JPH03400B2

JPH03400B2 -

Info

Publication number: JPH03400B2
Application number: JP1139089A
Authority: JP
Inventors: Makoto Tamura; Toshi Murai; Kyoshi Ito; Chikanori Tomioka
Original assignee: Kaken Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Kaken Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1980-10-11
Filing date: 1989-06-02
Publication date: 1991-01-07
Also published as: JPH02218698A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、インシユリン分泌増強活性因子の構
成成分である新規な蛋白性要素物質に係るもので
ある。更に詳しくは、ボルデテラ属に属する微生
物の菌体及び倍養上清中にインシユリン分泌を促
進し且つ、血糖値を正常に維持調整する薬理効果
を有する成分、すなわちボルデテラ属産生インシ
ユリン分泌増強活性物質（以下、Ｎ−IAPと略称
す。）の副作用を軽減した新規な蛋白性要素物質
に係るものである。糖尿病薬であるＮ−IAPは、その特徴的なイン
シユリン分泌の促進及び血糖値を正常に維持調整
する薬理作用と併せて、高分子蛋白質であるが故
に、Ｎ−IAPを投与した時に発現する抗体産生に
より、Ｎ−IAPを再び投与すると、アナフイラキ
シを誘発するという問題点を有している。すなわ
ち、糖尿病の治療及び予防に有効であるインシユ
リン分泌増強活性以外の副作用の除去、特にアナ
フラキシが抑制されたより安全な医薬品の提供が
望まれている。本発明者等は鋭意研究の結果、Ｎ−IAPを、高
濃度の尿素水溶液を用いて解離をおこなうことに
より新規な蛋白性要素物質を単離・同定すること
に成功した。この単離・同定された新規な蛋白性
要素物質はそれぞれ単独では、インシユリン分泌
増強作用は不活性であるが、この蛋白性要素物質
をそれぞれ別途に投与すると、驚くべきことに
IAPを投与したときと同等のインシユリン分泌促
進作用及び血糖値を正常に維持調整する作用を有
し、更に、Ｎ−IAPの投与したときに発現する抗
体産生により、Ｎ−IAPを再投与するとアナフイ
ラキシを誘発する欠点が著しく軽減することが判
明した。すなわち、単独では、糖尿病の治療及び
予防に有効であるインシユリン分泌増強作用は不
活性であるが、それぞれを別途に投与することに
よりインシユリン分泌増強活性を有し、しかも副
作用を大幅に減弱した新規な蛋白性要素物質の分
離・同定を達成したものである。以下本発明の構成について説明する。インシユリン分泌増強活性物質本発明に於ける出発物質であるインシユリン分
泌増強活性物質（以下、“Ｎ−IAP”と略称する）
は、病原性菌として公知のボルデテラ属に属する
微生物（百日咳菌、パラ百日咳菌、気管支敗血症
菌）、特に好ましくは百日核相菌（Bordetella
pertussis phase ）を固形培地や液体培地に
て培養し、その菌体しくは培地から採取、精製し
て得られる蛋白性物質である。菌体ならびに培養物からＮ−IAPの有利な採取
および精製は、溶解度法、クロマトグラフイー
法、分子篩法、電気泳動法および生物学的方法の
一つ又は、これ等の方法の組合せなど、当該分野
で汎用の多くの分別精製方法により達成され得、
従つて本発明は特定の採取精製法に何等限定され
るものではない。Ｎ−IAPの極めて有利な採取精製方法の１例と
して、カラムクロマトグラフイー的手段を提示し
得る。この場合、微生物の培養上清液は、ハイド
ロキシアパタイト（生化学工業(株)製）、カルボキ
シメチルセフアロースCL−6B（フアルマシア・
