JPH03500175A - ホルムアルデヒドに対する接触アレルギーを証明するための閉塞性上皮テストで使用される生成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 ホルムアルデヒドに対する接触アレルギーを証明するための閉塞性上皮テストで 使用される生成物技術的背景 閉塞性上皮テストに対する一般的な、英語に由来する名称は「パッチテスト」で ある。

この「バッチテスト」なる用語は、１９世紀末以来テスト物質に浸した織物また は紙のパッチが用いられた事実を反映している。信頼できかつ再現性のある結果 を得るための閉塞の重要さは１９５０年代以来ますますはつきりしてきている。

閉塞を得かつテスト物質を皮膚に十分に移動させるという見地から種々の異なる 種類のパッチが提案されてきた。例えば、米国特許Ａ第３，７０３．８０９号、 同３，８９４．５３１号、同４，２１４，５９２号、同４，１５８．３５９号、 同４．３９０．０２７号および同４，４５０．８４４号およびＷＯ−Ａ−８６１ ０１９９４号を参照されたい。「パッチ」なる用語は今日では現在の状況で非常 に広い意味で解釈される。それゆえこの明細書および請求の範囲では「パッチ」 なる語はテスト物質を担持しておりそして皮膚に施された領域を表す。慣用の技 術による最も一般的なパッチはアルミニウムまたはプラスチックの小カップ（そ れぞれＦｉｎｎ　Ｃｈａｍｂｅｒｓ■。

Ｅｐｉｃｏｎ　Ｏｙ、Ｆｉｎｌａｎｄ、およびＣｈｅｍｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　 ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＡＢ１Ｍａ１ｍ５、Ｓｗｅｄｅｎ）または濾紙を備えた小 さなアルミニウムディスク（ＡＩテスト、Ｈｏ１ｉｓｔｅｒ　５ｔｉｅｒ、　Ｕ ＳＡ）である。

これら慣用のパッチ上に、適当な賦形剤中に製剤化されたテスト物質がテスト直 前に貼付されていた。最も普通に用いられる賦形剤はペトロラタム（ワセリン） であるが、幾つかの問題性のある接触アレルゲンの場合（例えばホルムアルデヒ ド）、適当な溶媒（例えば水）中に溶解されたテスト物質に浸漬した織物または 濾紙のパッチを用いることが好ましかった。ＷＯ／Ａ／８６１０１９９４号およ びＢｒ、Ｊ、Ｄｅｒｍａｔｏｌ、１１２（１９８５）、ｐｐ６３〜８は完全に新 しいバッチ世代という点で進んでいると考えられる。

この技術は「トルー（ＴＲＵＥ）テスト」と呼ばれる。この方法は、皮膚に対し て閉塞下にパッチを施した場合に検査される皮膚領域から水分を吸収しうる薄い 乾燥ポリマー被膜であるパッチを用いる。最も好ましい賦形剤は次にゲルを形成 するものであると言われてきた。トルーテスト法によるパッチにおいては、ポリ マー被膜中へのテスト物質の均一な分配は製造段階ですでに達成されている。こ のトルーテストは保証された量のテスト物質を含有する高品質パッチを顧客に提 供しうる最初のシステムである。

接触アレルギーを証明するための閉塞性上皮テストは、テスト物質を含有する１ 種またはそれ以上のパッチが貼付された感圧性粘着性試験片を用いて行われる。

従ってかかる試験片は、たいていの場合はそのパッチ数は１５未満ではあるが、 ２５パツチまでの多数のパッチを担持てきる。これら試験片は空気、水分および 光に対して非透過性である物質で包装できることが知られている。

上皮テスト操作において、適当な製剤の形態のアレルゲン物質を閉塞下に正常な 皮膚に予め定められた期間正確な方法で付与する。このものは次に、接触アレル ギー症例の場合はテスト領域でアレルギー性湿疹を生じよう。

刺激性物質は同様の性質の刺激性湿疹反応を生ずる（Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｃｏ ｎｔａｃｔ　Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ：Ｆｒｅｇｅｒｔ　Ｓ、、　２ｎｄｅｄｉｔ ｉｏｎ、　Ｍｕｎｋｓｇａａｒｄ、　Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ（１９８１）、　＄ ）り　７１〜６）。

皮膚に面していない側のパッチは水分に対して非透過性であり、従って前記閉塞 をもたらす。

我々の知る限りでは、慣用のバッチテストに従い使用するための作製ずみホルム アルデヒドバッチは商業的にはけっして入手できなかった。ホルムアルデヒドア レルギーを証明する目的でトルーテストに使用するための一応満足できるパッチ はポリマー被膜中にシクロデキストリン複合物の形態をしたホルムアルデヒドま たはパラホルムアルデヒドを混入することにより作製できた（ＥＰ−Ａ−２５２ ，０４４）。しかしながら、ホルムアルデヒドに関する問題を解決するためには 別の溶液を必要とすることが判明本発明の目的の一つは貯蔵に安定でありそして 個体がホルムアルデヒドに対する接触アレルギーにかかっているか否かの判定に 診断上用いられるパッチおよびテスト用試験片を提供することである。他の目的 では、ここで意図される種類の接触アレルギーを検出するのに用いられる新規な 方法があげられうる。

