JPH0341355A - マクロ分子の調製および分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発里少宜量 本発明はＤＮＡまたは他の荷電マクロ分子の調製、分離
および精製方法に関し、さらに詳細には、それらの染色
体フラグメントの分離方法に関する。

本発明の１つの実施態様においては、例えば、１〜少な
くとも１０，０００キロベースベアを包含する任意の所
望の有効サイズ（大きさ）を有するＤＮＡフラグメント
の分離方法が提供される。本発明のもう１つの実施態様
においては、所望サイズのＤＮＡフラグメントの混合物
を調製し、これらのフラグメントを通常の公知のゲル電
気泳動装置中で沈着させ、単一寸法に沿った周期的順序
（ｐｅｒｉｏｄｉｃ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）の一方向性電
界パルスをゲルに適用し、１つの方向の電界パルスの持
続時間は上記順序の各周期において反対方向の持続時間
よりも長時間であり、それによって、例えば、上記フラ
グメントの分離をその大きさに従って行うことを含む方
法が提供される。本発明の１つの特定の実施態様はＤＮ
Ａのサンプルを陰極および陽極を有する電気泳動装置中
のゲルに注入し、１つの極性例えば正極性の第１電界の
パルスとこの第１極性電界と反対の第２極性例えば負極
性の電界パルスとを含む順序の周期を有する周期的順序
のパルスを適用し、第２の反対パルスは第１の前向きパ
ルスよりも長持続時間で適用しかつ低強度を有すること
を含む。本発明方法によれば、反対極性と異なる強度を
有する２つの電界を用い、第２の即ち逆行電界が周期的
順序の各周期において第１電界よりも低強度を有し長持
続時間で適用する零集積電界ゲル電気泳動（ＺＩＦＥ）
を使用することができる。また、例えば、各順序が２よ
り多いパルスを含む多重性電界パルスを用いて本明細書
で述べるようなかつ負極性パルスの平均強度が正極性パ
ルスの平均強度よりも小さい順序の周期を形成させるこ
とができる。

本発明方法の利点には、例えば、最低移動性（ｍｉｎｉ
ｍｕｎ−ｍｏｂｉｌｉｔｙ）現象の排除または最小化、
それによって中間サイズの分子がそれより大きい分子お
よび小さい分子の両方よりもゆっくり移動すること、即
ち、各分子が分子サイズの順で移動すること；各々が電
気泳動終了後にゲル中でハンドを形成する異なるＤＮＡ
種間の相対分離が他の公知の電気泳動法により得た分離
に比較して通常大きいこと；　ＤＮＡフラグメントまた
は分子の分離の最適化がＤＮＡ分子間での大きい相対分
離を可能にすること、例えば、１００キロベースベアの
小分子は２，０００キロヘースペアの大分子よりもかな
り速い速度、例えば、２０ｍｍ／日で移動するように指
向は得ること；最初に他の分子を分離することなしでの
任意の所望のＤＮＡまたは多価電解質分子の直接分離、
それによって、分離する分子の程度を測定できること；
冷却装置または他のコスト高の装置を使用せずに殆んど
の場合において速い電気泳動分離を遠戚すること；移動
性分子サイズ関係が段階的で単調であること；系総的な
分離戦略の設計、それによって、対象物を電気泳動後の
ゲル中で所定のバンド像、特に、例えば、パルス強度お
よび／または持続時間を変える異なる周期的パルス順序
の組合せによる線状または対数的パターンを得るような
形でＤＮＡ分子を分離するようにすること；マイクロプ
ロセッサ−を用いそれによって分離プロセスの制御を簡
略化できること；未知の分子サイズを既知の結果からの
内部または外部ポーレーション（ｐｏｌａｔｉｏｎ）か
ら評定できる結果の簡単な数理的分析；低強度の電界を
幾つかの実施態様においでは使用できるので、電気泳動
中のゲル内のＤＮＡサンプルにより形成されたバンドの
拡散を低減しそれによって本方法の解像力を増大させる
こと；パルス形状をとりわけバンド拡散を低減させ例え
ばＤＮＡ分子の電気泳動分離を増大した解像力によって
行うよう設計できること；他の公知の電気泳動方法によ
る通常の場合よりも短い時間での極めて大きい、例えば
、約１．０００〜約６．０００キロベースペアのサイズ
を有する染色体の分離；使用者がＤＮＡ混合物中の、例
えば、約１，０００〜約６０００キロベースペアサイズ
の大分子が電気泳動中に移動しないような条件を選定し
それによって最終結果の分析をより簡素化し得ること；
バンド反転を排除または最小化し得ること；および単一
ゲル上での極めて広い範囲の分子サイズ、例えば、６〜
６　、０００キロベースベアの分子の分離がある。本発
明方法によれば、種々のプロセスプロトコールを選定し
設計できる、即ち、各パルスの周期的順序のパラメータ
ーを、結果を得る目的で、即ち、分析し解明するのに簡
単でありかつある生物学的処理態様または試験において
殆んどの関連ＤＮＡ分子間の分離を最適にするゲル上の
ＤＮＡ分子の位置を測定する目的で、処理中に修正しま
たは制御することができる。例えば、本発明方法は未知
染色体のような未知分子のサイズの評価を容易にするよ
うにあるいは一定の実験条件で通常得られるよりも広範
囲の分子サイズを分離するように調整できる。

本発明方法を調整しその利点または利点の一部を得るの
に選定できる分離条件の修正例は後述するとおりであり
、電界強度の増減、パルス持続時間の増減、零強度のパ
ルスを包含する多重性パルスの使用等がある。

０ 送」１え散 米国特許出願第０２０，４０１／８７号は公知の電気泳
動法と新規な解明すべきフラグメントのサイズにおける
所定の電界パルス特性および他のプロセス条件に関する
方法との組合せを開示している（該米国特許出願の記載
はすべて参考として本明細書に引用する）。即ち、該米
国特許出願の１つの実施態様においては、ＤＮＡ粒子の
混合物を出力源を有する通常のゲル電気泳動装置中に付
着させ、正電圧を有する単一の均一な一次電界を一方向
にパルス形で適用する。一次パルスの間に、正または負
電圧の二次パルスを適用する。また、一次パルスの間に
、零電界条件の二次“パルス”も適用し得る。ＤＮＡフ
ラグメントの上記混合物は１つの実施態様において少な
くとも２つの異なるサイズを有するＤＮＡフラグメント
を含有する溶液またはゲルサンプルを含む。例えば、混
合物は１００，０００．２００，０００．３０００００
．４００．０００、および５００，０００ベースペアを
有するフラグメントを含有し得るであろう。処理中の一
次および二次パルスの持続時間は、゛オンザ　レプテー
ション　セオリー　オブ　ゲル　エレクトロホレインス
（Ｏｎ　ｔｈｅ　Ｒｅｐｔａｔｉｏｎ　Ｔｈｅｏｒｙ　
ｏｆＧｅｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）パイオ
ポリマース、Ｖｏｌ、　２５、ｐｐ、４３１−４５４　
　（１９８６）”においてＧ、　Ｗ。

５ｌａｔｅｒとＪ、　Ｎｏｏｌａｎｄｉ　により開示さ
れた式に従って選定する（該文献の記載はすべて参考と
して本明細書に引用する）。上記米国特許出願に対して
の本発明の利点には、例えば、最小移動性現象の排除ま
たは最小化、即ち、ＤＮＡ分子が分子サイズの順序にお
いて分離せず、中間サイズの分子がそれより小さいおよ
び大きい分子よりもゆっくり移動するという結果；ＤＮ
Ａゲル電気泳動の理論的モデルの計算結果に基づく最適
化した方法；分離がはるかに大でありより正確に予想し
得るものである最適化した方法；分子が分子サイズの順
序において移動し最終結果の分析を極めて信頼できるも
のにする最適化したＤＮＡ分離方法がある。

２０、０００ベースペアより大きいＤＮＡフラグメント
の分離に使用する方法は幾つかの欠点を有■ する。ある場合においては、上記の米国特許出願第０２
０，４０１／８７号に開示された方法を除いて、市販の
電気泳動装置をそれらの方法を適用する前に修正しなけ
ればならない。例えば、交差勾配電界を用いる米国特許
第４，４７３，４５２号に開示された方法は通常のゲル
電気泳動装置に費用高の変形を必要とする。また、上記
米国特許出願に開示された方法を除き、２０，０００ベ
一スペア以上のＤＮＡフラグメントの分離を意図してい
る多くの方法は比較的高電界（３ポル）　／　ｃｍ以上
）を用いてゲルおよび／またはＤＮＡの分解を回避する
のに嵩高で費用高の冷却装置の補充を必要とするの対し
、本発明の１つの実施態様においては、最高電界は１．
０ボルト／ｃｍ程の低値であり得る。また、本発明方法
によれば、逆方向において低強度の電界（しばしば、０
．３ボルト／ｃＩｎ程の）を使用でき、逆パルスがそれ
より高強度の先行パルスよりも長い持続時間を有するの
で、分子は殆んど低強度の電界中で移動し、これがバン
ドの電気泳動中に拡散する傾向、即ち、他のパルス型電
界装置におい３ ての極めて大きい分子に対しては電気泳動の使用を制限
するという問題を低減させている。また、パルス形状は
本発明方法の１つの実施態様によればバンド拡散を特に
減しるように選定または設計できる。さらに、本発明方
法はＤＮＡフラグメントの与えられた混合物の最適解像
力を得るのに使用できる諸実験パラメーター値を前もっ
て測定する信頼できる方法を提供して、分子が分子サイ
ズの順序において分離するのを確実にし、目的に応じた
プロセス制御戦略の集成を可能にして狭い範囲の分子サ
イズにおいては大きい解像力を得またはより広い分子サ
イズにおいてはより低い解像力を得、および／または結
果の単純な内部および外部ポーレーション分析を可能に
する。最適の解像力は特定サイズのフラグメントのすべ
てが処理終了時に他のサイズのフラグメントのバンドと
オーバーラツプしない明確なバンド内に存在する結果を
得ることと云える。

また、諸プロセスパラメーターに依存する本発明方法に
おいては、ＤＮＡ分離は分子が分子サイ４ ズの順序で分離する場合、大分子、例えば、３，０００
キロベ一ス以上の大分子が移動せずに小分子を干渉しな
い場合、および移動性と分子サイズの関係がシャープで
かつ単調的であり、その結果、結果の優れた制御と正確
な分析が得られ得る場合に達成される。これらの利点に
対しては、ある実施態様において以前の経験的および／
または理論的結果を用いて結果を分析するコンピュータ
駆動出力源および／またはコンピュータソフトウェア−
を用いることが好ましい。