フアイン・ケミカルズ社製）の充填材より成るカ
ラムを通し次いで、セフアクリルＳ−200（フアル
マシン・フアインケミカルズ社製）を用いるゲル
ろ過法により精製されるＮ−IAPはこれらのカラ
ムに極めて選択的に吸着され、次いで0.5M
NaCl含有の0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）等の適切
に選定された溶出液に溶離されて精製物を与え
る。この精製物に透析操作を適宜施こすことによ
り、不要な塩類が除去されて高活性のＮ−IAPが
得られる。又、Ｎ−IAPは菌体内にも存在するの
で、所望の場合には、例えば菌体浮遊液にNaCl
を添加して菌体内Ｎ−IAPを溶液中に浸出せしめ
る手段などを採用してもよい。Ｎ−IAPを産生するボルデテラ属の微生物は、
前記の通り百日核菌、パラ百日核菌及び気管支敗
血症菌として周知であるが、他方、これらの病源
菌を、培地組成の変更、紫外線、Ｘ線等の各種放
射線照射又は変異誘起剤の適用等の慣用の各種手
段で変異せしめて得られる変異株も又、Ｎ−IAP
産生菌として有用である。培養方法としては、液体振盪培養方法が活性及
び収率の点で好ましいが、他の方法によることも
妨げない。なお、ボルデテラ属に属する別生物の菌学的性
質、培養条件等はBergy′s Manual of
Deteminative Bacteriology第８版1974年
Baltimore：The Williams ＆ Willkns CO.，
J.Exp・Med.129；523〜550（1969）、細菌学実習
提要：第３版第６頁以下、昭和47年（丸善(株)発
行）、等に記載されている。次に、Ｎ−IAPの各種物性に付き詳述する。存
在状態及び溶解特性：脱塩後、凍結乾燥して得られる粉末は、非潮解
性白色または淡褐色粉末であり、約３〜５mg／ml
までは室温で水に溶解、6NHCl中では不溶性白
沈を生じ、ピリジン、ドデシル硫酸ナトリウム、
メルカプトエタノール、システイン溶液に溶解す
る。冷時（４℃）、精製活性物質の溶液に硫安、
ドライアイス・アセトンあるいはエタノール、ト
リクロル酢酸、塩化亜鉛溶液及びその他の数種の
金属イオンを含む溶液等の添加により、各々白
濁、沈澱を生ずる。水とクロロホルムあるいはｎ
−ブタノール混合液では不溶性となり両液の界面
に集まる。Ｎ−IAPの水溶液を80℃以上に加温すると白濁
する。0.5MNaCl含有0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）
に対し本Ｎ−IAPを溶解し、次いで蒸留水を外液
として透析すると、一時白濁するが透析の続行に
より完全に再溶液し、白濁は消失する。また、高
濃度溶液では0.01M酢酸緩衝液（PH4.5）に対し、
撤底的に透析すると淡褐色に着色して溶解するこ
ともある。分子量： 10〜30％の密度匂配のアクリルアミドゲル37：
１の架橋比で、濃縮ゲルのPHが6.8、泳動ゲルの
PHが8.8、泳動電圧：90Vで16時間泳動する平板
法SDS−ポリアクリルアミド−デイスク電気泳動
法（ラムリー法）で処理した後、20％TCAで１
時間処理し、次いでクマージーブルーで染色す
る。尚蛋白質のSDS化を１％SDSで100℃５分間
処理する。SDS−ゲル電気泳動法によるＮ−IAP
の分子量は105700±5000である。組成： Lowry法による蛋白質98重量％以上ある。尚、
各成分の測定方法は下記各文献に依つた。蛋白質 Lowry，O.H.，N.J.Rosebrough，A.L.Farr，
and R.J.Randall. J.Biol.Chem.193：265 1951蛋白質成分のアミ
ノ酸組成及び組成比（μM／100μM；6NHClで
110℃、24時間加水分解、日立−835高速アミノ酸
分析器にて分析）：アスパラギン酸（Asp）7.5〜7.9、スレオニン
（Thr）6.8〜7.8、セリン（Ser）5.9〜7.6、グルタ
ミン酸（Glu）8.8〜9.4、プロリン（Pro）5.5〜