発　明 本発明の観点の一つはホルムアルデヒドアレルギーを特異的に検出するための少 なくとも１種のパッチを有するテスト用試験片にある。ここでの特別の特徴は前 記少なくとも１種のバッチ上におけるテスト用物質がカルボキサミドまたは−イ ミドの可逆性Ｎ−ホルムアルデヒド誘導体（いわゆるＮＨ酸化合物）であること である。「可逆性誘導体」なる用語は水が存在する場合にそのテスト物質が分解 してホルムアルデヒドを形成できることを意味する。もう一つの特徴はその試験 片が用いられている間に、テストされる皮膚領域から最も好ましい態様において 、水分を吸収できる乾燥賦形剤中にそのテスト物質が製剤化されていることであ る。皮膚からの水分と接触すると、ホルムアルデヒドがその誘導体から放出され そして次に、その試験片を貼付された人物がホルムアルデヒドに対して感作され ている場合はアレルギー反応を生じうる。

本発明のより小さい観点は、本発明の目的に従って使用されるテスト組成物の製 造へのカルボキサミドまたは−イミドの可逆性Ｎ−ホルムアルデヒド誘導体の使 用にある。前記した種類の可逆性Ｎ−ホルムアルデヒド誘導体は有機化学者には よく知られている。かかる誘導体はＮＨａ化合物を通常加熱下にホルムアルデヒ ドと反応させることにより容易に製造できる。溶媒は水、エタノールまたはジオ キサンであることができる。この合成では等モル量のホルムアルデヒドとＮＨ酸 化合物を使用するか、またはホルムアルデヒドをＮＨ酸化合物に比較して過剰に 使用する。ホルムアルデヒドはホルマリンまたはバラホルムアルデヒドの形態で 用いられている。科学文献においては、通常のアミド、イミド、カルバメート、 尿素およびその誘導体、ヒダントイン、パルピッレートおよびウラシル誘導体等 から製造される誘導体が記載されている。合成の第一段階はＮ−ヒドロキシメチ ル化すること（例えば−ＣＯＮＨ−ＣＨ，ＯＨおよび（−Ｃｏ）Ｊ−ＣＨｚＯＨ ）であるがしかし、存在するアミドまたはイミドとさらに反応しうる（例えば− ＣＯＮＨ−ＣＨｚ−ＮＨＣＯまたは（−Ｃｏ）Ｊ−ＣＢ２−Ｎ（Ｃｏ−）ｘ）。

もし合成が適当な条件下に第２アミンの存在下に行われる場合は、いわゆるマン ニッヒ塩基である最終生成物を得ることができる（例えばジメチルアミンが用い られる場合は−ＣＯＮＨ−ＣＢ２−Ｎ（ＣＨｓ）２）。予め導入されたヒドロキ シル基をさらに誘導体形成させるには別の合成工程、例えばエステル化を行うこ とができる。

薬物の可逆性Ｎ−ホルムアルデヒド誘導体は導入されたホルムアルデヒド部分が インビボで容易に加水分解されるという見地から「プロドラッグ」として提案さ れている。この種の使用に関連した研究においてはＮ−ホルムアルデヒド誘導体 の加水分解が注意深く調べられた。

公表されたデータからはいかに構造が加水分解速度に影響するか分かる（ｐＨ７ 、血液）。Ｊｏｈａｎｓｅｎ　Ｍ、＆　Ｈ，Ｂｕｎｄｇ−ａａｒｄ、　Ａｒｃｈ 、Ｐｈａｒｍ、Ｃｈｅｍｉ、　Ｓｃｉ、Ｅｄ、７（１９７９）ｐｐ　１７５＝９ ２；Ａｒｃｈ−Ｐｈａｒｍ、Ｃｈｅｍｉ、Ｓｃｉ、Ｅｄ、９（１９８１）ｐｐ４ ０−２　；　Ａｒｃｈ、Ｐｈａｒｍ。

Ｃｈｅｍ　ｉ　、　Ｓｃ　ｉ、Ｅｄ　、９（１９８１）ｐｐ４３−５４　、およ びＢｕｎｄｇａａｒｄ、　Ｈ。

＆　Ｊｏｈａｎｓｅｎ、　Ｍ、　Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｐｈａｒｍ、　５（１９８０ ）ｐｐ　６７〜７７；　Ｊ。

