JPH0347095A - ポリアミンの選択的定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【産業上の利用分野】

本発明はポリアミンの新規な定量方法に関する。 詳しくは、カダベリンを除くポリアミンの量を選択的に
測定するためのポリアミンの選択的定量方法である。

【従来の技術］ 血液、尿等の生体液中のポリアミン量は生体における癌
の発生と相関性を有する。近年かかる原理を利用し、生
体試料中のポリアミン量を定量しこれより癌診断を行う
方法が提案されている。 従来、生体試料中のポリアミンを測定する方法として、
電気泳動法、液体クロマトグラフィー法、酵素法等が知
られているが、操作性、信頼性の面で酵素法が注目され
つつある。上記の酵素法については、種々の方法が提案
されている０例えば、特公昭５Ｂ−３６９１８号公報に
は、試料にジアミンオキシダーゼを作用させ、試料中の
ポリアミンから生成する過酸化水素を赤色キノン色素に
導き比色定量する方法が、又特開昭６３−１３４０００
号公報には、試料中のポリアミンにジアミンオキシダー
ゼを作用させてアミノアルキルアルデヒドを生成させ、
該アミノアルキルアルデヒドに、酸化型ニコチンアミド
補酵素（Ｎ　Ａ　Ｄ　）の存在下でアミノアルキルアル
デヒドデヒドロゲナーゼを作用させ、生成する還元型ニ
コチンアミド補酵素（ＮＡＤＨ）を定量することにより
ポリアミン量を測定する方法が提案されている。 【発明が解決しようとする問題点】 一方、ポリアミンを定量分析して癌診断を行う場合、ポ
リアミンのうちのカダベリン量が癌以外の要因、例えば
、試料の細菌汚染等によっても増加すにとが報告されて
いる。そのため、癌診断をポリアミンを定量することに
よって行う場合。 カダベリン量を除くポリアミン量を測定することが、か
かる診断をより正１ｌＩＩ：行うために必要である。 しかしながら、従来より知られているポリアミンの定量
方法は、カダベリンを除くポリアミンを選択して定量す
ることが困難であり、癌以外の要因によってカダベリン
量が増加した場合は、正確な診断を行うことができない
という問題を有していた。 ［問題点を解決するための手段］ 本発明者等はかかる問題を解決すべく鋭意研究を重ねた
結果、前記した酵素法のうち、ポリアミンを酸化してア
ミノアルキルアルデヒドに変換し、該アミノアルキルア
ルデヒドに酸化型ニコチンアミド補酵素の存在下で、ア
ミノアルキルアルデヒドデヒドロゲナーゼを作用させ、
生成する還元型ニコチンアミド補酵素を定量する方法に
おいて、上記アミノアルキルアルデヒドデヒドロゲナー
ゼとして特定の酵素を使用した場合には、カダベリンを
酸化して得られる５−アミノペンタナールの酸化型ニコ
チンアミド補酵素に対する反応性が、他のポリアミンを
酸化して得られるω−アミノアルキルアルデヒドの反応
性に対して著しく低いという知見を得た。そして、上記
反応における特定の酵素の使用量を制限することにより
、実用的な反応時間でカダベリンＩ：基づく還元型ニコ
チンアミド補酵素の生成を防止し、カダベリンを除くポ
リアミンを選択的に測定し得ることを見い出し、本発明
を完成するに至った。 即ち、本発明は、試料中のポリアミンをω−アミノアル
キルアルデヒドに変換し、次いで、酸化型ニコチンアミ
ド補酵素の存在下、該ω−アミノアルキルアルデヒドに
、　４−アミノブタナールを基質とした場合の酵素活性
に対す６５−アミノペンタナールを基質とした場合の酵
素活性の相対活性が１０％以下のω−アミノアルキルア
ルデヒドデヒドロゲナーゼを４−アミノブタナール及び
酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（Ｎ　Ａ
　Ｄ）を基質として測定される酵素活性が０．００１〜
３ユニットとなる量で作用させた徨、生成する還元型ニ
コチンアミド補酵素を定量することを特徴とするポリア
ミンの選択的定量方法である。 本発明において、ω−アミノアルキルアルデヒドデヒド
ロゲナーゼの酵素活性の単位である「ユニット」は、−
ＮＡＤの存在下に４−アミノブタナールに作用し、　１