6.4、グリシン（Gly）8.7〜9.6、アラニン（Ala）
9.1〜10.8、シスチン／２（Cys／２）1.0〜2.0、バ
リン（Val）6.6〜7.6、メチオニン（Met）2.5〜
3.3、イソロイシン（Ile）3.6〜4.1、ロイシン
（Leu）7.5〜8.7、チロシン（Tyr）5.1〜6.6、フ
エニルアラニン（Phe）3.7〜4.5、リジン（Lys）
3.1〜4.4、ヒスチジン（His）0.9〜1.4、アルギニ
ン（Arg）6.1〜6.6であつた。等電点PH（ポリア
クリルアミドゲル等電点電気泳動法により泳動
し、種々の標準蛋白との泳動パターンと比較測
定）：9.3±0.2 デイスク電気泳動パターン：アクリルアミドゲル（ポリアクリルアミド濃度
7.5％、1NKOH−泳酢酸緩衝液（PH4.3））、試料
30μｇ、通電4mA、２時間／ゲル１本、アミドブ
ラツク10Bによる染色、７％酢酸溶液による脱色
の条件下でのデイスク電気泳動において、距離
（スペーサ・ゲル先端を基準として）2.3±0.2cm
の位置に極めて先鋭な単一のバンドを与える。生物学的性質：哺乳動物に対しインシユリン分泌増強作用及び
耐糖能良化作用を有し、これらの作用は１回の投
与で数週間乃至数ケ月にわたつて持続する。急性
毒性（LD₅₀）はddy系マウス（静注）で約
200μg／Kg体重である。要素物質１前記Ｎ−IAPは、5M尿素の蛋白変性剤の共
存下、カラムクロマトグラフ法等により分別さ
れて２種の要素物質に分離されることが確認さ
れた。要素物質の有利な単離精製法の１例として、
5M尿素存在下に於けるイオン交換法を提示し
得る。即わち、Ｎ−IAPを３〜5M、好しくは４〜
5M尿素存在下PH5.4−6.8好しくはPH5.8−6.5の
リン酸緩衝液で12時間−96時間、好しくは24時
間−48時間インキユベイトし、前記リン酸緩衝
液によつて平衡化したCM−セフアロースカ
ラムクロマトグラフにて分離・精製を行な
う。その結果、Ｎ−IAPは分子量の異なる二種
の要素物質（以下、分子量の大きい順に蛋白性
要素物質CP−Ａ及びPs−１とそれぞれ命名す
る）に分離され、これらの要素物質は同一カラ
ムによる再ゲルろ過により、デイスク電気泳動
的に単一な物質として得られる。このようにして得られた要素物質Ps−１は
単独では、インシユリン分泌増強活性を示さな
い。またPs−１は酸性蛋白質であることが確
認された。２要素物質Ps−１は単独では殆んど目的とす
るインシユリン分泌増強活性を示さない。すな
わちインシユリン分泌増強不活性であるが、要
素物質Ps−１をもう一つの要素物質CP−Ａと
in vitroで混合するとＮ−IAPを再構成し、更
にPs−１とCP−Ａとを別々に投与、例えばCP
−Ａを3μｇ／rat当り右股関節よりIVで投与
し、８時間経過後Ps−１を左股関節静脈より
投与すると、Ｎ−IAPと同等のインシユリン分
泌増強活性が発現し、しかも前記Ｎ−IAPを投
与したときに発現する抗体産生が著しく減少
し、Ｎ−IAPを再投与すると誘発されるアナフ
イラキシの発生が著しく低減されることが判明
した。３要素物質の物性： Ps−１分子量：SDS−ゲル電気泳動法 28000±1200 等電点：PH5.8 アミノ酸分析 ASp.9.3±1.0，Thr.7.4±0.8，Ser.10.6±1.0，
Glu.10.6±1.0，Pro.4.4±0.5，Gly.11.2±1.0，
Ala.10.6±1.0，Cys／２ 1.3±0.3，Val.6.7±
0.7，Met.1.6±0.3，Ile.3.2±0.4，Leu.5.5±0.6，
Tyr.4.6±0.5，Phe.3.5±0.4，Lys.2.2±0.3，
His.1.7±0.3，Arg.5.9±0.6 組成： Lowry法による蛋白質98重量％以上 CP−Ａ分子量：SDS−ゲル電気泳動法 75000±5000 塩基性蛋白質アミノ酸分析： Asp.6.4±0.7，Thr.7.3±0.8，Ser.8.2±0.9，
Glu.9.3±1.0，Pro.6.3±0.7，Gly.11.±1.0，
