 molecules with altered activity and/or toxicity. Amino acids, preferably the parent hesox of the receptor binding domain IL-2 analogs in which an aqueous amino acid is replaced with an amino acid having a different charge are encompassed by the invention (e.g., an amino acid with a positively charged side chain is replaced with an amino acid with a negatively charged or uncharged side chain). (see below). In addition, in order to stabilize the structure of the helix and the whole analogue, the α-helix one or more amino acids with a preference for hesock structure in IL-2. Also included in the invention are analogs in which helices A, B', B, E and F are substituted. (Chou & Fasman, ^nnu, Rev, Biochem, 47:251 (1978). To aid in understanding the present invention, Chou and Fasman's hierarchy is shown below. 1.51 Met 1.45 H, = strong α-forming substance Lys (+) 1.16 Phe 1.13 Gln 1.11 h, = a-forming substance Trp 1.08 11e 1.08 VJII 1.06 ^5p ( -) 1.01!.-Weak α-forming substance) 1is(+) 1.00 ＾rg(10) 0.98 Thr O, 83ia= No effect on a Ser 0.77 Cys O, 70 Tyr O, 691) a= sn 0.67 Pro 0.57 B, = strong α-destroyer Gly O,57 The hesox of IL-2 is an amphipathic helix (Kaiser et al., PNA S, 80:1137-1143 (1983) and Kaiser et al., 5cie nce. 249-255 (1984)). This amphipathic interaction is associated with melittin, par-doxin and It is common to some cytotoxic peptides such as maganin. More specifically, the F-helix is highly amphipathic, and some of the amino acids in the F-helix do not have a high preference for α-hesox conformation; therefore, the F-helix The interaction between the hydrophobic surface of the C helix and the D helix is the F helix. It is believed that this provides the energy necessary to maintain the helical configuration of the matrix. Contains amino acid substitutions selected to include residues with a high preference for alpha-helical structures (e.g., ^5n-dl:In, Trp-+Phe, 5et-+Gin) IL-2 analogs that include modified hesox sequences built a body. The resulting helices do not require strong amphipathic interactions to maintain the helical structure, so by amino acid substitutions the amphipathic nature of the helix may be maintained (e.g. If it is hydrophilic! An amino acid with an I chain is replaced with another amino acid with a hydrophilic side chain. The above three substitutions may maintain amphipathic properties (e.g., an amino acid with a hydrophilic side chain is replaced with an amino acid with a hydrophobic side chain). We have constructed analogues that can be covalently linked to other molecules without compromising activity. these types The mimetics can be conjugated to toxins, reporter groups, or antiviral or other therapeutic compounds for the development of therapeutically important IL-2 conjugates and for the development of sensitive biological assays. used in the production of the specific target 11L-2. The most convenient way to obtain these site-specific conjugations is to use unusual molecules with unique reactive sulfhydryl groups. This method involves the introduction of a stain residue. The naturally abnormal cysteine (Cys125) is buried and tends to remain unreacted, so strategies should focus on chemically accessible cysteine. The purpose of the present invention is to incorporate Stin into (^Ia"5) TL-2. The present invention includes modifications in which additional amino acids are inserted between existing amino acids as a modification of the substitution of existing amino acids. 1. Receptor of IL-2 Hydrophilic amino acids in the α-wax region involved in high-affinity receptor interaction (Fig. 1, Fig. 2, and Fig. 3) A, B, B' and E) are promising amino acid substitution sites. Ru. Helical table where these sites interact with another amino acid (particularly a receptor) When substituted with W (an amino acid that changes the surface charge), the receptor binding properties are affected and the activity spectrum of the molecule changes. Such changes also affect receptors in various cell types. alters the ability of a molecule to interact with a target. For example, cells that possess only the p75 component of the IL-2 receptor have modified p75 domains. Introducing such selectivity into the IL-2 cell stimulation method, where the molecule is no longer capable of producing biologically significant receptor binding because it does not respond to the altered IL-2 species, improves the therapeutic index of the material. (e.g., one cell type (e.g., reducing the undesirable side effects caused by the disease and at the same time preserving the ability of IL-2 to stimulate the appropriate effector cell types, ultimately suppressing the disease). Certain modifications of the hesox of the synaptic domain have decreased ability to induce lymph inactivation, such as INF-γ, IL-1, and TNF (^la'), but not IL-2 or TNF. has equivalent biological activity compared to natural IL-2. IL-2 analogs can be produced that To facilitate understanding of the present invention, the side chains of amino acids 11e, Leu, Net, Phe, Pro, Trp, Tyr and Val are normally non-polar (hydrophobic), The side chains of amino acids ^Ia, ^sn, Cys-Gln, Gly-Ser, and Thr are polar (hydrophilic) and uncharged, the side chains of amino acids ^rg, His, and Lys are hydrophilic and positively charged, and the side chains of amino acids ^sp The side chains of Glu and Glu are considered to be hydrophilic and negatively charged. Hopp & Woods, PNAS''78 No, 6:3824-3828 (1981); Kyte & Doolittle, J. Mo1ee, Biol, 157:105-132 (1982); Parker et al., Bioch e+aistry, 2 5:5425-5432 (1986 ). See also A, E