分間で１μ■０１のＮＡＤＨを生成させる酵素量（μ■
ｏｌ／■１ｎ）をいう。 本咽細書において、上記＃Ｉｌ活性は、下記の方法によ
り測定した値である。 光路長１１のキュベツト中に１０５Ｍのプトレッシン・
二塩酸塩を含有する０、１１１１）リス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン−塩酸Ｐ＆街液（ｐＨ８，０）を２
．５ｍ１分注し、更に２０μｍ（５ユニット）のミクロ
コツカス属由来のプトレッシンオキシダーゼを添加混和
し、３０℃下で１０分間インキュベーションを行った徨
、　この反応溶液に２０■ＮのＮＡＤ水溶液を０　、５
　ｔｌ加え、　次を１で５０μｌのω−アミノアルキル
アルデヒドデヒドロゲナーゼを含有する被検液を添加混
和する。　直ちに３０℃下で３４０ｎ−の吸光度の増加
速度を測定する。１分間当りの増加量（Ａ）から以下の
換算式（１）を使用して被検体１．０ｍｌ当りの　ω−
アミノアルキルアルデヒドデヒドロゲナーゼの酵素活性
値を算出する。 本発明の対象とする試料としては、ポリアミンの測定を
目的とするものであれば特に制限はないが、　　例えば
、　尿、　血液、　血清、　髄液、　　リ　ンパ液、腹
水、唾液、精液、胃液等の生体液、該生体液をイオン交
換カラムクロマトグラフィー等により前処理したものが
挙げられる。 本発明において定量の対象とする試料中のポリアミンは
、カダベリンを除くプトレッシン、スペルミジン、及び
スペルミン等の遊離壁ポリアミンである。従って、例え
ば尿中に存在するこれらポリアミンのアセチル体等の抱
合型ポリアミンを測定対象とする場合は、アシルポリア
ミンアミドヒドロラーゼ等を用いた公知の方法によりポ
リアミンのアセチル体等を加水分解した徨、本発明の方
法を適用すればよい。 本発明において、試料中のポリアミンは、先ずω−アミ
ノアルキルアルデヒドに変換する。ポリアミンをω−ア
ミノアルキルアルデヒドに変換する方法は、ポリアミン
を酸化する酵素を作用させる方法が一般的である。かか
るポリアミンを酸化する酵素は、ポリアミンに対して等
モルのω−アミノアルキルアルデヒドを生成する特性を
有する公知の酵素が制限なく使用される０例えば、シュ
ードモナス属、ミクロコツカス属、ノカルデイア属、ア
スペルギルス属、アルスロバクタ−属等由来の微生物起
源のプトレッシンオキシダーゼ、発芽大豆等由来の植物
起源のプトレッシンオキシダーゼ、ブタ腎臓等由来の動
物起源のプトレッシンオキシダーゼ等が挙げられる。こ
れらの酵素のうち、カダベリンに対して反応性の弱いミ
クロコツカス・ルーベンス由来のプトレッシンオキシダ
ーゼ及びシュードモナス属由来のプトレッシンオキシダ
ーゼが好適に使用される。即ち、カダベリンに対して反
応性の弱い酵素を使用することにより、カダベリンから
生成する５−アミノペンタナールの量を減少させ、後記
する特定のω−アミノアルキルアルデヒドデヒドロゲナ
ーゼによる５−アミノペンタナールの反応性の選択性の
効果をより向上させることができる。その結果、より選
択性良くカダベリンを除くポリアミンの量を測定するこ
とが可能となる。 上記プトレッシンオキシダーゼのうち、特にシェードモ
ナス属由来のプトレッシンオキシダーゼがカダベリンに
対する反応性が極めて弱く、本発明において最も好適に
用いられる。 又、本発明において、試料中にスペルミンを含有する場
合は、前記プトレッシンオキシダーゼの他にポリアミン
を酸化する酵素として、スペルミンを酸化する酵素を作
用させて該スペルミンをω−アミノアルキルアルデヒド
に変換することが必要である。この目的を達成するため
には公知の方法が特に制限なく採用される。スペルミン
を直接ω−アミノアルキルアルデヒドに変換する方法と
して、　スペルミンをＮ　−（３−アミノプロピル）−
アミノブチルアルデヒドに直接変換する酵素を作用させ
る方法が知られている。該酵素としては例えば、大麦、
カラス麦、　トウモロコシ、エントウ豆等の植物起源の
ポリアミンオキシダーゼ等が挙げられる。又、スペルミ
ンを間接的にω−アミノアルキルアルデヒドに変換する