Ala.9.0±0.9，Cys／２ 1.2±0.3，Val.6.2±0.6，
Met.2.7±0.4，Ile.3.4±0.4，Leu.8.4±0.9，
Tyr.5.6±0.6，Phe.3.6±0.5，Lys.4.7±0.5，
His.1.1±0.3，Arg.4.9±0.5 組成： Lowry法による蛋白質98重量％以上実施例Ｎ−IAPの製造及び精製１百日咳相菌前野株IID513 （Bordetella pertussis phase Ｉ，Maeno
StrainIID 513）の凍結乾燥保存菌株（北里大薬
学部微生物学教室捉供）をBordet−Gengou平板
培地で37℃、２日間培養後、下記第１表に組成を
示すイオン交換樹脂加Cohen−Wheelerの変法培
地（CW培地）200mlを分注した500mlの振盪コル
ベンに１白金耳接種し、37℃、20〜22時間振盪培
養した。この培養液の菌量を、分光光度計（波長
650nm）で測定し、加えた時の菌量が最終濃度約
0.1×10⁹個／mlとなるように、イオン交換樹脂加
CW培地１を分注した２の振盪コルベンに加
え、37℃、48時間振盪培養（振盪回数97回／分）
を行つた。尚、上記菌株の菌学的性質は、先にあげた百日
咳Ｉ相菌に関する文献の記載と一致した。第１表 Cohen−Wheelerの変法培地組成カザミノ酸 1.0ｇ酵母エキス１ｇリン酸二水素カリウム 0.5ｇ可溶性濃粉２ｇ 0.5％硫酸銅液１ml １％塩化カルシウム液１ml ４％塩化マグネシウム液１ml ポリペプトン５ｇ１％シスチン液 2.5ml 0.5％硫酸鉄液１ml 塩化ナトリウム 2.5ｇ（蒸留水を加えた総量1000mlとし、20％NaOH
水溶液でPH7.2に調整後、陰イオン交換樹脂（ダ
イヤイオンSA−20AP；三菱化成(株)製）３ｇを加
え、121℃で15分間、高圧蒸気滅菌して使用に供
した。）得られた48時間振盪培養液を、56℃で30分間加
温した後、４℃で遠心分離（15000rpm）して培
養上清液と菌体とに分離した。得られた培養清液
をＮ−IAPの精製単離のための出発材料とした。 10の培養上清液を1N塩酸でPH6.0に調整後、
第１精製工程としてハイドロキシアパタイトカラ
ム（2.5×４cm）に流速200ml／時間で流した。大部分の蛋白質は吸着されずそのままカラムを
通過し、目的とするインシユリン分泌増強活性
（後記活性測定法参照）も殆んど検知されなかつ
た。尚、蛋白質濃度の測定は後記第２表註記の
Lowryの方法による。その後、吸着された物質についてはまず0.01M
リン酸緩衝液（PH6.0）でカラムを洗い、次いで
リン酸緩衝液のモル濃度を0.1にPHを7.0に夫々上
げて吸着された蛋白質を順次溶出する。しかし目
的のＮ−IAPはまだこの条件では溶出されず；更
に同じ条件のリン酸緩衝液に0.5MのNaClを含む
同組成のリン酸緩衝液で溶出した。この条件で溶
出された蛋白質に一致して目的Ｎ−IAPを効率よ
く回収することができた。得られた粗Ｎ−IAPを濃縮し、ついで透過分子
量限界8000の透析膜（Thomas社製Cat.No.3787−
F25）に入れた後蒸留水に対して２回（計12時
間）0.01Mリン酸緩衝液（PH6.0）に対して２回
（計12時間）夫々透析した。更に精製を進める為
に、上記透析後のＮ−IAPを含む溶液を0.01Mリ
ン酸緩衝液（PH6.0）で平衡化されたカルボキシ
メチルセフアロースCL−6Bカラム（1.5×10cm）
に通した。このカラムに吸着されない物質には全
く活性は存在しなかつたが、次いでリン酸緩衝液
のモル濃度を0.1にPHを7.0に上げ、更に食塩0.5M
を加えた溶出液で溶出してＮ−IAPを得た。この部分は、デイスク電気泳動法的には未だわ
ずかな不純物を含むため、このＮ−IAPを含む溶
液を濃縮し、セフアクリルＳ−200によりゲルろ
過法をおこなう。以上の精製工程によつて精製されたＮ−IAPの
活性の回収率、精製度等は第２表に示す通りであ
る。

【表】上記最終工程で得られた物質の純度をポリアク
