JPH066076B2 - ポリアミンの定量法 - Google Patents
ポリアミンの定量法Info
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- JPH066076B2 JPH066076B2 JP27942586A JP27942586A JPH066076B2 JP H066076 B2 JPH066076 B2 JP H066076B2 JP 27942586 A JP27942586 A JP 27942586A JP 27942586 A JP27942586 A JP 27942586A JP H066076 B2 JPH066076 B2 JP H066076B2
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- Japan
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- polyamine
- sample
- reaction
- putrescine
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は生体試料中のポリアミンの定量法に関するもの
である。
である。
生体試料中のカダベリン、プトレシン、スペルミジン、
スペルミンなどのポリアミン及びこれらポリアミンのア
シル体であるアシルポリアミンも含めた総ポリアミンの
総量もしくは個々の量は癌の発生もしくは進行状態と密
接な関係をもち、それらの定量は癌診断に有用な情報を
与えるものとして臨床的意義が高い。
スペルミンなどのポリアミン及びこれらポリアミンのア
シル体であるアシルポリアミンも含めた総ポリアミンの
総量もしくは個々の量は癌の発生もしくは進行状態と密
接な関係をもち、それらの定量は癌診断に有用な情報を
与えるものとして臨床的意義が高い。
（従来の技術） ポリアミンの測定法として従来よく知られているのは、
液体クロマトグラフィや電気泳動法等により生体中より
アミンを分離し、続いて螢光法やニンヒドリン比色法に
よる方法と最近開発された酵素を用いるポリアミンの測
定法（特公昭５６−３６９１８号公報）、つまりアミン
オキシダーゼを用いて生じた過酸化水素を４−アミノア
ンチピリン−フェノール−ペルオキシダーゼ系に導き、
生じた色素を比色定量する方法がある。
液体クロマトグラフィや電気泳動法等により生体中より
アミンを分離し、続いて螢光法やニンヒドリン比色法に
よる方法と最近開発された酵素を用いるポリアミンの測
定法（特公昭５６−３６９１８号公報）、つまりアミン
オキシダーゼを用いて生じた過酸化水素を４−アミノア
ンチピリン−フェノール−ペルオキシダーゼ系に導き、
生じた色素を比色定量する方法がある。
液体クロマトグラフィ−や電極泳動法によるアミノの定
量法は処理操作が極めて煩雑で測定に要する時間も長
く、多くの検体の処理ができず、特殊な技術や設備、機
器を要するために臨床検査の場では一般的な方法とは言
い難い。一方、上記方法の欠点を改良すべく開発された
酵素法は、上記法に比べて著しく操作が簡単になり、特
殊な技術や機器を要せず比色計があれば十分定量可能と
なった。しかしこの酵素法は生体試料からジアミン、ポ
リアミンをカラムを用いて分離する操作が必要なために
最近臨床検査の場で多く採用されている自動分析機への
適用が出来ない欠点がある。
量法は処理操作が極めて煩雑で測定に要する時間も長
く、多くの検体の処理ができず、特殊な技術や設備、機
器を要するために臨床検査の場では一般的な方法とは言
い難い。一方、上記方法の欠点を改良すべく開発された
酵素法は、上記法に比べて著しく操作が簡単になり、特
殊な技術や機器を要せず比色計があれば十分定量可能と
なった。しかしこの酵素法は生体試料からジアミン、ポ
リアミンをカラムを用いて分離する操作が必要なために
最近臨床検査の場で多く採用されている自動分析機への
適用が出来ない欠点がある。
（発明の解決しようとする問題点） 本発明の目的は簡便、正確かつ自動分析機への適用な可
能なポリアミン測定試薬を提供することにある。
能なポリアミン測定試薬を提供することにある。
（問題を解決する為の手段） 本発明者等はかかる従来の欠点を解消し、簡単な設備で
かつ簡単な操作で短時間に分析が出来て、しかも自動分
析機への適用が可能な定量法を見い出すべく種々鋭意検
討した結果、機器やカラムによる分離操作の不用な酵素
法によるポリアミンの定量法を見い出した。
かつ簡単な操作で短時間に分析が出来て、しかも自動分
析機への適用が可能な定量法を見い出すべく種々鋭意検
討した結果、機器やカラムによる分離操作の不用な酵素
法によるポリアミンの定量法を見い出した。
すなわち本発明は試料中のポリアミンをアミノアルキル
アルデヒドに変換させ、生成したアミノアルキルアルデ
ヒドにＮＡＤ又はＮＡＤＰの存在下、アミノアルキルデ
ヒドデヒドロゲナーゼを作用させ、生成したＮＡＤＨ又
はＮＡＤＰＨを測定することを特徴とするポリアミンの
定量法である。
アルデヒドに変換させ、生成したアミノアルキルアルデ
ヒドにＮＡＤ又はＮＡＤＰの存在下、アミノアルキルデ
ヒドデヒドロゲナーゼを作用させ、生成したＮＡＤＨ又
はＮＡＤＰＨを測定することを特徴とするポリアミンの
定量法である。
試料中のポリアミンはジアミンオキシダーゼ又は／及び
ポリアミンオキシダーゼを作用させ、アミノアルキルア
ルデヒドとし、該化合物にＮＡＤ又はＮＡＤＰの存在