Ｐｈａｒｍ、　Ｓｃｉ、　６９　（１９８０）　ｐｐ４４〜６　；　Ａｒｃｈ、 　Ｐｈａｒｍ、　Ｃｈｅｍｉ。

Ｓｃｉ、　Ｅｄ、　８（１９８０）　ｐｐ　２９〜５２を参照されたい。

本発明は一方では可逆性Ｎ−ホルムアルデヒド誘導体に関する知識に助けられて いるがこれら誘導体を医薬のための「プロドラッグ」としては使用せず、代わり にホルムアルデヒドのための「プロドラッグ」として使用するものである。

本発明により使用されるＮ−ホルムアルデヒド誘導体は皮膚により分泌される水 分中で容易に分解してホルムアルデヒドを生成しなければならない。他の分解生 成物のみならずＮ−ホルムアルデヒド誘導体それ自体もアレルギー性または刺激 性の種類の皮膚反応をあまり生じないかまたは好ましくは何ら生じないものでな ければならない。すなわちこれらの物質は不活性で皮膚に生理学的に受容されな ければならない。ホルムアルデヒドそれ自身であるただ１種の分解生成物のみが 皮膚反応を生じさせるべきであるという要件ゆえに、それらの分解経路がよく限 定されていて直接ホルムアルデヒドを生成する種類のＮ−ホルムアルデヒド誘導 体を選択することが必要となる。ホルムアルデヒドの放出はｐＨ依存性でありそ してその誘導体の構造により決定される。誘導体の分解速度はｐＨの上昇に伴っ て増大しよう。本願の場合迅速な放出が望ましいので、ｐＨ９（すなわち、必要 刺激を生ずる直前のｐＨ）での構造対分解の相互関係を調べた。実験結果の１つ によれば、その相互関係はｐＨ７，４におけると実質的に同じであることが示さ れる。いわゆるモルモット最大化試験においても、ホルムアルデヒド感作モルモ ットでのアレルギー反応を得るのに必要な分解半減値を測定した。その結果は半 減期は７時間未満でなければならないことをはっきりと示している（水溶液、ｐ Ｈ９−０，０，１Ｍ　Ｈｃｏｓ−／ｃｏ３”−１誘導体濃度８　Ｘ　１０−’Ｍ 、　３Ｑ°Ｃ）。この半減期上限はただ一般的なガイドラインであると理解され るべきである。ホルムアルデヒド誘導体が選択される場合は動物モデルにおける 適当な研究もなされねばならない、なぜなら補足的な評価をすることは、所定の 誘導体がホルムアルデヒド感作された個体において意図された反応を生ずること が確立されることを意味するからである。

現在の知識に基づけば、好ましい物質はＮ−ホルムアルデヒド誘導体化されたイ ミド、例えば７タルイミド、スクシンイミド、ヒダントイン等のような環状イミ ドである。カルボキサミドのマンニッヒ塩基が加水分解的に不安定であることが 判明している。そのためこれらは将来優れたホルムアルデヒド放出性物質である ことがよく判明しよう。この目的にとって良好であるためにはＮ−ホルムアルデ ヒド誘導体にとって何が非常に本質的であるかと言うと、それが水に溶解すべき ことで、できるならばさらにその溶解が迅速に進行することである。

賦形剤 Ｎｌ（酸化合物のＮ−ホルムアルデヒド誘導体が分解を受けるためには、水分が 存在することが必要である。それがＷＯ−Ａ−８６１０１９９４号記載の方法が 本発明において非常に適する理由である。従ってＮ−ホルムアルデヒド誘導体を 、テストで用いられた場合に水分を吸収しうるポリマーを被膜形成性ポリマーと して含有する乾燥被膜（賦形剤、通常０．２５＋＋＋＋ｎまたはそれより薄い） 中に製剤化することが好ましい。もちろんこれはその誘導体の他の製剤化用な媒 体と考えられ、この場合その加水分解（分解）は皮膚−ワセリン界面で起こる。

水分吸収要件を満たすためにはポリマーは多数の極性構造を含有すべきであり、 さらには良好な被膜形成体であるべきである。所定のポリマーの適否は筒車な予 備試験により容易に評価できる。ポリマーの適否を反映する種々の性質に関する 情報も製造者および教本から入手できる（例えばＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏ ｆ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　：　Ｐｌ ａｓｔｉｃｓ、　Ｒｕｂｂｅｒｓ、　Ｒｅ５ｉｎｓ、　Ｆｉｂｅｒｓ　；Ｊｏｈ ｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ　Ｉｎｃ、、Ｖｏｌ、６．　ｐｐ７７Ｂ＝９　（ １９６７））。極性構造の例をあげればエステル基、エーテル基、アミド基等で ある。疎水度（親油度／親水度）は極性基の数（密度）およびその極性度により 幅広く決定される。最適なポリマーの選択はＮ−ホルムアルデヒド誘導体、（も しあれば）製剤化に用いられる溶媒、およびその皮膜が貼付される基質（被膜用 担体）のいかんによろう。