発明の目的 次の目的が提供されるが、本発明はこれらの目的に必ず
しも限定されず、さらにまた、これらの目的のいつくか
の達成は、例えば、特定のプロセスパラメーター等に依
存し得ることに留意されたい。

本発明の目的は前述した多くの利点を有する方法を提供
することである。

また、本発明のもう１つの目的は零集積電界電気泳動（
ＺＩＦＥ）による荷電マクロ分子好まし５ くはＤＮＡ分子の分離方法を提供することである。

さらにまた、本発明のもう１つの目的は分離する分子の
分子サイズの数または範囲を前辺って選定できるＤＮＡ
分子の分離方法を提供することである。

さらに、本発明のもう１つの目的はＤＮＡ分子間の広範
な相対分離を得る方法を提供することである。

さらにまた、本発明のもう１つの目的はＤＮＡ分子間の
広範な相対分離を得る方法であって他の大分子がその起
源（オリジン）で残存しかくして分離する分子を干渉し
ない方法を提供することである。

さらにまた、本発明のもう１つの目的は望ましくない最
小移動性現象を排除または最小化した零集積電界電気泳
動（ＺＩＦＥ）によるＤＮＡの分離方法を提供すること
である。

衾奥也血査 本発明の上記および他の目的はＤＮＡ分子、およびＲＮ
Ａのような他の荷電分子等の改良された分離方法を提供
することによって達成される。さらに詳細には、本発明
の１つの実施態様は相対する電界の複数のパルスを電気
泳動装置において用い、電界の１つをもう１方の電界よ
りも長い持続時間のパルスで適用することからなるＤＮ
Ａ分子の分離方法に関する。特に、本発明の（つの実施
態様は零集積電界電気泳動（ＺＩＦＥ）によるＤＮＡ分
子の分離方法に関する。本発明の１つの実施態様におい
ては、ＤＮＡ粒子の混合物を陽極と陰極および出力源を
備えたゲル電気泳動装置中に付着または導入し、そこで
、反対極性と異なる強度の２種の電界のパルスをＤＮＡ
粒子に適用し、また低い方の強度の電界（逆行モードの
）は第１の（高い方の強度の前向きモードの）電界より
も長持続時間で適用する。これらのＤＮＡフラグメント
は本発明の１つの実施態様においては少なくとも２つの
異なるサイズのＤＮＡフラグメントを含有する溶液また
はゲルサンプルを含む。即ち、例えば、混合物は１００
，０００．２００，０００．３０００００．４００，０
００．５００，０００ベー７ スペア等のフラグメントの分子サイズを有するＤＮＡフ
ラグメントを含有し得る。特に述べてない他の分子サイ
ズも本発明の主目的または１つの目的が達成される限り
使用できる。

本発明のもう１つの実施態様はＤＮＡを包含する荷電マ
クロ分子の電気泳動分離方法に関し、その方法は荷電マ
クロ分子に正および負の極性の多重性の電界パルスを含
み負極性パルスを各サイクルにおいて正極性パルスより
も長い総持続時間で適用し、負極性パルスが正極性パル
スよりも低強度を有するサイクルを通用することを含む
。この実施態様方法においては、上記のサイクルは、例
えば、約１〜約１０日の有効合計時間で適用する。

また、各サイクルは、例えば、正および負極性の約２〜
約１００電界パルスを含み得る。

さらにまた、本発明の別の実施態様においては、ＤＮＡ
のようなマクロ分子に第１電界のパルスと第２電界のパ
ルスを含むサイクルを電気泳動装置内で連続的に適用し
、この２つの電界は反対極性を有し一方向性であるか、
あるいは単一寸法に沿８ って、第２電界が第１電界よりも低強度を有し、第２電
界を各サイクルにおいて第１電界よりも長持続時間で通
用することを含む荷電マクロ分子の分離方法が提供され
る。

さらに、本発明の実施態様には、〔■〕荷電マクロ分子
に各周期が負および正極性の多重性電界パルスを含む周
期的順序のパルスを繰返し適用し、負極性のパルスは各
周期において正極性パルスよりも長持続時間で適用し、
負極性パルスの平均強度は正極性パルスの平均強度より
も小さいかまたは負極性パルスは正極性パルスよりも低
強度を有すること特徴とする荷電マクロ分子の電気泳動
分離方法；　　（ＩＩ）　　（１）電気泳動装置を用意
し、（２）この装置に異なる長さのＤＮＡフラグメント
を含有する溶液混合物をゲルに加え、（３）上記装置を
荷動させて装置内に周期的）順序の一方向性の均一電界
パルスを形威し、この電界パルスの順序は一次正電圧パ
ルスとこの一次パルスよりも低電圧を有する負極性の二
次パルスとの間で交互に変化し、（４）上記一次および
二次電界パルス９ に必要な持続時間と電界強度、およびこれらの条件を分
離中に変化させて各フラグメントをそれらの最終位置お
よびサイズ間の所定の関係においてそれらの長さに相応
する別々の個々のグループに分割させることを含むＤＮ
Ａフラグメント混合物の分離方法；　　（ＩＩ［）　　
（１）電気泳動装置を用意し、（２）この装置に異なる
長さのＤＮＡフラグメントを含有する溶液混合物を含む
ゲルを加え、（３）装置を稼動させそれによって周期的
順序の一方向性の均一電界パルスを形威し、この周期的
順序の電界パルスは一次正極性および二次負極性パルス
を含み、周期の第１部分は零強度および／または負極性
電界の短時間の二次パルスにより多くのサブパルスに分
割される一次正極性パルスを含み、第２部分は零強度お
よび／または正極性電界の短時間の二次パルスにより多
くのサブパルスに分割される一次負極性パルスを含み、
一次負極性パルスは一次正極性パルスよりも抵電圧を有
し、周期の第２部分は第１部分よりも長持続時間を有し
、（４）種々の電界パルスが各フラグメントのそれ０ らの長さに相応する別々の個々のグループへの分割を可
能にするのに必要な持続時間と電界強度を推定し、（５
）装置内に分離すべき各フラグメントのサイズに相応す
る強度と持続時間を有する選ばれた順序の電界を通用す
ることを含むＤＮＡフラグメント混合物の分離方法；　
　（ＩＶ）　　（１）電気泳動装置を用意し、（２）こ
の装置に異なる長さのＤＮＡフラグメントを含有する溶
液混合物を含むゲルまたは異なる長さのＤＮＡフラグメ
ントを含有するアガロースプラグを加え；　（３）装置
を稼動させそれによって装置内に周期的順序の一方向性
の均一電界パルスを形成し、この電界パルスの順序は一
次正電圧パルスとこの一次パルスよりも低高圧を有する
負極性の二次パルスとの間で交互変化し、（４）一次お
よび二次電界パルスの持続時間と電界強度を推定し、さ
らに、これらの条件を分離中に変化させて各フラグメン
トのそれらの最終位置とサイズ間の所定の関係を有する
それらの長さに相応する別々の個々のグループへの分割
を可能にする時間を推定し、（５）装置内に分１ 離すべき各フラグメントのサイズに相応する強度と持続
時間を有する選ばれた一次および二次電界を適用するこ
とを含むＤＮＡフラグメントまたは分子混合物の分離方
法；および（Ｖ）（１）公知の電気泳動装置を用意し、
（２）この装置に異なる長さのＤＮＡフラグメントを含
有する溶液混合物を含むゲルまたは異なる長さのＤＮＡ
フラグメントを含有するアガロースプラグを加え、（３
）この装置を稼動させて装置内に周期的順序の一方向性
の均一電界パルスを形威し、この電界パルスの順序は一
次正極性および一次負極性パルスを含み、周期の第１部
分は零強度および／または負極性電圧の短時間二次パル
スにより多くのサブパルスに分割される一次正極性パル
スを含み、第２部分は零強度および／または正極性電界
の短時間二次パルスにより多くのサブパルスに分割され
る一次負極性パルスを含み、一次負極性パルスは一次正
極性パルスよりも低電圧を有し、周期の第２部分は第１
部分よりも長持続時間を有し；　（４）上記種々の電界
パルスが各フラグメントのそれらの２ 長さに相応する別々の個々のグループへの分割を行うの
に必要な持続時間と電界強度を推定し、（５）装置内に
分離すべき各フラグメントのサイズに相応する強度およ
び持続時間を有する選ばれた順序の電界を適用すること
を含むＤＮＡフラグメントまたは分子混合物の分離方法
がある。

さらに、本発明の別の特定の実施態様においては、（１
）電気泳動装置を用意し、（２）この装置に異なる長さ
のＤＮＡフラグメントを含有する溶液混合物を含むゲル
を加え、（３）装置を稼動させ、それによって装置内に
一方向性の均一電界パルスの順序を形成し、この電界パ
ルスの順序はゲル中の正味の移動方向を形成する一次正
電圧パルスとこの一次パルスよりも低電圧を有する負極
性の二次パルスとの間で交互変化し、（４）この一次お
よび二次電界パルスが各フラグメントをそれらの長さに
相応する別々の個々のグループに分割するのに必要な持
続時間と電界強度を推定し、（５）装置内に分離すべき
各フラグメントのサイズに相応する強度と持続時間を有
する選ばれた一３ 次および二次電界を適用することを含むＤＮＡフラグメ
ント混合物の分離方法が提供される。この方法および他
の前述した方法によれば、各サイクル内で多重性の電界
パルスも使用できる。

本発明のさらに特定の実施態様においては、０〜約＋１
０ボルト／ａｍの強度および０．１〜１０，０００秒の
持続時間の正極性の多重性の電界パルス、およびＯ〜約
１０ボルト／情の強度の負極性の多重性の電圧パルス（
少なくとも１つのパルスは零でない正強度を有すべきで
あり、１つのパルスは零でない負極性を有すべきであり
、また逆パルスは正極性パルスよりも長い総持続時間を
有する）とを使用しゲルの単一寸法に沿って適用でき；
その正極性は移動の正味の方向を形成する。この一連の
パルスは、１〜１０日間繰返すが、ＤＮＡのようなマク
ロ分子を含有する０、４〜２％（重量％）の濃度のアガ
ロースゲルに適用し得る。また、各電界および／または
各パルス持続時間は適当に、特に、最低移動性の排除ま
たは最小化のために、スイッチ装置により例えば２〜４
８時間毎に修正４ し得る。また、コンピュータープログラムを上記の修正
を自動的に行うよう書き込むことができ、あるいは使用
者が例えば約６時間毎の一定間隔で手動で条件を変化さ
せることができる。冷却装置は、商業的に人手できるゲ
ルボックスまたは電気泳動装置において使用する典型的
には２０〜２００ボルトの電圧が本発明方法の多くの実
施態様においては装置を通常高く加熱しないので、殆ん
どの場合通常使用しない。