方法として、スペルミンをプトレッシンに変換し、次い
で該プトレッシンを４−アミノブタナールと言うω−ア
ミノアルキルアルデヒドに変換する方法が挙げられる。 スペルミンをプトレッシンに変換する酵素としては、例
えば、ウシ血漿、ラット肝臓等由来の動物起源のポリア
ミンオキシダーゼ又はアスペルギルス属、ペニシリウム
属、ストレプトミセス属等由来の微生物起源のポリアミ
ンオキシダーゼ等が挙げられ、該プトレッシンを４−ア
ミノブタナールに変換する酵素としては、先に述べたプ
トレッシンオキシダーゼを使用することができる１以上
の方法のうち、スペルミンを４−アミノブタナールに変
換する間接法が後記する次段の反応における反応性が良
好であり好ましい。 尚、尿を試料とする場合は一般に尿中に存在するポリア
ミンのアセチル体は、スペルミジン、プトレッシン、カ
ダベリンが主であり尿を試料とする場合には、プトレッ
シンオキシダーゼのみを作用させればよい。 ポリアミンを含有する試料にポリアミンを酸化する酵素
、及び必要によりスペルミンをプトレッシンに変換する
酵素、又はスペルミンをＮ　−（３−アミノプロピル）
−アミノブチルアルデヒドに変摸する酵素を作用させる
条件は、公知の条件が制限なく採用される。一般には、
使用する酵素の至適−、至適温度等の付近で行うことが
望ましい。 又酵素量は酵素の活性、反応条件等により異なり一概に
限定できないが、−Ｍに０．０１〜５０ユニット、好ま
しくは０．１〜３０ユニットの範囲が、　好適に使用さ
れる。又、上記酵素はポリアミンに対して同時に作用さ
せてもよい。 尚本発明におけるプトレッシンオキシダーゼの酵素活性
は、プトレッシンに作用して１分間に１μ■０１の過酸
化水素を生成する酵素量を１ユニットとする。 本明細書において、上記酵素活性値は下記の方法により
測定した値である。 ０．０１％の４−アミノアンチピリン、　ｏ、ｏｏｓ％
の２．４−ジクロロフェノール、　０．００４％のペル
オキシダーゼを含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８，０）を２．０ｍｌ、　１０１Ｎのプトレッシン・二
塩酸塩を含む水溶液を０．２ｇ＋１．　　それぞれ光路
長ＩＣ層の標準キュベツトに分注し、酵素液０．０５謄
１を添加混合した後、３０℃に設定された分光光度計の
セルホールダーに！２１Ｌ、５１０ｎ■ｌ；おける吸光
度の時間当りの増加量（Ｂ）を測定し、生成する過酸化
水素の量を次式に示す換算式（２）から求める。 本発明において、試料中のポリアミンをω−アミノアル
キルアルデヒド番ご変換した場合、プトレッシンを酸化
した場合は４−アミノブタナールが生成し、カダベリン
の場合は５−アミノペンタナール、スペルミジン又はス
ペルミンの場合は４−アミノブタナール又は３−アミノ
プロパナール、Ｎ−（３−アミノプロピル）−アミノブ
チルアルデヒド等のω−アミノアルキルアルデヒドが生
成する。 本発明の特徴は、前記した反応によってポリアミンから
変換されたω−アミノアルキルアルデヒドを含有する試
料に酸化型ニコチンアミド補酵素の存在下、該ω−アミ
ノアルキルアルデヒドに、４−アミノブタナールを基質
とした場合の酵素活性に対する５−アミノペンタナール
を基質とした場合の酵素活性の相対活性が１０％以下の
ω−アミノアルキルアルデヒドデヒドロゲナーゼを４−
アミノブタナール及び酸化型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド（Ｎ　Ａ　Ｄ　）を基質として測定される
酵素活性がＯ，ＯＱｌ〜３ユニット、好ましくは０．０
１〜１ユニット、更に好ましくは０．０５〜０，４ユニ
ットの量で作用させることにある。即ち、４−アミノブ
タナールを基質とした場合の酵素活性に対する５−アミ
ノペンタナールを基質とした場合の酵素活性の相対活性
が１０％以下のω−アミノアルキルアルデヒドデヒドロ
ゲナーゼを使用することにより、試料中のω−アミノア
ルキルアルデヒドのうち、カダベリンに由来する５−ア
ミノペンタナールの酸化型ニコチンアミド補酵素との反
応を選択的に抑えることができる。又、かかる特定のり