リルアミドゲル（ポリアクリルミド濃度7.5％，
1N KOH−氷酢酸緩衝液（PH4.3））デイスク電
気泳動法によつて検定した。実験方法は、J.V.Maizel，Jrの方法
（Biochem，Biophys.Res.Comm.1963，13483）
によつた。尚、ゲル１本当りの試料は30Kg（蛋白質とし
て）、通電は4mAで２時間、染色はアミド・ブラ
ツク10B、脱色は７％酢酸溶液による。 −２百日咳Ｉ相菌東浜株IID 510 （Bordetella Pertussis phaseI，Tohama
Strain IID 510）の凍結乾燥保存菌株（北里大学
薬学部微生物学教室提供）を用いて、実施例Ｉ−
１と同様の方法にてＮ−IAPを生成した。本生成物のデイスク電気泳動（PH4.3ゲル使用）
で単一なバンドを与え、等電点PHは9.3±0.2を示
した。またその組成は、蛋白質約98重量％以上で
あり、かつアミノ酸組成および組成比は、第４表
に示す通りであつた。

【表】

【表】実施例要素物質の製造及び精製精製したインシユリン分泌増強活性物質（Ｎ−
IAP）10mgを5M尿素含有の0.05Mリン酸緩衝液
（PH6.4）で24時間透析した後、同じ緩衝液で平衡
化したCM−セフアロースCL−6Bカラム
（16φ200mm）に装填し、流速：２ml／時及び３
ｇ／フラクシヨンの条件にて0.1Mリン酸、0.5M
塩化ナトリウム及び5M尿素を含む水溶液を用い
食塩密度勾配にて溶出する。この結果を第１図に
示した。インシユリン分泌増強物質はこの操作に
より２種の分子量の異なる要素物質（前記の通り
分子量の大きい順にCP−Ａ及びPs−１と命名）
に分離された。これ等の構成成分を更に精製度を高めるため
に、まず、Ps−１分画を、集めて濃縮後、セフ
アクリルｓ−200カラム（16φ×1100mm）を用い
て、ゲルろ過をおこなつた。この結果、純粋Ps
−１を1.2mg得た。要素物質Ps−１とCP−Ａの蛋
白質成分のアミノ酸組成及び組成比率（μM／
100μM）は下記の通りである。 Ps−１ Asp.9.3，Thr.7.4，Ser.10.6，Glu.10.6，
Pro.4.4，Gly.11.2，Ala.10.6，Cys.／２ 1.3，
Val.6.7，Met.1.6，1le.3.2，Leu.5.5，Tyr.4.6，
Phe.3.5，Lys.2.2，His.1.7，Arg.5.9 CP−Ａ Asp.6.4，Thr.7.3，Ser.8.2，Glu.9.3，Pro.6.3，
Gly.11.1，Ala.9.0，Cys.／２ 1.2，Val.6.2，
Met.2.7，Ile.3.4，Leu.8.4，Tyr.5.6，Phe.3.6，
Lys.4.7，His.1.1，Arg.4.9 −３上記各例で単離精製された要素物質 Ps−１及びCP−Ａは、第２図に示す通り、デ
イスク電気泳動的に単一物質であることが確認さ
れた。又、インシユリン分泌増強活性因子と要素物質
Ps−１及びCP−ＡとをSDS・デイスク電気泳動
法により比較検討した結果を、第３図に示す。尚、要素物質Ps−１及びCP−Ａの物性は、前
記“要素物質の物性”の項に詳記した通りであ
る。又、各電気泳動の実験条件は実施例に準ず
る。実施例薬理効果 −１インシユリン分泌増強活性測定法各活性物質の当該活性は種々のインシユリン分
泌刺激物質に対する動物の反応性で測定出来る
が、通常はグルースを刺激物質として用いる。 Γ 検定用使用動物ウイスター系雄性ラツト（体重130〜140ｇ） Γ 試験方法各力価の活性物質を生理食塩液に溶解し、その
0.2mlをエーテル麻酔下で股静脈内に注入し、３
日後にインシユリン分泌増強活性を測定する。な
お実験開始前18〜20時間絶食させる。測定方法
は、ラツト尾静脈より0.1mlの血液を採取後、直
ちに30％グルコース溶液を体重100ｇ当り１ml腹
腔内に投与し、正確に15分後、0.1mlの血液を再
び採取する。インシユリン分泌増強活性は、グル
コース投与前、後の血糖値および血中インシユリ