分離を終了したとき、ゲルを電気泳動装置から取り出し
、染料、通常、臭化エチジウムを加える（この染料はＤ
ＮＡに粘着しＵＶ光により観察し追跡することができる
。次いで、ゲルの写真をＵＶ感知カメラにより撮ること
ができる。この写真はＤＮＡが処理中に移動した場所を
示し、この情報を用いて未知分子のサイズを決定するか
あるいは生物体のゲノム再編成を定量的に試験すること
ができる。この染料添加と写真手順は本発明の方法実施
態様のすべてに適用できるが、他の方法もＤＮＡ可視化
のために使用できる。また、分離５ したＤＮＡはＵＶ光を使用する前のゲルのＤＮＡバンド
を切り取ることによりさらなる生物学的実験用のサンプ
ルとして使用できる。さらにまた、放射線標識ＤＮＡプ
ローブを用いても本発明方法により分離したＤＮＡ分子
または染色体を同定することができる。

本発明のもう１つの特定の実施態様においては、０．１
〜約１０，０００秒の持続時間のパルス用の＋１〜約＋
（正）１０ポル）　／　ｃｍの前行電界、およびこの前
行パルスよりも１．１〜３倍長い持続時間のパルス用の
−０，２５〜−１０（負）ボルト／印の逆行電界を使用
し得る。この一連のパルスは０．４〜２％の濃度を有す
るアガロースゲルに１〜１０日間適用できる。また、各
電界および／または各パルス持続時間は、例えば、最低
移動性の排除または最少化のために、例えば、スイッチ
装置により２〜４８時間毎に適当に変化させ得る。さら
に、コンピュータプログラムを上記および他のＺＩＦＥ
プロセス修正を自動的に行うように書き込むことができ
、あるいは使用者がこれらの条件６ を例えば約６時間毎の一定間隔で手動により変化させ得
る。分離が終了したとき、ゲルを電気泳動装置から取り
出し、臭化エチジウムのような染料を前述のようにして
添加できる。次いで、ゲルの写真をＵＶ感知カメラによ
り撮る。この写真はＤＮＡが処理中に移動した場所を示
し、この情報を用いて未知分子のサイズを決定するかあ
るいは生物体のゲノム再編成を定量的に試験することが
できる。また、この方法実態様により分離したＤＮＡは
ＵＶ光を使用する前のゲル中のＤＮＡバントを切り取る
ことによりさらなる生物学的実験用のサンプルとして使
用できる。また、放射性標識ＤＮＡプローブを用いても
本発明のこの実施態様または他の実施態様により分離し
たＤＮＡ分子を同定することができる。

理論によって拘束することは望まないけれども、次の各
等式は本発明方法を最適化するためおよび、例えば、あ
る実施態様における好ましいプロセスパラメーターを包
含する実験条件を決定するために提示する。例えば、最
適の分離は前述のような７ ＺＩＦＥ形状、即ち、本発明方法において起り従来技術
のＦＩＧＥ法においては起らないと想定する。本発明の
ＺＩＦＥ法は１つの局面においてＤＮＡのようなマクロ
分子の移動性に基づき、この移動性は連続電界中にあっ
て、電界の機能（電界強度の適切な範囲での）、例えば
、ＤＮＡゲル電気泳動はアガロースゲル中での非直線的
現象である： β μＯＣＥ、　　　　Ｑ（β〈２ この関係はＤＮＡゲル電気泳動のバイアス化標準モデル
により実験的に観察され説明されている〔例えば、′キ
ュアンチティティブアンリシスオブザスリーリグメスオ
ブＤＮＡエレクトロホレシスインアガロースゲル（Ｑｕ
ａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆ　ｔｈｅ
　Ｔｈｒｅｅ　Ｒｅｇｉｍｅｓ　ｏｆ　ＤＮＡ　Ｅｌｅ
ｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｉｎ　　Ａｇａｒｏｓｅ　　
Ｇｅ１ｓ）、　　Ｇ、　　Ｗ、　　５ｌａｔｅｒ、　　
Ｊ、　　Ｒｏｕｓｓｅａｕ。

Ｊ、　Ｎｏｏｌｏｎｄｉ、　Ｃ，Ｆｕｒｍｅｌ、　Ｍ、
　Ｌａ１ａｎｃｌｅ　（１９８８）＋Ｂｉｏｐｏｌｙｍ
ｅｒｓ　２７　、　５０９−５２４”参照〕。この文献
は連続電気泳動に関し、その記載はすべて参考として本
明細書に引用する。

８ ＤＮＡの移動性は電界方向での分子の配向に比例する（
Ｓ、　Ｌｅｅ編集のＮｅｗ　Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｐｈ
ｙｓｉｃｓａｎｄ　Ｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ　ｏｆ　Ｐｏｌｙｍｅｒｓ　（ＰｌｅｎｕｍＰｒｅ
ｓｓ社）のＧ、　Ｗ、　５ｌａｔｅｒ、　Ｊ、　Ｎｏｏ
ｌａｎｄｉによる“ザバイアスドレプテーションモデル
オブＤＮＡゲルエレクトロホレシス（Ｔｈｅ　Ｂｉａｓ
ｅｄ　ＲｅｐｔａｔｉｏｎＭｏｄｅｌ　ｏｆ　ＤＮＡ　
Ｇｅｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）　　（１９
８９）参照〕、この文献の記載はすべて参考として本明
細書に引用する。配向を無視し得る場合、例えば、分子
コンホメーションが等方性である場合、指・数βは位数
０を有し、分子を連続電界中で分離し得る直線状の規則
性を有し；これは低電界中の比較的小分子典型的にはサ
イズ的に２０．　ＯＯＯヘースペア以下の分子において
生ずる。配向が大きいとき、例えば分子が電界軸に沿っ
て配列されているときには、非直線的規則性１〈β≦２
が得られ連続電界電気泳動は一般に大分子を分離できず
、不利益は前述のような本発明のＺＩ　ＦＩＥ法により
回避する。即ち、４、発明適法においては、電賓を１三
、から−丁）９に突化さ（Ｊ）、：、Ｉき分’１’　：
Ｉ　：′：ｌ、メションの配向はある時間ｔｌを新しい
電界に適応する前についやす。電界を変化させた直後の
時間ｔ＜ｔ”中に、大ＤＮＡ分子のコンホメーションは
電界Ｅ、中に依然としであるかのように配向したままで
あり、かくして、その移動性は本質的に未変化のままで
あり、次に等しい： β トμ＋”（Ｅ＋）　　、ｔ＜ｔ”として電界Ｅ１パルス
持続時間ｔ１で適用させ、次いで、持続時間ｔ２＜ｔ”
のＥ２パルスを適用させたとき、大ＤＮＡ分子の正味の
速度は トｖｏ＝　（ｔ＋μ＋Ｌ　　ｔｚ／’＋Ｅｚ）　／　（
Ｌ　＋ｔｚ）　。

ｔ、、２＜ｊ”および μＩＥＩ＞μ２Ｅ２として である。

電界を変えた後の時間ｔ＞ｔ”後、コンホメーションは
新しい電界強度および方向に完全に適応し、以前の電界
条件を何ら記憶しない。この制限４ｑ、１−１１き、正
味の電気泳動速度は次式で与えられる　： ｊづ　３ ”−”　　〔ｊ＋　μ＋８＋−ｔ２μ２巳Ｊ　　／　　
Ｃｔ＋＋ｔ２〕ｔ　１１２＞ｔ”および μ、Ｂ、＞μ２Ｂ２として 時間比と電界比、Ｒ，−巳、／Ｅ２　とＲｔ＝ｔ、／１
２’により、これらの漸近的速度は次のように示し得る
：＞　　ｖｏ−μ１ｌＥｌ　〔Ｒｔ−１／Ｌ、〕／　［
：Ｒｔ＋１：］ト　　ｖ。　−μ１ｌＥｌ　　［Ｒｔ−
（ＲＥ）　−β−１］／　　〔Ｒ，＋↓〕ここで、１つ
（速度μｍＥ１）を除くすべての絶対値を相対値（比）
で置換える。比Ｒｖおよびこれらの速度の差△Ｖは ＞　　ＲＶ＝ｖｏｏ　／Ｖｏ−［：ＲｔＲｇ　　（ｆｂ
、）−β〕／　［：Ｒ，ＩＩＥ−ＩＥト△Ｖ＝ＶＯＯ−
ＶＯ＝μ１Ｂｌ（ＲＥ）−’　［１−（ＲＥ）−β）　
／　［Ｒ，＋１）比ＲＶと速度差△Ｖは方法の分離力の
尺度であり、従って、本発明のＺＩＦＥ法の最適使用に
おいては通常最大である。ＲＥ　＝　１　／　ＲＬにお
いてのＶＯ＝Ｏに関しては、上記の等式はＤＮＡ分子の
高周波（ｔ＋、２＜ｔ　”　＞　速度Ｖ。は電界比が時
間比の逆数（ＲＥ＝１／Ｒｔ）である場合に零であるこ
とを示し、これは最低移動性が大分子間では通常生じ得
ないことを意味し、正味ＦＩＧＥ条件（Ｇ、Ｆ、　Ｃａ
ｒｌｅ、　Ｍ、　Ｐｒａｎｋ、　Ｍ、Ｖ、　０１ｓｏｎ
（１９８５）。

５ｃｉｅｎｃｅ　２３２．　６５−６８の″エレクトロ
ホレティクセパレーションズオブラージＤＮＡモレキュ
レスハイピリオディックインバージョンオブザエレクト
リックフィルード（ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃＳ
ｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　　ｏｆ　　Ｌａｒｇｅ　　ＤＮ
Ａ　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｓ　　ｂｙ　　Ｐｅｒｉｏｄｉｃ
（ｎｖｅｒｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｅｌｅｔｒｉｃ　
Ｆｉｅｌｄ）　”参照）が分子サイズの順で分子を分離
できない場合において極めて有用である。上記のＺＩＦ
Ｅ条件においては、１回の完全サイクル（または周期）
中の電界の正味積分値（２つの電界のいずれも零に等し
くない）は零である： この条件を零集積電界電気泳動、即ち、２／ＩＦＢと称
し得る。これが生ずるとき、比Ｒｖは２つの電界が異な
る強度（ＲＥ＞１）を有するので無限大となる： ）　Ｒ，−Ｒｖ（ＲＥ＝１／Ｒ，）−［１−（ＲＥ）−
β〕１０→無限大分離△Ｖはこれらの条件下ではＲＥ々
１．５〜３２ において大であり、かくして、時間比はＲｔｔｏ、３〜
０．７である。本発明方法においては、上記位数の数を
幾つかの実施態様において使用する。