一アミノアルキルアルデヒドの使用量を０．００１〜３
ユニットに制限することにより、実用的な反応時間内で
カダベリンに由来する５−アミノペンタナールの反応を
防ぎ、試料中のカダベリン以外のポリアミン量に対応し
て酸化型ニコチンアミド補酵素を還元型ニコチンアミド
補酵素に変えることができ　る。 従って、４−アミノブタナールを基質とした場合の酵素
活性に対する５−アミノペンタナールを基質とした場合
の酵素活性の相対活性が１０％以上、例えばミクロコツ
カス・フラビダス由来のω−アミノアルキルアルデヒド
デヒドロゲナーゼを使用した場合には、かかる効果は発
揮されず、カダベリン以外のポリアミンを選択的に定量
することは困難である。又、前記酵素の使用量が３ユニ
ットを越える場合は、　５−アミノペンタナールと他の
ω−アミノアルキルアルデヒドとの反応性の差を保持し
得る時間、即ち、　５−アミノペンタナールの反応量が
増加し始めるまでの時間が著しく短くなり、実用的な測
定時間内で５−アミノペンタナール以外のω−アミノア
ルキルアルデヒドを選択的に反応させることが困難とな
る。逆に、該酵素の使用量が０．００１ユニットより少
ない場合は、５−アミノペンタナール以外のω−アミノ
アルキルアルデヒドが充分反応するまでに多大の時間を
要し、実質的に該５−アミノペンタナール以外のω−ア
ミノアルキルアルデヒドを選択的に反応させ、定量する
ことが困難となる。 本発明において、上記反応時間は、ω−アミノアルキル
アルデヒドのうち、５−アミノペンタナールが実質的に
反応せず、且つ他のω−アミノアルキルアルデヒドが実
質的に全量反応する時間の範囲より選択することが好ま
しい、かかる反応時間は、実際の反応と同条件で予備実
験を行い、最適な時間を決定すればよいが、一般に１分
〜２時間、好ましくは２分〜３０分が好適である。 本発明に用いるω−アミノアルキルアルデヒドデヒドロ
ゲナーゼは、ω−アミノアルキルアルデヒドに対して、
等モルの還元型ニコチンアミド補酵素を生成し、且つ４
−アミノブタナールを基質とした場合の酵素活性番；対
する５−アミノペンタナールを基質とした場合の酵素活
性の相対活性が１０％以下のω−アミノアルキルアルデ
ヒドデヒドロゲナーゼであれば特に制限なく使用される
０例えば、ジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミス
トリー　２４９巻、に６，１フ３フ頁（１９７４）に記
載のシュードモナス属に属する微生物由来の４−アミノ
ブタナールデヒドロゲナーゼ、バイオケミストリー　１
３巻、４０１１頁（１９）４）記載のシュードモナス属
由来の３−アミノプロパナールデヒドロゲナーゼ、ミク
ロコツカス属由来の４−アミノブタナールデヒドロゲナ
ーゼ等が挙げられる。前記ω−アミノアルキルアルデヒ
ドデヒドロゲナーゼ産生能を有する微生物としては、シ
ュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・シ
リンゲ、シュードモナス・シンザンタ、ミクロコツカス
・ルーベンス等が挙げられる。そのうち、特に好ましく
はシュードモナス・フルオレッセンス由来の４−アミノ
ブタナールデヒドロゲナーゼ及びミクロコツカス・ルー
ベンス由来の４−アミノブタナールデヒドロゲナーゼが
使用される。 又、本発明において、前記反応に用いる酸化型ニコチン
アミド補酵素としては酸化型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド（Ｎ　Ａ　Ｄ）、酸化をニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドフォスフェート（ＮＡＤＰ）等が
好適に使用される。該酸化型ニコチンアミド補酵素は反
応の際、水素受容体として作用し、それぞれ還元型ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド（Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈ）