to 1... The short E helix is involved in receptor binding. Therefore, the E to sox is involved in receptor binding. are suitable targets for mutations that alter protein binding. Three amino acid side groups Glu106, ^5p109 and ^1al12 protrude from the E sock so that they can interact with the receptor. Figure 3 shows the structure of IL-2 and the estimated receptor binding. The positions of the binding domains and corresponding amino acids are shown. Part of the receptor-effector (e.g. IL-2) interaction is due to the loading of the receptor. It is mediated by electrostatic interactions between the electric group and the charged group of the effector of opposite charge. The E helix has three negatively charged amino acid side chains with one positively charged amino acid side chain. (1; Iu106, ^5p109 and GlullO), therefore, modification of the charge type of the E sock of IL-2 changes the binding efficiency. The ^5p109→Ly s109 substitution alters receptor binding with one mutation. ^5p109 is a conserved amino acid that protrudes from the center of the E helix. Substitutions of GIu106, ^5p109, ^1al12-Lys106, Lys109, Lysl12 completely convert the E helix from a negatively charged surface to a positively charged surface. Substitution of CIu106 or ^5p109 (an acid residue) with Lys results in a net +2 change in the charge of the E helix. Neutral residue (^Ial12) is replaced by Lys When it is exchanged, the charge changes by +1. When all three residues are replaced with Lys, the charge changes by +5. These changes may be made individually or together, and may also be substituted with amino acids that have a higher preference for alpha-helical structures. Amino acids Lys48, Thr51 and Lys54 of the B, B and B′ hesox protrude from the B° helix so that they can interact with the receptor. B' helium is one negatively charged amplifier. contains a amino acid side chain (GIu52) and four positively charged amino acid side chains (Lys48, Lys49, Lys54 and old 555). Lys48, Thr51, Lys54-+ CLu48,^5p51, CIu5 4 substitutions completely convert the sock to B' from a positively charged surface to a negatively charged surface. A change in charge similar to that of the B helix occurs. As with the E-helix link modifications, these changes may be made individually or together, with a higher preference for α-helical structures as well as different heli-links of IL-2. A person who has sex It may be substituted with a amino acid. C, Pro47→Gl 47 The splitting of the B-sock into the B-helix and the Bo-sock is unique to IL-2. This is a special structural feature. Pro47 ensures that the B' residue interacts properly with the receptor. It is considered that the socks are held fixedly on the B helix and Bo at the optimum angle for use. The Pro47→CIy47 substitution is present in the B helix and the B” hesock. It increases the flexibility of the hinge joint between the protein and protein, modulating the position of key residues and ultimately modifying the IL-2-receptor interaction. another amino Substitution of the 47-position with an acid is also encompassed by the present invention. D, Modification of one helix to A 1 The A helix is involved in receptor binding. A heli/ax has one negative electric current. It has a noic acid side chain (C, ful15) and one positively charged side chain (His16). As with the other hesoxes of TL-2, the structure of the A-helix can be strengthened by substitution with amino acids that have a preference for the α-hesox structure. E, B and Bo Changes in charge in hex A similar to hex A are also encompassed by the present invention. I! Amino acid substitutions after L that maintain or reduce the amphiphilicity of the Ahesox are also encompassed by the invention. E, dan Σ 艮 22 1 Otsu! and the modified F helix is an amphipathic helix. Some amino acids of F-hesox do not have a high preference for α-hesox structure, therefore the hydrophobicity table of F-hesox The interaction of the planes with the C and D socks is thought to provide the energy necessary to maintain the F helix in a helical configuration. Select to include residues with higher preference for α-helical structures. Perform amino acid substitutions (e.g. ^sn→Gln, Trp→Phe, 5e-Gln) Therefore, we constructed an IL-2 analog containing a modified (socks) sequence. does not require strong amphipathic interactions to maintain the helical structure; can maintain or reduce the amphipathic nature of the helix. 11. The substitution site obtained when binding to the modified ligand of IL-2 that binds to the substrate was selected so as not to disturb the carboxyl terminus and the structure of active IL-2 as much as possible. This is the exposed surface of the molecule. For example, by addition, insertion or substitution of cysteine residues. This provides a sulfhydryl group that can be chemically bonded to the following moieties: (a) Radiolabeled moiety (for assay, imaging). Attaching a reporter group to IL-2 allows rapid and sensitive detection of the resulting active IL-2 analog. These conjugates are used as key components in the development of sensitive IL-2 biological assays. (b) Enzymatic moieties (for assays, directed delivery of therapeutic agents). (e) Toxins (for selective cytotoxicity in vitro or in vivo), complexes of cytotoxic agents and IL-2, are toxic to cells that have IL-2 receptors. Guide the basics. These complexes are involved in certain types of leukemia, transplant rejection, autoimmunity and are useful in the treatment of altered immune states or other pathologically significant cell conditions. (d) Drugs (for directional delivery of therapeutic agents, e.g. for AIDS). ) Most of the cells susceptible to 11V infection are those that possess IL-2 receptors. The complex of TL-2 with a retroviral inhibitor such as ZT (reverse transcriptase inhibitor) guides the inhibitor into infected cells and provides a mechanism for internalization of the inhibitor via the IL-2 receptor. These complexes are useful in the treatment of AIDS and other related diseases. (e) Antibodies or mitogens (selective cell targeting, e.g. targeting of helper T cells using 0KT4 or equivalent and/or selective cell activation to a TL-2 responsive state), etc. According to the X-ray structure observation of IL-2, the receptor binding domain of IL-2 molecule is blocked. It is possible to attach another molecule to the carboxy terminus of IL-2 or the region spanning amino acids 79 to 82 without harm (see Figure 3); In the ~82 region (Δ1m''') incorporated into IL-2 (an IL-2 analog containing one disulfide bond but no free cysteine), the incorporation of free cysteine residues at these positions If obtained by modifying the IL-2 gene, IL-2 and cell surface receptor Free sulfhydride(s) can be removed by another molecule without affecting its binding to the target. It can be chemically bonded specifically to IL-2 by reaction with a lyle group. The carboxy-terminal region of IL-2 is not involved in receptor binding and contains a group of abnormal cysteines. This is a suitable site for inclusion. Leu132 was selected. The reason for this is that this amino acid is located close to the C-terminus (immediately after the final amino acid), and This is because these residues are not conserved when comparing the IL-2 sequences of mouse and mouse. An analogue in which cysteine is simply added to the carboxy terminus of IL-2 ((Cys'') IL-2) achieves the goal of incorporating an abnormal cysteine at the C-terminus. When the human, bovine, and mouse IL-2 sequences are aligned, the bovine and mouse sequences are compared to the human sequence. The amino acids, which include an insertion between amino acids 8o and 81, are part of a loop of four amino acids (amino M79-82) that connects the C helix and D hex of IL-2. This observation and the fact that this region of the molecule is distant from the putative receptor-binding domain and from other Cys residues in the molecule suggests that this site may be associated with aberrant systems. It can be concluded that this is an ideal insertion site for a phosphorus residue. Leu80→Cys80 Substitutions are also encompassed by the invention. C, modification of amine terminal region 1 Lys8→Cys8 in non-conserved residues? ! The substitution provides a reactive group near the amino terminus. , '5-m IL-2 fragment Certain structural components of IL-2 or The combination retains or loses the biological properties of intact IL-2, along with the ability to bind to the IL-2 receptor(s). Such peptides can be used in place of native IL-2 or as its antagonist. It is useful. Peptides suitable for this use include at least one of the A, B, B' and E helices. maintains its own internal symmetry (internal sy+nmetry) as a species of Such another structure, including the A and B sock regions, has I'L-2 receptors. - binds to components of IL-2 and has or does not have biological activity of IL-2. Or something. Such structures remain active in only a subset of IL-2 responsive cells, thus allowing for greater precision in manipulating IL-2 responses. Such another structure Although they have lost physical activity, they function as competitive inhibitors of IL-2 binding and are useful for antagonizing physiological conditions in which the stimulatory effects of IL-2 are implicated. This structure modulates the IL-2 receptor to enhance or decrease it, and the result is As a result, it affects cellular receptivity to IL-2. Other analogues encompassed by the present invention include the following modifications to the amino acid sequence of native IL-2. IL-2 analogues such as those described above are included, characterized in that one or more alterations are present. (a) deletion and/or substitution of amino acid residues that provide intramolecular folding sites; (b) deletion of terminal amino acid residues; (c) addition of amino acid residues to terminal amino acid residues; (d) strong acids. hydrolyzed under normal conditions (e) substitution of an amino acid residue with a glutamine residue; (f) substitution of an amino acid residue with a phenylalanine residue; (g) tryptophan residue; (h) deletion and/or substitution of asparagine residues, (i) deletion and/or substitution of cysteine residues, (j) substitution of amino acid residues with serine residues, and (k) substitution of an amino acid residue by an alanine residue. TL-2 regulation 2. IL-2 and IL-2 analogs are extremely hydrophobic proteins and therefore It tends to bind to hydrophobic pyrogens. These peptides may be in monomeric form, which is stable at acidic pH values. Under these conditions, the pyrogen has a monomer molecular weight similar to that of IL-2. etc., it is easy to form agglomerates with higher molecular weight. Therefore, the development of agglomerate morphology To separate monomeric IL-2 from thermal substances, we separated proteins based on size. Different processing procedures are used. A suitable procedure for carrying out this step is ultrafiltration through a YM-30 membrane (8mlcon). Glucose, mannitol or other bulk agents may be added as toxicity modifiers, which may be subjected to repeated dilutions and ultrafiltration