ＲＥ　＞　１とＲｔ＞１の使用は示唆されていたＣＭ。

Ｌａ１ａｎｄｅ、　Ｊ、　Ｎｏｏｌａｎｄｉ、　Ｃ，Ｔ
ｕｒｍｅｌ、　Ｊ、　Ｒｏｕｓｅａｕ。

Ｇ、　Ｗ、　５ｌａｔｅｒ　、（１９８８）　、Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４．８０１１　８０１５の”　Ｐｕ
１ｓｅｄＦｉｅｌｄ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｅ
：　Ａｐｐｌｉｃａｔｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｃｏｍｐｕｔｅ
ｒＭｏｄｅｌ　ｔｏ　ｔｈｅ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　
ｏｆ　Ｌａｒｇｅ　ＤＮＡ　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｓ参照、
該文献の記載はすべて参考として本明細書に引用する〕
。しかしながら、この文献において開示された方法にお
いては、最低移動性効果、限定された解像力、大きいバ
ンド拡散、および他の不利益が得られていた。本発明方
法においてはまた主として実験的証拠に基づけば、ＤＮ
Ａ分離の最適条件はＲＥ〜１／Ｒ０のときのＲＥ　＞　
１およびＲｔ　＞　１において見い出されるものと信し
られる：異なる分子サイズのＤＮＡの電気泳動分離は、
臨界的時間ｔ″（これは実験結果から理論的に計算ある
いは推定し得る）が分子サイズの関数であ３ るので、上記のＺＩＦＥ条件下で起る。第１の概である
。

指数Ｔとδ（共に正である）は実験結果または理論によ
り得られる〔例えば、Ｓ、　ＬｅＪ、ｉ集のＮｅｗＴｒ
ｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｐｈｙｓｉｃｓ　ａｎｄ　Ｐｈｙｓｉ
ｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆＰｏｌｙｍｅｒｓ（
Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ社）のＧ、　Ｗ、　５ｌａｔ
ｅｒ、　Ｊ。

Ｎｏｏｌａｎｄｉ　（１９８９）による”　Ｔｈｅ　Ｂ
ｉａｓｅｄＲｅｐｔａｔｉｏｎ　Ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　Ｄ
ＮＡ　Ｇｅｔ　Ｅｌｅｔｒｏｐｈｏｓｅｓｉｓを参照さ
れたい、該文献の記載はすべて参考として本明細書に引
用する〕。この関係から、ｊｚ＝ｊ“（「）のような臨
界的分子サイズＭ”を求め得る。実験条件の選択におい
ては、即ち、例えば、固定電界とパルス持続時間によれ
ば、分子サイズＭ＜Ｍ”を有するすべての分子は速度Ｖ
〜ＶｏＯを有し、また、分子サイズＭＵＭ“を有するす
べての分子は（はるかに低い）速度Ｖ〜Ｖｏ〜０を有す
るであろう。

本発明のＺＩＦＢ法によれば、Ｍ＞Ｍ”分子は４ 実際に近零速度を有し、またそれより小さいＭ＜Ｍ”分
子は最適化し得る有限速度Ｖ、ｘ、を保持している。

従って、相対分離Ｒｖ＝Ｖ、、、／Ｖｏは極めて大きく
て１よりも実質的に大であり、微分速度ΔＶは連続電界
速度μＩ　Ｅ　Ｉの大分数であり得る。Ｍ々Ｍ′″を有
する分子は極めて強いサイズ依存性速度を有し、従って
、広範囲の速度０〜ｖｏ≦■≦■。

に亘って分離で６る。

本発明のＺＴＦＥ構戒法構成つかの実施態様において極
めて小さい漸近的速度■。をもたらし得る。好ましいの
は、１　／　ＲＥよりもわずかに大きいＲ０値（最適結
実用の理論値）を用いて完全分離および最適処理時間を
得ることである。これらの好ましい値はＺＩＦＥ法の定
量的特徴を変化させず、従って、上記の各等式はいつで
も使用可能である。総集積電界はおよそ零に等しいけれ
ども、本方法はＺＩＦＥと称し得る。従って、一般的に
は、ＺＴＦＥは）ＲＥ＞１（逆行電界が前向電界よりも
低強度を有する）、および１／ＲＥ≦Ｒｔ＜１　（逆行
パルス持続時間が前向きパルス持続時間よりも５ 長い）であるときの電界逆転法であり、従って、本発明
のＺＩＦＥ法を従来技術のＦＩＧＥ法と実質的に異なる
ものとしている。後述の実施例で得られた結果も、従来
のＦＩＧＥ法（Ｒ，とＲ３がく１でありあるいはＲゆ〉
１、Ｒｔ−１である）と比較し著しい改良（例えば、分
離した広範囲の分子サイズ、最低移動性のないこと、大
分子が零速度を有すること）を示しており、これらおよ
び他の利点は従来法において得られるとは信しられない
。

ＦＴＧＢのような他のパルス化電界電気泳動法に比べて
の本発明のＺＩＦＥ法の主な利点の１つは本発明方法が
最低移動性を全くあるいは殆んど示さないことである、
何故ならば、その速度対パルス持続時間関係が与えられ
た分子サイズＭにおいて次のように殆んど階階であるこ
と：Ｖ（ｔｚ＜ｔ”（Ｍ））ｘｏ；　　　Ｖ（ｔ２＞ｔ
”（Ｍ））ｘＶ。

即ち、例えば、大分子ＭＵＭ”が分離工程において静止
したままであるからである。

また、２つの異なるフラグメント間の相対分離６ Ｒｖと微分速度ΔＶは前述したように適当な実験条件を
選定することにより極めて大きくすることができる。さ
らに、本発明方法は単一セントの実験条件（電界Ｅ１と
Ｒ２、およびパルス持続時間ｔ１とｔｚ）により実施す
るときのＭ〜Ｍ”中心の極めて狭い範囲の分子サイズを
分離するのにも使用できる。また、本ＺＩＦＥ法は実験
条件を電気泳動分離中にしばしば変化させるような理論
および／または実験に基づくプロセス制御設計も提供す
る。このプロセス制御は実験結果が処理終了後のゲル中
の任意の所望パターンを追従する形で設計され；これは
、例えば、ＺＩＦＥ法により与えられた単調で鋭敏な分
子サイズ対移動性関係において生ずる。例えば、直線状
または対数的速度対分子サイズ関係を本発明方法により
得られたサイズ推定の正確性を改良し得る適当なプロセ
ス制御を設計することによって設定できる。２つ（また
はそれ以上の）電界を単一寸法に沿って適用するので、
本発明の方法は新しい電気泳動ゲル系を必要とせず、む
しろ、出力源、例えば、ＺＩＦＥ７ パルスを給送するＤＣ動力源によって与えられたＤＣ電
界を調節するマイクロコンピュータ−を有する市販の通
常の電気泳動装置を使用できる。さらにまた、低電界Ｅ
２を長時間適用するので、その強度は逆行パルス中に熱
が殆んどまたは全く発生しないように選定でき；前向き
電界Ｅ、が熱を発生させる程に大きくても、装置は長い
ｔ２パルス中に冷却し得、冷却装置を通常必要としない
。

また、分子バンドは大電界中で拡がる傾向にあるので、
長時間のパルスでの低強度の電界Ｅ１の使用はＦＩＧＥ
を包含する他の公知の方法に比しバンド拡散を低減する
。

従って、本発明のＺＩＦＥ法は、例えば、極めて大きな
分離（例えばＲＶ　＞　１　＞を与え、その単調な移動
性−サイズ関係（最低移動性効果のない）が他の公知の
従来技術法によって与えら得ない柔軟性を与える。装置
の簡単性、正確な定量的サイズ推定を得る可能性および
特定の条件に合致するように工程を系総的に制御する可
能性は本発明のＺＩＦＥ法が提供する利点のうちに属す
る。上記８ のＺＩＦＥ法等式はわずかに２つのパルスのみについて
与えられているけれども、これらパルスの総集積電界が
約０である場合の多動性パルス等も前述したように使用
できる。

後述の実施例および本明細書で述べる他の情報は本発明
のＺＩＦＥ法が多く利点を有することを明白にしている
。第１表、実施例１〜９は電気泳動速度Ｖ　（ｔ＋＋が
如何に１＋（秒）によりＲ，＝１／１．４０であ／Ｊ（
これはすべての場合における条件１／ＲＥ≦Ｒ５〈１を
満足する）、また分子サイズが約６〜６，０００キロベ
ースペア（ｋｂｐ　）で変化した場合において変化する
かを示している。実施例１〜９における移動は６５時間
であり、種々のフラグメントの移動距離は前述したよう
なゲルの写真からξリメーターで測定した。極めて大き
い解像領域は星印（＊＊ＸＸ＊−）でマークしている。

結果は、６〜６，０ＯＯｋｂｐの範囲において、本発明
のＺＩＦＥ法が望ましくない最低移動性現像（これは本
発明方法によって排除または最小化される）の懸念なし
にＤＮＡ分子の分離を改良でき；例え９ ば、第１表のいずれの欄においても、即ち、いずれの実
験においても、分子の移動した距離は大きいまたは小さ
い分子の両方よりもかなり短い距離で移動している中間
サイズの分子のない大分子において減少している。木表
の星印でマークした最適条件は、また、例えば、広範囲
の分子サイズを単一ゲル上で分離すべきときにどの条件
がプロセス制御戦略の一部であり得るをも示唆している
。

本発明方法は種々のサイズのＤＮＡフラグメントの分離
において交差ゲル電気泳動の助力およびそれに付随する
複雑さなしに使用できる。また、本発明方法は、特に理
想的なパラメーターを本方法の１部として提供できるの
で、最適分離条件を決定する多くの予備実験を行う必要
がない。しかも、本発明方法は前述のように任意のサイ
ズのフラグメント混合物の分離に使用できる。理論的に
は、分離する各フラグメントのサイズは無制限であるが
、−船釣には、約２，０００ベースペア〜６．０００，
０００ベースペアのサイズ範囲を有するフラグメントを
本発明方法によって分割され得０ る。さらにまた、本発明方法は与えられたサイズのＤＮ
Ａフラグメントを与えられたサイズのＤＮＡフラグメン
トを同し順序の電界パルスにより分離するのを可能にす
る再現性ある結果を他のすべての条件を保持したときの
種々の市販のゲル電気泳動槽内で得るのに使用できる。