賦形剤が選択される場合、考慮すべき重要なポイントはその賦形剤が製剤上受容 されうろことおよび皮膚に対して刺激性でないこと、被膜用担体等に対して不活 性であることである。

最終生成物での良好なテスト結果を確保するには、下記の二つの条件が決定的に 重要である。すなわち（１）Ｎ−ホルムアルデヒド誘導体が加工中水を使用する ことなく製剤化されねばならない。水の存在により徐々に加水分解を生じ、そし てその場合バッチ中のテスト物質の含量が確保できない。および（２）Ｎ−ホル ムアルデヒド誘導体が被膜形成性物質中に均一に分配されねばならない。

次にこの物質がいわゆる被膜用担体上に均一な厚さの層として広げられねばなら ない。選択すべき被膜用担体に関してはＷＯ−Ａ−８６１０１９９４号を参照さ れたい。

ＴＲＵＥテストを取り扱う早期の特許公報では被膜形成性ポリマーは揮発性液体 と一緒になってゲルまたは合着性乳濁液を形成できなければならないことが強調 されている。特に水があげられる。この要件は製剤化技術という理由からあげら れる。

ＷＯ−Ａ−８６１０１９９４号によるテスト用試験片の製造に現在用いられる方 法においてはゲルまたは乳濁液の塗布は、薄い層が得られ次にその層を乾燥させ ると柔軟な被膜が形成されるような方法でできなければならない。ここで意図さ れるＮ−ホルムアルデヒド誘導体が加水分解に対して感受性が高いという見地か ら、本発明においては非水性溶媒好ましくは非プロトン性溶媒と混合された場合 に所望のゲルまたは乳濁液を生成する被膜形成性ポリマーを使用することが推奨 される。所定のポリマーが所定の溶媒と組み合わせて使用するのに適しているか 否かは、なかんずく幾つかの簡単な予備試験により判定できる。

被膜の製造に現在量も良く知られた方法においては、Ｎ−ホルムアルデヒド誘導 体を、揮発性の非プロトン性溶媒中に溶解またはゲル化した親油性を有する被膜 形成性ポリマー例えばポリビニルピロリドンに加える。これはＮ−ホルムアルデ ヒド誘導体をゲル中に微細な状態で均一に分散または乳化することにより行うこ とができる。

次に被膜用担体を均一な厚さのゲル層で被覆し、これを乾燥させ、かくして得ら れた被膜シートを次に好ましくは形状および寸法（面積）が等しい適当な数のバ ッチに切断する。得られる乾燥被膜の厚さは塗布されたゲル量の如何に応じて変 動しうる。バッチの面積は通常０．２から４ｃｍ２の範囲内である。被膜内にお ける単位面積当たりのＮ−ホルムアルデヒド誘導体の量は用いられる個々の誘導 体、賦形剤および場合により添加されうる任意の緩衝系の如何によろう。ここで Ｎ−ホルムアルデヒド誘導体の加水分解速度はｐＨ依存性であることに留意され たい。この理由で、乾燥緩衝剤成分を前記ゲル中に分散させて、分泌された水分 が緩衝剤の作用を受けて皮膚上で生理学的に受容できかつホルムアルデヒド放出 に関して受容されうるｐＨを生ずることが推奨される。用いられる誘導体の如何 に応じ、ｐＨは４から１０の範囲内で選択されうる。かかる緩衝作用によってホ ルムアルデヒドの放出が検査される人物により分泌される水分のｐＨ次第となる ことが回避されよう。緩衝系の適当なものをあげれば、１（ＱＣンＣＯニー、　 ＨＰ　Ｏ”、−／　Ｐ　Ｏニー、　ＨｔＰ　ＯンＨＰＯニー、ＡｃＯＨ／Ａｃ０ −　である。

次にバッチを、各バッチの周囲全体に少なくとも１ｃＩ１１の突き出た縁辺を供 与する感圧性の粘着性物質（被膜側はシートの反対側とされる）のシート上に置 く。テスト操作を促進するためには、数種の異なる接触アレルゲンを１個のシー トの上にのせることが出来る。バッチ中におけるテスト物質の含量を確保するに は、それらを原則的に水分、光および空気を通さない包装材料を用い、ＴＲＵＥ テスト法で知られた方法で包装することが重要である。

本発明により用いられるＮ−ホルムアルデヒド誘導体の場合のみならずその他の 炭種かのテスト物質の場合、その包装中に付加的に乾燥剤を封入することにより 貯蔵安定性をさらに改善することも可能である。