to increase the yield of IL-2. Alternatively, IL-2 at a desired concentration can be obtained by concentrating by ultrafiltration or diluting with a suitable buffer. Pyrogens may also be separated from monomeric IL-2 by size exclusion chromatography using, for example, Sephadex G-75. Surfactants (e.g. laurate, sarcosine, sodium dodecyl sulfate) nullify the law. The reason is that in the presence of surfactants, pyrogens are decomposed into lower molecular weight forms, with an apparent molecular weight equivalent to IL-2. ion exchange chlorine Pyrogens from IL-2 solutions such as chromatography and hydrophobic chromatography The method 11N, which was expected to remove the quality, was found to be ineffective under the test conditions.The method of the present invention is easy to scale up and is therefore economically efficient. The following examples demonstrate the production of DNA sequences encoding microbial expression of IL-2 and its polypeptide analogs in accordance with the present invention, and also demonstrate the construction of expression vectors for microbial expression of the desired polypeptides. Construction of Oligonucleotide Sequences This example demonstrates a synthetic procedure for oligonucleotide sequences used to produce IL-2 analogue genes according to the present invention. Oligonucleotide sequences were synthesized in a four-step procedure including several intermediate washes. ^ pplied Biosystems (8BL) Model 380 automatic machine Synthesis was carried out using a sesizer and the obtained reagents. Support collar The polymer-bound dimethoxytrityl-protected nucleoside in the film is first treated with dichloromethane. The 5° protecting group (dimethoxytrichloride) was removed by treatment with 3% trichloroacetic acid in a solution for 1 minute. The polymer was washed with acetonitrile. washed polymer was then rinsed with anhydrous acetonitrile, maintained under argon, and then rinsed with acetonitrile. Protected nucleoside phosphoramidis in acetonitrile using tetrazole in lysate was condensed with <phosphoramidite). This reaction continued for 2.0 minutes. The reactants were then removed by passing 1 part of a mixture of acetic anhydride, 2,6-lutidine and tetrahydrofuran (1:1:8) and 1 part of 6.5% dimethylaminopyridine in tetrahydrofuran. The unreacted 5'-hydroxyl group was capped using the solution prepared by mixing. After 1 min, the capping solution was removed and treated with oxidizing solution (0.IN L in H20/2.6-lutidine/T HF, 1:10:40) for 1.5 min. The tolyl rinse, trichloroacetic acid/methylene chloride deprotection cycle was restarted and repeated until the desired oligonucleotide sequence was obtained. The final oligonucleotide strand was treated with fresh concentrated ammonia for 2.0 hours at room temperature. Decant the solution from the polymer and heat the concentrated ammonia solution in a sealed tube at 60°C for 16 hours. It was hot. Each oligonucleotide solution was extracted with 1-butanol and ethyl ether, and the concentration of each solution was measured using a spectrophotometer (260 nm). Each oligonucleotide at position was dried and washed with 15% polyacrylamide, 7M urea gel. Filled the bottle. The bands obtained after pneumophoresis are visualized by UV shadowing. The purified product is purified by oxidation, cutting from the gel, extraction, and desalting on a -50 Sephadex column. A manufactured oligonucleotide was obtained. Construction of IL-2 analogs by site-directed mutagenesis of oligonucleotides This example describes the production of IL-2 analogs using recombinant methods. Using the site-directed mutagenesis procedure described in PCT Application No. 111085700817 of 5ouza et al., filed February 28, 1985, the oligonucleotides of Table 2 were added to the DNA sequences of Table 1 (with E. coli preference codons). used. 45 (u (IJ ro . ro ro -H ni ＜-to＜ 口 2 8 ≧ 巳 = ま 口 に え い ５ み Ｇａ . . . to to to. to. to..);;;;;;;;;;;;;;;;,; For induction, the Xba I to Bam HI region of IL-2 from the expression vector pcFM 536 IL-2 was cloned into both M13mplO and M13mpH, single-stranded phage DNA was isolated and the DNA sequence was determined. Although we used pcF8536 (see U.S. Pat. No. 4,710,473, which is incorporated herein), any suitable expression vector can be used. The DNA in these mixtures was heated to 65°C to anneal and then slowly cooled to room temperature. TP-dATP, dCTP, clGTP, TTP, T4 DNA ligase, and the KIenou+ fragment of E. coli DNA polymerase were added to the annealed DNA. In this reaction, Fa DNA was converted into covalently closed double-stranded circular DNA. i n vitr. Synthesized double-stranded DNA is purified without first purifying it with an alkaline sucrose concentration gradient. Enterobacterium JM103 strain was directly transfected. derived from transfection Many plaques contain phage DNA along with the starting recombinant IL-2 sequence. However, some plaques contained IL-2 sequences with the desired base changes. To identify these plaques, the plaques were placed on nitrocellulose filters and the filters were coated with synthetic deoxynucleotides end-labeled with ^TP (γ-32P). Hybridized with Ochido. After hybridization, synthesize the filter with deoxynu Washing was carried out at 0-3°C, which is lower than the melting point of the cleotide and its complementary DNA sequence. child These wash conditions provide a strong A strong autoradiographic signal remained selectively. Each analog positive clone was confirmed by DNA sequencing and these clones were backcloned into pcFM 536 from Xba I to Bam HI. Cultures of recombinant IL-2 analogs were incubated with 10 g of tryptone per 11 and 5. of yeast extract and 5 g of NaCl at 30°C. . The cells were grown with shaking until 0.5, and then rapidly heated to 42°C. centre The shaking of Lasko continued for 3 hours in the dark at 42 degrees Celsius. Cells were collected by centrifugation at 1υ, oooxa at 4°C for 20 minutes. Cell pellets at 0. 