、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォス
フェート（Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈ）等の還元型ニコチンア
ミド補酵素となる。又、本発明が良好に適用される該還
元型ニコチンアミド補酵素の濃度は、反応条件等により
多少異なり一概に限定できないが、　一般に０．００１
５Ｍ〜５０ｍ１１の範囲が好適である。 本発明において、ω−アミノアルキルアルデヒドに前記
したω−アミノアルキルアルデヒドデヒドロゲナーゼを
酸化型ニコチンアミド補酵素の存在下に作用させる際の
他の条件は特に限定されず、公知の条件が特に制限なく
採用される。 本発明において、測定対象のポリアミン量に対応して生
成した還元型ニコチンアミド補酵素の定量は一般に使用
されている公知の方法が制限なく使用される０例えば、
還元型ニコチンアミド補酵素の３４０ｎ■の吸収を直接
測定する方法、　電子伝達体の存在下、テトラゾリウム
系発色剤を作用させ比色定量するかレサズリン蛍光系に
て測定するか又はフラビンレダクターゼ及びルシフェラ
ーゼにより発光系に導いて測定する等挙げられる。上記
方法において測定対象のポリアミン量に対応して生成し
た還元型ニコチンアミド補酵素の定量を電子伝達体の存
在下、テトラゾリウム系発色剤を作用させ比色定置する
場合、試料中に存在する還元性物質の影響を回避し正確
に定量するためには、還元型ニコチンアミド補酵素を含
有する試料液のｐＨを４〜７、好ましくはｐＨ５〜６．
５で且っノニオン系界面活性剤０．３〜ｌＯ重量％、　
好ましくは０．５〜２重量％の存在下でテトラゾリウム
系発色剤を作用させることが好適に使用される。 また本発明において、上記還元型ニコチンアミド補酵素
の定量は、前記ω−アミノアルキルアルデヒドデヒドロ
ゲナーゼを作用させたときに生成する還元型ニコチンア
ミド補酵素の生成速度を測定する方法によっても行うこ
とが出来る。即ちカダペリン以外のポリアミンから生成
するω−アミノアルキルアルデヒドが４−アミノブタナ
ールになる様に変換し、次いでω−アミノアルキルアル
デヒドデヒドロゲナーゼを作用させ、生成する還元型ニ
コチンアミド補酵素の生成速度を測定する方法である。 具体的には上記還元型ニコチンアミド補酵素の生成速度
を直接測定する方法又は、生成した還元型ニコチンアミ
ド補酵素をホルマザン色素に変換する反応速度を測定す
る等のレートアッセイ法、及び酵素反応終了後に前記し
た方法により還元型ニコチンアミド補酵素を測定するエ
ンド・ポイント法等、いかなる方法Ｃ：より測定するこ
とも可能である。 尚、前記したポリアミンを酸化する酵素のうちシュード
モナス属由来のプトレッシンオキシダーゼは新規なもの
であり、理化学的性質は、下記の通りである。 ０作用 次式に示す通り、酸素存在下で、　１モルのプトレッシ
ンから１モルの４−アミノブタナールと１モルの過酸化
水素と１モルのアンモニアを生成し、且つ１モルのスペ
ルミジンから１モルの４−アミノブタナールと１モルの
１，３−ジアミノプロパンと１モルの過酸化水素を生成
せしめる。 ＮＨ＊（ＣＨｅ）４ＮＨｔ　　　　　　　０２　　　　
　　　　　ＨｚＯ→に１ｉｔ（ＣＨｉｈＣＨＯｔｈｌｈ
　　　　　　　旧ｈＭＨｚ（ＣＨｅ）４ＮＨ（ＣＨｔｈ
ＮＨ＊　　　　　　（ｈ　　　　　　８２０　−＋ＮＨ
ｔ（ＣＨｅ）ｔｅＨｏ　　＋　　ＨｅＯ＊　　　　　　
ＮＨｔ（ＣＨｅ）ｔｌｌＨｅ■ｌｌＨｅ性 プトレッシン、カダベリン、スペルミジンに対して作用
し、　１．　３−ジアミノプロパンに対しては、作用を
示さない、これらのポリアミン類に対する作用の強さを
、プトレッシンに対する作用を１００とした相対活性値
で第１表に示す。 第１表　基質特異性 ■至適ｐＨ：　　ｐＨ７，５〜ａ、Ｏ ■ｐ）Ｉ安定性＝２５℃下にて４８時間保存した時、ｐ
Ｈ５，５〜９．０において９０％以上の残存活性を有す
る。 ■分子量　：　　８３，００Ｇ±５，０００　（Ｂｌｏ
−５ｉｌ　ＴＳト２５６（商品名：　　８１０−ＲＡＤ