さらにまた、本発明方法によれば、染色体ＤＮＡの分離
、染色体マツピング、遺伝子ライブラリーの作製、およ
び染色体ＤＮＡへの種々の薬物の効果試験のような領域
において研究を容易にするであろう。

第１Ａ、ＢおよびＣ表を含む第１表においては、初期混
合物中に存在する各グループのＤＮＡフラグメントがゲ
ル中で移動した距離についての実験結果が示されている
（実施例１〜９参照）。

第２表においては、パルス持続時間と総実験時間の割合
に関しての実施例１０で用いた実験条件が示されている
（特定の目的で設計したプロセス制御の例）。

第３表は第２表で示した割合を計算するのに用いた２組
の実験データを示している。

１ 本発明の１つの実施態様においては、本発明方法は（１
）電気泳動装置を用意し；　（２）この装置に異なる長
さのＤＮＡフラグメントを含有する溶液混合物またはア
ガロースプラグを加え；（３）装置を稼動させて装置内
に周期的順序の一方向性の均一電界パルスを形威し、こ
の順序は電界が正（即ち、前向き）電圧パルスと負極性
で前向きパルスよりも平均で低い電圧を有する逆行パル
スと間で交互に変化し；　（４）上記前向きおよび逆行
電界パルスが各ハンド中に存在するＤＮＡフラグメント
の長さに相応する別々の個々のグループ（またはバンド
）へ各フラグメントを分割するのを可能にするのに必要
な持続時間と電界強度を推定し；　（５）このＤＮＡに
工程（４）で計算したような分離すべき各フラグメント
のサイズに相応する強度と持続時間を有する選定された
前向きおよび逆行電界を適用し、逆行電界パルスは前向
き電界パルスよりも長時間で適用しまた低強度を有する
ことを含む。多重性の電界も前述したように使用できる
。

２ 本発明方法において使用できる電気泳動装置にはベセス
ダリサーチラボラトリーズライフテクノロジーズ社（Ｐ
、Ｏ，ボックス６００９、カイザースバーグ、Ｍｄ、２
０８７７＞から人手できるモデルＨ１または同社より入
手できるモデルＨ３のような普通に商業的に人手できる
標準ゲル電気泳動槽がある。これらの装置は一般に陽極
、陰極およびゲル床を有している。また、モデルＨ１の
寸法は４７　Ｘ　２２　Ｘ　１２．５　Ｃｍであり、ゲ
ル床は２５×２０ｃｍであり、電極間距離は４１ｃｍで
あり、各白金電極（，２５ｍ径）はゲル床を横切って１
９ｃ＋ｎにある。この装置またはボックスはプレキシガ
ラスから構成し得、２．５２の緩衝溶液を含む。モデル
Ｈ３の寸法は３７　Ｘ　１２．８　Ｘ　６．５　ｃｍで
あり、ゲル床は１４Ｘ１１ｃｍであり、電極間距離は３
１ｃｍであり、各白金電極（，２５ｍ径）はゲル床を横
切って９．５　ｃｍにある。ゲル床はプレキシガラスか
ら構成され得、０．９ｅの緩衝溶液を含む。２つの電極
は白金が好ましいけれども任意の非腐蝕性金属からなり
得る。

３ ＤＮＡフラグメントを含有する溶液混合物またはアガロ
ースプラグを装置のゲル床上に置く。使用する１つの溶
液は高温（約１００’ｃ）でバッファー中に溶解した少
なくとも０．２重量％のアガロースを含有する弱アガロ
ース溶液を含み６０”Ｃでゲル化が生ずるまで維持した
ゲルを含有する。アガロースの濃度は通常少なくとも０
．２％で２％を越えず、好ましい値は不実施態様におい
て０．８〜１．４％である。好ましいゲルはスウェーデ
ンウプスラのファルマシアＡＢ、モレキュラーバイオロ
ジ一部門から人手できるアガロースＮＡ、即ち、高純度
級ゲルである。ゲルは０．２〜２ｃｍの厚さを有し、好
ましいのは０．５　ｃｍの付近である。バッファーは０
．０８９Ｍのトリスペース（トリスペ−ス、セントルイ
スのシグマケミカル社）　、０．０８９Ｍのほう酸、お
よび０．００２ＭのＥＤＴＡ　（エチレンジニトロソテ
トラ酢酸二ナトリウム塩）を含むが、他の同様な等価の
バッファーも使用できる。

ＤＮＡフラグメントは任意の供給源より取得できる。本
発明方法によって分離したＤＮＡフラグ４ メントの例にはバクテリオファージ（Ｎ４、Ｔ２、Ｔ５
、Ａｅｈ−Ｕ、Ｇ、　Ｃｈａｒｏｎ２１−ａ＞　、酵母
株（サッカロミセスセレビシアＹＰ１４８およヒＳポー
ベ２４７６）、およびヒトおよびマウスＤＭＡの制限フ
ラグメントがある（約１〜約３．０００キロベースペア
のサイズ範囲）。１００〜２４００ｋｂｐＤＮＡフラグ
メントを有する酵母株ＹＰ１４８はカナダのケベック州
モンｌ−’Ｊオール（Ｈ４Ｐ２Ｒ２）（７）６１００ア
ベニユーロイヤルマウントのインスチチュトデリサーチ
スエンハイオテクノロジー社から入手した。イーストＳ
、ポーベ（Ｐｏｍｂｅ）　　２４７６はメリーランド州
ロックビル、パークラウンドライブ１２３０１のアメリ
カンタイプカルチャーコレクションより入手した。バク
テリアファージＮ４、Ａｅｈ−Ｉ［およびＧはカナダ、
ケベック州（ＧＩＫ　　７Ｐ４）のラベル大学微生物学
部Ｈ０Ｗ、　Ａｃｋｅｒｍａｎ氏より入手した。

バクテリオファージＴ２とＴ５はカナダ、モントリオー
ルのモントリオール大学微生物学部から人手した。ベセ
スダリサーチラボラトリーズライ５ フテクノロジー社より入手した小フラグメントは２．０
〜２３．１キロベースのサイズ範囲のλ−ＤＮＡ／ＨＩ
ＮＤ−１フラグメントからなっている（カタログ１１ｋ
１５６１２ＳＡ）。

ＤＮＡフラグメントはゲル中に液状サンプルまたはアガ
ロースプラグサンプルの形で負荷し得る。

通常、液状サンプルは１７０キロベースペアより小さい
フラグメント（λ−ＤＮＡ／ＨＩ　ＮＤ−１［１フラグ
メント、およびＮ４、Ｔ２、Ｔ５バクテリオファージゲ
ノム）用に用いる。酵母サンプルはＣ，Ｒ，Ｃａｎｔｏ
ｒおよびり、　　Ｃ１ＳｃｈＣ１５ｃｈによりＣｅ１ｌ
、　Ｖｏｌ、　３７．６７−７５　（１９８４）″に開
示された方法により調製した（該文献の記載はすべて参
考として本明細書に引用する。ヒト、マウス、Ａｅｈ−
ＵおよびＧフェースの各ＤＮＡはに、　Ｇａｒｄｉｎｅ
ｒ、　Ｗ、　Ｌａａｓ、およびり、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ
により“Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ。

Ｖｏｌ、１２．出２，１８５−１９５　（１９８６）に
記載された方法の修正方法により調製した（該文献の記
載もすべて参考として本明細書に引用す６ る）。

ゲル電気泳動装置を活性化させる電界は種々の適当な出
力源により発生させ得る。低電圧電気泳動用の時限出力
源は０〜±１００ボルトの電圧で１００−、リアンペア
を供給し得る自己収容型直流電力源として設計した。こ
の出力源は使用者が前述のＺＩＦＥ条件を選択できるソ
フトウェアを操作するマイクロコンピュータ−により駆
動させ得る。

適用した電界パルスの持続時間は、例えば、分離すべき
分子のサイズおよび生物学において必要な分離の種類に
従って選定する。考慮すべき他のファクターはバッファ
ー成分および濃度、温度、ポアサイズ（またはアガロー
ス濃度）、電界強度等である。前述したような電界は約
１／１０〜約１０．０００秒のパルス用に適用でき、逆
行パルスは平均でより長時間通用する。

電界パルスは何ら特定の形状に限定されない。

形状とは、例えば、電圧がパルスを適用しあるいは終ら
せたときにおいて増大する速さまたは勾配７ を意味する。電圧対時間のプロットは電界形状の既念を
示す。例えば、矩形電界は電圧が直ちに最適であると決
定した値に増大し、その値でパルスの全持続時間の間そ
のままである形である。そのような電界の電圧対時間の
プロットは第１図のように示される。

第１図は実施例１〜１０で使用するような矩形電界パル
スの電圧対時間のプロットを示す。電圧は約＋１０〜約
−１０ポル）　／　ｃｍの間の範囲であり得る。時間は
各パルスにおいて約０．　Ｌ〜約１０，０００の範囲で
あり得、逆行パルスはより長時間（１）で適用する。実
施例１〜１０においては、逆行パルスはｔ２／１ｌ−１
，４０でより長い持続時間を有していた。１回の完全サ
イクルでの総集積電界は約Ｏである。

総集積電界が約０である条件を満足させる他のパルス形
状もまた使用可能である。例えば、矩形パルスは極めて
短時間の零または逆電圧を含み得、バンド拡散の望まし
い削減を助長する（第２図参照）。第２図は実施例１１
で使用したパルス形状８ を図式的に示す。

第２図は実施例１１のＺＩＦＥ法用の図式的パルス形状
を示す。前向きおよび逆行パルス（それぞれ、持続時間
１．およびｔ２を有する）は電界が零である短時間のｔ
０２．の各々により分離された多くの持続部分ｔ。に分
割されていた。この短時間の緩和期間はメガベースＤＮ
Ａ分子により形成されたハンドの拡散を減少させまた装
置の冷却にも貢献する。電界はまた期間ｔ。Ｉｆ中に逆
行または簡単に低減できた。

電界形状は例記したものに限定されず；多くの他の形状
も使用可能である。電界の形状は実施すべき各分離毎に
選定してフラグメントの分離を最適にし得る。特定な形
状の電界は特定のＤＮＡ分離に応答性の上記顕微鏡的伸
縮法に他の電界形状よりも良好に合致し得る。