テスト操作 この操作は前記した種類のバッチまたはテスト用試験片を用いそれ自体知られた 方法で行われる。１個またはそれ以上のバッチ（テスト試験片）を、賦形剤（被 膜）がテストすべき皮膚領域と接触するような方法で患者の皮膚に付着させ、そ こでその試験片が皮膚に密封状に圧しつけられて位置に固定される。試験片（バ ッチ）の除去は通常約４０〜５０時間後に行われよう。結果の読み取りはさらに ２０〜３０時間後に行われよう。

本発明を明細書の一部分を形成する添付の請求の範囲において明確にする。

実施例　１ アミドおよびイミドの種々のＮ−ヒドロキシメチル誘導体の分解半減期の測定 装置二分光測定はＺｅｉｓｓ　ＰＭＱＩ［分光光度計を用いて行われた。ｐＨは Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ　ＰＭＭ−８３を用いて測定された。

物質二Ｎ−（ヒドロキシメチル）−ベンズアミド（Ｈｅｌｌ−ｍａｎ、　Ｈ，Ａ ｎｇｅｗ、　Ｃｈｅｍ、　６９（１９５７）、４７０）、Ｎ−（ヒドロキシメチ ル）−ニコチンアミド（Ｃｈｅｃｈｅｌｓｋａ、Ｂ、　＆　Ｕｒｂａｎｓｋｉ。

Ｔ、、　Ｒｏｃｚｎｉｋｉ　Ｃｈｅｍ、　２７．３９６〜４０９）、Ｎ−（ヒド ロキシメチル）−７タルイミド（Ｂｕｃｈ、　Ｓ、　Ｒ，、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈ ｅｗ。

Ｓｏｃ、　６９（１９４７）　２５４−）、Ｎ−（１：：ドロキシメチル）−ヒ タントイン（Ｋｏｎｉｓｈｉｒｏｋｕ　Ｐｈｏｔｏ　Ｉｎｄｕｓｔｒ、　Ｇｏ、 　Ｌｔｄ、　Ｊａｐａｎ６８８２　（’５８）　Ａｕｇ−２０，Ｃｈｅｍｉｃａ ｌ　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　５４．１３５ｈ）、Ｎ−ヒドロキシメチルスクシンイ ミド（Ｖａｉｌ、　Ｓ、　Ｌ、　＆Ｐｉｅｒｃｅ、　Ａ、　Ｇ、、　Ｊ、　Ｏｒ ｇ、　Ｃｈｅｍ、　３７（１９７２）３９３−）　、およびＭａｎｎｉｃｈ塩基 Ｎ−ジメチルアミノメチルニコチンアミド（Ｓｉｎｇｈ、（、、等、Ｉｎｄｉａ ｎ　Ｊ、　Ｐｈａｒｍ、　３０（１９６８）２３１〜３　）およびＮ−ジメチル アミノメチルスクシンイミド（Ｂｏｅｈｍｅ　。

Ｈ１等Ａｎｎ、　Ｃｈｅｍ、　６６４　（１９６３）１３０〜４０）を既知方法 で製造した。

速度測定：分解は炭酸塩（０，１Ｍ、　ｐＨ９，０３）、燐酸塩（０，１Ｍ１ｐ Ｈ６，０，７，１２，７，２０および０．０５Ｍ　、　ｐＨ６，１５）および酢 酸塩（０，０５ＭおよびＯ，ＬＭ　、　ｐＨ４，０）の緩衝液中３０℃で進行さ せた。Ｎ−ホルムアルデヒド誘導体の当初濃度は０．１〜ｌＸｌ０−”Ｍであり そしてマンニッヒ塩基のそれは２　Ｘ　１０−’Ｍであった。反応は以下に記載 する比色法でホルムアルデヒドの放出を測定することにより監視した。

迅速な反応に対しては、下記代替「トラッピング」法が用いられた。適切な頃合 いを見て試料採取することにより、１０００μΩずつの試料を採取した。これら を水で１０．００ｍＱまで希釈し、次に各希釈物５００μａずつを分析した。擬 −次速度定数は時間に対するｌｏｇ（Ａ−ＡｔＸここでＡおよびＡｔはそれぞれ 無限大および時間ｔでの吸光度（６２５ｎｍ）の読みである）の直線状プツトに 基づき計算した。結果を以下に示す。