下、アミノアルキルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、特に
アミノブチルアルデヒド・デヒドロゲナーゼを作用さ
せ、生じたＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ補酵素を直接又は他
の発色系、螢光系及び発光系に導いて測定することを特
徴とする試料中のポリアミンの定量法である。
ポリアミンオキシダーゼを作用させ、アミノアルキルア
ルデヒドとし、該化合物にＮＡＤ又はＮＡＤＰの存在
下、アミノアルキルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、特に
アミノブチルアルデヒド・デヒドロゲナーゼを作用さ
せ、生じたＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ補酵素を直接又は他
の発色系、螢光系及び発光系に導いて測定することを特
徴とする試料中のポリアミンの定量法である。
この場合、必要がればポリアミンのアシル体を前もって
又は同時にアシルポリアミンアミドヒドロラーゼ（ＡＰ
ＡＨ）と作用させ、ポリアミンを遊離させてもよい。
又は同時にアシルポリアミンアミドヒドロラーゼ（ＡＰ
ＡＨ）と作用させ、ポリアミンを遊離させてもよい。
本発明のＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの測定法としては、３
４０ｎｍの吸収を直接比色測定するか、電子伝達体の存
在下、ホルマザン発色系又はレサズリン螢光系に導いて
測定するか、フラビンレダクターゼ及びルシフェラーゼ
により発光系に導いて測定することが出来る。
４０ｎｍの吸収を直接比色測定するか、電子伝達体の存
在下、ホルマザン発色系又はレサズリン螢光系に導いて
測定するか、フラビンレダクターゼ及びルシフェラーゼ
により発光系に導いて測定することが出来る。
本発明に使用するジアミンオキシダーゼ（ＤＡＯ）はプ
レトレシン、カダベリン又はスペルミジンに作用する酵
素（Ｅ．Ｃ．1,4,3,6）又はプトレシンオキシダーゼ
（Ｅ．Ｃ．1,4,3,10）などであり、いかなる起源のもの
でもよいが、たとえば発芽大豆、麦等の植物起源、ブタ
腎等の動物起源、ミクロコッカス属、カルディア属、ア
スペルギルス属等の微生物起源が産生するＤＡＯがあ
る。
レトレシン、カダベリン又はスペルミジンに作用する酵
素（Ｅ．Ｃ．1,4,3,6）又はプトレシンオキシダーゼ
（Ｅ．Ｃ．1,4,3,10）などであり、いかなる起源のもの
でもよいが、たとえば発芽大豆、麦等の植物起源、ブタ
腎等の動物起源、ミクロコッカス属、カルディア属、ア
スペルギルス属等の微生物起源が産生するＤＡＯがあ
る。
本発明に使用するポリアミンオキシダーゼ（ＰＡＯ）は
スペルミン又はスぺルミニジンに作用する酵素であり、
いかなる起源のものでもよいが、たとえばウシ血漿等の
動物起源、たとえば大麦等の植物起源、ペニシリウム
属、アスペルギルス属、ストレプトミセス属等の微生物
起源が産生するＰＡＯがある〔Biochimica et Bioplrys
ica Acta 743(1983)431−436，同705(1982)133−138,Ag
ri，Biol，Chem,45(12)(1981)2943−2945)〕。
スペルミン又はスぺルミニジンに作用する酵素であり、
いかなる起源のものでもよいが、たとえばウシ血漿等の
動物起源、たとえば大麦等の植物起源、ペニシリウム
属、アスペルギルス属、ストレプトミセス属等の微生物
起源が産生するＰＡＯがある〔Biochimica et Bioplrys
ica Acta 743(1983)431−436，同705(1982)133−138,Ag
ri，Biol，Chem,45(12)(1981)2943−2945)〕。
本発明に使用するアミノアルキルアルデヒドデヒドロゲ
ナーゼ（ＡＢＡＬ−ＤＨ）は、例えばアミノブチルアル
デヒドデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．1,2,1,19）などがあ
り、いかなる起源のものでもよいが、たとえばシュウド
モナス属等の微生物起源が産生するＡＢＡＬ−ＤＨがあ
る。（J.Biol,Chem,234(8)(1959)2145−2150,Agri,Bio
l,Chem,50(8)(1986)2009−2016）。
ナーゼ（ＡＢＡＬ−ＤＨ）は、例えばアミノブチルアル
デヒドデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．1,2,1,19）などがあ
り、いかなる起源のものでもよいが、たとえばシュウド
モナス属等の微生物起源が産生するＡＢＡＬ−ＤＨがあ
る。（J.Biol,Chem,234(8)(1959)2145−2150,Agri,Bio
l,Chem,50(8)(1986)2009−2016）。
本発明に使用するアシルポリアミンアミドヒドロラーゼ
（ＡＰＡＨ）はいかなる起源のものでもよい。
（ＡＰＡＨ）はいかなる起源のものでもよい。
ホルマザン系色素としては特に制限がないが、例えばニ
トロテトラゾリウムブルー、３−（ｐ−ヨードフェニ
ル）−２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニルテト
ラゾリウム及び（３−（4,5−ジメチルチアゾール−２
−イル）−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミドな
どがある。
トロテトラゾリウムブルー、３−（ｐ−ヨードフェニ
ル）−２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニルテト
ラゾリウム及び（３−（4,5−ジメチルチアゾール−２
−イル）−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミドな
どがある。
電子伝達体としてはフェナジンメトサルフェート、１−
メトキシフェナジンメトサルフェートやジアホラーゼが
使用されうる。
メトキシフェナジンメトサルフェートやジアホラーゼが
使用されうる。
本発明に用いられるフラビンレダクターゼ（ＦＲ）及び
ルシフェラーゼ（ＬＣＦ）は発光細菌由来のものが有効
である。
ルシフェラーゼ（ＬＣＦ）は発光細菌由来のものが有効
である。
各種酵素濃度（ＤＡＯ、ＰＡＯ、ＡＢＡＬ−ＤＨ、ＡＰ
ＡＨ、ＦＢ、ＬＣＦ）については特に制限がなく、測定
時間反応条件、経済条件等によって自由に設定できる。
ＡＨ、ＦＢ、ＬＣＦ）については特に制限がなく、測定
時間反応条件、経済条件等によって自由に設定できる。
ＮＡＤ濃度についてはアミドアルキルアルデヒドデヒド
ロゲナーゼ、例えばＡＢＡＬ−ＤＨの反応を最高に発揮
出来る濃度で全体の酵素反応系が阻害がない程度であれ
ばいかなる濃度でも良いが、好ましくは0.1〜２０ｍＭ
が適当である。
ロゲナーゼ、例えばＡＢＡＬ−ＤＨの反応を最高に発揮
出来る濃度で全体の酵素反応系が阻害がない程度であれ
ばいかなる濃度でも良いが、好ましくは0.1〜２０ｍＭ
が適当である。
ホルマザン系色素の濃度については特に制限ないが、好
ましくは0.05ｍＭ〜５ｍＭが適当である。
ましくは0.05ｍＭ〜５ｍＭが適当である。
電子伝達体の濃度も特に制限がないが、好ましくは0.1
ｍＭ以上であり、酵素ジアホラーゼを用いる場合は0.1
Ｕ／ｍ以上あれば十分である。
ｍＭ以上であり、酵素ジアホラーゼを用いる場合は0.1
Ｕ／ｍ以上あれば十分である。
上記酵素類、補酵素類及び発色剤、螢光剤又は発光剤を
用いて試料中のポリアミンを測定する場合は、適当な緩
衡液中で測定することが好ましい。緩衡液の種類として
はpH４〜１０の範囲に保つことが出来るものなら特に制
限はない。又、反応温度についても試薬が作用すればい
かなる温度でも良いが、好ましくは約２０〜４０℃付近
が良い。
用いて試料中のポリアミンを測定する場合は、適当な緩
衡液中で測定することが好ましい。緩衡液の種類として
はpH４〜１０の範囲に保つことが出来るものなら特に制
限はない。又、反応温度についても試薬が作用すればい
かなる温度でも良いが、好ましくは約２０〜４０℃付近
が良い。
本発明では各酵素反応及び発色反応又は螢光反応又は発
光反応を同時に行なっても良く、又は別々に例えば酵素
反応を行なってから発色反応又は螢光反応又は発光反応
を、又は酵素反応を２段階以上に反応してから発色反応
又は螢光反応又は発光反応を行なうようなことをしても
良い。
光反応を同時に行なっても良く、又は別々に例えば酵素
反応を行なってから発色反応又は螢光反応又は発光反応
を、又は酵素反応を２段階以上に反応してから発色反応
又は螢光反応又は発光反応を行なうようなことをしても
良い。
本発明では例えばジアミンオキシダーゼ及び／又はポリ
アミンオキシダーゼにより生成したアミノアルキルアル
デヒドにＮＡＤ又はＮＡＤＰの存在下にアミノアルキル
アルデヒドデヒドロゲナーゼを作用させ、生成したＮＡ
ＤＨ又はＮＡＤＰＨを測定する。従来実施されている酵
素法であるペルオキシダーゼの系では試料中よりポリア
ミンをカチオン性のインオン交換樹脂により分離する操
作が必要であったが、本法ではその分離操作が必要でな
く、直接に試料中のジアミン及びポリアミンが測定がで
き、しかも分離操作が不要な為に操作が煩雑でなく簡単
でしかも短時間に分析が可能となった。したがって自動
分析機への適用も容易になり日常の臨床検査法として実
用的有効な方法となった。
アミンオキシダーゼにより生成したアミノアルキルアル
デヒドにＮＡＤ又はＮＡＤＰの存在下にアミノアルキル
アルデヒドデヒドロゲナーゼを作用させ、生成したＮＡ
ＤＨ又はＮＡＤＰＨを測定する。従来実施されている酵
素法であるペルオキシダーゼの系では試料中よりポリア
ミンをカチオン性のインオン交換樹脂により分離する操
作が必要であったが、本法ではその分離操作が必要でな
く、直接に試料中のジアミン及びポリアミンが測定がで
き、しかも分離操作が不要な為に操作が煩雑でなく簡単
でしかも短時間に分析が可能となった。したがって自動
分析機への適用も容易になり日常の臨床検査法として実
用的有効な方法となった。
（作用） 本発明法に従い試料中のポリアミンの測定を実施する場
合、煩雑な分離操作を必要とせず、又特殊な技術や設
備、機器も要することなく、短時間に簡便にしかも正確
に試料中のポリアミンを測定でき、更に自動分析機への
適用も可能なので広く日常臨床診断法にとり入れること
が可能となり、癌の発見及び診断治療に貢献する所大な
るものがある。
合、煩雑な分離操作を必要とせず、又特殊な技術や設
備、機器も要することなく、短時間に簡便にしかも正確
に試料中のポリアミンを測定でき、更に自動分析機への
適用も可能なので広く日常臨床診断法にとり入れること
が可能となり、癌の発見及び診断治療に貢献する所大な
るものがある。
（実施例） 以下、本発明を参考例又は実施例により説明する。
参考例１ プトレシンの定量 反応組成が下以の通りである試薬を用い、３７℃、pH8.