フラグメント分離は与えられたサイズのフラグメントの
各グループが電界を適用した時間中に如何に遠く移動し
たかの点で決定する。エチジウムの染料マーカーは前述
したように用いてゲル全体９ を染色できる。次いで、ゲルを紫外線で照射し、像を紫
外線感知カメラ（ＵＶトランスイルミネーター）により
カルホルニア州サンガブリエルのウルトラバイオレット
プロダクツ社より入手できる５５０ｎｍロングーパスフ
ィルターを用いて記録する。また、ジョイスーロベルデ
ンシトメータークロモスカン３モデルを用いてもゲル中
のバンドを追跡できる。

本発明のＤＮＡゲル電気泳動法を容易にするコンピュー
タープログラムを前述のように使用できる。このプログ
ラムは実験または工程が進行するときの最適実験パラメ
ーターの連続再計算を可能にする。さらに、そのような
プログラムはＺＩＦＢ計算を行う迅速手段を提供しまた
処理終了時に分離されたフラグメントのグループを同定
するもう１つの手段を提供し得る。

プログラムは使用者が次のことを行うように作製または
書き込みし得る： １、パルス形状、パルス持続時間と強度、処理時間、お
よびパルス条件を変えるべき時機の選択０ （実施例１１および付記を参照されたい）；および／ま
たは、 ２、最適実験条件（パルス形状、持続時間と強度、処理
時間、各パルス条件の数と重要性を包含するプロセス制
御パラメーター）を自動的に選定または計算する以前の
実験結果および／または理論的等式、与えられた分子サ
イズおよび所望する分離の種類を含む表の選択。

このプログラムは以前の実験結果の表を理論から得られ
た外的ポーレーションプロトコールと一緒に組合せても
使用できる。温度、バッファーおよびアガロース濃度の
ような標準の実験条件を用いることにより、そのプログ
ラムは最終結果の分析を簡単にしまたコンピュータープ
ログラムを自己習得性にする。

本発明のＺＩＦＥ法はコンピュータープログラムを使用
してＤＮＡゲル電気泳動のＺＩＦＥ法に従って出力源を
駆動させることによりより効果的に使用できるものと確
信している。ＺＩＦＥ法に適する実験条件はまた機械的
スイッチまたは他の■ 同様な簡単な装置によっても変化し得る。

また、本発明方法は、幾つかの実施態様において（実施
例１０参照）、出力源をＤＮＡゲル電気泳動のＺＩＦＥ
法に従って最終結果が予じめ選定した周囲の分子サイズ
に亘って移動性と分子サイズ間で直線関係を示すような
形で制御することによってより効果的に使用できるもの
と信じている。

また、このプログラムは出力源をＤＮＡゲル電気泳動の
ＺＩＦＥ法に従って最終結果が予しめ選定した範囲の分
子サイズに亘って移動性と分子サイズ間で対数関係（ま
たはその目的のための他の関係）を示すような形でも駆
動できる。このプログラムは本発明の１つの好ましい実
施態様において有用であろう。

実益斑 Ａ／Ｈ４ｎｄ−Ｉ［１（６，６，９，４，２３，１キロ
ヘースペアの各フラグメント）から、ＥｃｏＲＩ制限酵
素（アメリカンタイプカルチャーコレクション）による
Ｐ８０プラスミドＣｆｐｓ　／ｆｅｓの消化物（１４ｋ
ｂｐのフラグメント）から、カロン２１２ ファージ（４１，７ｋｂｐ）から、Ｔ５およびＴ２ファ
ージ（それぞれ、１２５および１７０ｋｂｐ）から、Ａ
ｅｈ−ＩＩファージ（２３０ｋｂｐ）から、イーストＹ
Ｐ−１４８（３６０，４６０，５４０，７００，１，６
００、および２．４００ｋｂｐ）から、Ｇ−ファージ（
７００ｋｂｐ　）　、およびイーストＳ、ポーベ（３，
０００，４，５００および６　、ＯＯＯｋｂｐ）からの
１８種のＤＮＡ分子を一連の９つの実施例において用い
て本発明のＺＩＦＥ法の広範囲の応用性と高解析力（サ
イズ的に近似する２つのＤＮＡ分子間の分離がその同定
を可能にするのに十分に大きいこと）を説明する。約１
１００ｎ／分子の量の上記１８種のＤＮＡ分子を０．０
８９Ｍのトリスヘース、０．０８９Ｍのほう酸および０
．００２ＭのＥＤＴ八を含むバッファー中の０．８％ア
ガロースゲルの９ケのゲル中に入れ、これらのサンプル
をモデルＨ３またはモデルＨ１電気泳動装置（共にベセ
スダリサーチラボラトリーズライフテクノロジース社か
ら入手でき、陰極および陽極を含む）に入れた。

装置の温度はいかなる冷却装置によっても制御し３ ないですべての実施例において２５℃付近にあった。ま
た、時間比は１／Ｒ，＝１．４０に固定し、電界は２．
６７〜０．７ボル）　／　ｃｍで変化させ、電界比はＲ
１−２，０〜２．５の範囲であった。上記電界の適用に
当っては、２つの出力源として、ファルマシアＬＫＢか
ら入手できる２つのモデルＧＰＥ２００／４００を用い
た。これらの出力源はワシントン州シアトルのサウンド
サイエンティフィック社により入手できるモデルＨイン
ターバロメーターに連結した。このモデルＨインターバ
ロメーターは次のようにパルス順序の２つの電界ＶＩ、
■２間の切換を可能にする。

＋ｙ、の電圧をＨｌおよびＨ３装置の各電極間で前向き
方向に１．秒の矩形パルス（第１図）で適用し、矩形パ
ルスの−Ｖ２の電圧（第１図）を逆方向にＶＩパルス間
で４２秒間適用した。この周期的順序を総持続時間６５
時間で繰返した。その後、出力源を断続した。９ケのゲ
ルすべてをＨｌおよびＨ３装置から取り出した。そのよ
うにして分離したＤＮＡ分子をその中に含む９ケのゲル
４ を得、次いで、これらのゲルを個々に臭化エチジウム染
料マーカー（バッファー中０．５μｇ／ｍＡ）で染色し
た。次に、各ゲルを紫外光で照射し、ＤＮＡフラグメン
トハンドの位置を紫外線感知カメラ（ＵＶＩ−ランスイ
ルミネーター）により５５０ｎｍロングーパスフィルタ
ーを用いて記録した。その結果は第１表の実施例１〜９
で示す。

表中、第１欄はＤＮＡサイズ（ｋｂｐでの）が用いたＤ
ＮＡ分子の分子サイズを示す。他の９ケの欄はこれらＤ
ＮＡ分子の各々のミリメーター（ｆｉ）での移動距離（
位置）を示す。Ｖ＋およびＶ２はＨ３またはＨｌの電気
泳動装置中の２つの電極間で適用した電圧を示し、ｈお
よびｔ２はパルス持続時間を示す。星印０は最高の解像
力を示した各実施例での分子サイズの範囲を示す。即ち
、実施例１での最高解像力は４１．７および７１ｋｂｐ
であった。

５ 第 表 ６ 第 ■ 表 ７ 第 ■ 表 ８ 第１表の星印（”ＸＸ”ａ間の数値は、前述したように
、各実施例において、最高分離または解像力が得られた
分子サイズの範囲を示す。第１表に示した結果から明ら
かなように、パルス接続時間および／または電圧を変化
させることが分離（または解像力）が最高である分子サ
イズの範囲を選定することを可能にしている。また、最
低移動性現象は全くまたは殆んど存在せず、即ち、各欄
において、移動距離が約０またはわずかに大きい４ｍｍ
、１ｍｍ、１ｍｍおよび３ｍｍ（実施例２参照）である
場合を除いて、大きい分子が小さい分子よりも遅い速度
で移動し、実質的に結果のない小さい最低移動性効果を
与えている。

他の同様な分離剤はゲル、バッファー、温度、ＤＮＡの
分子サイズ、ｖ、、、ｖ２．ｔ、、ｔ２等を変えること
により実施でき；各サイクルでのパルスの数（即ち、周
期的順序の電界パルスの周期）は前述したように２回以
上であり得る。

さらに、コンピュータープログラムは、例えば、主とし
て第１表の結果および本明細書で提示した９ 他の情報に基づいて書き込み得、このコンピュータープ
ログラムは、例えば、選定すべきパルス持続時間および
分離に使用すべき電界強度を包含するプロセス制御戦略
、例えば、同じゲル上での分子サイズの広い範囲を決定
する。次の実施例１０においては、対数分離をこの方法
で行った。

実施例１０ 実施例１の方法を繰返したが、２つのパルス持続時間ｔ
Ｉ＋　　ｔ２を第２表で示すように処理中に手動で６回
変化させた。次の第２表は６５時間で使用した矩形パル
スの６つの周期的順序の各々でのパルス持続時間１．と
ｔ２、およびこれら周期的順序の各々を使用した６５時
間のうちの割合（％での）を示す。

０ 実施例１０の方法でのパルス持続時間（第１欄）と総実
験時間での割合（第２欄） これらの条件は簡単なコンピューターアルゴリズムによ
って選択し２３〜２□４００キロベースヘア範囲の分子
サイズのＤＮＡ分子の６５時間実験終了時のＤＮＡ分子
サイズと移動性〔即ち、移動性”ｌｏｇ　　（分子サイ
ズ）〕間の対数関係を得た。

第２表中のパーセントはコンピューターアルゴリズム（
第４図参照）によって、第１表、実施例１〜４および次
の第３表のデータを含む糸線的実験からの結果を用いて
計算した。

２ 第２表のパーセントを計算するのに用いた実験データ。

第１欄においてはＤＮＡサイズ（ｋｂｐでの）が使用し
たＤＮＡの分子サイズを示している。他の２つの欄は２
３〜２，４００ｋｂｐ範囲のこれらＤＮＡ分子の各々が
移動した距離を示し、そのパルス条件は第１列に示され
ている。

このＺＩＦＥ電気泳動分離の結果は第４図に示す。

第３図においては、パルス条件を第２表に従って選定し
た実施例１０のＺＩＦＥ法の結果を示す。

ｙ軸はＤＮＡ分子が移動した距離を示し、ＤＮＡ分子の
サイズはそのキロベースペアでのサイズの対数（ベース
１０）でのＸ軸で示される。各点はおよそ直線的に落ち
込んでおり、第２表に示したプロセス制御が上記範囲の
分子サイズに亘って対数分離を与えており、従って、未
知ＤＮＡ分子の３ サイズ推定を可能にしている。