4. Reconstitute IIaM dithiothreitol (DTT) in the proportion of wet weight, '·p. The cells were suspended at 1° C. and passed through a French Pressure Chamber (French Pressure Cell) at 10,000 psi and 4° C. twice for 15 minutes each time, and the supernatant of the disrupted cells was discarded. Starting with 5oIIIM Tris, 5mM EDT^, 5mM DTT, 0.5M NaCl, 1% sodium deoxycholate (DOC), pH 9.0. Suspend and mix for 30 minutes at room temperature. Matched. These mixtures were centrifuged at 10,000×G for 15 minutes at 14° C. and the supernatant was discarded. Wet weight 0.151? The starting pellet was resuspended in H2O at a ratio of /ii' and centrifuged at 10,0 OOX G for 15 minutes at 4°C. Discard the supernatant and 4% sodium laurate, 50mM Tris, 5% ethanol at room temperature. 20-30 zg/ml of protein in 50mM DTT, pH 8.7. It was solubilized by mixing. The solubilized protein was chromatographed on Sephadex G-75 using 2% sodium laurate, 50mM Tris and 5% ethanol, pH 8.7. Analyze the fractions with E on 5DS-PA and find more than 95% The higher purity IL-2 containing fractions were pooled. In some cases, it is desirable to obtain an IL-2 analog that is substantially free of pyrogens and endotoxins, and to this end the molecule is further purified. Proteins were oxidized in the presence of Cu'', concentrated and diluted with 1% laurate/25+eM Tris 15% ether. Chromatography was performed on Sephadex G-75 equilibrated with Nord, pH 8.7. Fractions containing the monomeric form of IL-2 were pooled and added to an equal volume of ethanol. protein was added to precipitate the protein. Pellets were collected by centrifugation, washed with 50% ethanol, and then solubilized with 50% acetic acid. Regenerating IL-2 analogs The solution was diluted 50 times so that the solution was diluted 50 times and then dialyzed against sodium acetate buffer such that the collection concentration and pH were 10 mM sodium acetate, pH 4. Activity of the 111 1L-2 Analog This example relates to the activity of the analog prepared in Example 2. A number of IL-2 analogs have been produced that contain two amino acid sequences that differ from the native sequence of IL-2. All analogs tested had ^la at position 125. As a positive control for these experiments, IL-2 (which contains one amino acid different from the native sequence) (^1aI25) was used. (Asp") IL-2 and (Glu") IL-2 are molecules with amino acid changes in the putative receptor binding B" domain of IL-2. More specifically, (Asp") IL-2 In IL-2, the neutral threonine at position 51 is replaced by a negatively charged aspartic acid; in IL-2, the positively charged lysine is replaced by a negatively charged glutamic acid. (in IF) In IL-2, the proline between the B and B' domains is replaced by glycine. This change represents a significant seminal binding of the molecule. 9 of these species were predicted to have a significant reduction in biological activity. The analogs were tested in several in vitro assays for IL-2 activity. 3H-thymidine is incorporated into the murine T-cell line CTTL-1 or human peripheral blood leukocytes (hPBL) to produce lymphocytes-activated killer cells from hPBL cultures. cells (LAK cells) were measured. We also measured the ability of this partially purified material to induce IFN-γ, IL-1 and TNF production in hPBL cultures. We conducted these experiments. Another CTLL-1 assembly using highly purified materials In B, the specific activity of (^1a125)IL-2 is 7.8X 10’Ll/my. The specific activity of (Glu") IL-2 was found to be 7.9x 10'U/rg, and the specific activity of (As p") IL-2 was 6.6x 10'U/rg. did. stomach The results of several experiments are shown in Table 3 below. Target specific sites using the following primers encoding desired changes in the DNA sequence: used natural mutagenesis. EC0R) 1; Since there is a pooler EcoR1 site, there is a The part of the IL-2 gene encoding It can be removed. In the second step, the excised portion of the gene is replaced with a synthetic NA sequence encoding the amino acid sequence of the modified F.socks. Using this method, the following IL-2 analogs C4 and C5 were constructed. [1 C^^ TTT to CT ^to T CCT T to ATCACT TTCTG T CA to TCCATC Iu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser IleATCAGCACT CTCACC lle Ser Thr Leu Thr 4(ni1n1111 ys120^1a12ko^1a12)leu12Direct^1a'ko1) IL-2C ^^TTCCTCAG^^^TGG ATCGCT TTCCCA CAG GCT ATCGlu Phe Leu Gin Lys Trp Ile^l a Phe^Ia Gln Ala l1eCT AGCGCA CT [; ACCLeu Ser Ala Leu Thrl -2 G^^ TTCCTG CAG ^^^ TTCATCGCT TTC CA CAG CAG ATCGlu Phe Leu Gln Lys Phe I le Ala Phe Ala Gln Gln l1eCTG CACGCA CTG [;CTLeu (:ln Ala Leu Ala 綽 1'a(^ :α helix , B・β sheet, T・turn) ln Lys Trp Tie Ala Phe Ala Gln Ala l1eAAAAAAAAAAAAA Leu Ser Ala Leu ThrAAAA AAA Leu Gln Ala Leu AlaAAAA Although the present invention has been described above based on a preferred embodiment, the description It will be readily apparent to those skilled in the art that modifications and variations are possible, and the scope of the claims should therefore be understood to cover all such modifications within the scope of the invention.International Search Report

Claims (1)