1でプトレシンを定量した。
1でプトレシンを定量した。
2.5ｍ ５０ｍＭトリス−ＨＣ，pH8.1 0.1ｍ ３０ｍＭ ＮＡＤ+ 0.1ｍ ２０Ｕ／ｍ ＡＢＡＬ−ＤＨ 0.1ｍ ４５０Ｕ／ｍ プトレシンオキシダーゼ 0.1ｍ プトレシン すなわち酵素（ＡＢＡＬ−ＤＨおよびプトレシンオキシ
ダーゼ）を含む反応液を３７℃で予備加温したのち、各
濃度のプトレシンを加えて反応を開始した。３４０ｎｍ
の吸収の増加を分光々度計にて記録したところ、反応は
３分以内に終結した（第１図）。その吸光度差を測定し
て検量線を作成すると、１００μＭまで直線が得られた
回収率は99.4％であった（第２図）。初速度を測定する
レート法でも検量線は成立するが、試料中には何種もの
ポリアミンが含まれるので、エンドポイント法が望まし
い。
ダーゼ）を含む反応液を３７℃で予備加温したのち、各
濃度のプトレシンを加えて反応を開始した。３４０ｎｍ
の吸収の増加を分光々度計にて記録したところ、反応は
３分以内に終結した（第１図）。その吸光度差を測定し
て検量線を作成すると、１００μＭまで直線が得られた
回収率は99.4％であった（第２図）。初速度を測定する
レート法でも検量線は成立するが、試料中には何種もの
ポリアミンが含まれるので、エンドポイント法が望まし
い。
参考例２ カダベリンの定量 参考例１においてプトレシンをカダベリンに代替する以
外は、同一条件、同一組成でカダベリンを測定した。反
応は３分以内終結し、検量線は１００μＭまで直線であ
った。検量線から得られた回収率は99.4％であった。
外は、同一条件、同一組成でカダベリンを測定した。反
応は３分以内終結し、検量線は１００μＭまで直線であ
った。検量線から得られた回収率は99.4％であった。
参考例３ スペルミジンの測定 参考例１においてプトレシンをスペルミジンに代替する
以外は同一条件、同一組成でスペルミジンを測定したと
ころ、反応は４分で終結し、１００μＭまで直線であっ
た。
以外は同一条件、同一組成でスペルミジンを測定したと
ころ、反応は４分で終結し、１００μＭまで直線であっ
た。
参考例４ ′Ｎ−アセチルスペルミンの測定 ポリアミンオキシダーゼ反応の組成は以下の通りであ
る。
る。
0.5ｍ ２０ｍＭ 酢酸緩衡液，pH5.0 0.1ｍ １００ｍＵ／ｍ ポリアミンオキシダーゼ 0.1ｍ ′Ｎ−アセチルスペルミン ３７℃で１０分間反応させた後、上記反応液に 2.0ｍ １００ｍＭ トリス−ＨＣ，pH8.1 0.1ｍ ２００Ｕ／ｍ ＡＢＡＬ−ＤＨ 0.1ｍ ３０ｍＭ ＮＡＤ+ を加えて更に３７℃、５分間反応させ３４０ｎｍの吸収
が一定になることを確認した。これに0.1ｍの４５０
Ｕ／ｍプトレシンオキシダーゼを加えて、５分間反応
させ吸収増加を読みとった。エンドポイント法で測定し
た吸光値をプロットした。用いたサンプルの２００μＭ
まで直線で回収率１００％であった（第３図）。
が一定になることを確認した。これに0.1ｍの４５０
Ｕ／ｍプトレシンオキシダーゼを加えて、５分間反応
させ吸収増加を読みとった。エンドポイント法で測定し
た吸光値をプロットした。用いたサンプルの２００μＭ
まで直線で回収率１００％であった（第３図）。
参考例５ 8Ｎ−アセチルスペルミジンの測定 参考例４に示した組成でポリアミンオキシダーゼ反応を
させたあと、同じ方法でpHを８に変えて、更にＡＢＡＬ
−ＤＨと共に0.1ｍの１００Ｕ／ｍＡＰＡＨを加え
て、更に１０分間反応させたあと、吸光度が一定である
ことを確認した。0.1ｍの４５０Ｕ／ｍプトレシン
オキシダーゼを加えて５分間反応させ、吸光度の増加値
を読み、8Ｎ−アセチルスペルミジンの試料濃度に対し
吸光度をプロットしたところ、６００μＭまで直線性が
得られた。
させたあと、同じ方法でpHを８に変えて、更にＡＢＡＬ
−ＤＨと共に0.1ｍの１００Ｕ／ｍＡＰＡＨを加え
て、更に１０分間反応させたあと、吸光度が一定である
ことを確認した。0.1ｍの４５０Ｕ／ｍプトレシン
オキシダーゼを加えて５分間反応させ、吸光度の増加値
を読み、8Ｎ−アセチルスペルミジンの試料濃度に対し
吸光度をプロットしたところ、６００μＭまで直線性が
得られた。
実施例１ 尿サンプルの測定 尿サンプルを2.5ｍとり、2.5ｍの１００ｍＭトリス