上述したように、ｙ軸は処理終了時のゲル上での分子の
位置（時間零での元の位置からのミリメーターで測定し
たとき）を示し、Ｘ軸は実験で用いたＤＮＡ分の分子サ
イズ（キロベースペアでの）の対数を示す。例えば、第
１点（最高の点）は２３．１キロベ一スベア分子（Ｘ軸
上ではｌｏｇ　１０（２３，１）＝１．３６と読む）が
６５時間の実験中に７４ｍｍの距離（ｙ軸よりこの距離
を読む）で移動したことを示す。

各点はおよそ直線状に落ち込み分子サイズと移動性間で
の対数関係を示している μ＝　ａ　＋　ｂ　ｘ　ｌｏｇ＋ｏ　（Ｍ）式中、ａお
よびｂは定数であり、１０ｇ＋ｏ　（Ｍ）はＤＮＡ分子
の分子サイズ（キロベースペアでの）の対数を示し、μ
は分子の移動性である。そのような関係は単一ゲル上で
の広範囲の分子サイズの分離を可能にしく上記では、２
３〜２，４００ｋｂｐ分子が単一実験で分離された）、
内部ポーレーションにより未知ＤＮＡのサイズ推定を容
易にしてい４ る。また、最低移動性効果は起らず、即ち、２つの分子
が同じ移動性を有していない（第３図参照）他のプロセ
ス制御プロトコールは他の目的、例えば、他のサイズ範
囲の分子を分離するためあるいは線状の移動性対分子サ
イズ関係を得るために当業者が容易に設計し得ることで
ある。

実施例１１ 次の点を除いて実施例１の方法を繰返した。パルス条件
はｔ、＝３００秒、ｔ２＝４２０秒、ＶＩ−８２ボルト
およびＶ２＝−２６ボルトであった。Ｈ３ゲルボックス
の電極間距離は３１ｃｍであり、Ｅ、＝２．６５ボルト
／Ｃｍ、、Ｅｚ　＝　　０．８３ボルト／ｃｔｒｌであ
った。Ｓ、ポーベ染色体（およその分子サイズ３，００
０．４，５００．６，０００キロベースペア）を第１図
で示すパルス形状によりさらにまたｔ。、、−１秒およ
びｔ　０ｔｒ＝　０．２５秒の第２図のパルス形状によ
り電気泳動させた。これらのパルス順序はゲルに対しＰ
Ｃ駆動出力源により適用した（後の付記参照）。

パルス形状が第１図に相応するところでは、す５ へてのＤＮＡはゲル上の元の位置とおよそ１５ｍｍに等
しい距離の間に位置した広いバンド（あるいはなすりつ
け状）中に存在した。パルス形状が第２図に相応すると
ころでは、即ち、短時間（０，２５秒）の零電界強度を
長時間電界パルス内ではさんだところでは、３つのバン
ドは各々２．５　ｍｍ程の幅を有して５．１２および１
８ｍｍの距離で形成した。

第２図に示すようなＺＩＦＥサイクルの両方の部分内の
上記零電界時間ｔ。１．のはさみ込みは写真上で同定す
るのに十分な狭いハンドを与えた。第２図の好ましいパ
ルス形状を有する短時間の零電界強度による上記処理条
件は３，０００．４．５００および６，０００キロベー
スペアのメガベース分子の分離を３日以内で過度のバン
ド拡散なしに、即ち、各バンドが次のバンドとオーハー
ラソブしないで可能にする。

さらに本発明方法に関しては、パルス、多重性、周期的
順序、強度、平均強度、周期等の用語および語句の意味
は本発明の主題に精通した者にとっては周知のことであ
る。しかしながら、これらの６ 用語および語句に関する次の情報は上記に拘束しないで
提供される。周期的順序のパルスとは、例えば、約１〜
約１００時間の長い持続時間で繰返す１群の連続パルス
例えば約２〜１００パルスを称する。各パルスはその固
有の強度、極性および持続時間を有し、その順序は２以
上の異なるパルスを含む。すべての順序を適用したのち
、繰返す（周期的に）。１つの順序を多数回または長い
持続時間で繰返したのち、その順序は他のパルスセント
を含みこのセットもまた多数回または長い持続時間で繰
返し得る異なる順序と交換し得る。順序の周期とはその
順序のパルスを終了させるのにかかる総時間を称す。電
界パルスの多重性は各順序が２以上のパルスを含み得る
ことを示し；負および正電界極性は各パルスが電界極性
を有することを示す。正極性とはＤＮＡまたは他の分子
のゲル中での正味移動方向を称し、負極性は逆方向を称
す、即ち、負極性はＤＮＡまたは他の分子のゲル中での
正味移動の逆方向を称する。各順序または周期は少なく
とも１つの正極性および１つの負７ 極性パルスを含む。パルス順序の平均電界強度とはゲル
の不存在下での等ＤＮＡ移動を等える電界強度を称し；
１つの順序のパルスにおいては、平均電界強度はその順
序の零でない強度のパルスのみを考慮してパルス強度を
パルス持続時間を掛けた積の総計をパルス持続時間で割
ったものとして算出し；零強度パルスは存在し得るが、
これらは平均強度計算に使用する必要はない。ＺＩＦＥ
、即ち、本発明方法においては、前向き方向の平均電界
強度は逆方向の平均電界強度よるも多きい；しかしなが
ら、逆行パルスはより長持続時間で適用するので、１つ
の完全周期での平均電界強度はおよそ零である。理論に
拘束することは望まないけれども、これらの特徴を有す
るパルス形状はいずれもゲル中のＤＮＡまたは他の同様
な分子を分離するのに使用できるものと信している。

平均電界強度の計算に関しては、次の非限定的な例を提
示する： （１）各周期内に１つの正極性パルスと１つの負極性パ
ルスが存在する場合。正極性パルスが千２８ ポル）７ｃｍの電界強度と２０秒の持続時間を有し、負
極性パルスが一１ポル）７ｃｍの電界強度と４０秒の持
続時間を有する場合、平均正極性電界強度は＋２ポル）
７ｃｍであり、平均負極性電界強度は−１ボルト／ｃｍ
である。それで、全体の平均電界強度は、 （（＋２）　Ｘ　（２０）＋　（−１）　ｘ　４０）　
）　／　（２０＋４０）＝０ボルト／ｃｍであり、式中
、分子は電界×持続時間の積の総和を含み、分母は上述
したように持続時間の総計のみを含む。

（２）各周期内に２つの正極性パルスと２つの負極性パ
ルスを含み、各パルスが次のとおりである場合： ２０秒間で＋４ボルト／ｃｍ ３０秒間で＋３ボルト／ｃｍ ４０秒間で−２ボルト／ｃｍ ９０秒間で−１ボルト／ｃｍ 平均正極性電界強度は、次の如くである：（（＋４）　
Ｘ　（２０）＋（＋３）　Ｘ　（３０））　／　（２０
＋３０３　＝＋１７１５ボルト／ｃｍ　−＋３．４ボル
ト／ｃｍ９ 平均負極性電界強度は、次のとおりである：〔（−２）
　Ｘ　（４０）＋（−１）　Ｘ　（９０）　：］　／　
［：４０＋９０〕＝１７／１３　ボルト／ｃｍ　＝−１
，３１ボルト／ｃｍそれで、全体の平均電界強度は、 ［：（＋４）Ｘ　（２０）＋（＋３）Ｘ　（３０）＋（
−２）Ｘ　（４０）＋（−１）Ｘ（９０））／　　Ｃ２
０＋３０＋４０＋９０）　　＝　　０である。

負極性パルスは正極性パルスよりも長い総持続時間で適
用し、負極性パルスの持続時間の総計も正極性パルスの
持続時間の総計よりも大きいものとする。零電界強度は
存在するとき任意の持続時間を有し得る。

付記 本発明のパルス型電界ゲル電気泳動に柔軟性を与えるた
めに、ゲルに適用する電界のプログラム可能な制御をこ
れら適用した電界により誘起した条件のいくつかをモニ
ターしながら提供するシステムを開発し使用した。この
システムは基本プロセンサー制御パラメーターおよび特
定書き込みプログラム、ＧＥＬＰＨＯＲ用のＭＳ−ＤＯ
３摸作０ システムを操作して最終制御機能を励起し操作条件のい
くつかを記録するマイクロプロセンサーがらなっている
（第５図参照）。

■、ハードウェア 使用装置は６４０ｋｂメモリー、フロッピーディスクド
ライブ、２０Ｍｂ固定ディスク、高解像力グラフィック
デイスプレーカード、直列および並列ポート、クロック
、高解像カモツクロムモニターおよびドツトマトリック
スプリンターで構成された一般的機能のＩＢＭ−ＸＴで
あった。

このハードウェアはストロベリーツリー社より供給され
たＡ／ＤおよびＤ／Ａボードを用いて制御およびモニタ
ー工程を満足させる。プローブは溶液中の温度および電
界をモニターするために用い、低値抵抗体はゲルコント
ローラーの回路中に含ませて電流をモニターする。

コントローラーは各ゲルトレイ用の出力源および測定用
の信号コンディショナーであった。そのユニットは４ケ
のトレイ、即ち、４ケの電気泳動装置へ出力を供給可能
であるが、実施例１１にお１ いては、Ｈ３電気泳動ゲル装置（ゲル実験１）即ち１ケ
のトレイを正および負の両方向において９０ポルトで０
．１アンペアの最大電流（直流）で用いた。各信号はゲ
ルプローブから受は入れ適当な値にほん訳してアナログ
−デジタルコンバーターボードに戻した。このボードは
１６のチャンネルを１２の２成分ビット（４０９６中の
１部）の精度にモニターできる。第５図は４ケのトレイ
を制御するようセットアツプした装置を略図的に示す。

プローブは電解質中の電圧降下を測定するための２つの
白金電極を収容しているプレキシガラスハウジングと選
定したパルス条件下での温度上昇をモニターするための
ガラスケース入り白金抵抗素子とからなる。プローブを
ゲル中に挿入するのに用いた方法は負（ブラック）電圧
ター旦ナルに最も近いゲルの末端部上のゲルボックスカ
バーに５７８インチ（１，５９ｃｍ）径の穴を開けるこ
とであった。

２、ソフトウェア ２ プログラムゲルホア プログラムゲルホア（Ｇｅｌｐｈｏｒ）の方法およびデ
イスプレーは一部１組の機能説明書に基づく。このプロ
グラムは４ケの別々のトレイ上で同時に異なる実験を行
うことを可能にする。各実験開始はこのプログラム自体
が使用者を導びく簡単な方法であった。先ず、パルスお
よびパルスをプログラムに如何に記載するかを構成した
。