社製）Ｉ；よるゲル濾過法より） ■サブユニットの分子量： ４２．０００±５．Ｇｏｏ（Ｓ　Ｄ　Ｓ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法より） ■サブユニットの数：　２個 本発明における分子量の値は、特に断わらない限りゲル
濾過法により、サブユニットの分子量の値は、　ドデシ
ル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
により、それぞれ測定したものをいう。 ■Ｋｍ値 ０．１Ｎ＋−リス−塩酸緩衝液（ｐ［１，Ｏ）の条件に
おける各基質ｌ；対するＫｍ値は、プトレッシン二０２
１１１１、カダベリン　ｏ　６ｇ＋Ｍ、スペルミジン：
０．３園圓である。 ■至適温度 ０．１Ｍ１１１ｔ１１１１ｉ液（ｐＨ７，５）において
　３５〜４５℃である。 ［相］温度安定性 ０、ＩＮ燐酸緩鵞液Ｃｐ）１７．５＞において、　３０
℃以下の温度条件下、２時間処理で９０％以上の残存活
性を有する。 ■吸収スペクトル ２フ４　ｎｌ、　　３８０　ｎｍ、４６０ｎｍに極大吸
収を持つ。 ＠阻害剤 種々の試薬及び金属イオンの濃度１曹にでの本発明の酵
素に対する影響を第２表に示す、銀イオン、水銀イオン
、コバルトイオンにより強く阻害を受ける。 第２表 試薬及び金属イオンの影響 ■等電点：３．９〜４．３ 尚シュードモナス属由来のプトレッシンオキシダーゼは
、該プトレッシンオキシダーゼの生産能のある微生物の
培養物から採取することが出来る。 かかる微生物としては、例えばシュードモナス・フルオ
レッセンスＩＦＯ−３９２５（Ｐｓ＠ｕｄｏｍｏｎａｓ
　ｆｌｕｏｒｓｓｃａｎｓ）、　　シュードモナス・シ
ンザンタＩＦＯ−３９１３（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　
５ｙｎｘａｎｔｈａ）、シュードモナス・シリンゲＩＦ
Ｏ−１２６５５（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｙｒｉｎ
ｇａｅ）等が挙げられる。 上記菌体からのプトレッシンオキシダーゼの分ａ　ｙｉ
製は、次の様にして行うことが出来る。菌体内に８７１
されたプトレッシンオキシダーゼを精製する場合は、従
来から行われている超音波による菌体破砕、或し）はガ
ラス・ビーズと共に回転させるダイノミル破砕機による
菌体破砕又は、　リゾチーム等の酵素やトルエン等の有
機溶媒による細胞膜の破壊等の方法が挙げられる。これ
らの中から適当な方法を選択して面体から酵素の抽出を
行うことにより、酵素の採取が出来る。又菌体外のプト
レッシンオキシダーゼを分離する場合は、培養液を通常
の酵素精製法に用いられる方法、例えば塩析、透析等の
処理によって分離することができる。 これらの方法で抽出又は、分離された粗酵素液からプト
レッシンオキシダーゼを更に精製する必要性がある場合
は、通常実施されている一般的な酵素の精製手段である
硫酸アンモニウム沈澱法、イオン交換カラムクロマトグ
ラフィー法、ゲル濾過法、ヒドロキシアパタイト・カラ
ムクロマトグラフィー法、アフィニティー・カラムクロ
マトグラフィー法、調製用電気泳動法等の方法を適宜組
み合わせるか、あるいは繰り返すことによって精製を行
うことが出来る。 〔効　　果〕 以上の説明より理解される様に、本発明はカダベリンか
ら生成する５−アミノペンタナールに極めて反応性の弱
いω−アミノアルキルアルデヒドデヒドロゲナーゼを使
用し、試料中のポリアミン即ちプトレッシン、　カダベ
リン、スペルミジン、スペルミン等からカダベリンを除
いたポリアミンつまりプトレッシン、　スペルミジン、
スペルミン等を選択的に定量する優れた方法である。 以上、本発明の方法はポリアミンを抽出分離する操作を
必要とせず、カダベリン以外のポリアミンの定量が安定
で正確にしかも高感度で、又測定操作が容易であり、臨
床検査の場において更に正確な診断を可能とするもので
ある。 ［実施例］ 以下、本発明の方法をより具体的に説明するため実施例
を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない、又表中のｒｕノは、　ユニットを示す。 ５分反応させ、更に１ｍｏｌ／ｌ塩酸水溶液を０．５■