−ＨＣ，pH8.1を加え、１００Ｕ／ｍＡＰＡＨ0.1ｍ
を加えて３７℃で１時間インキュベートした。濁りが
生じたサンプルは遠心して濁りを除いたあと、１ｍを
測定の試料とし、次の組成で吸光度の増加を測定した。
−ＨＣ，pH8.1を加え、１００Ｕ／ｍＡＰＡＨ0.1ｍ
を加えて３７℃で１時間インキュベートした。濁りが
生じたサンプルは遠心して濁りを除いたあと、１ｍを
測定の試料とし、次の組成で吸光度の増加を測定した。
１ ｍ 試料 1.8ｍ ５０ｍＭ トリス−ＨＣ，pH8.1 0.1ｍ ３０ＵｍＭ ＮＡＤ＋ 0.1ｍ ２０Ｕ／ｍ ＡＢＡＬ−ＤＨ及び４５０Ｕ
／ｍプトレシンオキシダーゼ 酵素液を加える前に３７℃にて３４０ｎｍの吸光度が一
定であることを確認した後、酵素液を加えて５分間吸光
度の増加を測定した。吸光度よりポリアミン濃度を測定
し、別途市販の測定キット（Ｈ2Ｏ2を測定する）と相関
を調べたところ、良い相関性を示した。サンプル数２０
でＹ＝0.9958Ｘ＋0.38，ｒ＝0.9993であった（第４
図）。
／ｍプトレシンオキシダーゼ 酵素液を加える前に３７℃にて３４０ｎｍの吸光度が一
定であることを確認した後、酵素液を加えて５分間吸光
度の増加を測定した。吸光度よりポリアミン濃度を測定
し、別途市販の測定キット（Ｈ2Ｏ2を測定する）と相関
を調べたところ、良い相関性を示した。サンプル数２０
でＹ＝0.9958Ｘ＋0.38，ｒ＝0.9993であった（第４
図）。
参考例６ 発光法による′Ｎ−アセチルスペルミンの定量 ポリアミンオキシダーゼ反応は以下の組成で行った。
0.2ｍ ２０ｍＭ 酢酸緩衡液 pH5.0 0.05ｍ １０ｍＵ／ｍ ポリアミンオキシダーゼ 0.1ｍ ′Ｎ−アセチルスペルミン ２５℃で２０分間反応させた後、上記反応液に 0.40ｍ ２００ｍＭ リン酸緩衡液 pH7.5 0.05ｍ ２０ｍＵ／ｍ ＡＢＡＬ−ＤＨ 0.05ｍ ２０ｍＭ ＮＡＤ＋ 0.05ｍ ４００ｍＵ／ｍ フラビンレダクターゼ 0.05ｍ ５０μＭ ＦＭＮ 0.05ｍ ０．０２％ デカナール を加えて２５℃、５分反応させた後、1.0ｍの0.1Ｕ／
ｍルシフェラーゼ及び２０Ｕ／ｍプトレシンオキシ
ダーゼの混液を２００ｍＭリン酸緩衡液pH7.5に溶解し
た酵素液を注射器で急速に注入し、生じた発光を３分間
積分した。この時いずれのインキュベーションも、所定
時間以上放置しても問題はなかった。検量線は終濃度１
０-9Ｍ−１０-6Ｍで直線であった。１０-9ＭにおけるＳ
／Ｎ比は2.0であった。発光の時間変化を第５図に示
し、発光による検量線を第６図に示す。
ｍルシフェラーゼ及び２０Ｕ／ｍプトレシンオキシ
ダーゼの混液を２００ｍＭリン酸緩衡液pH7.5に溶解し
た酵素液を注射器で急速に注入し、生じた発光を３分間
積分した。この時いずれのインキュベーションも、所定
時間以上放置しても問題はなかった。検量線は終濃度１
０-9Ｍ−１０-6Ｍで直線であった。１０-9ＭにおけるＳ
／Ｎ比は2.0であった。発光の時間変化を第５図に示
し、発光による検量線を第６図に示す。
実施例２ 尿サンプルの発光法による測定 実施例１に示した方法に従って、ＡＰＡＨ処理をしたサ
ンプルを発光法に用いた。このとき濁りが生じたサンプ
ルは分離遠心せず、そのまま用いることができた。即
ち、検体は１０００倍に希釈して用いた。
ンプルを発光法に用いた。このとき濁りが生じたサンプ
ルは分離遠心せず、そのまま用いることができた。即
ち、検体は１０００倍に希釈して用いた。
0.1ｍ ＡＰＡＨ処理尿 0.05ｍ ２０ｍＭ ＮＡＤ＋ 0.05ｍ ５０μＭ ＦＭＮ 0.05ｍ 0.02％デカナール 0.25ｍ ２００ｍＭ リン酸緩衡液 pH7.5 上記組成物をバイヤルに入れ、バイヤルは発光測定装置
にセットそた。これに以下の酵素液0.5ｍを注射器に
て混入した。酵素は２００ｍＭリン酸緩衡液pH7.5にて
混和した。
にセットそた。これに以下の酵素液0.5ｍを注射器に
て混入した。酵素は２００ｍＭリン酸緩衡液pH7.5にて
混和した。
0.5ｍ２Ｕ／ｍＡＢＡＬ−ＤＨ、１０Ｕ／ｍプト
レシンオキシダーゼ、４０ｍＵ／ｍフラビンレダクタ
ーゼ、0.1ｍＵ／ｍルシフェラーゼ、プトレシンをサ
ンプルとして求めた検量線は１０-9Ｍ〜１０-6Ｍで直線
であり、この検量線より３分間の発光積分値を読みと