パルスバ一連の持続時間（秒での）としての１つのサイ
クルで形成された電圧の周期的順序であり、その電圧は
その持続時間中トレイ電極へ適用される。例えば、＋５
０ボルトと−５０ボルト間で３０秒毎に交互変化する単
純矩形波を適用したいときには（実施例１１においては
、■、は８２ポルトであり、Ｖ２は一２６ボルトであり
、時間は実施例１１に示したとおりである）、リスト３
０　５０　３０−５０として特定化されているであろう
。最初の３０は５ｏボルトを適用すべき持続時間であり
、次の３０は一５０ボルトを適用すべき持続時間である
。プログラムはこの順序を３ 上記で特定した時間長に亘って繰返す。時間と電圧は１
０進法数である。各数は他の数から１ケ以上のスペース
で離れていなければならない。パルスを特定化する（コ
ンピューターメモリーの明確なサイズに供する）のに使
用できる持続時間−電圧対の数に特別な制限はなく、１
００ケの持続時間−電圧対を有するパルスも実施可能で
ある。１／１０秒毎に変化する電圧を有するのこぎり歯
状パルスは次の如く記載できるであろう：０．１００．
１　５　０．１　１０　０．１　１５　０．１　２０゜
これは０ボルトで１／１０秒、５ボルトで１／１０秒、
ＩＯボルトで１７１０秒、・・・・のように遮断されて
いる。これらの２例はすべての持続時間が同じであるの
を示すが、０．０１秒から約１年までの任意の値であり
得る。

プログラムガルホアは使用者が記載する時限順序で電気
泳動トレイの各々に対し１０ケの異なるパルスを与える
。

個々のパルス書込みを前述したフォーマントに正確にテ
キストキャラクタ−として時間−電圧対４ のリストを含む名称付したファイルに保存する。

そのようなファイルを手でマークするのは簡単であるが
（プログラムガルホアは使用者をプロセスに導びくの利
便性を含んでいる）、実施例１１で使用しなかった複雑
なパルス形状は論理的予測に基づく他のプログラムによ
って形威し得る。パルスファイルは任意の名称を有し得
るがディスクオペレーションシステム（ＤＯ３）フォー
マットに適合すべきであり、このフォーマント８つまで
のキャラクタ−長次いで１つの周期さらに３つのキャラ
クタ−エクステンションの名称である。ガルホアはエク
ステンションＰＬＳ　（パルスの短縮形）を有するファ
イルのみを認識し、従って、例えば、前述したような矩
形パルス、５ＱＵＡＲＥ、ＰＬＳおよびのこぎり歯ＳＡ
Ｗ、ＰＬＳを認め得る。パルスプロフィルの代表的なも
のを第６図に示す。

パルスをプログラム利便性により形成する場合、このエ
クステンションでタイプする必要はなく、ファイルをデ
ィスクに保存したとき自動的に加えられるであろう。

５ プログラムガルホアを開始する場合、使用者は上部にタ
イトルを有するスクリーン（これは上部スクリーンと称
する）とトレイ１〜トレイ４と標示した４つの長方形ボ
ックス（実施例１１では１つのトレイまたはＨ３装置の
みを用いた）が与えられる。各ボックスの内側には、各
トレイで行う実験についての幾つかの情報がある。シス
テムを先ずオンしたとき、これらボックスの各々はその
トレイが不活性であることを指示し、使用者がファンク
ションキーを押して開始するよう案内する。

ファンクションキーＦ１〜ＦＩＧはキーボードの左手側
にある。キーＦ１〜Ｆ４を押して実験を開始したとき、
ガルホアはフロッピーディスクがドライブ゛Ａ′”の内
に存在するか次いでディスク上にＰＬＳで終るファイル
があるかどうかを探る。

次いでその通路がＣ：＼Ｄ　Ｎ　Ａ　’ｚ　Ｐ　Ｕ　Ｌ
　Ｓ　Ｅであるデレクトリー上のハードディスク　（ド
ライブＣ）上で、Ｐ　Ｌ　Ｓファイルをもっと探す。、
ＰＬＳファイルが見い出し得なかった場合、使用者はフ
ァイルを作製することを進めるかどうか求められる。こ
６ の質問に対する間違った回答は“はい゛のＹである。パ
ルスファイルの作製を進めるのを決定する場合、使用者
は処理案内として機能する１連のスクリーンが与えられ
る。

ガルホアが１つ以上の実在するパルスファイルを探り出
した場合、見い出した最初の４８まではスクリーンの左
手側にデイスプレーされる。次いで、使用者は実験で操
作すべき１０までを選択するよう案内される。選択法は
上下矢印キーを用いて所望のパルスを際立せスペースバ
ーを押して際立せた名称をスクリーン右手の選択ボック
スにコピーする。この加工の任意の時点で、Ｍキーを押
してキーボードパルスエントリー手順を呼び出し使用者
に選択ボックスに挿入すべき他のファイルを作製せしめ
る。パルス選択中にエラーが生じた場合、Ｒを押して処
理を再開する。Ｆを押すと選択処理は終了し計画用スク
リーンに移る。

ガルホアは使用者にパルスの各々の出発時間をセットす
るオプション１または持続時間を特定化するオプション
２を選択させる。第３のオプショ７ ンは使用者にパルススケジュールを選択する順序で再整
理させることである。これらオプションの各々によって
現われるスクリーンは自己脱性的である。１つのパルス
順序だけを実施例１１では使用した。

次に使用者はガルホアが使用する実験の名称を明記して
重要な情報の保存ファイルを維持することが求められ、
最後には、使用者は実験を進めることを望むかの確認を
求められる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明方法の１つの実施態様において用いた典
型的なパルス形状のグラフ図である。近零集積電界を得
る条件を満足する他のパルス形状も受は入れ可能である
。 第２図は実施例１１で用いた交互パルス形状である。 第３図は実施例１０の初期混合物中に存在するＤＮＡフ
ラグメントの各グループ（Ｘ軸上での分子サイズの対数
として）がゲル中で移動した距離（６５時間移動当りの
ｍｍ）についての実験結果を８ 示す。 第４図は実施例１０で使用したコンピューターアルゴリ
ズムプログラムのブロックダイヤグラムである。 第５図は本発明方法で使用するゲル電気泳動制御装置の
レイアウトを示す。 第６図は本発明で使用するパルス形状のさらに別の態様
を示す。 第７図は本発明方法のゲル電気泳動法の制御プログラム
のブロックダイヤグラムである。 ９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、荷電マクロ分子に各周期が負極性および正極性の多
   重性電界パルスを含む周期的順序のパルスを適用するこ
   とを含み、負極性パルスは各周期において正極性パルス
   よりも長い総持続時間で適用し、負極性パルスの平均強
   度は正極性パルスの平均強度よりも小さいことを特徴と
   する荷電マクロ分子の電気泳動分離方法。 ２、電気泳動装置内に含まれた荷電マクロ分子に各周期
   が第１電界のパルスと第２電界のパルスを含む周期的順
   序のパルスを繰返し適用することを含み、これらの電界
   は反対極性を有しかつ一方向性または単一寸法に沿って
   おり、第２電界は第１電界よりも低強度を有しており、
   第２電界は各周期において第１電界よりも長持続時間で
   適用することを特徴とする荷電マクロ分子の分離方法。 ３、（１）電気泳動装置を用意すること；（２）この装
   置に異なる長さのＤＮＡフラグメントを含有する溶液混
   合物、または異なる長さのＤＮＡフラグメントを含有す
   るアガロースプラグを含むゲルを加えること；（３）こ
   の装置を活性化し、それによって装置内に一方向性の均
   一な電界パルスの順序を形成させること、この電界パル
   スの順序は一次正電圧パルスとこの一次パルスよりも低
   電圧を有する負極性の二次パルスとの間で交互変化する
   こと；（４）上記一次および二次電界パルスが上記各フ
   ラグメントのその長さに相応する別々の個々のグループ
   への分割を行うのに必要な持続時間と電界強度を推定す
   ること；および（５）装置内に分離すべき各フラグメン
   トのサイズに相応する強度と持続時間を有する選定した
   一次および二次電界を適用すること、第２電界パルスは
   第１電界パルスよりも長持続時間を有することを特徴と
   するＤＮＡフラグメントまたは分子混合物の分離方法。 ４、（１）電気泳動装置を用意すること；（２）この装
   置に異なる長さのＤＮＡフラグメントを含有する溶液混
   合物または異なる長さのＤＮＡフラグメントを含有する
   アガロースプラグを含むゲルを加えること；（３）この
   装置を活性化し、それによって装置内に周期的順序の一
   方向性の均一な電界パルスを形成させること、この電界
   パルスの順序は一次正電圧パルスとこの一次パルスより
   も低電圧を有する負極性の二次パルスとの間で交互変化
   すること；（４）上記一次および二次電界パルスの持続
   時間および電界強度を推定すること、上記条件を分離中
   に変化させて各フラグメントのその長さに相応する別々
   の個々のグループへの分割を行う時間をこれらフラグメ
   ントの最終位置とサイズ間の所定の関係によって推定す
   ること；および（５）装置内に分離すべき各フラグメン
   トのサイズに相応する強度と持続時間を有する選定した
   一次および二次電界を適用すること、第２電界は各順序
   のパルスにおいて第１電界よりも長持続時間で適用する
   ことを特徴とするＤＮＡフラグメントまたは分子混合物
   の分離方法。 ５、（１）電気泳動装置を用意すること；（２）この装
   置に異なる長さのＤＮＡフラグメントを含有する溶液混
   合物または異なる長さのＤＮＡフラグメントを含有する
   アガロースプラグを含むゲルを加えること；（３）この
   装置を活性化しそれによって装置内に周期的順序の一方
   向性の均一な電界パルスを形成させること、この電界パ
   ルスの順序は一次正極性パルスと一次負極性パルスを含
   み、周期の第１部分は零強度および／または負極性電界
   の短時間二次パルスにより多くのサブパルスに分割され
   た一次正極性パルスを含み、第２部分は零強度および／
   または正極性電界の短時間二次パルスにより多くのサブ
   パルスに分割された一次負極性パルスを含み、一次負極
   性パルスは一次正極性パルスよりも低電圧を有し、周期
   の第２部分は第１部分よりも長持続時間を有すること；
   （４）上記の種々のパルスが各フラグメントのその長さ
   に相応する別々の個々のグループへの分割を可能にする
   持続時間と電界時間を推定すること、および装置内に分
   離すべき各フラグメントのサイズに相応する強度と持続
   時間を有する選定した順序の電界を適用することを特徴
   とするＤＮＡフラグメントまたは分子混合物の分離方法
   。