ン値の差より求める。血糖値はグルコースオキシ
ダーゼ法、インシユリンは二抗体法にて測定す
る。血糖値及びインシユリンの測定方法は夫々下
記文献及びキツトによる。血糖値：グルコースオキシダーゼ法 Bergmeyer，Ｈ，−U.，and Berner，E.in
“Methods of enzymatic analysis” Bergmeyer，Ｈ，−U.，eds，New York
Academic press P.123（1963）グルコスタツトインシユリン；二抗体法 Morgan，C.R.，and Razarow，A.Diabetes
12115（1963）インシユリンリアキツト−ダイナボツト社製まず以下の式に従つて活性物質投与群及び対照
群ラツトの△Ｉ／△Ｇ値を求める。 △Ｉ／△Ｇ（μU／mg）＝グルコース投与後の血中インシユリン値（μU／m
l）−グルコース投与前の／グ
ルコース投与後の血糖値（mg／ml）−グルコース※ ※血中インシユリン値（μU／ml）／投与前の血糖値
（mg／ml）尚、血糖値を活性の計算に用いるのは分泌され
るインシユリン量が血糖値によつて大きく影響さ
れるためである。次に活性物質の力価は、単位（unit）＝（本物質投与群ラツトの平均△Ｉ／△
Ｇ−対照群の平均△Ｉ／△Ｇ／対照群の平均△Ｉ／△Ｇ
）×100 で求める。各物質の比活性は力価単位を、重量で除したも
のとする。 −３インシユリン分泌増強活性本発明者が単離、精製したインシユリン分泌増
強活性物質は哺乳動物のインシユリン分泌を促進
し、且つ血糖値を正常値に維持調製する作用を示
し、さらに抗体産生を増強し、細胞性免疫を高め
る作用をも示す。本活性因子は極めて微量でこれ
等の作用を示す事から各種糖尿病の治療および予
防薬として、或いは免疫機能の異常による疾患
（例えば、悪性腫瘍、再生不良性貧血、リユウマ
チ関節炎等）に対する医薬として有用である。本発明者は、この様な有効な活性を示すＮ−
IAPを、その要素物質に分離すると、薬理作用が
不活性となるが、これ等の要素物質をそれぞれ別
途に投与することによつて、その薬理活性を示す
新規な単一物質を得ることに成功した。要素物質
Ps−１及びCP−Ａのインシユリン分泌増強活性
を第６表に示す。 −４副作用および毒性本発明者が単離、精製したインシユリン分泌増
強活性物質は、きわめて微量で、インシユリン分
泌増強活性を示し、各種糖尿病の治療および予防
薬として極めて有用と考えられる。しかしこのイ
ンシユリン分泌増強活性物質には、本来の活性と
は別に、白血球数を増加させる作用、ヒスタミン
に対する感受性を増加させる作用等のいわゆる副
作用を示し、さらに強い抗体産生の発現、すなわ
ち抗原性を示す事が判明した。特に抗原性は、二
回目以後の投与時にアナフイラキーシヨツク等の
重篤な結果をもたらしかねない。インシユリン分
泌増強活性物質は極めて微量で、本来の効果を示
すことから、この副作用が発現する可能性は少な
いものと考えられるが、より安全で有効な医薬品
と言う意味からは、本来の効果を低下させない
で、副作用を除去する事が望ましい事は言うまで
もない。本発明はインシユリン分泌増強活性物質を要素
物質に分離し、これ等要素物質をそれぞれ別途に
投与することによつて、インシユリン分泌増強活
性はインシユリン分泌増強物質と同程度の活性を
有し、更に抗原性が1/30以下に減弱し、急性毒性
値（LD₅₀値）も減少することが確認された。要
素物質Ps−１及びCP−Ａの抗原性を第６表に示
す。 Γ 抗原性の測定法ハートレイ系雄性モルモツト（体重 250ｇ）−
群６匹に、試料を連日３回投与し、投与後22日目
に、同じ試料１mgを静脈内に注射し、その後のア
ナフイラキシ−シヨツクによる死亡数を観察し
た。

【表】要素物質Ps−１及びCP−Ａの静注LD₅₀値を第７
表に示す。

【表】要素物質Ps−１はもう一つの要素物質CP−Ａ
と組合わせて主に糖尿病治療薬として有用と考え
られる。現在糖尿病に対する薬物療法は、インシ
ユリン注射あるいは血糖降下薬の経口投与のみで