り、尿中ポリアミン量を計算した。この値は市販の測定
キットによる尿中ポリアミン測定値とよい相関を示し
た。
レシンオキシダーゼ、４０ｍＵ／ｍフラビンレダクタ
ーゼ、0.1ｍＵ／ｍルシフェラーゼ、プトレシンをサ
ンプルとして求めた検量線は１０-9Ｍ〜１０-6Ｍで直線
であり、この検量線より３分間の発光積分値を読みと
り、尿中ポリアミン量を計算した。この値は市販の測定
キットによる尿中ポリアミン測定値とよい相関を示し
た。
実施例３ 全血の測定 ヘパリン採血をした血液１ｍに0.4Ｍトリクロロに酢
酸（ＴＣＡ）１ｍを加えて攪拌し、遠心分離した上清
を0.5ｍとり、0.5ｍのトリス溶液を加えてpHを５に
調整した。この後、0.1ｍ１０ｍＵ／ｍポリアミン
オキシダーゼを加えて３７℃１０分間反応させた後、 1.6ｍ １００ｍＭトリス−ＨＣ，pH8.1 0.1ｍ ２０Ｕ／ｍＡＢＡＬ−ＤＨ 0.1ｍ ３０ｍＭ ＮＡＤ＋ を加えて更に３７℃５分反応させ、３４０ｎｍの吸光度
が一定であることを確認した。0.1ｍの４５０Ｕ／ｍ
プトレシンオキシダーゼを加えて３４０ｎｍの吸光度
の増加を５分間測定した。この操作を各検体について行
い吸光度変化からポリアミン量を求めておいた。
酸（ＴＣＡ）１ｍを加えて攪拌し、遠心分離した上清
を0.5ｍとり、0.5ｍのトリス溶液を加えてpHを５に
調整した。この後、0.1ｍ１０ｍＵ／ｍポリアミン
オキシダーゼを加えて３７℃１０分間反応させた後、 1.6ｍ １００ｍＭトリス−ＨＣ，pH8.1 0.1ｍ ２０Ｕ／ｍＡＢＡＬ−ＤＨ 0.1ｍ ３０ｍＭ ＮＡＤ＋ を加えて更に３７℃５分反応させ、３４０ｎｍの吸光度
が一定であることを確認した。0.1ｍの４５０Ｕ／ｍ
プトレシンオキシダーゼを加えて３４０ｎｍの吸光度
の増加を５分間測定した。この操作を各検体について行
い吸光度変化からポリアミン量を求めておいた。
一方で、ＴＣＡ処理の全血を２０ｍＭ酢酸緩衡液pH５を
用いて1000倍に希釈した。遠心分離操作は必要としない
が値の正確性を期すため希釈前に遠心分離した。
用いて1000倍に希釈した。遠心分離操作は必要としない
が値の正確性を期すため希釈前に遠心分離した。
0.1ｍ 希釈全血サンプル 0.05ｍ １０ｍＵ／ｍ ポリアミンオキシダーゼ 0.2ｍ ２０ｍＭ酢酸緩衡液 pH５ ２５℃で２０分以上反応させた後、 0.4ｍ ２００ｍＭリン酸緩衡液pH7.5 0.05ｍ ２０Ｕ／ｍ ＡＢＡＬ−ＤＨ 0.05ｍ ２０ｍＭ ＮＡＤ＋ 0.05ｍ ４００ｍＵ／ｍフラビンレダクターゼ 0.05ｍ ５０μＭ ＦＭＮ 0.05ｍ 0.02％デカナール を加えて２５℃５分反応させた後、1.0ｍの0.1ｍＵ／
ｍルシフェラーゼ、２０Ｕ／ｍプトレシンオキシダ
ーゼの混液を同じリン酸緩衡液に溶解したものを急速に
混入した。生じた発光を３分間積分し、プトレシンを用
いて得られた検量線から、全血中のポリアミン濃度を求
めた。
ｍルシフェラーゼ、２０Ｕ／ｍプトレシンオキシダ
ーゼの混液を同じリン酸緩衡液に溶解したものを急速に
混入した。生じた発光を３分間積分し、プトレシンを用
いて得られた検量線から、全血中のポリアミン濃度を求
めた。
発光法においては消去法を用いることがＳ／Ｎ比を上げ
るためにも望ましい。
るためにも望ましい。
第７図のように全血をサンプルとして３４０ｎｍでの吸
光法と発光法での相関は良い相関を示した。ｙ＝1.0058
−0.048、ｒ＝0.9962（ｎ＝２０） 実施例４ ジアホラーゼによるホルマザン発色系 測定系は実施例１に準じている。
光法と発光法での相関は良い相関を示した。ｙ＝1.0058
−0.048、ｒ＝0.9962（ｎ＝２０） 実施例４ ジアホラーゼによるホルマザン発色系 測定系は実施例１に準じている。
ＡＰＡＨ処理をした尿サンウルを試料として用いた。
１ｍ 試料 0.1ｍ ３０ｍＭ ＮＡＤ 0.1ｍ ２０Ｕ／ｍ ＡＢＡＬ−ＤＨ、４５０Ｕ／
ｍプトレシンオキシダーゼ及び３０Ｕ／ｍジアホラ
ーゼ 0.1ｍ 0.6mg／ｍ ＭＴＴ（３−（4,5−ジメチル
チアゾール−２−イル）−2,5−ジフェニルテトラゾリ
ウムブロミド） 1.7ｍ ５０ｍ トリス−ＨＣ、pH8.1 測定は酵素液を加える前に、５７０ｎｍの安定性を確認
し、上記試料に酵素液を加えて５分間測定した。プトレ