測定：ホルムアルデヒドの放出はＪｏｈａｎｓｅｎ、　Ｍ、　＆　Ｂｕ−ｎｄｇ ａａｒｄ、　Ｈ，（Ａｒｃｈ、　Ｐｈａｒｎ、　Ｃｈｅｍｉ、、　Ｓｃｉ、　Ｅ ｄ、　７（１９７９）１）Ｉ）１７８〜）に従い測定した。テスト溶液（約８ｘ 　１０−’Ｍ）５００μ０を０．１Ｍ酢酸塩緩衝液（ｐＨ４，０）　４００μＱ および０．５％３−メチルベンゾチアゾール−２−オンヒドラゾン塩酸塩水溶液 １００μＣと混合した。室温で３０分後、０．２５％のＦｅ（ｎｌ　＋　）クロ ライド６水和物を含有する水溶液５００μＱを加えた。

さらに１０分後、水１５００μＱを加え、そしてこの混合物の吸光度を試薬を含 有するブランクに比較して６２５ｎｍで読み取った。次にテスト溶液中における ホルムアルデヒド濃度をホルムアルデヒドに関する標準曲線により計算しｔこ　 。

ホルムアルデヒドの「トラッピングＪ　：　ｐＨ９，０ではスクシンイミド、フ タルイミドおよびヒダントインのＮ−ヒドロキシメチル誘導体およびマンニッヒ 塩基（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノメチルスクシンイミドおよびＮ、Ｎ−ジメチルア ミノメチルニコチンアミド）の分解速度は比色法により測定するには高すぎた。

しかしながらこの反応速度は形成されたホルムアルデヒドをセミカルバジドで捕 捉しそしてセミカルバゾンの吸光度（２３５）の増大を測定することにより分光 測光的に監視できた。それゆえセミカルバジド塩酸塩（１０−”Ｍ　）を分解が 行われる緩衝液中に包含させた。

ここで意図される化合物の分解に関する以前の調査では速度は一定のｐｎを維持 するために用いられる緩衝剤濃度（０，０２〜０．２Ｍ　）とは関係ないことが 示される。表１に示される値を含むｐｎ範囲にとって、観察された擬−次速度定 数がヒドロキサイドイオン濃度に正比例することが先に示されている（Ｊｏｈａ ｎｓｅｎ、　Ｍ、　＆　Ｂｕｎｄｇａａｒｄ、　Ｈ，、Ａｒｃｈ−Ｐｈａｒｍ、 　Ｃｈｅｍｉ、　Ｓｃｉ、　Ｅｄ、　７（１９７９）　１７８〜）。

Ｃｏｂｓ”ＣＸ　（ＯＨ−） この等式を用いてＮ　ｃｏｂｓ測定値に基づき所定のＮ−ホルムアルデヒド誘導 体のｐＨ９（３０℃）における速度定数ｃＧよび半減期を計算できる。

希薄溶液（約Ｉ　Ｘ　１０−”Ｍ）においては、アミド／イミドの形成が優勢で ある。Ｎ−ヒドロキシメチル誘導体の当初濃度が増大するに伴い、ホルムアルデ ヒドが化学量論的量に形成されないことが観察された。測定された擬−次速度定 数に基づき、検査しｔ；誘導体の半減期を計算しておよそ次のとおりであった。

ベンズアミド誘導体６．３時間、ニコチンアミド誘導体０．７時間、スクシンイ ミド誘導体０．０３分、フタルイミド誘導体０．０３分未満、ヒダントイン誘導 体０．０３時間、そして調査された２種のマンニッヒ塩基０．０３未満。

実施例　２ ベンズアミド、ニコチンアミド、フタルイミド、スクシンイミドおよびヒダント インのＮ−ヒドロキシメチル誘導体を用いるモルモット最大化試験 テスト操作：モルモット最大化試験は既知方法により実施した（Ｍａｇｎｕｓｓ ｏｎ、　Ｂ、　＆　Ｋｌｉｇｍａｎ、　Ａ、　Ｍ、、　Ｊ、Ｉｎｖｅｓｔ。

Ｄｅｒｍａｔｏｌ、　５３（１９６９）　ｐｐ２６８〜７６；Ｗａｈｌｂｅｒｇ 、　Ｊ、　Ｅ、　＆Ｂｏｍａｎ、　Ａ、、　Ｃｕｒｒ、　Ｐｒｏｂｌ、　Ｄｅｒ ｍ、　１４（１９８５）ｐｐ５９−１０６）　；およびＡｎｄｅｒｓｅｎ、　Ｋ 、　Ｅ、等Ａｃｔａ　Ｄｅｒｒｂ、　Ｖｅｎｅｒｅｏｌ、６５（１９８５）ｐｐ ４７２〜８）。

パッチの製造 Ｎ−−ヒドロキシメチル誘導体を含有するバッチを製造した。詳細な記述はスク シンイミド誘導体の場合に関して以下に述べる。他の誘導体の製剤も同様であっ た。

２０．００９のＮ−ヒドロキシメチルスクシンイミドを６８．０ｈのメチレンク ロライド中に懸濁した（１分、Ｕｌｔｒａ−ｔｏｒｒａｘ。

９５００ｒｐｍ）。次に乾燥重炭酸ナトリウム（０，４００ｇ、微細状）および 乾燥炭酸ナトリウム（０，０６０ｇ、微細状）を添加した。

終わりに７．０００ｇのポリビニルピロリドン（Ｐｏ１ｙｖｉｄｏｎｅ。

ＧＡＦ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を３００ｒｐｍで撹拌しながら加えた。次に 撹拌速度を５０ｒｐｍに設定して１時間撹拌した。ゲル様稠度を有する塊を次に 厚さ７５μｍを有するポリエステルシート（Ｍｙｌａｒ　Ｔｙｐｅ　Ｄ、　Ｄｕ ｐｏｎｔ）上の厚さ７０％ｍを有するポリエステルシート（Ｍｙｌａｒ　Ｔｙｐ ｅＤ、　Ｄｕｐｏｎｔ）上に均一な厚さく７０μｍ）の被膜として展げた。乾燥 すると薄い柔軟な、約３０μｍの厚さの被膜が得られた。次にこの被膜で被膜し たシートラ０．７９ｃｍ２ずつの四角なバッチに切断し、それらを感圧性粘着シ ート上にのせ、各バッチの周囲にはそのシートのヘリが少なくとも１ＣＩＩＩず つ残るようにした。得られたバンチを分析すると、それらが０．０８ｒｎｇ／ｃ ｍ２のホルムアルデヒドをＮ−ヒドロキシメチルスクシンイミドの形態で含有す ることが示された。次にシート（テスト用試験片）をラミネートアルミニウム箔 中にそれぞれ包んで光、空気および水分に対して非透過性の包装となし、そして 種々の温度で種々の時間貯蔵した。次にそれらをＮ−ヒドロキシメチルスクシン イミドの形態をした残留ホルムアルデヒド含量について分析した。結果：８℃　 １０２％　１１０％　９７％　１１２％２５°Ｃ９８％　１１９％　９３％　７ ５％４０℃　４６％　４２％　３１％　１７％他の濃度のＮ−ヒドロキシメチル スクシンイミドを用いて同様の検査を行った。そのテストでは８℃、で９か月ま での貯蔵で満足できる安定性を有することが示された。

また、この検査では貯蔵安定性がパッチ上のテスト物質濃度と無関係であること が示された。

Ｎ−ヒドロキシメチルスクシンイミドの量を変動させ、およびこの物質をベンズ アミド、ニコチンアミド、フタルイミドおよびヒダントインのＮ−ヒドロキシメ チル誘導体で置き代えることにより、ホルムアルデヒドに関して以下に列挙する 濃度を有するパッチを製造した。全てのバッチ寸法は帆７９ｃｒｎ２であった。

ベンズアミド　２．０７および０．８０ニコチンアミド　０．３０および０．６ ２フタルイミド　０．４３および０．８５ヒダントイン　３．０９ スクシンイミド　０．５および０．１２次にパッチをモルモット最大化テストに 用いた。比較のにめに用いられｔニパツチは（ｉＮ％（Ｖ／Ｖ）ホルムアルデヒ ド Ｃｈａｍｂｅｒ■中の２個のＦｉｎｎ　Ｃｈａｍｂｅｒ■フィルターに３０ｕＱ で０．７８ｒｎｙ／　ｃｍ’）、および（ｉｉ）ベンズアミド（６．８０ｍｇ／ ｃｍ”）、ニコチンアミドＣ７．７ｔｎｙ／ｃｍす、フタルイミド（３．６０ｍ ｇ／ｃｒａす、ヒダントイン（３．６０ｍ９／ｃｍ”）およびスクシンイミド（ 　０．５１１１９／Ｃ１１つのトルーテストによる製剤であった。それぞれのテ スト系列に２群のモルモットが用いられた。すなわち（ａ）９匹の未感作動物お よび（ｂ）２０匹のホルムアルデヒド感作動物である。テスト製剤は、全部の毛 が注意深く除去された動物の両わき腹の５×５ＣＩＩ＋の皮膚領域に閉塞下に施 した。２４時間後製剤をはずしそしてテスト結果をさらに２４時間および４８時 間後の２回読みとった。各読みとりの２時間前にも前記皮膚領域の毛を刈りそし て剃った。このようにして読み取った応答を下記等級系による得点にあてはめた 、すなわち〇−何ら視認しうる反応なし、１−個別のそしてスポットの形態の紅 斑、２−中程度のもしくは干渉性の紅斑、３＝ひどい紅斑および腫脹。得られた 結果を以下にまとめる。

Ｎ−ヒドロキシメチルベンズアミドは検査したいずれの濃度でも何ら接触アレル ギー反応を生じなかった。ホルムアルデヒド溶液での反応は陽性であるので、Ｎ −ヒドロキシメチルベンズアミドで得られた陰性結果はホルムアルデヒドの放出 がゆっくりしているせいであるに相違ない（ｔ＋ｚｚ＝ｐＨ９で６．３時間）。

Ｎ−ヒドロキシメチル誘導体としてのホルムアルデヒド濃度が用いられたＦｉｎ ｎＣｈａｍｂｅｒｓ［Ｆ］におけるそれより３倍高いという事実にもかかわらず その応答が陰性であることに注目するのは興味がある。Ｎ−ヒドロキシメチルニ コチンアミド製剤では、比較的高濃度（０．６２１１１ｇ／ｃ＋ｘ２）でのみ陽 性反応が得られＩこ　。

Ｎ−ヒドロキシメチルフタルイミドで得られたアレルギー反応は、たとえそのフ タルイミド誘導体がニコチンアミド誘導体に比較してｐＨ９　（３０℃）ではる かにより迅速に分解するとしても（ｔ，７□−それぞれ＜０．０３分および０、 ７時間）、Ｎ−ヒドロキシメチルニコチンアミドで得られるより弱かった。それ ゆえインビボ応答とインヒドロ分解速度半減期との間に直線状の相関関係を確立 することはできない。恐らくこれは溶解度および拡散性が相異するためであろう 。

フタルイミドおよびヒダントイン誘導体の場合、対照群動物が実際には感作され ているという徴候が幾つかあった。このことは実験結果を適切に解釈する妨げと なった。最もはっきり言ってかかる妨害はヒダントイン誘導体を検査した場合に 起こることが見出され、そしてそれゆえこの誘導体でははっきりした結果は得ら れなかつｔこ　。

Ｎ−ヒドロキシメチルスクシンイミドでは、ホルムアルデヒドを含有するＦｉｎ ｎ　Ｃｈａｍｂｅｒｓ■が用いられた場合に得られたそれと明らかに一致するテ スト結果が得られた。

要約すれば、調査したＮ−ヒドロキシメチル誘導体に関しそれらが閉塞性接触ア レルギーテスト操作においてテスト物質として用いられた場合に、ｐＨ９でのそ れらの分解速度とホルムアルデヒド感作されたモルモットにおけるアレルギー反 応生成能力との間に相互に関連があることが確立されうる。これら物質のうちの 最良のものは疑いなくＮ−ヒドロキシメチルスクシンイミドであることが判明し た。

国際調査報告

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくとも１種のパッチをその上に有しておりかつホルムアルデヒドに対す る接触アレルギーを検出するための閉塞性上皮テストでの使用が意図されるテス ト用試験片であって、前記少なくとも１種のパッチの少なくとも１種上のテスト 物質はカルボキサミドまたは−イミドの可逆性Ｎ−ホルムアルデヒド誘導体であ り、該テストは乾燥賦形剤中に製剤化されているものであることを特徴とするテ スト用試験片。
2. ２．試験片の使用期間中賦形剤が検査される皮膚領域から水分を吸収でき従って ホルムアルデヒドが前記誘導体から放出されうることを特徴とする請求項１記載 のテスト用試験片。
3. ３．テスト物質がアタルイミド、スクシンイミド、ヒダントイン等のような環状 イミドのＮ−ホルムアルデヒド誘導体であることを特徴とする請求項１〜２のい ずれかに記載のテスト用試験片。
4. ４．テスト物質がＮ−ヒドロキシメチル置換カルボキサミドまたは−イミドであ ることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のテスト用試験片。
5. ５．ｐＨ９（ＨＣＯ３−／ＣＯ３２−、温度３０℃）の水溶液中におけるＮ−ホ ルムアルデヒド誘導体（８×１０−４Ｍ）が半減期７時間未満で分解することを 特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のテスト用試験片。
6. ６．賦形剤が、パッチを覆いかつ検査される皮膚領域から分泌された水分を吸収 できかくしてゲルを形成しうるポリマー被膜であることを特徴とする請求項１〜 ５のいずれかに記載のテスト用試験片。
7. ７．ｐＨ範囲４〜１０を有する緩衝剤系が賦形剤中に混入されることを特徴とす る請求項１〜６のいずれかに記載のテスト用試験片。
8. ８．ホルムアルデヒドに対する接触アレルギーを検出するための閉塞性上皮テス トにおけるテスト用組成物として使用される調製物の製造へのカルボキサミドま たは−イミドの可逆性Ｎ−ホルムアルデヒド誘導体の使用。
9. ９．ホルムアルデヒド誘導体が請求項３〜４のいずれかに記載のものでありそし て調製物が請求預１、２、５、６、７のいずれかに記載のものであることを特徴 とする請求項８記載の使用。