ｌ添加混和徨、波長５３０ｎｍの吸光度を調べた。　上
記方法により得られた吸光度の測定値とその測定値に対
応するポリアミン１度を第５表に示す。 検量線の作成 ２４０μ■０１ハのアセチルプトレッシン水溶液を用意
し、希釈系列を作成した。該ポリアミンの希釈系列溶液
をそれぞれ０．５ｍｌずつ分取し、　第３表に示す試薬
１を０．５１１５加混和後、　３７℃２０分反応させた
。その後、　第４表に示す試薬２を０．５ｍｌ添加混和
後、ｐＨ６，０、界面活性剤濃度１．３３９量％、３７
℃、第　　３ 表 （試薬１） 第　　４ 表 （試薬２） 第　　５ 表 第５表より作成した検１ｉＩｓを第１図に示す、第１図
から、ポリアミンｌＩＡ度と得られる吸光度の関係は、
２４０μ謬ｏ１／１の１度まで直線関係が得られ、これ
より抱合型ポリアミン及び遊離型ポリアミンの比色定量
が可能であることがわかる。 実１１ 血中のポリアミンの定置 血液検体を１．０層１分取し、　ｌＯ％トリクロロ＃酸
１、Ｏｍｌを加え、激しく撹拌して除タンパクを行い、
３０００ｒＰｌ、５分で遠心分ａ徨、上清１．Ｏ＋１を
分取した。該上清１．Ｏｍｌに対して０．３Ｍ　Ｉ−リ
ス溶液１．０■１を添加して液を中和せしめ試料を調製
した。 上記試料０．５１１を分取し、　これに第６表に示す試
薬３を０．５■１加え、ｐＨ８，０，３７℃で２００分
間反応せた。ついで、この液に前記した第４表に示す試
薬２を０．５瞭１加え、　　ｐＨ６，０、界面活性剤濃
度１．３３重量％、３７℃で５分間反応させた後、更に
１ｍｏｌ／１塩酸水溶液を０　、５　ｔｘ　ｌ　ｉ９加
して波長５３０ｎ謬における吸光度を測定した。この吸
光度を（Ｅｓ）とする、又、前記試料のブランクの吸光
度を測定するため該試料０．５ｍｌを分取し、これｌ：
第７表に示す試Ｊ４を０．５腸１加えて３７℃で２００
分間反応せた。その＋＆は、上記したＥｓの測定と同様
にして試薬２、及び１Ｍ塩酸水溶液を添加して波長５３
０ｎ膳における　吸光度を測定した。この吸光度を（Ｅ
ｓ’　）とする。 第 表 （試１ｉ３） 第　７　表（試薬４） 一方、　標準液として３０μ緘のプトレッシン・二塩＃
Ｉ塩水溶液、及び盲検体として精製水を用い、前記の１
！＄及びＥｉ’の測定方法と同様な方法により吸光度を
それぞれ測定した。かかる標準液について得られた吸光
度をそれぞれＥｓｔ及びＥｓｔ’　とし、盲検体につい
て得られた吸光度をそれぞれＥ１１２０及びＥＨ２０′
とする。上記した測定方法を第８表にまとめて示す。 上記方法によって得られた測定値により下記式を用いて
試料中のポリアミン量を計算して求めた。 （Ｅｓｔ４：ｓｔ’　　）−（！ｎｔｏ−！ｓａｏ’　
　）＝　ポリアミン量（μ謬ｏ１／１　） 以上の測定操作を３種類の血液検体について行い、それ
ぞれのポリアミン量を算出した。結果を第９表に示す。 又、上記血液検体より調製される試料中のポリアミン値
を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析
で、カダベリン以外のポリアミン量を定量した。その結
果を第９表に併せて示す。 第　　９　　表 第９表から、血液中のカダベリン以外のボ１ぴミン値が
選択的に且つ正確に測定できていることがわかる。 実施例２ 尿中のポリアミンの定量 実施例１において、血液検体より調製された試料に代え
て尿検体（０，５ｍ１）を試料として用い、又、試薬３
に替えて第１０表に示す試薬５を用いた以外は実施例１
と同様の測定方法により尿検体中のポリアミン値を定量
した。 上記の測定操作を３種類の尿検体について行った。この
結果より、本発明の方法が良好な再現性を示すことがわ
かる。尚、Ｅｓｔ　−！ｓｔ′値は０．１４３、Ｅｕ２
ｏ−１ｉｌＩｔｏ’値は０．０１０であった。　それぞ
れのポリアミン量を第１回目のＥｓ−Ｅｓ’［より算出
した。 その結果を第１１表に示す。 又、上記の尿検体３検体中のポリアミンをＨＰＬＣによ
って測定した。即ち、尿検体を１■ｌずつ分取し、０．
４Ｍ　）リスー塩Ｍｌ！衝液（ｐＨ８，０）を１ｍｌ添
加した７組　　アシルポリアミンアミドヒドロラーゼ２
４０ユニットを含んだ０．ＩＭ燐酸ａｍ液（ｐＨ７，２
）を１ｍ１ｍ１加混和し、３７°Ｃ１時間反応させ、尿
中のポリアミンをすべて遊離型のポリアミンとした０次
いで遠心分層し、／ｉ：＃物除去後、該反応液（３＊１
）を弱酸性カチオン交換樹脂が充填しであるミニカラム
に通し、ポリアミンを吸着させ、精製水で洗浄徨、０．
４Ｍ　！−リクロロ酢酸溶液１ｍｌでポリアミンを脱着
させた。該脱着液中のポリアミン値を高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）による分析で定量し、カダベリ
ン以外のポリアミン量を測定した。その結果を第１１表
に併せて示す。 第 　０ 表 （試薬５） 第１１表から、本発明の方法は尿中のカダベリン以外の
ポリアミン値も正確にかつ選択的に測定できていること
がわかる。 実施例３ 実施例２の尿１検体に高濃度のカダベリン水溶液を等量
添加し、尿中のカダベリンの添加濃度がそれぞれ、０．
１０．　３０．６０．１００．２００．　５００μｍｏ
ｌ／ｌとなる尿検体を作成した。　この尿検体を試料と
した以外は実施例２の方法とまったく同じ操作した。そ
の結果を第１２表に示す。 第 １２ 表 ナールを基質とした場合の酵素活性の相対活性が１０％
以上（４−アミノブタナールを基質とした場合の酵素活
性に対する５−アミノペンタナールを基質とした場合の
酵素活性の相対活性が４０％）のω−アミノアルキルア
ルデヒドデヒドロゲナーゼを使用した以外は実施例３と
まったく同じ操作をしたその結果を第１３表に示す。 第　　１３　　表 第１２表から試料中に存在するカダベリンは反応せず、
カダベリンが選択的に除外された尿中のポリアミン１度
を正確に定量できることがわかる。 比較例１ 実施例３に使用した試薬中のω−アミノアルキルアルデ
ヒドデヒドロゲナーゼをミクロコツカス・フラビダス由
来の４−アミノブタナールを基質とした場合の酵素活性
に対する５−アミノペンタ第１３表からω−アミノアル
キルアルデヒドデヒドロゲナーゼの選択性が低下し、試
料中に存在するカダベリンも反応が進行していることが
推測される。 比較例２ 実施例２で使用した試薬中のω−アミノアルキルアルデ
ヒドデヒドロゲナーゼの酵素量が０．００２ユニットと
２００ユニット、即ち１回反応当り０．０００１ユニッ
トと１０ユニットに成るようにω−アミノアルキルアル
デヒドデヒドロゲナーゼの酵素量を変えた以外は実施例
２と同じ試薬をそれぞれ調製し使用した。実施ｆＰ４２
と同じ操作法により、実施例２の尿３検体を試料として
尿中のポリアミン濃度を測定した。その結果を第１４表
に示す。 第　　１４　　表 第１４表から０．０００１ユニットの酵素量で反応した
場合はカダベリン以外のポリアミンも反応が進行せず、
ポリアミン定量値が真価に比べ明らかに低いことが判明
した。又逆に１０ユニットの酵素量で反応した場合は、
カダベリンから生成した５−アミノペンタナールも所定
時間内に反応が進行し、本発明の目的を達成し得ないこ
とが判明した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ポリアミンの１度と吸光度の測定値との関係
を示す検量線である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）試料中のポリアミンをω−アミノアルキルアルデ
   ヒドに変換し、次いで、酸化型ニコチンアミド補酵素の
   存在下、該ω−アミノアルキルアルデヒドに、４−アミ
   ノブタナールを基質とした場合の酵素活性に対する５−
   アミノペンタナールを基質とした場合の酵素活性の相対
   活性が１０％以下のω−アミノアルキルアルデヒドデヒ
   ドロゲナーゼを４−アミノブタナール及び酸化型ニコチ
   ンアミドアデニンジヌクレオチドを基質として測定され
   る酵素活性が０．００１〜３ユニットとなる量で作用さ
   せた後、生成する還元型ニコチンアミド補酵素を定量す
   ることを特徴とするポリアミンの選択的定量方法