いずれも対症療法にすぎず、殆んど不治の病と言
つてさしつかえない。しかもインシユリン注射の
ために毎日通院しなければならない繁雑さがあ
り、血糖降下薬の投与では血糖値の常位低下の発
現が常に危険視されている。要素物質Ps−１の
特徴は、もう一つの要素物質CP−Ａと組合せる
と、インシユリン分泌活性を有するのみならず血
糖値をいろいろな条件で高めた時（高血糖状態、
特に摂食時に類するグルコース負荷時）にのみ血
中インシユリンを増加させて血糖値をすみやかに
正常に戻す作用を発現する。要素物質Ps−１を
もう一つの要素物質CP−Ａと別々に投与する利
点としては、１回投与で数週間から数ケ月にわた
つて活性が持続することがあり、更に特に、特願
昭52−10397号及び特願昭52−49641号に開示され
ているインシユリン分泌増強活性物質の、抗体産
生の発現により連続投与することができなかつた
次点を解決し、連続投与可能ならしめたことであ
る。更に、要素物質Ps−１はもう一つの要素物
質CP−Ａと組合せることによつて糖尿病、糖尿
病の合併症及び糖尿病が起因となる様々な成人病
の治療薬としてばかりでなく、前糖尿病状態への
適用や、現在全く治療法がなく悲慘な状態にある
若年型糖尿病の予防及び治療薬ならびに診断薬と
して有用である。以上、詳述の通り、本発明要素物質Ps−１は
もう一つの要素物質CP−Ａと組合せることによ
つて、糖尿病の治療および予防薬、免疫調節剤と
して極めて有用であり、人体に対する有効量は、
活性物質の比活性に応じて固形物として、インシ
ユリン分泌増強活性用途においては約数
10Units／Kg（体重）〜数万Units／Kg（重量）
の範囲であり、免疫増強活性用途については約数
10Units／Kg（体重）〜数万Units／Kg（体重）
の範囲である。患者に対する投与方法は、各活性用途とも静脈
内投与が最も有効であり、その他腹腔内、筋肉内
および皮下投与、あるいは消化管内への直接投
与、経口投与、直腸内投与および舌下、皮内、鼻
粘膜、動脈、リンパ乃至気管投与も有効である。投与形態としては、各活性用途とも注射液、坐
剤、腸溶・胃溶剤、舌下錠および吸入剤等を例示
し得る。注射液の最も単純な組成を例示すれば、
インシユリン分泌増強活性10000Units，NaCl9mg
および滅菌蒸溜水で１mlとしたものをあげ得る。又、薬剤に調合する際に、活性を劣化せしめる
ことのない任意の他成分を混合し得ることも当業
者にとり自明であろう。

【図面の簡単な説明】

第１乃至第３図は、本発明実験説明図であり、
第１図は、CM−セフアロースCL−6Bカラムク
ロマトグラフイーである。第２図は、Disc−電
気泳動図である。第３図は要素物質のSDS−
Disc電気泳動図である。

Claims

【特許請求の範囲】１ SDS−ゲル電気泳動法による分子量が28000
±1200；Lowry法による蛋白質98重量％以上で
あり、且つ蛋白質成分のアミノ酸組成及び組成比
（μM／100μM）は、 Asp.9.3±1.0，Thr.7.4±0.8，Ser.10.6±1.0，
Glu.10.6±1.0，Pro.4.4±0.5，Gly.11.2±1.0，
Ala.10.6±1.0，Cys／２ 1.3±0.3，Va1.6.7±
0.7，Met.1.6±0.3，Ile.3.2±0.4，Leu.5.5±0.6，
Tyr.4.6±0.5，Phe.3.5±0.4，Lys.2.2±0.3，
His.1.7±0.3及びArg.5.9±0.6であり；且つ等電点PH5.8でありCP−Ａとの組合せによ
りインシユリン分泌増強活性の発現に係わること
を特徴とする蛋白性要素物質Ps−１。２ボルデテラ属に属する微生物を精製して得ら
れたインシユリン分泌増強活性物質を3M〜5M尿
素含有リン酸緩衝液（PH5.4−6.8）で12−96時間
インキユベイトし、次いで、リン酸緩衝液（PH
5.4−6.8）によつて平衡化したCM−セフアロー
スCL−6Bカラムにて分離・精製をおこなうこと
を特徴とする蛋白性要素物質Ps−１の製造方法。