シンによる検量線は１００μＭまで成立し、この検量線
から試料中のポリアミン濃度を読取り、市販のキットと
相関を求めたところ、測定した尿検体について良い相関
を示した。
ｍプトレシンオキシダーゼ及び３０Ｕ／ｍジアホラ
ーゼ 0.1ｍ 0.6mg／ｍ ＭＴＴ（３−（4,5−ジメチル
チアゾール−２−イル）−2,5−ジフェニルテトラゾリ
ウムブロミド） 1.7ｍ ５０ｍ トリス−ＨＣ、pH8.1 測定は酵素液を加える前に、５７０ｎｍの安定性を確認
し、上記試料に酵素液を加えて５分間測定した。プトレ
シンによる検量線は１００μＭまで成立し、この検量線
から試料中のポリアミン濃度を読取り、市販のキットと
相関を求めたところ、測定した尿検体について良い相関
を示した。
実施例５ 自動分析機器によるポリアミン又はジアミンの定量 ２００μＭ以下のスペルミジン、カダベリン、プトレシ
ンの試料を調製し、自動分析機Cobas−Bioにて反応性を
検討した。１７０μの反応液中の酵素、ＮＡＤ＋濃
度、及び反応条件は参考例１と同じであるが、試料とし
てポリアミン又はジアミンを５０μ加えた。結果は、
スペルミジン、カダベリン又はプトレシンとも２００μ
Ｍ以下で直線であり、市販キットによる過酸化水素の測
定法と良い相関を示した。このとき、反応は３分以内に
完結した。プトレシン測定値の市販キットとの相関を第
８図に示す。
ンの試料を調製し、自動分析機Cobas−Bioにて反応性を
検討した。１７０μの反応液中の酵素、ＮＡＤ＋濃
度、及び反応条件は参考例１と同じであるが、試料とし
てポリアミン又はジアミンを５０μ加えた。結果は、
スペルミジン、カダベリン又はプトレシンとも２００μ
Ｍ以下で直線であり、市販キットによる過酸化水素の測
定法と良い相関を示した。このとき、反応は３分以内に
完結した。プトレシン測定値の市販キットとの相関を第
８図に示す。
（発明の効果） 本発明では試料中のポリアミン又はこれらのアシル体で
あるアシルポリアミンをアミノアルキルアルデヒドに変
換させ、生成した該化合物にＮＡＤ又はＮＡＤＰの存在
下にアミノアルキルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、例え
ばアミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼを作用さ
せ、生成したＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを測定することに
より、簡便、正確かつ自動分析機への適用が可能とな
る。
あるアシルポリアミンをアミノアルキルアルデヒドに変
換させ、生成した該化合物にＮＡＤ又はＮＡＤＰの存在
下にアミノアルキルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、例え
ばアミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼを作用さ
せ、生成したＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを測定することに
より、簡便、正確かつ自動分析機への適用が可能とな
る。
【図面の簡単な説明】 第１図はプトレシンを終濃度１００μＭ加えた時の３４
０ｎｍにおけるＮＡＤＨ生成の時間変化を示す。光路長
0.6cmで測定。縦軸は３４０ｎｍの吸収度。横軸は時間
（分）。 第２図はプトレシンのエンドポイント法による定量を示
す。横軸は添加したプトレシンの終濃度（μＭ）。縦軸
は３４０ｎｍより測定されたプトレシンの量（μＭ） 第３図は′Ｎ−アセチルスペルミンの定量を示す。横軸
は、試料中の濃度（μＭ）。縦軸は、３４０ｎｍでの測
定値（μＭ）。 第４図は尿中ポリアミンの測定における市販キット（過
酸化水素定量）と３４０ｎｍ吸光法との相関を示す。縦
軸は市販キットによる測定値（μＭ）。横軸は３４０ｎ
ｍ吸光法での測定値（μＭ）。 第５図は′Ｎ−アセチルスペルミンの細菌ルシフェラー
ゼによる発光の時間経過を示す。縦軸は発光強度（１０
-1カウント／秒）。横軸は測定時間（分）。 第６図は′Ｎ−アセチルスペルミンの発光法による定量
を示す。縦軸は発光量の積分値（カウント数）。横軸