【特許請求の範囲】 ｌ．以下の式［Ｉ］、 【配列があります】［Ｉ］ で示されるアミノ酸配列を有しており、式中の４７、５１、８０、８１、１０６ 、１０９、１１２、１１９、１２０、１２３、１２７、１２９、１３１及び１３ ３番目の出発アミノ酸残基の少なくとも１つが置換アミノ酸残基によって置換さ れるか、または、８、４７、４８、５１、５４、８０、８１、１０６、１０９、 １１２、１１９、１２０、１２１、１２３、１２７、１２９、１３０、１３１、 １３２及び１３３番目の出発アミノ酸残基の少なくとも２つが置換アミノ酸残基 によって置換され、ＸがＣｙｓ、Ａｌａ及びＳｅｒから成るグループから選択さ れることを特徴とする宿主細胞による人工遺伝子の発現によって産生されたポリ ペプチド産物。 ２．アミノ酸配列中に以下の、 Ｌｙｓ８→Ｃｙｓ８ Ｐｒｏ４７→Ｇｌｙ４７ Ｔｈｒ５１→ＡＳＰ５１ Ｌｅｕ８０→Ｃｙｓ８０ Ａｒｇ８１→Ｃｙｓ８１ ＧＩｕ１０６→Ｌｙｓ１０６ Ａｓｐ１０９→Ｌｙｓ１０９ Ａｌａ１１２→Ｌｙｓ１１２ Ａｓｎ１１９→Ｇｌｎ１１９ Ａｒｇ１２０→Ｌｙｓ１２０ Ｔｈｒ１２３→Ａｌａ１２３ Ｓｅｒ１２７→Ａｌａ１２７またはＧｌｎ１２７ＩＩｅ１２９→Ｌｅｕ１２９ Ｓｅｒ１３０→Ｇｌｎ１３０ Ｔｈｒ１３１→Ａｌａ１３１ Ｌｅｕ１３２→Ｇｙｓ１３２ Ｔｈｒ１３３→Ａｌａ１３３ Ｇｙｓ１３４の付加 から選択されたｌつ以上の置換が存在し、また任意に以下の、 Ｌｙｓ４８→Ｇｌｙ４８ Ｌｙｓ５４→Ｇｌｕ５４ Ｔｒｐ１２１→Ｐｈｅ１２１ から選択されたｌつ以上の置換が存在しうることを特徴とする請求項ｌに記載の ポリペプチド。 ３．（Ｃｙｓ８）ＩＬ−２ （Ｇｌｙ４７）ＩＬ−２ （Ａｓｐ５１）ＩＬ−２ （Ｃｙｓ８０）ＩＬ−２ （Ｇｙｓ８１）ＩＬ−２ （Ｌｙｓ１０６）ＩＬ−２ （Ｌｙｓ１０９）ＩＬ−２ （Ｌｙｓ１１２）ＩＬ−２ （Ｇｙｓ１３２）ＩＬ−２ （Ｇｙｓ１３４）ＩＬ−２ から成るグループから選択されることを特徴とする請求項２に記載のポリペプチ ド。 ４．前記ポリペプチドがアミノ酸配列中に、（ａ）分子内折り畳み部位を与える アミノ酸残基の欠失及び／または置換、 （ｂ）末端アミノ酸残基の欠失、 （ｃ）末端アミノ酸残基へのアミノ酸残基の付加、（ｄ）高酸性の条件下で加水 分解に不安定な部位を与えるアミノ酸残基の欠失及び／または置換、 （ｅ）グルタミン残基によるアミノ酸残基の置換、（ｆ）フェニルアラニン残基 によるアミノ酸残基の置換、（ａ）トリプトファン残基の欠失及び／または置換 、（ｈ）アスパラギン残基の欠失及び／または置換、（ｉ）システイン残基の欠 失及び／または置換、（ｊ）セリン残基によるアミノ酸残基の置換、及び、（ｋ ）アラニン残基によるアミノ酸残基の置換から選択された改変を１つ以上含むこ とを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。 ５．８、８０及び１３２番目のアミノ酸残基の少なくとも１つが、リガンドと結 合し得る置換アミノ酸残基によって置換されているか及び／またはリガンドと結 合し得る１３４番目のアミノ酸残基が付加されていることを特徴とする請求項１ に記載のポリペプチド産物。 ６．前記置換アミノ酸残基及び前記１３４番目のアミノ酸残基がＧｙｓであるこ とを特徴とする請求項５に記載のポリペプチド。 ７．前記８、８０、８１、１３２または１３４番目のアミノ酸残基を介してラベ ルに結合されていることを特徴とする請求項５に記載のポリペプチド。 ８．前記８、８０、８１、１３２または１３４番目のアミノ酸残基を介して酵素 部分に結合されていることを特徴とする請求項５に記載のポリペプチド。 ９．前記８、８０、８１、１３２または１３４番目のアミノ酸残基を介して毒素 に持合されていることを特徴とする請求項５に記載のポリペプチド。 １０．前記８、８０．８１、１３２または１３４番目のアミノ酸残基を介して医 薬に結合されていることを特徴とする請求項５に記載のポリペプチド。 １１．前記８、８０、８１、１３２及び１３４番目のアミノ酸残基を介して抗体 またはマイトジェンに結合されていることを特徴とする請求項５に記載のポリペ プチド。 １２．天然ヒトＩＬ−２と交差反応しないことを特徴とする請求項１のポリペプ チド産物に特異的に結合する抗体。 １３．標識されていることを特徴とする請求項１２に記載の抗体。 １４．選択された宿主細胞中で請求項１に記載のポリペプチドの合成を指令し得 る人工遺伝子。 １５．選択された宿主細胞中で請求項２のポリペプチドの合成を指令し得る人工 遺伝子。 １６．塩基配列が、予定された宿主細胞中でのコドン発現優先性に基づいて、同 じアミノ酸を特定する複数の代替可能コドンから選択された１つ以上のコドンを 含むことを特徴とする請求項１４に記載の人工遺伝子。 １７．塩基配列が、大腸菌中でのコドン発現優先性に基づいて、同じアミノ酸を 特定する複数の代替可能コドンから選択された１つ以上のコドンを含むことを特 徴とする請求項１４に記載の人工遺伝子。 １８．ポリペプチドを特定する塩基コドンが、合成されたポリペプチド中の付加 的な開始及び／または終結アミノ酸を夫々特定する開始及び／または終結コドン を含むことを特徴とする請求項１４に記載の人工遺伝子。 １９．付加的な開始アミノ酸を特定する前記開始コドンが開始メチオニン残基を 特定するコドンであることを特徴とする請求項１８に記載の人工遺伝子。 ２０．ポリペプチドを特定する塩基コドンの上流及び／または下流及び／または 該コドン中に、制限エンドヌクレアーゼ酵素開裂認識部位を与える塩基配列の一 部を含む塩基の配列が存在することを特徴とする請求項１４に記載の人工遺伝子 。 ２１．ポリペプチドを特定する塩基コドンの上流に、リボソーム結合部位を与え る塩基配列の一部を含む塩基の配列が存在することを特徴とする請求項１４に記 載の人工遺伝子。 ２２．前記リボソーム結合部位が配列【配列があります】によって特定されるこ とを特徴とする請求項２１に記載の人工遺伝子。 ２３．標識されていることを特徴とする請求項１４に記載の人工遺伝子。 ２４．請求項１４または１５に記載の人工遺伝子を含む生物学的に機能性ＤＮＡ 形質転換ベクター。 ２５．請求項１４または１５に記載の人工遺伝子を含むベクターによって形質転 換された細胞。 ２６．（ａ）界面活性剤非含有ＩＬ−２溶液のｐＨを発熱物質がＩＬ−２単量体 の分子量より大きい分子量の集塊を形成するようなｐＨに調整し、 （ｂ）サイズによってＩＬ−２溶液から集塊を分離する段階を含むことを特徴と する発熱物質含有ＩＬ−２溶液から発熱物質を除去する方法。 ２７．段階（ｂ）で、（ｉ）ＩＬ−２溶液を希釈し、（ｉｉ）ＩＬ−２溶液から 集塊を分離する処理を繰り返すことを特徴とする請求項２６に記載の方法。 ２８．段階（ｂ）で、限外濾過またはサイズ排除クロマトグラフィーによってＩ Ｌ−２溶液から集塊を分離することを特徴とする請求項２６に記載の方法。 ２９．天然ＩＬ−２の生物学的特性を１つ以上有し、ヘリックスＡ及び／または ヘリックスＦの少なくとも２つの出発アミノ酸が置換アミノ酸によって置換され 、前記置換アミノ酸が置換アミノ酸を含有する各ヘリックスの両親媒性を変性し ていることを特徴とする宿主細胞による人工遺伝子の発現によって産生されたＩ Ｌ−２類似体。 ３０．置換アミノ酸が、置換アミノ酸を含有する各ヘリックス中の疎水性側鎖を もつアミノ酸と親水性側鎖をもつアミノ酸との比率を変化させることを特徴とす る請求項２９に記載のＩＬ−２類似体。 ３１．前記少なくとも２つの出発アミノ酸が疎水性側鎖を有するアミノ酸であり 、前記置換アミノ酸が親水性側鎖をもつアミノ酸であることを特徴とする請求項 ２９に記載のＩＬ−２類似体。 ３２．前記置換アミノ酸の各々が、該アミノ酸によって置換される出発アミノ酸 よりもαヘリックス構造に対して優先性を有することを特徴とする請求項２９に 記載のＩＬ−２類似体。 ３３．天然ＩＬ−２の生物学的特性を１つ以上有し、ヘリックスＥの少なくとも １つの出発アミノ酸及び／またはヘリックスＡ、Ｂ及び／またはＢ′の少なくと も２つの出発アミノ酸が置換アミノ酸によって置換され、前記置換アミノ酸の各 々は、置換アミノ酸によって置換される出発アミノ酸とは異なる電荷を有するこ とを特徴とする宿主細胞による人工遺伝子の発現によって産生されたＩＬ−２類 似体。 ３４．前記出発アミノ酸が親水性アミノ酸であることを特徴とする請求項３３に 記載のＩＬ−２類似体。 ３５．前記出発アミノ酸が荷電アミノ酸であることを特徴とする請求項３３に記 載のＩＬ−類似体。 ３６．前記置換アミノ酸の各々が、該アミノ酸によって置換される出発アミノ酸 よりもαヘリックス構造に対して優先性を有することを特徴とする請求項３３に 記載のＩＬ−２類似体。 ３７．天然ＩＬ−２の生物学的特性を１つ以上有し、ヘリックスＣ、Ｄ及び／ま たはＥの少なくとも１つの出発アミノ酸及び／またはヘリックスＡ、Ｂ、Ｂ′及 び／またはＦの少なくとも２つの出発アミノ酸が置換アミノ酸によって置換され 、前記置換アミノ酸の各々は、置換アミノ酸によって置換される出発アミノ酸よ りもαヘリックス構造に対して優先性を有することを特徴とする宿主細胞による 人工遺伝子の発現によって産生されたＩＬ−２類似体。 ３８．ヘリックスＡ、Ｂ、Ｂ′、Ｅ及び／またはＦの前記出発アミノ酸が前記置 換アミノ酸によって置換され、前記置換アミノ酸の各々は、該置換アミノ酸によ って置換される出発アミノ酸よりもαヘリックス構造に対して優先性を有するこ とを特徴とする請求項３７に記載のＩＬ−２類似体。 ３９．ヘリックスＦの前記少なくとも１つのアミノ酸が、αヘリックス構造に対 して優先性を有する前記置換アミノ酸によって置換されていることを特徴とする 請求項３７に記載のＩＬ−２類似体。 ４０．前記置換アミノ酸がＧｌｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、 Ｃｌｎ、Ｔｒｐ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｓｐ及びＨｉｓから成るグループから選択 されることを特徴とする請求項３７に記載のＩＬ−２類似体。 ４１．天然ＩＬ−２の生物学的特性を１つ以上有し、ヘリックスＡ、Ｂ′、Ｃ、 Ｄ及び／またはＥの少なくとも１つの出発アミノ酸及び／またはヘリックスＢ及 び／またはＦの少なくとも２つの出発アミノ酸が置換アミノ酸によって置換され 、前記置換アミノ酸の各々は、該置換アミノ酸によって置換される出発アミノ酸 よりもαヘリックス構造に対して優先性を有しており、前記置換アミノ酸の各々 は、該置換アミノ酸を含有する各ヘリックスの両親媒性を変性することを特徴と する宿主細胞による人工遺伝子の発現産物であるＩＬ−２類似体。 ４２．出発アミノ酸が親水性のとき、置換アミノ酸はＭｅｔ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、 Ｔｒｐ、Ｉｌｅ及びＶａｌから成るグループから選択され、出発アミノ酸が疎水 性のとき、置換アミノ酸はＧｌｕ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ及びＨｉｓ から成るグループから選択されることを特徴とする請求項４１に記載のＩＬ−２ 類似体。 ４３．ＩＬ−２レセプターと結合し得、ヘリックスＡ、Ｂ、Ｂ′及びＥの少なく とも１つを含み、ヘリックスＣ、Ｄ及びＦを含まないことを特徴とする宿主細胞 による人工遺伝子の発現産物であるペプチド。 ４４．ヘリックスＡ、Ｂ、Ｂ′及びＥの少なくとも１つの出発アミノ酸が、αヘ リックス構造に対して該アミノ酸よりも優先性を有する置換アミノ酸によって置 換されていることを特徴とする請求項４３に記載のペプチド。 ４５．有効量の請求項１に記載のポリペプチドと、製薬上許容される希釈剤、ア ジュバントまたは担体とを含むことを特徴とする医薬組成物。[Claims] l. The following formula [I], [There is an array] [I] It has the amino acid sequence shown in the formula, 47, 51, 80, 81, 106 , 109, 112, 119, 120, 123, 127, 129, 131 and 13 at least one of the third starting amino acid residues is replaced by a replacement amino acid residue; or 8, 47, 48, 51, 54, 80, 81, 106, 109, 112, 119, 120, 121, 123, 127, 129, 130, 131, At least two of the starting amino acid residues at positions 132 and 133 are substituted amino acid residues and X is selected from the group consisting of Cys, Ala and Ser. Polymers produced by expression of artificial genes by host cells characterized by Peptide products. 2. The amino acid sequence contains the following: Lys8→Cys8 Pro47→Gly47 Thr51→ASP51 Leu80→Cys80 Arg81→Cys81 GIu106→Lys106 Asp109→Lys109 Ala112→Lys112 Asn119→Gln119 Arg120→Lys120 Thr123→Ala123 Ser127→Ala127 or Gln127IIe129→Leu129 Ser130→Gln130 Thr131→Ala131 Leu132→Gys132 Thr133→Ala133 Addition of Gys134 There are one or more permutations selected from and optionally: Lys48→Gly48 Lys54→Glu54 Trp121→Phe121 according to claim 1, characterized in that there can be one or more permutations selected from polypeptide. 3. (Cys8)IL-2 (Gly47)IL-2 (Asp51)IL-2 (Cys80)IL-2 (Gys81)IL-2 (Lys106)IL-2 (Lys109)IL-2 (Lys112)IL-2 (Gys132)IL-2 (Gys134)IL-2 The polypeptide according to claim 2, characterized in that the polypeptide is selected from the group consisting of Do. 4. The polypeptide provides (a) an intramolecular folding site in the amino acid sequence; deletion and/or substitution of amino acid residues; (b) deletion of terminal amino acid residues, (c) addition of amino acid residues to terminal amino acid residues, (d) hydration under highly acidic conditions Deletion and/or substitution of amino acid residues that render sites unstable to degradation; (e) substitution of amino acid residues with glutamine residues, (f) phenylalanine residues Substitution of amino acid residues by (a) deletion and/or substitution of tryptophan residues , (h) deletion and/or substitution of asparagine residues, (i) deletion of cysteine residues. deletions and/or substitutions, (j) substitution of amino acid residues by serine residues, and (k ) containing one or more modifications selected from the substitution of amino acid residues by alanine residues; The polypeptide according to claim 1, characterized in that: 5. At least one of the 8th, 80th, and 132nd amino acid residues binds to the ligand. is substituted with a substituted amino acid residue that can bind to the ligand and/or binds to the ligand. Claim 1 characterized in that a 134th amino acid residue that can be combined is added. The polypeptide product described in. 6. The substituted amino acid residue and the 134th amino acid residue are Gys. The polypeptide according to claim 5, characterized in that: 7. Label via the 8th, 80th, 81st, 132nd or 134th amino acid residue. 6. The polypeptide according to claim 5, wherein the polypeptide is linked to a polypeptide. 8. Enzyme via the 8th, 80th, 81st, 132nd or 134th amino acid residue Polypeptide according to claim 5, characterized in that it is attached to a moiety. 9. toxin via the 8th, 80th, 81st, 132nd or 134th amino acid residue The polypeptide according to claim 5, characterized in that it is combined with 10. Through the amino acid residue at position 8, 80.81, 132 or 134, Polypeptide according to claim 5, characterized in that it is conjugated to a drug. 11. Antibodies via the amino acid residues 8, 80, 81, 132 and 134 or a mitogen, the polypeptide according to claim 5, Petite. 12. The polypeptide according to claim 1, characterized in that it does not cross-react with natural human IL-2. An antibody that specifically binds to tide products. 13. 13. The antibody according to claim 12, which is labeled. 14. capable of directing the synthesis of a polypeptide according to claim 1 in a selected host cell. artificial genes. 15. An artificial substance capable of directing the synthesis of the polypeptide of claim 2 in a selected host cell gene. 16. The base sequences are identical based on codon expression preferences in the intended host cell. one or more codons selected from multiple alternative codons specifying the same amino acid. The artificial gene according to claim 14, characterized in that it contains. 17. The base sequences contain the same amino acids based on codon expression preference in E. coli. Contains one or more codons selected from a plurality of alternative possible codons. The artificial gene according to claim 14, wherein the artificial gene is a characteristic. 18. Addition of base codons that specify polypeptides in synthesized polypeptides start and/or stop codons specifying the respective start and/or stop amino acids; 15. The artificial gene according to claim 14, comprising: 19. If the initiation codon specifies an additional starting amino acid, the starting methionine residue is The artificial gene according to claim 18, which is a specific codon. 20. Upstream and/or downstream and/or of the base codon that specifies the polypeptide A part of the base sequence that provides a restriction endonuclease enzyme cleavage recognition site within the codon. 15. The artificial gene according to claim 14, wherein there is a base sequence containing . 21. Provides a ribosome binding site upstream of the base codon that specifies the polypeptide. Claim 14, characterized in that there is a base sequence including a part of the base sequence. Artificial genes. 22. The ribosome binding site can be identified by the sequence [there is a sequence]. The artificial gene according to claim 21, characterized in that: 23. The artificial gene according to claim 14, characterized in that it is labeled. 24. Biologically functional DNA comprising the artificial gene according to claim 14 or 15 Transformation vector. 25. Transformation with a vector containing the artificial gene according to claim 14 or 15. converted cells. 26. (a) The pH of the surfactant-free IL-2 solution is determined by the pyrogen and the IL-2 monomer. Adjust the pH to such a level that agglomerates with a molecular weight larger than that of (b) separating the agglomerates from the IL-2 solution by size; A method for removing a pyrogen from a pyrogen-containing IL-2 solution. 27. In step (b), (i) dilute the IL-2 solution and (ii) remove from the IL-2 solution 27. A method according to claim 26, characterized in that the process of separating agglomerates is repeated. 28. In step (b), I by ultrafiltration or size exclusion chromatography 27. A method according to claim 26, characterized in that agglomerates are separated from the L-2 solution. 29. has one or more biological properties of native IL-2, and has helix A and/or at least two starting amino acids of helix F are replaced by substituted amino acids , the substituted amino acid modifies the amphipathic nature of each helix containing the substituted amino acid. I produced by expression of an artificial gene by a host cell characterized by L-2 analog. 30. The substituted amino acid replaces the hydrophobic side chain in each helix containing the substituted amino acid. It is characterized by changing the ratio of amino acids with hydrophilic side chains and amino acids with hydrophilic side chains. 30. The IL-2 analogue of claim 29. 31. the at least two starting amino acids are amino acids with hydrophobic side chains; , wherein the substituted amino acid is an amino acid having a hydrophilic side chain. IL-2 analogue according to 29. 32. each of said substituted amino acids is a starting amino acid that is replaced by said amino acid; Claim 29, characterized in that it has a preference for α-helical structure over α-helical structure. IL-2 analogs as described. 33. has one or more biological properties of native IL-2, and has at least one of the helix E at least one starting amino acid and/or helices A, B and/or B' Also, two starting amino acids are replaced by substituted amino acids, and each of said substituted amino acids each has a different charge than the starting amino acid that is replaced by the substituted amino acid. IL-2s produced by expression of artificial genes by host cells characterized by Similar body. 34. 34. According to claim 33, the starting amino acid is a hydrophilic amino acid. IL-2 analogs as described. 35. 34. The method according to claim 33, wherein the starting amino acid is a charged amino acid. IL-analogs of 36. each of said substituted amino acids is a starting amino acid that is replaced by said amino acid; Claim 33, characterized in that it has a preference for α-helical structure over α-helical structure. IL-2 analogs as described. 37. It has one or more biological properties of natural IL-2 and contains helices C, D and/or or at least one starting amino acid of E and/or helices A, B, B' and and/or at least two starting amino acids of F are replaced by substituted amino acids. , each of said substituted amino acids is different from the starting amino acid that is replaced by the substituted amino acid. host cells characterized by a preference for α-helical structures. IL-2 analogs produced by expression of artificial genes. 38. The starting amino acids of helices A, B, B', E and/or F are each substituted amino acid is replaced by a substituted amino acid; has a preference for α-helical structure over the starting amino acid being substituted. 38. The IL-2 analogue according to claim 37, characterized in that: 39. The at least one amino acid of helix F is oriented toward an α-helical structure. characterized in that the substituted amino acid has a preference for 38. IL-2 analogue according to claim 37. 40. The substituted amino acids are Glu, Met, Ala, Leu, Lys, Phe, Select from the group consisting of Cln, Trp, Ile, Val, Asp and His 38. IL-2 analogue according to claim 37, characterized in that it is 41. It has one or more biological properties of natural IL-2, and has helices A, B', C, at least one starting amino acid of D and/or E and/or helices B and and/or at least two starting amino acids of F are replaced by substituted amino acids. , each of said substituted amino acids is a starting amino acid substituted by said substituted amino acid. each of said substituted amino acids has a preference for α-helical structures than is characterized by modifying the amphipathic nature of each helix containing the substituted amino acid. An IL-2 analogue that is the product of expression of an artificial gene by a host cell. 42. When the starting amino acid is hydrophilic, the substituted amino acids are Met, Leu, Phe, selected from the group consisting of Trp, He and Val, and the starting amino acid is hydrophobic. In the case of sex, the substituted amino acids are Glu, Ala, Lys, Gln, Asp and His. IL-2 according to claim 41, characterized in that the IL-2 is selected from the group consisting of Analogs. 43. Able to bind to the IL-2 receptor, the majority of helices A, B, B' and E A host cell characterized in that it contains one of helices C, D and F. Peptides are the expression products of artificial genes. 44. At least one starting amino acid of helices A, B, B' and E is replaced by a substituted amino acid that has preference over that amino acid for the complex structure. 44. The peptide according to claim 43, characterized in that the peptide has been modified. 45. an effective amount of the polypeptide of claim 1 and a pharmaceutically acceptable diluent; A pharmaceutical composition comprising a juvant or a carrier.
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