は′Ｎ−アセチルスペルミンの終濃度（Ｍ）。 第７図は全血中ポリアミンの測定における340ｎｍ吸光
法と、発光法の相関を示す。濃度は試料中のポリアミン
量（μＭ）である。縦軸は発光法。縦軸は３４０ｎｍ吸
光法。 第８図は自動分析機によるプトレシンの定量における市
販キットとの相関を示す。
０ｎｍにおけるＮＡＤＨ生成の時間変化を示す。光路長
0.6cmで測定。縦軸は３４０ｎｍの吸収度。横軸は時間
（分）。 第２図はプトレシンのエンドポイント法による定量を示
す。横軸は添加したプトレシンの終濃度（μＭ）。縦軸
は３４０ｎｍより測定されたプトレシンの量（μＭ） 第３図は′Ｎ−アセチルスペルミンの定量を示す。横軸
は、試料中の濃度（μＭ）。縦軸は、３４０ｎｍでの測
定値（μＭ）。 第４図は尿中ポリアミンの測定における市販キット（過
酸化水素定量）と３４０ｎｍ吸光法との相関を示す。縦
軸は市販キットによる測定値（μＭ）。横軸は３４０ｎ
ｍ吸光法での測定値（μＭ）。 第５図は′Ｎ−アセチルスペルミンの細菌ルシフェラー
ゼによる発光の時間経過を示す。縦軸は発光強度（１０
-1カウント／秒）。横軸は測定時間（分）。 第６図は′Ｎ−アセチルスペルミンの発光法による定量
を示す。縦軸は発光量の積分値（カウント数）。横軸
は′Ｎ−アセチルスペルミンの終濃度（Ｍ）。 第７図は全血中ポリアミンの測定における340ｎｍ吸光
法と、発光法の相関を示す。濃度は試料中のポリアミン
量（μＭ）である。縦軸は発光法。縦軸は３４０ｎｍ吸
光法。 第８図は自動分析機によるプトレシンの定量における市
販キットとの相関を示す。
Claims (2)
- 【請求項１】試料中のポリアミンをアミノアルキルアル
デヒドに変換させ、生成したアミノアルキルアルデヒド
にＮＡＤ又はＮＡＤＰの存在下、アミノアルキルアルデ
ヒドデヒドロゲーゼを作用させ、生成したＮＡＤＨ又は
ＮＡＤＰＨを測定することを特徴とするポリアミンの定
量法。 - 【請求項２】試料中のポリアミンにポリアミンオキシダ
ーゼおよび／又はジアミンオキシダーゼを作用させてア
ミノアルキルアルデヒドを生成することを特徴とする特
許請求の範囲第１項記載のポリアミンの定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27942586A JPH066076B2 (ja) | 1986-11-21 | 1986-11-21 | ポリアミンの定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27942586A JPH066076B2 (ja) | 1986-11-21 | 1986-11-21 | ポリアミンの定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63134000A JPS63134000A (ja) | 1988-06-06 |
| JPH066076B2 true JPH066076B2 (ja) | 1994-01-26 |
Family
ID=17610899
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27942586A Expired - Fee Related JPH066076B2 (ja) | 1986-11-21 | 1986-11-21 | ポリアミンの定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH066076B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023191077A1 (ja) * | 2022-03-31 | 2023-10-05 | 東洋紡株式会社 | フレイルの進行度の層別化を支援するための方法、層別化装置、及び層別化プログラム |
-
1986
- 1986-11-21 JP JP27942586A patent/JPH066076B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63134000A (ja) | 1988-06-06 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |